JPWO2011062206A1 - ヒト人工染色体ベクター - Google Patents

Abstract

ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ヒト人工染色体ベクター。

Description

本発明は、ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ヒト人工染色体ベクター、該ヒト人工染色体ベクターを有する動物、並びにヒト抗体を生産する方法に関する。

ヒト染色体断片を含む微小核と分化多能性を有する細胞との融合により雑種細胞を取得しキメラ動物を作製する技術が開発され、長大な外来遺伝子を保持する非ヒト動物の作出が可能となった（非特許文献１および特許文献１）。

続いて、上記の非ヒト動物作製を行うための所望のヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ；以下、ＨＡＣと略記する）ベクターを構築する方法が考案され、広範囲のヒト抗体遺伝子座を搭載したＨＡＣが樹立された。

まず、非ヒト動物に導入する染色体断片の改変方法として、ニワトリＤＴ４０細胞内で保持されたヒト染色体上の所望の配列に対し、テロメア配列をジーンターゲティングにより挿入することにより、高効率で欠失染色体を作製する技術が開発された（特許文献２）。

また、ヒト染色体を保持したマウス細胞の維持の過程で、ヒト１４番染色体由来の抗体重鎖遺伝子座を含む断片ＳＣ２０が得られ、該断片がマウスの胚性幹（ＥＳ）細胞および個体で安定的に保持され、かつ子孫伝達効率が高いことが見出された（特許文献２）。

そこで、このＳＣ２０をベクター母骨格として、ヒト２２番染色体上の抗体λ型軽鎖遺伝子座を含む断片を、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組み換えシステムを用いて転座させることにより、ヒト抗体重鎖およびヒトλ鎖を搭載したλＨＡＣが作製された（非特許文献２および特許文献３）。

このλＨＡＣは、ＳＣ２０とほぼ同等の安定性および子孫伝達効率を有し、マウスＥＳ細胞へ導入することにより安定的にλＨＡＣを保持するキメラマウスを作出し得た（非特許文献２および特許文献３）。本法により、特定のメガベース（Ｍｂ）サイズのヒト染色体領域を搭載したＨＡＣベクターを作製することが可能となった。

さらに、被染色体導入動物の発生に悪影響を及ぼす染色体領域の除去を目的として、ヒト２２番染色体の構造情報（非特許文献３）に基づき、抗体λ型軽鎖（λ鎖）遺伝子領域を含む至適なサイズの染色体断片ΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣが作製された（特許文献４）。

ΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣは、λＨＡＣ上の抗体λ型軽鎖遺伝子領域周辺１０Ｍｂよりも短い、２．５Ｍｂおよび１．５Ｍｂサイズの領域をそれぞれ含み、λＨＡＣに比して高い子孫伝達効率を賦与することが確認された（特許文献４）。

一方、現在、様々な疾患治療および予防に用いられているヒトポリクローナル抗体は、複数のヒトドナーより得られる血清プールより調製されている。そのため、ヒトポリクローナル抗体の性能は供給源であるヒトドナー血清に大きく依存し、調製時には所望の抗原反応性や力価を有するドナーを選抜する過程を要する。

さらに、ポリクローナル抗体を作製するうえでの抗原の種類、免疫原に曝露された回数、および集め得るドナー血清量などの要因から、その用途の開発に制限を生じている。そのため、ヒトポリクローナル抗体の生産装置として、ヒト抗体遺伝子座を有する形質転換動物の作製が行われてきた。

有蹄動物はその体躯の大きさからヒトポリクローナル抗体の大量供給源として有用である。これまでに、ヒトポリクローナル抗体を生産するために、前述のＨＡＣ、具体的にはΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣを導入することによりヒトポリクローナル抗体を産生するようになったウシが知られている（非特許文献４および特許文献５）。

これらのＨＡＣを導入したウシの新生仔の血清中では、１３−２５８ｎｇ/ｍＬのヒトイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇが産生された（非特許文献４）。

次に、ウシ生体内で生成されるウシ抗体を排除するため、ウシ内在性の抗体重鎖遺伝子のうち機能性ＩｇＭ遺伝子をコードするＩＧＨＭおよびＩＧＨＭＬ１に対するジーンターゲティングが行った結果、抗体重鎖がノックアウトされたウシが知られている（非特許文献５および６、特許文献６および７）。

作製された抗体重鎖ダブルノックアウトウシ（ＩｇＨＭ^−／−／ＩｇＨＭＬ１^−/−ウシ）にΔΔＨＡＣを導入したところ、生後１４日目の仔ウシの血清中に７．１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧの産生が認められた（特許文献７）。

また、ヒト抗体重鎖遺伝子座およびヒト抗体κ型軽鎖（κ鎖）遺伝子座を有するＨＡＣベクターであるκＨＡＣを導入されたウシが作出された（非特許文献６および特許文献８）。κＨＡＣは、ヒト２番染色体上の抗体κ鎖遺伝子座を含む断片を、ＳＣ２０上に転座させることにより構築されたベクターである。図１にκＨＡＣの模式図を示す。

このκＨＡＣを導入したＩｇＨＭ^−／−／ＩｇＨＭＬ１^−／−ウシのうち、最も高い抗体産生個体であったクローン４６８は、生後８４日目から恒常的に血清中に１ｇ／Ｌ以上のヒトＩｇＧを産生し、生後２１０日目には２ｇ／Ｌを超える力価を示した。

しかし、上記のような高力価を発揮する個体を安定的に作出する技術は未だ知られておらず、より高い効率でヒト抗体を産生する動物や、それらの動物を安定的に作出しうる技術が求められている。

国際公開第９７／０７６７１号 国際公開第９８／３７７５７号 国際公開第００／１０３８３号 国際公開第０２／９２８１２号 国際公開第２００２／７０６４８号 国際公開第０３／９７８１２号 国際公開第０５／１０４８３５号 国際公開第０９／１１１０８６号

Tomizukaら, Nature Genetics, 16, 133-143, 1997 Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000 Dunhamら, Nature, 402, 489-495, 1999 Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 20, 889-894, 2002 Kuroiwaら, Nature Genetics, 36, 775-780, 2004 Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009

本発明は、効率的にヒト抗体を生産する動物、該動物を安定的に供給しうる方法および高効率でヒト抗体を生産する方法を提供することを課題とする。

前記課題を鑑み、本発明者らは、従来のＨＡＣに比して高いヒトＩｇＧ産生量を達成し、かつ安定的に高力価のウシ個体を出現させることを目的として、ＨＡＣベクターの改良を行った。

すなわち、本発明は以下（１）〜（８）のとおりである。
（１）ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ヒト人工染色体ベクター。
（２）ヒト抗体代替軽鎖遺伝子がＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子である、（１）記載のヒト人工染色体ベクター。
（３）非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子を含む、（１）または（２）記載のヒト人工染色体ベクター。
（４）非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子がウシＩＧＨＭ由来である、（３）記載のヒト人工染色体ベクター。
（５）（１）または（２）に記載のヒト人工染色体ベクターを有する動物。
（６）（３）または（４）に記載のヒト人工染色体ベクターを有するウシ。
（７）（５）記載の動物に目的の抗原を投与し、該抗原特異的なヒト抗体を該動物の血清中に生成、蓄積させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を生産する方法。
（８）（６）記載のウシに目的の抗原を投与し、該抗原特異的なヒト抗体を該ウシの血清中に生成、蓄積させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を生産する方法。

本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ＨＡＣベクターを動物に導入することにより、従来のＨＡＣ技術によるベクターと比較して、高い効率でヒト抗体を生産することができる。また本発明のヒト人工染色体ベクターを動物に導入することにより、高効率でヒト抗体を生産しうる動物を安定的に作出することができる。

また、好ましい実施形態として、ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子に加えて、さらに非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターによれば、動物に導入した場合に、さらに高い効率でヒト抗体を生産することができ、またそのような高効率でヒト抗体を生産しうる動物を安定的に生産することができる。

図１（ａ）にκＨＡＣの模式図を示す。図１（ｂ）にκＨＡＣを動物に導入した場合にＢ細胞膜上で形成されるＩｇＭの模式図を示す。図１（ｂ）において、点線はヒト由来のＩｇＭ部分を示し、実線はウシ由来のＩｇＭ部分を示す。 図２（ａ）にＫＳＬ−ＨＡＣの模式図を示す。図２（ｂ）にＫＳＬ−ＨＡＣを動物に導入した場合にＢ細胞膜上で形成されるＩｇＭの模式図を示す。図２（ｂ）において、点線はヒト由来のＩｇＭ部分を示し、実線はウシ由来のＩｇＭ部分を示す。 図３（ａ）にｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの模式図を示す。図３（ｂ）にｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを動物に導入した場合にＢ細胞膜上で形成されるＩｇＭの模式図を示す。図３（ｂ）において、点線はヒト由来のＩｇＭ部分を示し、実線はウシ由来のＩｇＭ部分を示す。 図４は、ターゲティングベクターｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}Ｆ９Ｒ９の模式図を示す。 図５は、ターゲティングベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦ２Ｒ２の模式図を示す。 図６は、ターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧ^{ｌｏｘ２２７２}ＢｓｒＤＴの模式図を示す。 図７は、ターゲティングベクターｐＳＣ３５５ＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}ｈｉｓＤＤＴの模式図を示す 図８は、ターゲティングベクターｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏ^{ｌｏｘ５１１}ＤＴの模式図を示す。 図９は、ターゲティングベクターｐＲＮＲ２^ｌｏｘＰｂｓｒＤＴの模式図を示す。 図１０は、ターゲティングベクターｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴの模式図を示す。 図１１は、ニワトリＤＴ４０細胞内においてヒト２番染色体を改変する方法の概要を示す。 図１２は、ニワトリＤＴ４０細胞内においてヒト２２番染色体を改変する方法の概要を示す。 図１３は、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてＳＬＫＨ断片を構築する方法の概要を示す。 図１４は、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてＫＳＬ−ＨＡＣを構築する方法の概要を示す図である。 図１５は、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてＣＨ２Ｄ断片を構築する方法の概要を示す。 図１６は、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてヒト１４番染色体を改変する方法の概要を示す。 図１７は、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを構築する方法の概要を示す。 図１８は、６月齢での各ＨＡＣウシ血清中の総ヒトＩｇＧ量を示す。 図１９は、ＣＥＭ細胞特異的ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

本発明は、（１）ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ヒト人工染色体ベクター、（２）該ヒト人工染色体ベクターを有する動物および（３）該動物に目的の抗原を投与し、該抗原特異的なヒト抗体を該動物の血清中に生成、蓄積させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を生産する方法に関する。

１．本発明のヒト人工染色体ベクター
本発明において、「ヒト人工染色体ベクター」とは、ヒト染色体由来のセントロメア配列、テロメア配列および複製起点を含み、宿主細胞の核内において宿主細胞の染色体とは独立して存在するベクターをいう。

具体的には、ヒト染色体上の所望の領域を安定なヒト染色体断片へ転座させることにより作製された、ヒト人工染色体（ＨＡＣ：Ｈｕｍａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）をいう。

ＨＡＣの作製方法として具体的には、ヒト染色体または染色体断片上の所望の領域を含むようにテロメア配列およびＣｒｅ組換え酵素認識配列ｌｏｘＰを挿入した後、該染色体または染色体断片のテロメア配列とｌｏｘＰ配列とで挟まれた領域を、別の染色体または染色体断片（核内で安定でありかつ子孫伝達効率の高い染色体断片であることが好ましい）上のテロメア配列とｌｏｘＰ配列とで挟まれた領域へ、転座により結合する方法が挙げられる（Kuroiwaら,Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／１０３８３号）。

（ヒト抗体重鎖遺伝子）
本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体重鎖遺伝子を含む。本発明において、「ヒト抗体重鎖遺伝子」とは、ヒトの免疫グロブリン分子を構成する２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖のうち、前者をコードする遺伝子をいう。

ヒト抗体重鎖遺伝子としては、具体的には、ヒト抗体重鎖の可変領域をコードする遺伝子、並びに定常領域の構造を規定するγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖およびε鎖をコードする遺伝子が挙げられる。

本発明の人工染色体ベクターは、ヒト抗体重鎖遺伝子として、ヒト抗体重鎖の可変領域をコードする遺伝子、並びに定常領域の構造を規定するγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖およびε鎖をコードする遺伝子を含むことが好ましい。

本発明の人工染色体ベクターにおいて、「ヒト抗体重鎖遺伝子を含む」とは、ヒト抗体重鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含むことをいう。本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体重鎖遺伝子をコードするＤＮＡを任意の位置に挿入してもよいし、ヒト抗体重鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含む染色体断片を挿入または連結してもよい。

ヒト抗体重鎖の可変領域遺伝子および定常領域遺伝子はクラスターを形成し、ヒト１４番染色体上の１４ｑ３２に座乗する。したがって、本発明の人工染色体ベクターは、ヒト１４番染色体を含むことが好ましく、ヒト抗体重鎖の可変領域遺伝子および定常領域遺伝子が座乗するヒト１４番染色体を含むことがより好ましく、１４ｑ３２領域を含むヒト１４番染色体を含むことがさらに好ましい。

（ヒト抗体軽鎖遺伝子）
本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体軽鎖遺伝子を含む。本発明において、「ヒト抗体軽鎖遺伝子」とは、ヒトの免疫グロブリン分子を構成する２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖のうち、後者をコードする遺伝子をいう。

ヒト抗体軽鎖遺伝子としては、具体的には、κ鎖遺伝子とλ鎖遺伝子の二種類が挙げられる。各鎖遺伝子には、可変領域をコードする遺伝子および定常領域をコードする遺伝子が含まれる。

本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体軽鎖遺伝子として、κ鎖遺伝子とλ鎖遺伝子のいずれか一方のみを含んでいてもよいし、両方を含んでいてもよい。

本発明のヒト人工染色体ベクターにおいて、「ヒト抗体軽鎖遺伝子を含む」とは、ヒト抗体軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含むことをいう。本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを任意の位置に挿入してもよいし、ヒト抗体軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含む染色体断片を挿入または連結してもよい。

κ鎖およびλ鎖の可変領域遺伝子および定常領域は、各々クラスターを形成して染色体上に座乗する。κ鎖遺伝子クラスターはヒト２番染色体の２ｐ１１．２−１２に位置し（Gottfrieら, Genomics, 16. 512-514, 1993）、λ鎖遺伝子クラスターはヒト２２番染色体の２２ｑ１１．２に位置する（Collinsら, Nature, 377, 367-379, 1995）。

したがって、本発明の人工染色体ベクターは、ヒト２番染色体断片を含むことが好ましく、κ鎖遺伝子クラスターが座乗するヒト２番染色体断片を含むことがより好ましく、２ｐ１１．２−１２領域を含むヒト２番染色体断片を含むことがさらに好ましい。

また、本発明の人工染色体ベクターは、ヒト２２番染色体断片を含むことが好ましく、λ鎖遺伝子クラスターが座乗するヒト２２番染色体断片を含むことがより好ましく、２２ｑ１１．２領域を含むヒト２２番染色体断片を含むことがさらに好ましい。

（ヒト抗体代替軽鎖遺伝子）
本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む。本発明において、「ヒト抗体代替軽鎖遺伝子」とは、ヒトのプロＢ細胞における遺伝子再構成により生成した抗体重鎖に会合し、プレＢ細胞受容体（ｐｒｅＢＣＲ）を構成する、仮の抗体軽鎖をコードする遺伝子をいう。

ヒト抗体代替軽鎖遺伝子としては、具体的には、ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子が挙げられる。本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子として、ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子を含むことが好ましい。

本発明においてＶｐｒｅＢ遺伝子としては、ＶｐｒｅＢ１遺伝子およびＶｐｒｅＢ３遺伝子のいずれか一方または両方を含むことが好ましく、ＶｐｒｅＢ１遺伝子およびＶｐｒｅＢ３遺伝子の両方を含むことがより好ましい。

本発明のヒト人工染色体ベクターにおいて、「ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む」とは、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含むことをいう。本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを任意の位置に挿入してもよいし、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡを含む染色体断片を挿入または連結してもよい。

ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子のいずれもが、ヒト２２番染色体の２２ｑ１１．２のヒト抗体λ鎖遺伝子座内に位置する。したがって、本発明のヒト人工染色体ベクターは、ヒト２２番染色体を含むことが好ましく、ＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子を含むヒト２２番染色体を含むことがより好ましく、２２ｑ１１．２領域を含むヒト２２番染色体を含むことがさらに好ましい。

（ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子）
本発明のヒト人工染色体ベクターは、さらに、非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域（μ鎖）遺伝子を含むことが好ましい。該非ヒト動物としては、本発明のヒト人工染色体ベクターを導入する宿主となる非ヒト動物であれば特に制限はなく、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタなどの有蹄動物、マウス、ラットおよびウサギなどのげっ歯動物並びにニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類などのいずれでもよい。

非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が好ましく、有蹄動物がより好ましく、ウシがさらに好ましい。

本発明において、「ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子」とは、ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子をいう。ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｂ細胞膜分子Ｉｇα／Ｉｇβと相互作用し細胞内シグナル伝達を惹起することで、Ｂ細胞の発生を促進する。ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子としては、具体的には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの定常領域ドメイン、並びにＴＭ１およびＴＭ２などのＢ細胞膜貫通ドメインをコードする遺伝子が挙げられる。

本発明のヒト人工染色体ベクターが含む非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子としては、上記のＩｇＭ重鎖定常領域のうちＢ細胞発生のシグナルを十分に惹起することができる範囲であれば特に制限はないが、非ヒト動物由来のＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインを含むことが好ましく、非ヒト動物由来のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードする遺伝子を含むことがより好ましい。

本発明のヒト人工染色体ベクターにおいて、「非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含む」とは、非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡを含むことをいう。

本発明のヒト人工染色体ベクターにおいて、非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡを任意の位置に挿入してもよいし、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡを含む染色体断片を結合してもよい。

特に、ヒト人工染色体上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡの一部を、非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡの一部で置換することが好ましい。

具体的には、ヒト人工染色体上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡの一部を、非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子をコードするＤＮＡの一部で置換する場合、ヒト人工染色体上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のうち、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに各々置換することが好ましく、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のうち、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに各々置換することがより好ましい。

非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子としては、非ヒト哺乳動物のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子が好ましく、有蹄動物のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子がより好ましく、ウシのＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子がさらに好ましい。

ウシのＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子としては、ウシの内在性ＩｇＭ重鎖遺伝子が位置するＩＧＨＭ領域内に含まれる（ＩＧＨＭ由来）ウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子またはＩＧＨＭＬ１領域内（ＩＧＨＭＬ１由来）ウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子が好ましく、ＩＧＨＭ領域内に含まれるウシＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子がより好ましい。

２．本発明のヒト人工染色体ベクターの作製方法
本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターは、下記（１）〜（３）の方法を用いて作製することができる。

（１）ヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片の作製
ヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターは、国際公開第９８／０３７７５７号に記載の方法により、ヒト正常細胞からヒト１４番染色体を単離し、該染色体よりヒト抗体重鎖遺伝子を含む染色体断片を取得することにより、作製することができる。

具体的には、国際公開第００／０１０３８３号に記載の方法により、ヒト１４番染色体の単離の過程または細胞内における該染色体の保持の過程で偶発的に発生した染色体断片を単離することができるが、ヒト１４番染色体に電離放射線を照射し断裂させることで染色体断片を得ることもできるし、ヒト１４番染色体の所望の位置にテロメア配列を挿入し該位置で欠失を生じることで染色体断片を得ることもできる。

さらに、黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／０１０３８３号）を用いて、ヒト１４番染色体由来のヒト抗体重鎖遺伝子を含む断片へ、ヒト抗体重鎖遺伝子を含まないヒト染色体断片を、挿入または連結することにより、作製することができる。

そのようにして取得されるヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片としては、ＳＣ２０（Tomizukaら, Proceeding of the National Academy of Sciences, 97, 722-727, 2000および国際公開第９８／０３７７５７号）、λＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／０１０３８３号）、κＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009および国際公開第０９／１１１０８６号）、ΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／１０３８３号）などを挙げることができる。

（２）ヒト抗体軽鎖遺伝子を含む人工染色体断片の作製
ヒト抗体κ鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片は、国際公開第９８／０３７７５７号に記載の方法により、ヒト正常細胞からヒト２番染色体を単離し、該染色体よりヒト抗体κ鎖遺伝子を含む染色体断片を取得することにより、作製することができる。

具体的には、国際公開第００／１０３８３号に記載の方法により、ヒト２番染色体の単離の過程または細胞内における該染色体の保持の過程で偶発的に発生した染色体断片を単離することができるが、ヒト２番染色体に電離放射線を照射し断裂させることで染色体断片を得ることもできるし、ヒト２番染色体の所望の位置にテロメア配列を挿入し該位置で欠失を生じることで染色体断片を得ることもできる。

さらに、黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009および国際公開第０９／１１１０８６号）を用いて、ヒト抗体κ鎖遺伝子を含まないヒト染色体断片へ、ヒト２番染色体由来のヒト抗体κ鎖遺伝子を含む断片を、挿入または連結することにより、ヒト抗体κ鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片を作製することができる。

このようにして取得されるヒト抗体κ鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片としては、例えば、κＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009および国際公開第０９／１１１０８６号）などが挙げられる。

ヒト抗体λ鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片は、国際公開第９８／０３７７５７号に記載の方法により、ヒト正常細胞からヒト２２番染色体を単離し、該染色体よりヒト抗体λ鎖遺伝子を含む染色体断片を取得することにより、作製することができる。

具体的には、国際公開第００／０１０３８３号に記載の方法により、ヒト２２番染色体の単離の過程または細胞内における該染色体の保持の過程で偶発的に発生した染色体断片を単離することができるが、ヒト２２番染色体に電離放射線を照射し断裂させることで染色体断片を得ることもできるし、ヒト２２番染色体の所望の位置にテロメア配列を挿入し該位置で欠失を生じることで染色体断片を得ることもできる。

さらに、黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／０１０３８３号）を用いて、ヒト抗体λ鎖遺伝子を含まないヒト染色体断片へ、ヒト２２番染色体由来のヒト抗体λ鎖遺伝子を含む断片を、挿入または連結することにより、ヒト抗体λ鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片を作製することができる。

そのようにして取得されるヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片としては、λＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／０１０３８３号）、ΔＨＡＣおよびΔΔＨＡＣ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 20, 889-894, 2002および国際公開第０２／０９２８１２号）などを挙げることができる。

（３）ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片の作製
ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片は、国際公開第９８／０３７７５７号の方法により、ヒト正常細胞からヒト２２番染色体を単離し、該染色体よりヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む染色体断片を取得することにより、作製することができる。

具体的には、国際公開第００／０１０３８３号に記載の方法により、ヒト２２番染色体の単離の過程または細胞内における該染色体の保持の過程で偶発的に発生した染色体断片を単離することができるが、ヒト２２番染色体に電離放射線を照射し断裂させることで染色体断片を得ることもできるし、ヒト２２番染色体の所望の位置にテロメア配列を挿入し該位置で欠失を生じることで染色体断片を得ることもできる。

さらに、黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000および国際公開第００／１０３８３号）を用いて、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含まないヒト染色体断片へ、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む断片を挿入または連結することにより、ヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片を作製することができる。

本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターは、（１）の方法により作製したヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト１４番染色体断片へ、（２）の方法により作製したヒトκ鎖遺伝子を含むヒト２番染色体断片、並びに（２）および（３）の方法により作製したヒトλ鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト２２番染色体断片を連結することにより作製することができる。

より具体的には、以下のようにして、本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターを構築することができる。

まず、ヒト２番染色体断片上のヒトκ鎖遺伝子クラスター領域の、極セントロメア側に位置するｃｏｓ１３８座位（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009）、および極テロメア側に位置するＡＣ１０４１３４座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）に、Ｃｒｅ組換え酵素認識配列であるｌｏｘＰ配列及びｌｏｘ２２７２配列を相同組換えにより挿入する。

一方、ヒト２２番染色体断片上のヒトλ鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むクラスター領域の、極テロメア側のＡＰ０００３５０座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）へ、相同組換えによりテロメア配列を挿入して染色体を切断した後、極セントロメア側のＡＰ０００５５３座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）へ、相同組換えによりｌｏｘ２２７２配列を挿入する。

また、ヒト１４番染色体断片上のＲＮＲ２遺伝子座（Wortonら, Science, 239, 64-68, 1988）へ、相同組換えによりｌｏｘＰ配列を挿入する。

Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより、該ヒト２番染色体断片上のＡＣ１０４１３４座位へ、該ヒト２２番染色体断片上のＡＰ０００５５３座位を転座させることにより、両染色体を連結する。

さらに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより、該連結体のヒト２番染色体断片上のｃｏｓ１３８座位へ、該ヒト１４番染色体断片上のＲＮＲ２遺伝子座を転座させることにより、三つの染色体を連結する。

このように作製される本発明のヒト人工染色体ベクターとしては、ＫＳＬ−ＨＡＣを挙げることができる。図２にＫＳＬ−ＨＡＣの模式図を示す。図２に示すように、ＫＳＬ−ＨＡＣは、κＨＡＣ（図１）の構造と比較して、さらにヒト抗体代替軽鎖をコードする遺伝子を含むことにより、動物に導入した場合に、より高い効率でヒト抗体を生産することができる。また、ＫＳＬ−ＨＡＣはそのような高い効率でヒト抗体を生産しうる動物を安定的に生産することができる。

さらに、非ヒト動物由来のＩｇＭ定常領域の遺伝子を含む本発明のヒト人工染色体ベクターは、以下の方法により作製することができる。

（４）非ヒト動物由来ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターの作製
非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子は、上記（１）の方法で作製されるヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を、非ヒト動物由来ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子へ置換することによりヒト人工染色体断片に挿入することができる。

具体的には、上記（１）の方法で作製されるヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片上の、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のうち、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、好ましくはＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、相同組換えにより置換することで作製することができる。

したがって、ヒト抗体重鎖遺伝子およびヒト抗体軽鎖遺伝子を含み、かつ非ヒト動物由来ＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターは、上記（１）〜（３）の方法で作製されるヒト抗体重鎖遺伝子およびヒト抗体軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターにおける、ヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト人工染色体断片上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のうち、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、好ましくはＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、または、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、相同組換えにより置換することで作製することができる。

また、本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含み、かつ非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターは、上記（１）〜（４）の方法を用いて作製することができる。

具体的には、（１）の方法により作製したヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト１４番染色体断片上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を、（３）の方法により非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子へ置換した後、（２）の方法により作製したヒトκ鎖遺伝子を含むヒト２番染色体断片、並びに（２）〜（３）の方法により作製したヒトλ鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むヒト２２番染色体断片を連結することにより、ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含み、かつ非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターを作製することができる。

より具体的には、以下のようにして、本発明のヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含み、かつ非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子を含むヒト人工染色体ベクターを構築することができる。

まず、ヒト１４番染色体断片上のヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のうち、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、好ましくはＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡを、非ヒトＩｇＭ重鎖定常領域遺伝子のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＴＭ１ドメインおよびＴＭ２ドメインをコードするＤＮＡに、相同組換えにより置換する。次に、該ヒト１４番染色体断片上のＲＮＲ２遺伝子座（Wortonら, Science, 239, 64-68, 1988）へ、相同組換えによりｌｏｘＰ配列を挿入する。

一方、ヒト２番染色体断片上のヒトκ鎖遺伝子クラスター領域の、極セントロメア側に位置するｃｏｓ１３８座位（Kuroiwa, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009）、および極テロメア側に位置するＡＣ１０４１３４座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）に、Ｃｒｅ組換え酵素認識配列であるｌｏｘＰ配列およびｌｏｘ２２７２配列を相同組換えにより挿入する。

また、ヒト２２番染色体断片上のヒトλ鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含むクラスター領域の、極テロメア側のＡＰ０００３５０座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）へ、相同組換えによりテロメア配列を挿入して染色体を切断した後、極セントロメア側のＡＰ０００５５３座位（Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）へ、相同組換えによりｌｏｘ２２７２配列を挿入する。

Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより、該ヒト２番染色体断片上のＡＣ１０４１３４座位へ、該ヒト２２番染色体断片上のＡＰ０００５５３座位を転座させることにより、両染色体を連結する。さらに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えにより、該連結体のヒト２番染色体断片上のｃｏｓ１３８座位へ、該ヒト１４番染色体断片上のＲＮＲ２遺伝子座を転座させることにより、三つの染色体を連結する。

このように作製される本発明のヒト人工染色体ベクターとしては、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを挙げることができる。図３にｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの模式図を示す。図３に示すように、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔは、κＨＡＣ（図１）の構造と比較して、さらにヒト抗体代替軽鎖をコードする遺伝子および非ヒト動物（ウシ）由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子を含むことにより、動物に導入した場合に、より高い効率でヒト抗体を生産することができ、またそのような高い効率でヒト抗体を生産しうる動物を安定的に生産することができる。

３．本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物
本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物とは、本発明のヒト人工染色体ベクターを導入された動物をいう。

本発明のヒト人工染色体を有する動物としては、ヒト人工染色体断片をその細胞に導入することができる動物であれば特に限定されず、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタなどの有蹄動物、マウス、ラットおよびウサギなどのげっ歯動物並びにニワトリ、アヒルおよびガチョウなどの家禽類などのいずれの非ヒト動物も用いることができる。

非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物が好ましく、有蹄動物がより好ましく、ウシがさらに好ましい。

本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物は、上記２の方法で作製される本発明のヒト人工染色体ベクターを、宿主動物の卵母細胞へ導入することにより作製することができる。

具体的には、国際公開第２００５／１０４８３５号記載の方法および黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 20, 889-894）を用いて、上記２の方法で作製される本発明のヒト人工染色体ベクターを、ミクロセル融合法により宿主動物由来の体細胞に導入する。その後、当該細胞の核またはクロマチン塊を卵母細胞へ移植し、該卵母細胞または卵母細胞より形成される胚を宿主動物の子宮に移植し、出産させることにより作製することができる。

上記の方法で作製された動物が、本発明のヒト人工染色体ベクターを有していることは、黒岩らの方法（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000およびKuroiwaら, Nature Biotechnology, 20, 889-894）により確認することができる。

４．本発明のヒト抗体を生産する方法
上記３で作製される本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物を、所望の抗原で免疫し、該抗原特異的なヒト抗体を該動物の血清中に産生させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することにより、抗原特異的なヒト抗体を生産することができる。

本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物を免疫する抗原としては、特に制限はないが、腫瘍関連抗原、アレルギーまたは炎症に関連する抗原、循環器疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、神経変性疾患に関連する抗原およびウイルスまたは細菌感染に関連する抗原などが挙げられる。

腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１（ＣＦＲ−１）、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ−４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１８、ＤＦ３、Ｅ−ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ−２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−８（ＦＧＦ−８）、ＦＧＦ８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ １０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（ＦＺＤ−４）、Ｇ２５０、Ｇ−ＣＳＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２およびＧＭ３等)、ｇｌｏｂｏ Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ−９−６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ−ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ （ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ−６およびＩＬ−１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−１５Ｒ等)、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−４（ＩＲＴＡ−４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ−１、ｌａｍｐ−２、ｌａｍｉｎｉｎ−５、Ｌｅｗｉｓ ｙ、ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ （ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ−５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ−４（ＰＦ−４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ４Ｂ （ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＳＬＰＩ）、ＳＭ５−１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２（ＴＡＧ−７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、Ｔｈｙ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉn ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ １（ＴＩＭ−１）、ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＲ４およびＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ ＡＳＣ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ−２、ＴＷＥＡＫ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ ＩＶ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３等）、ｖｉｍｅｎｔｉｎおよびＶＬＡ−４等が挙げられる。

アレルギーまたは炎症に関連する抗原としては、例えば、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、インターロイキン５、インターロイキン５受容体、インターロイキン４、インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ＣＣＲ４およびケモカインまたはケモカイン受容体などが挙げられる。

循環器疾患に関連する抗原としては、例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、血液凝固因子、ＩｇＥ、α_Ｖβ_３およびα_４β_７などが挙げられる。

ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原としては、例えば、ｇｐ１２０、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ベロ毒素、炭疽菌防御抗原、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）抗原、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）抗原、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）抗原、狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）抗原および水痘帯状ヘルペス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）抗原などが挙げられる。

ほかには、例えば、Ｔ細胞表面膜タンパク質混合物、Ｒｈ（Ｄ）抗原、ガラガラヘビ毒およびジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ）などが挙げられる。

免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。

抗原を本発明のヒト人工染色体ベクターを有する動物に投与する形態としては、例えば、ペプチド、タンパク質、細菌、ウィルス、細胞および生体組織片などが挙げられる。

抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。

抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜４週間おきに１〜１０回行う。各投与後１〜１４日目に採血し、その血清の抗体価を測定する。

血清中に含まれる抗原特異的なヒト抗体を検出、測定する方法としては、例えば、酵素免疫測定法による結合アッセイ［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］およびバイオセンサービアコアなどが挙げられる。

具体的には、該ヒト抗体を含む血清を抗原発現細胞とインキュベーションした後、ヒト抗体を特異的に認識する抗体を用いて、血清中のヒト抗体の結合量を測定することができる。

また、これらの方法以外に、公知の方法（The Prostate, 67, 1163, 2007）により、抗体の標的抗原を同定することで選択することもできる。

血清中からヒト抗体を回収する方法としては、例えば、プロテインＡ担体、プロテインＧ担体、またはヒト免疫グロブリン特異的抗体を支持した担体に、該ヒト抗体を吸着させることにより、精製する方法がある。

また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わせることもできる。

上記の方法により生産されるヒト抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、ポリクローナル抗体であることが好ましい。

［実施例１］ターゲティングベクターの構築
（１）ターゲティングベクターｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}Ｆ９Ｒ９の構築
ターゲティングベクターの構築には基本的に既報（Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000、Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 20: 889-894, 2002、Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に記載の方法を用いた。

具体的には、ホモロジーアームとして用いるゲノムＤＮＡ断片Ｄｋ−Ｆ９Ｒ９を、ｋＤ−F９（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｇｃｃａｇｇｇａｇａｃａｇａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｇｔｔｔａｇ−３’)（配列番号１）およびｋＤ−Ｒ９（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃａｇｇａｔｃｔｔｔｇｇｇｇｇａｃｔｇａａｔｇｇｇｇｔｇｔｇｃｔ−３’）（配列番号２）の２つのプライマーＤＮＡを用い、ヒト２番染色体を保有するニワトリ ＤＴ４０細胞株ＫＴＬ１(Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009)のゲノムＤＮＡを鋳型として、９８℃１０秒間、６８℃９分間を４０サイクル繰り返すＰＣＲにより増幅した。

次に、プラスミドｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}を以下の手順で構築した。

まず、改変型ｌｏｘ２２７２配列を含む２つのオリゴＤＮＡ断片［５’−ａｇｃｔｔｇｇａｔｃｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｇａｔａｃｔｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａ−３’（配列番号３）の塩基配列からなるＤＮＡ断片および５’−ａｇｃｔｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａａｇｔａｔｃｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇｇａｔｃｃａ−３’（配列番号４）の塩基配列からなるＤＮＡ断片］をアニーリングした後、プラスミドｐＰＵＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングし、プラスミドｐＰＵＲ^{ｌｏｘ２２７２}を作製した。

一方、プラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏ（Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000、Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 20: 889-894, 2002、Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009）のピューロマイシン耐性遺伝子（以下ｐｕｒｏ^ｒと称す）をｈｉｓＤ遺伝子に、ＥｃｏＲＩサイトをＳｒｆＩサイトに、さらにＳｐｅＩサイトをＰｍｅＩサイトに置換し、プラスミドｐＴＥＬ’ｈｉｓＤＰｍを作製した。

ｐＰＵＲ^{ｌｏｘ２２７２}のＢａｍＨＩ切断断片を平滑化した後ｐＴＥＬ’ｈｉｓＤＰｍのＰｍｅＩサイトにクローニングし、得られたプラスミドをｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}とした。

ｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}のＢａｍＨＩサイトに上記ＰＣＲで増幅したＤｋ−Ｆ９Ｒ９をサブクローニングし、プラスミドｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏ^{ｌｏｘ２２７２}Ｆ９Ｒ９を作製した（図４）。

（２）ターゲティングベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦ２Ｒ２の構築
（１）と同様に、プラスミドｐＴＥＬｐｕｒｏのＥｃｏＲＩサイトをＳｒｆＩサイトに置換し、さらにＳｒｆＩサイトをＰｍｅＩサイトへ置換し、ｐｕｒｏ遺伝子をＣＡＧｚｅｏ ｇｅｎｅに置換することによりｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏ（Ｓｒ）Ｐｍを作製した。

一方、ホモロジーアームとして用いるゲノムＤＮＡ断片を、ＳＬ−Ｆ２（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｇｇｃｃｔｃｃｃａａａｇｇａｔｔａｔａｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｔｇｔ−３’）（配列番号５）およびＳＬ−Ｒ２（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃａａａｇａａｇｇｇｇｃｃｃｇｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔａａａｔｃｃｔｇａｃ−３’）（配列番号６）をＰＣＲのプライマーセットとし、ヒト２２番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞の系統である５２−１８（Kuroiwaら、Nucleic Acids Res 26: 3447-3448, 1998）の染色体ＤＮＡを鋳型として、９８℃１０秒、６８℃９分のサイクルを４０回繰り返すことにより増幅した。

得られたＰＣＲ産物をプラスミドｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏ（Ｓｒ）ＰｍのＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、ｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦ２Ｒ２を作製した（図５）。

（３）ターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧ^{ｌｏｘ２２７２}ＢｓｒＤＴの構築
ターゲティングベクターｐＨＣＦ２ｌｏｘＰＨｙｇ（Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）をＨＣＦ２遺伝子のホモロジーアーム配列を、ＰＣＲで増幅したＡＰ０００５５３座位（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）配列と置換した構造のベクターを作製し、ターゲティングベクターｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇ（Ｆ）とした。

その際、ＡＰ０００５５３座位断片の増幅は５５３−Ｆ３（５’−ｔｇｔａｇｃｔｇａｃｔｔｔａｇｃｃａｃｃｃａｃａａｇｔａｃ−３’)（配列番号７）および５５３−Ｒ３（５’−ｃｔｔｇｃｔｇａｔｔａｔａｃｃｔｃａｔｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃ−３’)（配列番号８）をプライマーセットとして用い、ニワトリＤＴ４０細胞５２−１８のゲノムＤＮＡを鋳型として、９８℃１０秒間、６８℃１５分間のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲにより行った。

得られたプラスミドｐ５５３ｌｏｘＰＨｙｇ（Ｆ）をＮｏｔＩで切断し、セルフライゲーションを行った後、ＳｒｆサイトにジフテリアトキシンＡ断片（以下ＤＴ−Ａと略す）断片をクローニングした。

一方、ｐＤＲＩＶＥ−ＣＡＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を以下のように改変した。それぞれｌｏｘＰ配列を含むオリゴＤＮＡ［５’−ｇｔａｃａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｃａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａｇａｔｃｔｇ−３’（配列番号９）および５’−ａａｔｔｃａｇａｔｃｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔｇｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔ−３’（配列番号１０）］をアニーリングし、ｐＤＲＩＶＥ−ＣＡＧのｌａｃＺ断片を置換した。ＳｄａＩおよびＳｗａＩで切断した断片をＰｓｔＩおよびＳｍａＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＣＡＧ^ｌｏｘＰを作製した。

続いて、２つのオリゴＤＮＡ［５’−ｇａｔｃｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｇａｔａｃｔｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇ−３’（配列番号１１）および５’−ｃｔａｇｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａａｇｔａｔｃｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａ−３’（配列番号１２）］をアニールして生成したｌｏｘ２２７２を含む配列でｐＣＡＧ^ｌｏｘＰのｌｏｘＰ配列を置換した。さらに、ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ遺伝子）をＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＣＡＧ^{ｌｏｘＰ２２７２}ｂｓｒを作製した。

最後に、ＮｏｔＩ−ＫｐｎI断片（ＣＡＧ−ｌｏｘ２２７２−ｐｏｌｙＡ−ｂｓｒ）をＮｏｔＩサイトにクローニングし、ｐ５５３ＣＡＧ^{ｌｏｘ２２７２}ＢｓｒＤＴ（図６）を完成した。

（４）ターゲティングベクターｐＳＣ３５５ＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}ｈｉｓＤＤＴの構築
ホモロジーアームとして用いるゲノムＤＮＡを、ＳＣ３５５−Ｆ３（５’−ｇｔａｃａａｔｃｔｔｇｇａｔｃａｃｔａｃａａｃｃｔｃｔｇｃｃｔａｃｃａ−３’)（配列番号１３）およびＳＣ３５５−Ｒ３（５’− ｔｇｃｔｇｔｇｔｃｔａａｔｃａｇｇｔｇｔｔｇａａｃｃｃａｔｃｔａｃｔａ−３’)（配列番号１４）をプライマーセットとし、ヒト１４番染色体を含有するニワトリＤＴ４０細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、９８℃１０秒間、６８℃１５分間のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲにより増幅した。

プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＫｐｎＩサイトをＳｒｆＩサイトに置換し、上記で増幅されたＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩサイトにサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３とした。

次に、ｐＣＡＧ^ｌｏｘＰのｌｏｘＰ配列を、２つのオリゴＤＮＡ［５’−ｇａｔｃｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｔａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇ−３’（配列番号１５）の配列からなるＤＮＡ断片および５’−ｃｔａｇｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａ−３’（配列番号１６）の塩基配列からなるＤＮＡ断片］をアニールして生成したｌｏｘ５１１を含む配列で置換し、ｐＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}とした。

ｐＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}のＳｐｅＩサイトにｈｉｓＤ遺伝子を挿入し、ｐＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}ｈｉｓＤを作製した。ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで切断した断片（ＣＡＧ−ｌｏｘ５１１−ｐｏｌｙＡ−ｈｉｓＤ）をｐＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。最後にＤＴ−Ａ断片をＮｏｔＩサイトにサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＳＣ３５５ＣＡＧ^{ｌｏｘ５１１}ｈｉｓＤＤＴ（図７）とした。

（５）ターゲティングベクターｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏ^{ｌｏｘ５１１}ＤＴの構築
ホモロジーアームとして用いるゲノムＤＮＡ断片を、１４ＣＥＮ−Ｆ（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｃｃａａａｇａｔｇａｔｔａｃａｇａｔｔａｃ−３’)（配列番号１７）および１４ＣＥＮ−Ｒ（５’−ｔｃｇａｇｇａｔｃｃｔａｃａｃｔａｇａａｇｃａｃａａａｃｃｃｃａｃｃａｔｔａｃａｃａｔ−３’)（配列番号１８）をプライマーセットとして、ヒト１４番染色体を含有するニワトリＤＴ４０細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、９８℃１０秒間、６８℃１５分間のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲ産物はＫｐｎＩサイトをＰｍｅＩサイトに置換したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）を作製した。

ｌｏｘ５１１配列を含むオリゴＤＮＡ［５’−ａｇｃｔｔｇｇａｔｃｃａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａｇｔａｔａｃａｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａ−３’（配列番号１９）の塩基配列からなるＤＮＡ断片および５’−ａｇｃｔｔａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｔｇｔａｔａｃｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｇｇａｔｃｃａ−３’（配列番号２０）の塩基配列からなるＤＮＡ断片］をアニーリングした。得られた断片を、プラスミドｐＰＵＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローニングし、プラスミドｐＰＵＲ^{ｌｏｘ５１１}を作製した。

ｐＰＵＲ^{ｌｏｘ５１１}のＢａｍＨＩ切断断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＢａｍＨＩサイトに、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ遺伝子）をＥｃｏＲＶサイトにそれぞれクローニングし、ｐＨｙｇＰｕｒｏ^{ｌｏｘ５１１}を作製した。

ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで切断した断片（ｐｕｒｏ−ｌｏｘ５１１−ｈｙｇ）をｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）のＨｐａＩサイトにクローニングした。最後に、ＤＴ−Ａ断片をＰｍｅＩサイトにサブクローニングし、ｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏ^{ｌｏｘ５１１}ＤＴ（図８）を完成した。

（６）ターゲティングベクターｐＲＮＲ２^ｌｏｘＰｂｓｒＤＴの構築
ベクターｐＲＮＲ２^ｌｏｘＰｂｓｒ（Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000)にＤＴ−Ａ断片を挿入し、ターゲティングベクターｐＲＮＲ２^ｌｏｘＰｂｓｒＤＴ（図９）を構築した。

（７）ターゲティングベクターｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴの構築
κＨＡＣ（国際公開第２００９／１１１０８６号）のλファージゲノムライブラリーを、κＨＡＣを含むＣＨＯ細胞より、λＦＩＸ ＩＩベクターを用いてカスタムライブラリー構築サービス（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ社）により構築した。

構築したゲノムライブラリーからヒトＩｇＭ定常領域を含むクローンを、５’-ｃａｇｔｃｃｃｃｇｇｃａｇａｔｔｃａｇｇｔｇｔｃｃ-３’（配列番号８９）および５’−ｇａａａｇｔｇｇｃａｔｔｇｇｇｇｔｇｇｃｔｃｔｃｇ-３’（配列番号９０）の塩基配列からなるＤＮＡをプライマーとして用い、κＨＡＣを含有するＣＨＯ細胞（国際公開第２００９／１１１０８６号）のより抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として９８℃１０秒間、６４℃３０秒間、７２℃１分間のサイクルを４０回繰り返すことにより増幅したＰＣＲ産物をプローブとしてスクリーニングした。その結果クローン＃１、＃４および＃７が単離された。

一方、それぞれ５’−ｇｇａｃｃａｇｇｔｇｇａｇａｃｔｇｔｇｃａｇｔｃｃｔｃａｃｃｃａｔａａｃｔｔｔｃａｇｇｇｃｃｔａｃａｇｃａｔｇｃｔｇ−３’（配列番号２１）および５’−ｃａｇｃａｔｇｃｔｇｔａｇｇｃｃｃｔｇａａａｇｔｔａｔｇｇｇｔｇａｇｇａｃｔｇｃａｃａｇｔｃｔｃｃａｃｃｔｇｇｔｃｃ−３’（配列番号２２）の塩基配列からなるオリゴＤＮＡをアニーリングしてできたＳｅＳｐ断片を、平滑化したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＰｓｔＩサイトにクローニングした。

ＳａｌＩ−ウシＩＧＨＭ染色体断片がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたプラスミドｐＢＣμＡＹ３７−９５より、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断した断片（約２ｋｂ）を、上記で得られたプラスミドのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、ｐｍＡＹＳｐＢを作製した。

同様に、ｐＢＣμＡＹ３７−９５のＢａｍＨＩおよびＰｍｌＩで切断した断片(約２ｋｂ)を、ｐｍＡＹＳｐＢのＢａｍＨＩ−ＰｍｌＩサイト（本来のＳｐｅＩサイトを置換したもの）にサブクローニングしてｐｍＡＹＳｐＢＰｍｌを作製した。

上記のクローン＃１のＥｃｏＲＩ−ＳｅｘＡＩ断片（約０．６ｋｂ）をｐｍＡＹＳｐＢＰｍｌのＥｃｏＲＩ−ＳｅｘＡ１サイトにサブクローニングしてｐＲＩＳｅを作製した。

次に、ｌｏｘＰ配列が導入されたＣＡＧｚｅｏをｐＲＩＳｅのＶａｎ９１Ｉサイトにサブクローニングし、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）を作製した。さらに、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏ（Ｒ）のＮｏｔＩサイトをＥｃｏＲＩサイトに置換し、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏＥを作製した。

一方、上記のクローン＃４のＰｍｌＩ断片(約１．７ｋｂ)を、ＥｃｏＲＶサイトをＭｌｕＩサイトに置換したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩサイトにサブクローニングし、ｐＣＨ２Ｓ（Ｆ）を作製した。

上記のクローン＃１のＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで切断した断片（約６．６ｋｂ）をｐＣＨ２Ｓ（Ｆ）のＭｌｕＩ−ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、ｐＣＨ２ＬＳを作製した。

次に、ｐＲＩＳｅＣＡＧｚｅｏＥのＥｃｏＲＩ断片をｐＣＨ２ＬＳのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングし、ｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏ（Ｆ）を作製した。最後に、ＤＴ−Ａ断片をｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏ（Ｆ）のＮｏｔＩサイトにサブクローニングし、ｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴ（図１０）を完成した。

［実施例２］ＫＳＬ−ＨＡＣの構築
（１）ニワトリＤＴ４０細胞内におけるヒト２番染色体の改変
ヒト２番染色体のＡＰ１０４１３４座位にて欠失を生じさせ、かつｌｏｘ２２７２配列とプロモーターレスｐｕｒｏ^ｒカセットを挿入するため、ターゲティングベクターｐＴＥＬ’ｈｉｓＤｐｕｒｏｌｏｘ２２７２Ｆ９Ｒ９をＳｒｆＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で線状化し、ＣＤ８Ａ遺伝子座で切断されたヒト２番染色体断片を保有するニワトリ ＤＴ４０細胞の系統であるＫＴＬ１（Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に、エレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。ＤＴ４０細胞のエレクトロポレーションは既報(Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000)に記載の方法により行った。

コロニーをヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）による２週間の選抜に供し、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）に対する感受性を、ＣＤ８Ａ遺伝子座上のｐｕｒｏ^ｒカセットの脱落の指標として測定した。

ピューロマイシン感受性のコロニーからＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ｃｅｌｌ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して染色体ＤＮＡを抽出し、ＦＡＢＰ１−Ｆ（５’−ｔａｔｃａａｇｇｇｇｇｔｇｔｃｇｇａａａｔｃｇｔｇ−３’)（配列番号２３）およびＦＡＢＰ１−Ｒ(５’−ａｃｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇａｇａａｃｃｔｇａｇａｃｔ−３’)（配列番号２４）をプライマーとしたＰＣＲスクリーニングに供した。

ＰＣＲを、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間のサイクルを３０回繰り返す条件で行うことで、ＫＴＬ１に存在し、標的クローンには存在しないＦＡＢＰ１遺伝子座を増幅するような条件で行った。その結果、クローンＫ５３が、正しく欠失が起こったクローンとして同定された。図１１に、ニワトリＤＴ４０細胞内においてヒト２番染色体を改変する方法の概要を示す。

（２）ニワトリＤＴ４０細胞内におけるヒト２２番染色体の改変
ヒト２２番染色体のＡＰ０００３４４座位（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 20: 889-894, 2002）より約４５０Ｍｂテロメア側に位置するＡＰ０００３５０座位で欠失を生じさせるため、ターゲティングベクターｐＴＥＬＣＡＧｚｅｏＳＬＦＲをＰｍｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で線状化し、ヒト２２番染色体を保持するニワトリＤＴ４０細胞の系統である５２−１８（Kuroiwaら、Nucleic Acids Res 26: 3447-3448, 1998）に、エレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。

コロニーをゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による２週間の選抜に供した。得られたコロニーから抽出したゲノムＤＮＡを３５０Ｔ−Ｆ(５’−ｇａｇｇｔｇｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｔｇｔｇ−３’)（配列番号２５）および３５０Ｔ−Ｒ(５’−ｔａｃｇａｇｇａｇｇｇｇａｇｇｃａｇｔｇａｇａｇｇ−３’)（配列番号２６）をプライマーとし、ＰＣＲスクリーニングに供した。

ＰＣＲを、５２−１８に存在しターゲティングの起こったクローンには存在しない、ＡＰ０００３５０座位が増幅される条件（９８℃１０秒間、６３℃３０秒間、７２℃１分間のサイクルを３０回繰り返す）により行った。その結果、クローンＳＴ１３が、正しく欠失を生じたクローンとして同定された。。

ｌｏｘ２２７２配列およびＣＡＧプロモーターをＡＰ０００５５３座位に組込むため、ＳＴ１３にＰｍｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で線状化したターゲティングベクターｐ５５３ＣＡＧｌｏｘ２２７２ｂｓｒＤＴをエレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）で導入した。

コロニーをブラストサイジンＳ（１５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による２週間の選抜に供した。得られたコロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、５５３ＫＯ−Ｆ(５’−ｇｔｃａｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｃｃａｔｔｔａｃｃｇｔａａｇｔｔａｔｇｔａ−３’)（配列番号２７）および５５３ＫＯ−Ｒ(５’−ａｇｇｇｃｔｇｇｇｔｔａｇａｔｇｇｃａｃｃａａａｔｇａａａｇｇａｇａａ−３’)（配列番号２８）をプライマーとするＰＣＲスクリーニングに供した。ＰＣＲは９８℃１０秒間、６８℃６分間のサイクルを４０回繰り返すことにより行った。その結果、クローンＳＴＬ５４が、ターゲティングの起こったクローンとして同定された。図１２に、ニワトリＤＴ４０細胞内においてヒト２２番染色体を改変する方法の概要を示す。

（３）ＤＴ４０ハイブリッド細胞内におけるＳＬＫＨ断片の構築
ＳＬＫＨ断片を既報（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）の方法に倣い、ニワトリＤＴ４０ハイブリッド細胞内で構築した。

ｈｙｇ^ｒカセットを有するヒト２番染色体由来断片を含む実施例２（１）のＫ５３（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）、およびｂｓ^ｒカセットを有するヒト２２番染色体由来断片を含む実施例２（２）のＳＴＬ５４を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合し、ＤＴ４０ハイブリッド細胞を作製した。

コロニーをハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびブラストサイジンS（２０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で３週間維持し、両方のヒト染色体断片を保持する細胞を選択した。ゲノムＤＮＡをコロニーより抽出し、ＰＣＲに供した。

ヒト２番染色体断片の保持を、表１に示すＰＣＲ１〜ＰＣＲ５のプライマーの組み合わせで、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒを用いる場合には９８℃１０秒間、６５℃８分間から成るサイクルを４０回、それ以外の場合には９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間から成るサイクルを４０回繰り返すＰＣＲをそれぞれ行うことにより確認した。

ヒト２２番染色体断片の保持を、以下の表２に示すＰＣＲ１〜ＰＣＲ８の組み合わせのプライマーと以下の反応サイクルによるＰＣＲ１〜８をそれぞれ行うことにより確認した。

各ＰＣＲ反応を、ＰＣＲ１と７は９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間を４０回のサイクルで、ＰＣＲ２と３は９８℃１０秒間、６３℃３０秒間、７２℃１分間を４０回のサイクルで、ＰＣＲ４と５は９８℃１０秒間、５６℃３０秒間、７２℃１分間を４０回のサイクルで、ＰＣＲ６は９８℃１０分間、６５℃３０秒間、７２℃１分間を４０回のサイクルで、ＰＣＲ８は９８℃１０秒間、６８℃６分間のサイクルを４０回のサイクルで行った。

さらに、ＨＵＭＡＮ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとして用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を既報（Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）の方法に従って行い、２つのヒト染色体断片が適切なサイズ（ヒト２番染色体断片は約１５４Ｍｂ、ヒト２２番染色体断片は約２４Ｍｂ）を有していることを確認した。その結果、クローンＳＬＫ２を陽性クローンとして同定した。

ヒト２番染色体断片上のＡＣ１０４１３４座位およびヒト２２番染色体断片上のＡＰ０００５５３座位に各々配置された二つのｌｏｘ２２７２部位の間で、部位特異的組換えを起こすため、エレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）によりＣｒｅ発現プラスミドをＳＬＫ２へ導入した。

転座位置に生じたＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｏｘ２２７２−ｐｕｒｏ^ｒカセットにより付与されるピューロマイシン耐性を利用し、組換え体をピューロマイシン（１〜５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下、１０日間にて選抜した。

さらに、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３（５’−ｇｃｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｇｇａａｇｇａａａｔｇ−３’)（配列番号５５）およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３(５’−ｃｇａｇｇｃｇｃａｃｃｇｔｇｇｇｃｔｔｇｔａ−３’)（配列番号５６）をプライマーとして用いた、ＰＣＲ（９８℃１０秒間、６８℃１．５分間のサイクルを４０回）およびＰＣＲ産物の配列解析により組み換えを確認した。

その結果、ＳＬＫＨ６が、所望の転座が生じＳＬＫＨ断片を保持したクローンとして同定された。図１３に、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてＳＬＫＨ断片を構築する方法の概要を示す。

（４）ＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）法によるＳＬＫＨ断片のＤＴ４０細胞野生株への移入
ＭＭＣＴ法（Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）により、ＤＴ４０ハイブリッド細胞株ＳＬＫＨ６から実施例２（３）のＳＬＫＨ断片をＤＴ４０細胞野生株へ移入した。ＳＬＫＨ６より精製した微小核を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２×１０^７個のＤＴ４０細胞と融合し、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、２週間でピューロマイシン耐性細胞を選択した。

ＳＬＫＨ断片がＤＴ４０へ移入されたコロニーが単離されている場合には、該コロニーはブラストサイジン耐性を喪失するため、コロニーのブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）感受性試験を行った。また、ブラストサイジンＳ感受性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、以下の組み合わせのＰＣＲプライマーを用いてＳＬＫＨ断片の保持を確認した。

すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒの組み合わせ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒの組み合わせ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒの組み合わせＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒの組み合わせ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒの組み合わせ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３の組み合わせ、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒの組み合わせ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒの組み合わせ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒの組み合わせ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒの組み合わせ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒの組み合わせ、並びに５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒの組み合わせを用いた［以上、実施例２（３）に記載］。

さらに、ＨＵＭＡＮ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとして用いたＦＩＳＨによりヒト染色体断片（ＳＬＫＨ断片に相当する約１５４Ｍｂの断片）が一つのみ存在することを確認した。ローダミン標識した２番染色体ペインティングプローブ、フルオロセイン標識した２２番染色体ペインティングプローブ（いずれもＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および、対比染色としてＤＡＰＩ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて、２色ＦＩＳＨ法を添付のプロトコールに従って行い、ＳＬＫＨ断片の存在を確認した。その結果、クローンＳＬＫＤ１７およびＳＬＫＤ１８を陽性クローンとして同定した。

（５）ＤＴ４０ハイブリッド細胞内でのＫＳＬ−ＨＡＣの構築
既報（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に記載の方法に従い、ＫＳＬ−ＨＡＣを以下に示すＤＴ４０ハイブリッド細胞内で構築した。

まず、実施例２（４）で取得したｈｙｇ^ｒカセットを有するＳＬＫＤ１８と、ｂｓ^ｒカセットを有したＳＣ２０断片を含むＤＴ４０細胞株Ｒ５６（Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）とを、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合し、ＤＴ４０ハイブリッド細胞を作製した。

コロニーをハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)およびブラストサイジンＳ（２０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で３週間維持し、ＳＬＫＨ断片およびＳＣ２０の両方を保持する細胞を選択した。コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲに供した。

ＳＬＫＨ断片の保持を確認するためのＰＣＲは、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒ、並びに５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒの組み合わせのプライマーを使用して行った［以上、実施例２（３）に記載］。

ＳＣ２０断片の保持を確認するためのＰＣＲは、下記表３に記載のプライマーおよび反応条件にて行った。

さらに、ＨＵＭＡＮ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとして用いたＦＩＳＨによって、２つの適切なサイズのヒト染色体断片（ＳＬＫＨ断片は約１５６Ｍｂであり、ＳＣ２０は約２６Ｍｂ）を確認した。その結果、クローンＫＳＬ３を陽性クローンとして同定した。

ＳＬＫＨ断片（２番染色体に由来する領域）のｃｏｓ１３８座位（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）およびＳＣ２０断片のＲＮＲ２遺伝子座に各々配置された二つのｌｏｘＰ部位の間で、部位特異的組換えを起こすため、エレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）によりＣｒｅ発現プラスミドをＫＳＬ３へ導入した。

転座部位に形成されたＰＧＫ プロモーター−ｌｏｘＰ−ＧＦＰカセットによりＧＦＰ発現能が賦与されるため、既報に記載の方法（Kuroiwaら、 Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009）により、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＧＦＰ陽性細胞をソーティングし、組み換え体を濃縮した。９５％以上の純度のＧＦＰ陽性細胞を得るため、ソーティングを２回行った。

ＰＧＫ２（５’−ｔｇｔｔｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃａｔｃｔｃｃ−３’）（配列番号６９）およびＧＦＰ２（５’−ｔｇａａｇｇｔａｇｔｇａｃｃａｇｔｇｔｔｇｇ−３’)（配列番号７０）をプライマーとして用い、９８℃１０秒間、５９℃３０秒間、７２℃１分間のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲによりＧＦＰカセットを確認した。

クローンＫＳＬＨ１２（２）が、所望の転座を生じＫＳＬ−ＨＡＣを保持するクローンとして同定された。図１４に、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてＫＳＬ−ＨＡＣを構築する方法の概要を示す。

（６）ＭＭＣＴ法およびＷＣＦ法（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）によるＫＳＬ−ＨＡＣのＤＴ−４０ハイブリッド細胞からＣＨＯ細胞への移入
既報（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）に記載のＭＭＣＴ法またはＷＣＦ法の一部改変した方法により、（５）のＫＳＬ−ＨＡＣをＤＴ４０ハイブリッド細胞株ＫＳＬＨ１２（２）からチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へ移入した。

ＭＭＣＴ法については、ＫＳＬＨ１２（２）より精製した微小核を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて約２×１０^７個のＣＨＯ細胞と融合し、Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびウアバイン（Ｏｕａｂａｉｎ、１０^−５ｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下、３週間の選抜を行った。

ＷＣＦ法については、２×１０^７個のＫＳＬＨ１２（２）細胞と２×１０^７個のＣＨＯ細胞とをＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合し、Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびウアバイン（１０^−５ｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で３週間の選抜を行った。

Ｇ４１８耐性のコロニーを選択し、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲスクリーニングに供した。

ＫＳＬ−ＨＡＣの保持は以下のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲにより確認した。すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒの組み合わせ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒの組み合わせ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒの組み合わせ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒの組み合わせ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒの組み合わせ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３の組み合わせ、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒの組み合わせ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒの組み合わせ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒの組み合わせ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒの組み合わせ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒの組み合わせ、５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒの組み合わせ［以上すべて実施例２（３）に記載］、ＶＨ３−ＦおよびＶＨ３−Ｒの組み合わせ、ｇ１（ｇ２）−Ｆおよびｇ１（ｇ２）−Ｒの組み合わせ、ＳＣ３５５−Ｆ２およびＳＣ３５５−Ｒ２の組み合わせ、ＳＣ８５８−Ｆ４およびＳＣ８５８−Ｒ４の組み合わせ、ＣＨ３−Ｆ３およびＣＨ４−Ｒ２の組み合わせ、並びにＰＧＫ２およびＧＦＰ２の組み合わせ［以上すべて実施例（５）に記載］をＰＣＲのプライマーセットとして用いた。

さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブに用いたＦＩＳＨによって、ＫＳＬ−ＨＡＣの保持を確認した。

また、ＫＳＬ−ＨＡＣ上のヒトイムノグロブリン重鎖（ＩｇＨ）、イムノグロブリンκ鎖（Ｉｇκ）およびイムノグロブリンλ鎖（Ｉｇλ）遺伝子座の存在はＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｌｅ ＢＡＣ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＲＰＣＩ−１１）のＢＡＣクローンＲＰ１１−４１７Ｐ２４、ＲＰ１１−３１６Ｇ９およびＲＰ１１−２２Ｍ５(有限会社ジェノテックス、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＧｅｎｏＴｅｃｈｓ Ｃｏ．)をプローブとした３色ＦＩＳＨ（Ｔｈｒｅｅ−ｃｏｌｏｒ ＦＩＳＨ）で確認した。

Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔt Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いて、ＲＰ１１−４１７Ｐ２４をＲｅｄ−ｄＵＴＰで、ＲＰ１１−３１６Ｇ９をＧｒｅｅｎ−ｄＵＴＰで、ＲＰ１１−２２Ｍ５をＯｒａｎｇｅ−ｄＵＴＰでそれぞれ標識し、スライド上に染色体を展開し、３つすべてのプローブを用いて製品の添付文書に従いハイブリダイズした。ここで、対比染色にはＤＡＰＩ ＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いた。

最後に、ＭＭＣＴ法で得られたクローンＫＳＬＣ５と、ＷＣＦ法で得られたクローンＫＳＬＣ２０に対し、ヒトＩｇＨ、ＩｇκおよびＩｇλの遺伝子座をカバーする約７２０００のプローブを用いたカスタムメイドアレイにより、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎにてＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）解析を行った。その結果、両クローンは相同な構造を有していることが示された。

［実施例３］ＫＳＬ−ＨＡＣΔの構築
（１）ＤＴ４０細胞内におけるヒト１４番染色体の改変
ＩｇＨ遺伝子座より約３００ｋｂセントロメア側に位置するＡＬ５１２３５５座位にｌｏｘ５１１配列およびＣＡＧプロモーターを組込むため、ｐＳＴｎｅｏ［Katohら、Cell Structure and Function, 12, 575-580, 1987;Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏf Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＪＣＲＢ）バンク、寄託番号ＶＥ０３９］で標識した無傷なヒト１４番染色体を保持するＤＴ４０細胞に、ＳｒｆＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で線状化したターゲティングベクターｐＳＣ３５５ＣＡＧｌｏｘ５１１ｈｉｓＤＤＴを、エレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。ＤＴ４０細胞へのエレクトロポレーション方法は既報に記載されている（Kuroiwaら、Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）。

コロニーをヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）による２週間の選抜に供し、耐性コロニーより抽出したゲノムＤＮＡをＰＣＲスクリーニングに供した。

ＰＣＲを、ターゲティングの起こったクローンを増幅するプライマーＳＣ３５５ＫＯ−Ｆ２（５’−ａｃｇｇｃｇｔｇａｇｇａｃｃａａｇｇａｇｃｇａａａｃｃ−３’)（配列番号７１）およびＳＣ３５５ＫＯ−Ｒ２（５’−ｔｇａｇｃｇａｃｇａａｔｔａａａａｃａｇｇｃｇａｔｇａｃ−３’)（配列番号７２）を用いて９８℃１０秒間、６８℃６分間を４０回繰り返すサイクルで、また、ベクター断片がランダムに組込まれたクローンを増幅するプライマー３５５Ｎ−Ｆ(５’−ｇｇｇｃａａｃａｔａｇｃａａｇａｃａｃｃａｔｔｃ−３’)（配列番号７３）および３５５Ｎ−Ｒ(５’−ｔｃｃｔｃｔｃａｃｃｔｃａｇｃｃｔｃｃａｔａｇｔａ−３’)（配列番号７４）を用いて９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１分間を４０回繰り返すサイクルで行った。

その結果、クローンＩ３５５−２を、ターゲティングを起こしたクローンとして同定した。

次に、ＡＬ５１２３５５座位より８５Ｍｂセントロメア側のＡＬ３９１１５６領域へｌｏｘ５１１配列およびプロモーターレスｐｕｒｏ^ｒカセットを挿入するため、Ｉ３５５−２に、ＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）で線状化したターゲティングベクターｐ１４ＣＥＮ（ＦＲ）ｈｙｇｐｕｒｏ ｌｏｘ５１１ＤＴをエレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。

コロニーをハイグロマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による２週間の選抜に供し、耐性コロニーより抽出したゲノムＤＮＡをＰＣＲスクリーニングに供した。プライマー１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３(５’−ａｃｔｇａａａｔａｔｔｔｔａａａｔｇｔｔｔｇｃｃｃｔｔｃｃｃａｃｔｃｃ−３’)（配列番号７５）および１４ＣＥＮＫＯ−Ｒ３(５’−ａｇａｃｃｔｃｃｇｃｇｃｃｃｃｇｃａａｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｔａｃ−３’)（配列番号７６）を用い、９８℃を１０秒間、６８℃を５分間のサイクル４０回繰り返す条件のＰＣＲにて、ターゲティングが生じたか否かを判定した。

また、プライマー１４ＣＥＮ（Ｎ）−Ｆ２(５’−ａａｃａｇｔｔｇａａｔｔｔａｔｇｇｇｇａｇｔｃ−３’)（配列番号７７）および１４ＣＥＮ（Ｎ）−Ｒ２（５’−ｔｃａｇｇｃｔｔｔａａａｃａｃａｇｔａｔｃａｃａｇ−３’)（配列番号７８）を用い、９８℃を１０秒間、６０℃を３０秒間、７２℃を１分間のサイクルを３０回繰り返す条件のＰＣＲにて、ランダム挿入を判定した。

その結果、クローンＩ１５６−１０を、ターゲティングがなされたクローンとして同定した。

ＡＬ５１２３５５座位およびＡＬ３９１１５６座位に各々配置された二つのｌｏｘ５１１部位の間で、部位特異的組み換えを起こすことにより、ヒト１４番染色体より約８５Ｍｂの配列を削除して約１０６Ｍｂから２１Ｍｂに短縮するため、Ｉ１５６−１０にＣｒｅ発現プラスミドをエレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。

組み換え部位に形成されたＣＡＧプロモーター−ｌｏｘ５１１−ｐｕｒｏ^ｒカセットによりピューロマイシン耐性が付与されるため、４日間培養した後、コロニーをピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）による選抜に供した。実施例２（３）に記載のプライマーＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の配列を解析することにより、該カセットの存在を確認した。

また、この８５Ｍｂの削除の結果ｈｉｓＤおよびｈｙｇ^ｒカセットのいずれもが喪失したことを確認するため、ヒスチジノール（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびハイグロマイシン（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する感受性を解析した。さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとしたＦＩＳＨによりヒト１４番染色体が短縮していることを確認した。

以上より、クローンＤ８を、所望の短縮のなされたクローンとして同定した。

ヒト１４番染色体のＲＮＲ２遺伝子座（Kuroiwa ら, Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009)上のＧＦＰコード配列にｌｏｘＰ配列を組込むため、ＳｗａＩ（Ｒｏｃｈｅ）で線状化したターゲティングベクターｐＲＮＲ２ｌｏｘＰｂｓｒＤＴを、エレクトロポレーションによりクローンＤ８に導入した（５５０Ｖ、２５μＦ）。

コロニーをブラストサイジンＳ（２０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による２週間の選抜に供し、、耐性コロニーのゲノムＤＮＡを、実施例２（５）記載のプライマーＲＮＲ２−１およびＳＴＯＰ−３を用いたＰＣＲスクリーニングに供した。

その結果、クローン１４Ｄ１および１４Ｄ３が、１４Ｄ断片を保持する陽性クローンとして同定された。

ヒトイムノグロブリンμ重鎖定常領域のＣＨ２ドメインからＴＭ２ドメインまでをウシ由来配列へ置換してキメラＩｇＭを作製するため、ＳａｌＩ（Ｒｏｃｈｅ）で線状化したターゲティングベクターｐＣＨ２ＣＡＧｚｅｏＤＴ（Ｆ）を、エレクトロポレーションによりクローン１４Ｄ１へ導入した（５５０Ｖ、２５μＦ）。

コロニーを２週間のゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）選抜に供し、耐性コロニーのゲノムＤＮＡをＰＣＲスクリーニングに供した。ＰＣＲはプライマーｃＨＡＣ−Ｆ(５’−ａｃｇｃｃｔｇｃｔｃｇｃｃｔｇｃｃｃｇｃｔｃｇｃｔｔｃｔ−３’)（配列番号７９）およびｃＨＡＣ−Ｒ(５’−ｔｔｇｃｃａｇｇｇｃｃａｃａｇｔｔａａｃｇｇａｔａｃｇ−３’)（配列番号８０）を用い、９８℃を１０秒間、６８℃を５分間のサイクルを４０回繰り返す条件で行った。

ウシ配列とヒト配列の５’および３’の連結部分はプライマーＣＨ２ ５’−Ｆ（５’−ｃａｇｃａｃｃｃｃａａｃｇｇｃａａｃａａａｇａａａ−３’)（配列番号８１）およびＣＨ２ ５’−Ｒ（５’−Ｃｃｃｃａｇｇｇｃｔｇｃａｃｔｃａｃｃａａｃａｔ−３’)（配列番号８２）を用い、９８℃を１０秒間、６４℃を３０秒間、７２℃を１分間のサイクルを４０回繰り返す条件、ならびに、ｃＨＡＣ−Ｆ３（５’−ｔｇｃａｇｇｔｇａａｇｔｇａｃｇｇｃｃａｇｃｃａａｇａａｃａ−３’）（配列番号８３）およびｃＨＡＣ−Ｒ３（５’−ｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｇｇａａｇｇｃａｇｇｇａａａａｇ−３’)（配列番号８４）をプライマーとし、９８℃を１０秒間、６８℃を８分間のサイクルを４０回繰り返す条件のＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の配列を解析することにより確認した。

以上より、クローンＣＨ２Ｄ２が、ＣＨ２Ｄ断片を保持する陽性クローンとして同定された。図１５および１６に、ＤＴ４０細胞内においてヒト１４番染色体を改変し、ＣＨ２Ｄ断片を構築する方法の概要を示す。

（２）ＤＴ４０ハイブリッド細胞内におけるＫＳＬ−ＨＡＣΔの構築
実施例２（５）のＫＳＬ−ＨＡＣと同様の方法で、ＫＳＬ−ＨＡＣΔをＤＴ４０ハイブリッド細胞内で構築した。ｈｙｇ^rカセットを含む実施例２（４）のＳＬＫＤ１７またはＳＬＫＤ１８と、ｂｓ^ｒカセットを含む実施例３（１）の１４Ｄ１とを、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合し、ＤＴ４０ハイブリッド細胞を作製した。

コロニーをハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびブラストサイジンＳ（２０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下３週間維持し、ＳＬＫＨおよび１４Ｄ断片の両方を含む細胞を選択した。耐性コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲに供した。

ＳＬＫＨ断片の保持を、以下のプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲにより確認した。すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒ、並びに５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒ［いずれも実施例２（３）に記載］を用いた。

１４Ｄ断片の保持を以下のプライマーの組み合わせ；ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３［実施例２（３）］、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３および１４ＣＥＮＫＯ−Ｒ３［実施例３（１）］、ＲＮＲ２−１およびＳＴＯＰ−３、ＶＨ３−ＦおよびＶＨ３−Ｒ、ｇ１（ｇ２）−Ｆおよびｇ１（ｇ２）−Ｒ、ＣＨ３−Ｆ３およびＣＨ４−Ｒ２［実施例２（５）］、並びにＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｆ２(５’−ｇｃｃａｔｔｇｔｃｇａｇｃａｇｇｔａｇｔ−３’)（配列番号８５）およびＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ ＫＯ−Ｒ２(５’−ｔｃｃｃｔｃａｔｃａｇｃｃａｔｃｃｔａａ−３’)（配列番号８６）；を用い、９８℃を１０秒間、６０℃を３０秒間、７２℃を１分間のサイクルを４０回繰り返す条件のＰＣＲで確認した。

さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとして用いたＦＩＳＨによって、２つのヒト染色体断片が適切なサイズ（ＳＬＫＨ断片は約１５６Ｍｂ、１４Ｄ断片は約２１Ｍｂ）であることを確認した。

以上より、クローンＫＳＬＤ１およびＫＳＬＤ１６が、陽性クローンとして同定された。

ＳＬＫＨ断片のｃｏｓ１３８座位および１４Ｄ断片のＲＮＲ２遺伝子座に各々配置された二つのｌｏｘＰ部位の間で、部位特異的組み換えを生じさせるため、実施例２（５）の記載に従って、ＫＳＬＤ１およびＫＳＬＤ１６にＣｒｅ発現プラスミドをエレクトロポレーション（５５０Ｖ、２５μＦ）により導入した。

転座部位に形成されたＰＧＫ プロモーター−ｌｏｘＰ−ＧＦＰカセットによりＧＦＰ発現が付与されるため、既報(Kuroiwa ら, Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000)の方法に従い、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＧＦＰ陽性の細胞をソーティングすることにより、組み換え体を濃縮した。

ソーティングを２回行い、発現レベルの異なる２つのＧＦＰ発現陽性の集団を得た。実施例２（５）に記載のＰＣＲプライマーＰＧＫ２およびＧＦＰ２を用いて解析した結果、ＧＦＰ発現レベルが低い方の集団は、所望の転座を生じた構造であることが確認され、これをＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持する集団として同定した。

以上より、ＫＳＬＤ１由来のＫＳＬＤＨ１（２Ｌ）およびＫＳＬＤ１６由来のＫＳＬＤＨ１６（２Ｌ）が、ＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持し、低いＧＦＰ発現レベルを示す細胞集団から成るＤＴ４０ハイブリッド細胞株であることが確認された。

（３）ＭＭＣＴおよびＷＣＦによるＫＳＬ−ＨＡＣΔのＤＴ４０ハイブリッド細胞からＣＨＯ細胞への移入
ＭＭＣＴ法またはＷＣＦ法を用いて、ＤＴ４０ハイブリッド細胞株ＫＳＬＤＨ１（２Ｌ）またはＫＳＬＤＨ１６（２Ｌ）から、実施例３（２）記載のＫＳＬ−ＨＡＣΔをＣＨＯ細胞へ移入した。

ＭＭＣＴ法については、ＫＳＬＤＨ１（２Ｌ）またはＫＳＬＤＨ１６（２Ｌ）より精製した微小核を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２×１０^７のＣＨＯ細胞と融合し、ゼオシン（８００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびウアバイン（１０^−５ｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）により３週間の選抜を行った。

ＷＣＦ法については、２×１０^７個のＫＳＬＤＨ１（２Ｌ）またはＫＳＬＤＨ１６（２Ｌ）をＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２×１０^７個のＣＨＯ細胞と融合し、ゼオシン（８００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびウアバイン（１０^−５ｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）により３週間の選抜を行った。

ゼオシン耐性のコロニーを採取し、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲスクリーニングに供した。

ＫＳＬ−ＨＡＣΔの保持は以下のＰＣＲプライマーの組み合わせを用いて確認した。すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒの組み合わせ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒの組み合わせ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒの組み合わせ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒの組み合わせ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒの組み合わせ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３の組み合わせ、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒの組み合わせ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒの組み合わせ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒの組み合わせ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒの組み合わせ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒの組み合わせ、５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒ［以上いずれも実施例２（３）に記載］、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３および１４ＣＥＮＫＯ−Ｒ３［実施例３（１）］の組み合わせ、ＶＨ３−ＦおよびＶＨ３−Ｒの組み合わせ、ｇ１（ｇ２）−Ｆおよびｇ１（ｇ２）−Ｒの組み合わせ、ＣＨ３−Ｆ３およびＣＨ４−Ｒ２の組み合わせ、ＰＧＫ２およびＧＦＰ２の組み合わせ［以上全て実施例２（５）に記載］、並びにＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｆ２及びＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ ＫＯ−Ｒ２［実施例３（２）］の組み合わせを用いた。

さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとしたＦＩＳＨによってＫＳＬ−ＨＡＣΔの保持を確認した。ＫＳＬ−ＨＡＣΔ上のＩｇＨ、ＩｇκおよびＩｇλ遺伝子座は、実施例２（６）記載のＢＡＣクローンＲＰ１１−４１７Ｐ２４、ＲＰ１１−３１６Ｇ９およびＲＰ１１−２２Ｍ５を用いた３色ＦＩＳＨで確認した。

最後に、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎにて、実施例２（６）記載のカスタムメイドアレイによるＣＧＨ解析を行った。その結果、ＫＳＬＤＨ１（２Ｌ）のＷＣＦにより得られたクローンＫＳＬＤＣ１と、ＫＳＬＤＨ１６（２Ｌ）のＭＭＣＴで得られたクローンＫＳＬＤＣ２５との間に相同な構造があることが示唆された。

［実施例４］ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの構築
（１）ＤＴ４０ハイブリッド細胞内でのｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの構築
実施例３（２）のＫＳＬ−ＨＡＣΔと同様に、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内でｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを構築した。

ｈｙｇ^ｒカセットを含む実施例２（４）のＳＬＫＤ１７またはＳＬＫＤ１８と、ｂｓ^ｒカセットを含む実施例３（１）のＣＨ２Ｄ−４とをＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融合し、ＤＴ４０ハイブリッド細胞を作製した。

コロニーをハイグロマイシンＢ（１．５ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびブラストサイジンＳ（２０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下で３週間維持し、ＳＬＫＨ断片およびＣＨ２Ｄ断片を両方保持する細胞を選択した。コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲに供した。

ＳＬＫＨ断片の保持を、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより確認した。すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒの組み合わせ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒの組み合わせ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒの組み合わせ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒの組み合わせ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒの組み合わせ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３の組み合わせ、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒの組み合わせ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒの組み合わせ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒの組み合わせ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒの組み合わせ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒの組み合わせ、並びに５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯの組み合わせ［以上すべて実施例２（３）に記載］を用いた。

ＣＨ２Ｄ断片の保持を、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより確認した。すなわち、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３［実施例２（３）］の組み合わせ、ＲＮＲ２−１およびＳＴＯＰ−３の組み合わせ、ＶＨ３−ＦおよびＶＨ３−Ｒの組み合わせ、ｇ１(ｇ２)−Ｆおよびｇ１(ｇ２)−Ｒの組み合わせ［以上すべて実施例２（５）に記載］、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３および１４ＣＥＮＫＯ−Ｒ３の組み合わせ、ＣＨ２ ５’−ＦおよびＣＨ２ ５’−Ｒの組み合わせ、ｃＨＡＣ−Ｆ３およびｃＨＡＣ−Ｒ３の組み合わせ［以上すべて実施例３（１）に記載］、並びにＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｆ２およびＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｒ２［実施例３（２）］の組み合わせを用いた。

さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブに用いたＦＩＳＨによって、２つのヒト染色体断片が適切なサイズ（ＳＬＫＨ断片は約１５６Ｍｂ、ＣＨ２Ｄ断片は約２１Ｍｂ）であることを確認した。

以上より、クローンｃＫＳＬＤ２およびｃＫＳＬＤ２２が陽性クローンとして同定された。

ＳＬＫＨ断片［実施例２（５）］のｃｏｓ１３８座位およびＣＨ２Ｄ断片［実施例３（１）］のＲＮＲ２遺伝子座に各々配置された二つのｌｏｘＰ部位の間で、部位特異的組み換えを起こし、キメラＩｇμ遺伝子座上のｌｏｘＰ配列で挟まれたＣＡＧプロモーター−ｚｅｏ^ｒカセット［実施例３（１）］を削除するため、Ｃｒｅ発現ベクターをエレクトロポレーションによりｃＫＳＬＤ２およびｃＫＳＬＤ２２へ導入した(５５０Ｖ、２５μＦ)。

転座部位に形成されたＰＧＫプロモーター−ｌｏｘＰ−ＧＦＰカセットによりＧＦＰ発現能が付与されるため、既報(Kuroiwa ら, Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000)に記載の方法により、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いてＧＦＰ陽性細胞のソーティングを行い、組み換え体を濃縮した。

ソーティングを２回行い、実施例３（２）と同様に異なる二つのＧＦＰ発現レベルを有するＧＦＰ陽性細胞集団を取得した。

実施例２（５）のＰＣＲプライマーＰＧＫ２およびＧＦＰ２、ＰＣＲプライマーＣｒｅＣＡＧｚｅｏ−Ｆ３(５’−ｇｃｃｃｔｃａｃｃｔｔｇｃａｇａｃｃａｃｃｔｃｃａｔｃａｔ−３’)（配列番号８７）およびＣｒｅＣＡＧＺｅｏ−Ｒ３(５’−ｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃａｇｔｃｃｃｃｔｔｃｃｔｔｃｃａｔｃ−３’)（配列番号８８）を用い、９８℃を１０秒、６８℃を４分のサイクルを４０回繰り返すＰＣＲにより、キメラＩｇμ遺伝子座のＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ-ｚｅｏ^ｒカセットの削除が確認されたことから、ＧＦＰ発現レベルの低い集団は、所望の転座を生じたｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持していることが示唆された。

以上より、ｃＫＳＬＤ２由来のｃＫＳＬＤＨ２(２Ｌ)およびｃＫＳＬＤ２２由来のｃＫＳＬＤＨ２２(２Ｌ)が、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを保持し、低いＧＦＰ発現レベルを示す細胞集団から成るＤＴ４０ハイブリッド細胞株として同定された。図１７に、ＤＴ４０ハイブリッド細胞内においてｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを構築する方法の概要を示す。

（２）ＭＭＣＴ法によるｃＫＳＬ−ＨＡＣΔのＤＴ４０ハイブリッド細胞からＣＨＯ細胞への移入
実施例３（３）のＫＳＬ−ＨＡＣΔの場合と同様にして、ＤＴ４０ハイブリッド細胞株ｃＫＳＬＤＨ２(２Ｌ)またはｃＫＳＬＤＨ２２(２Ｌ)からＣＨＯ細胞へ、実施例４（１）記載のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔをＭＭＣＴ法により移入した。

ｃＫＳＬＤＨ２(２Ｌ)またはｃＫＳＬＤＨ２２(２Ｌ)より精製した微小核を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて約２×１０^７個のＣＨＯ細胞と融合し、ゼオシン（８００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびウアバイン（１０^−５Ｍ、Ｓｉｇｍａ）による３週間の選抜を行った。

ゼオシン耐性コロニーを採取し、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲスクリーニングに供した。ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの保持は、以下のＰＣＲプライマーを用いて確認した。すなわち、ＩＧＫＣ−ＦおよびＩＧＫＣ−Ｒの組み合わせ、ＩＧＫＶ−ＦおよびＩＧＫＶ−Ｒの組み合わせ、ＲＰＩＡ−ＦおよびＲＰＩＡ−Ｒの組み合わせ、ＥＩＦ２ＡＫ３−ＦおよびＥＩＦ２ＡＫ３−Ｒの組み合わせ、ｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｆおよびｃｏｓ１３８ＫＯ−Ｒの組み合わせ、ＣＡＧｐｕｒｏ−Ｆ３およびＣＡＧｐｕｒｏ−Ｒ３の組み合わせ、５５３Ｐ−Ｆおよび５５３Ｐ−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ１−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ１−Ｒの組み合わせ、ｈＶｐｒｅＢ３−ＦおよびｈＶｐｒｅＢ３−Ｒの組み合わせ、ＩｇＬ−ＦおよびＩｇＬ−Ｒの組み合わせ、３４４−Ｆおよび３４４−Ｒの組み合わせ、ｈＬ５−ＦおよびｈＬ５−Ｒの組み合わせ、３５０Ｐ−Ｆおよび３５０Ｐ−Ｒの組み合わせ、５５３ＫＯ−Ｆおよび５５３ＫＯ−Ｒの組み合わせ［以上いずれも実施例２（３）に記載］、ＶＨ３−ＦおよびＶＨ３−Ｒの組み合わせ、ｇ１(ｇ２)−Ｆおよびｇ１(ｇ２)−Ｒの組み合わせ、ＰＧＫ２およびＧＦＰ２の組み合わせ［以上いずれも実施例２（５）に記載］、１４ＣＥＮＫＯ−Ｆ３および１４ＣＥＮＫＯ−Ｒ３の組み合わせ、ＣＨ２ ５’−ＦおよびＣＨ２ ５’−Ｒの組み合わせ、ｃＨＡＣ−Ｆ３およびｃＨＡＣ−Ｒ３の組み合わせ［以上いずれも実施例３（１）に記載］、ＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｆ２およびＳＣ３５５Ｆ３Ｒ３ＫＯ−Ｒ２［実施例３（２）］の組み合わせ、並びにＣｒｅＣＡＧｚｅｏ−Ｆ３およびＣｒｅＣＡＧｚｅｏ−Ｒ３の組み合わせ［実施例４（１）］を用いた。

さらに、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプローブとして用いたＦＩＳＨにより、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔの保持を確認した。また、実施例２（６）記載のＢＡＣクローンＲＰ１１−４１７Ｐ２４、ＲＰ１１−３１６Ｇ９、およびＲＰ１１−２２Ｍ５を用いた３色ＦＩＳＨにより、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ上のＩｇＨ、ＩｇκおよびＩｇλ遺伝子座の存在を確認した。

Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎにて、実施例２（６）記載のカスタムメイドアレイを用いてＣＧＨ解析を行った。その結果、ｃＫＳＬＤ２(２Ｌ)からＭＭＣＴ法により得られたクローンｃＫＳＬＤＣ６と、ｃＫＳＬＤＨ２２(２Ｌ)からＭＭＣＴ法により得られたクローンｃＫＳＬＤＣ１５およびｃＫＳＬＤＣ２３とが、相同な構造を有していることが示された。

［実施例５］ヒトＩｇＧ生産用ＨＡＣウシを生成するためのウシ細胞株へのＨＡＣの移入
ＤＴ４０ハイブリッド細胞から、ＫＳＬ−ＨＡＣ、ＫＳＬ−ＨＡＣΔおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔのそれぞれを、ＣＨＯ細胞へＭＭＣＴ法（Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000）により移入した。ＨＡＣを含有するＣＨＯクローンを１０％ＦＢＳ(Ｇｉｂｃｏ)および０．８ｍｇ／ｍｌのゼオシンを加えたＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で、３７℃、５％のＣＯ_２条件で培養した。

ＨＡＣ含有クローンを１２本のＴ２５フラスコで拡大培養した。細胞密度が８０−９０％に到達したのち、コルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ、Ｓｉｇｍａ）を終濃度０．１μｇ／ｍｌになるように培地に添加した。

３日後培地を１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎＢ、Ｓｉｇｍａ）を加えたＤＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)に交換した。フラスコを８０００回転で６０分間遠心分離し、微小核を回収した。微小核を８、５、３−μｍフィルター（Ｃｏｓｔａｒ）を通して精製し、ＤＭＥＭ培地に再縣濁した。得られた微小核を後述のウシ繊維芽細胞との融合に使用した。

ウシ胎児線維芽細胞(ＩＧＨＭ^−／−ＩＧＨＭＬ１^−／−、Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009)を、１５％ＦＢＳ(Ｈｙｃｌｏｎｅ)を加えたα−ＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)中、３８．５℃、６．５％ＣＯ_２の条件下で培養した。繊維芽細胞はＴ１７５フラスコで拡大培養した。細胞密度が７０−８０％に到達したところで細胞を０．０５％トリプシンでフラスコから剥離した。該繊維芽細胞をＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、微小核懸濁液上に重層した。

微小核−線維芽細胞懸濁液を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を添付文書のプロトコールに従ってペレットに添加し、微小核とウシ線維芽細胞とを融合した。

続いて、融合細胞を２４−ｗｅｌｌプレート１０枚に播種し、１５％ＦＢＳを添加したα-ＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、０．６ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地に交換した。

抗生物質存在下で約２週間培養した後、薬剤耐性を有する融合細胞を選択した。

選択した各種ＨＡＣを含有する融合細胞をクロマチンドナーとして用い、国際公開第２００２／０５１９９７号に記載のクロマチントランスファー法により各種ＨＡＣ含有ウシを作製した。

［実施例６］ＨＡＣウシ血清中のにおけるヒトＩｇＧレベルの評価
作製した各種のＨＡＣウシ血清中のヒトＩｇＧレベルを既報（Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に記載の方法で測定した。６月齢での各ＨＡＣウシ血清中の総ヒトＩｇＧ量を以下の図１８に示す。また、６月齢の各種ＨＡＣウシ血清中の総ヒトＩｇＧ量の平均値を以下の表４に示す。

図１８および表４に示すように、ＫＳＬ−ＨＡＣおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔを有するウシでは、κＨＡＣを有するウシに比べて、血清中のヒトＩｇＧ生産量が有意に増加していた。

また、既報（Kuroiwaら、Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に従い、ＨＡＣウシの末梢血およびリンパ節におけるＢ細胞プロファイルをフローサイトメトリーにより解析した。

その結果、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔウシの末梢血では、ＩｇＭを発現しているＢ細胞の数がκＨＡＣウシの末梢血に比べて増加していた。また、ＫＳＬ−ＨＡＣウシおよびｃＫＳＬ−ＨＡＣΔウシのリンパ節でもＩｇＭを発現しているＢ細胞の数がκＨＡＣウシのリンパ節に比べて増加していた。

［実施例７］ＨＡＣウシによる炭疽菌防御抗原（ＰＡ）に対する特異的ヒトＩｇＧの生産
ＨＡＣウシが、既知の単一抗原に対し、ヒトＩｇＧによる抗原特異的な液性応答を惹起し得ることを評価するため、炭疽菌防御（ＰＡ）抗原を用いて検討を行った。既報の記載（Kuroiwaら、 Nat Biotechnol. 27: 173-181, 2009）に従って、３頭のＫＳＬ−ＨＡＣ／ＩＧＨＭ^−／−ＩＧＨＭＬ１^−／−ウシ（Ｎｏ．１８５３、Ｎｏ．１８５４、Ｎｏ．１８５７）をＰＡで免疫し、ＰＡ特異的ヒトＩｇＧの力価を測定した。結果を表５に示す。

表５に示すように、全てのＨＡＣウシがＰＡ特異的ヒトＩｇＧを生産した。また、Ｎｏ．１８５７においては、免疫を繰り返すごとにＰＡ特異的ヒトＩｇＧの生産量が増大し、免疫5回目の時点では１２１１２５Ｕ／ｍｇ ＩｇＧを生産した。

［実施例８］ＨＡＣウシによるＴ細胞表面膜タンパク質混合物に対する特異的ヒトＩｇＧの生産
ＨＡＣウシが、未知の複合抗原に対し、ヒトＩｇＧによる抗原特異的な液性応答を惹起し得ることを評価するため、Ｔ細胞表面膜タンパク質混合物（ＣＥＭ細胞膜調製画分）を抗原として用い、検討を行った。

（１）ＣＥＭ細胞の培養
１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の恒湿恒温槽中で、ヒトＴ細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ）を２２５ｃｍ^２フラスコにてコンフルエント（２×１０^６個／ｍＬ）になるまで増殖させた。

ベントキャップ付８５０ｃｍ^２ローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へ１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５００ｍＬを分注し、該細胞を密度２×１０^５個／ｍＬで播種した。該ローラーボトルをローラーボトル培養装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へ設置し、５日間培養した。ＣＥＭ細胞をローラーボトルから回収するため、培養物を２Ｌ容滅菌ポリプロピレン製バイオボトル（Ｎａｌｇｅｎ）に注入した。

次に、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ１２ＢＰを用いた４５０×ｇ、３０分間、２−８℃の遠心分離により、該細胞をペレットとした。滅菌冷却ＰＢＳに該細胞ペレットを再懸濁し、洗浄する操作を２回行った。

最終洗浄後、１ｍＭ ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、各種プロテアーゼ阻害剤［１．６μＭ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、４０μＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２ｍＭ ＡＥＢＳＦ、０．１ｍＭ Ｂｅｓｔａｔｉｎ、３０μＭ Ｅ−６４、２０μＭ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）］および２５．６μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）を含む冷却破砕緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）へ、該細胞ペレットを密度２×１０^８個／ｍＬで懸濁した。そして該細胞を直ちに液体窒素で凍結させた。後に使用するまで凍結細胞を−８０℃にて保存した。

（２）ショ糖密度勾配遠心分離法によるＣＥＭ細胞膜の単離
凍結したＣＥＭ細胞を冷却水槽にて融解した。細胞膜を破砕するため、ウルトラソニックプロセッサー（Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を用いて、４０アンプ、３０秒間の条件で、ＣＥＭ細胞を冷却水槽にて２−３回超音波処理した。

滅菌ウルトラクリアー遠沈管中の破砕緩衝液の下部に、冷却した４１％(ｗ／ｖ)ショ糖溶液を用いて該破砕物をピペットで注入した後、ベックマン社超遠心分離機により８３，０００×ｇ（ＳＷ ３２ Ｔｉローター）、４℃で１時間の遠心分離を行った。ショ糖層と破砕緩衝液層の間に形成された、ＣＥＭ細胞膜を含む雲状の中間層を回収して、ポリカーボネイト製超遠沈管へ移し、滅菌冷却ＰＢＳを用いて１：３の割合になるように希釈した。

８０，０００×ｇ（７０．１ Ｔｉローター）、４℃で５０分間の超遠心分離を行ってＣＥＭ膜をペレットとした。滅菌パスツールピペットで注意深く上清を除去した後、滅菌冷却ＰＢＳを用いて、ＣＥＭ膜を４℃で５０分間の超遠心分離により１回洗浄した。最後に、ＣＥＭ細胞膜をＰＢＳに再懸濁した。

膜ペレットを破砕するため、ウルトラソニックプロセッサーを用いて、２０アンプ、３０秒間の条件で、該ＣＥＭ細胞膜を冷却水槽にて超音波処理した。後に使用するまでＣＥＭ膜破砕物を−８０℃にて保存した。

（３）ＣＥＭ膜の予備免疫
三頭のＫＳＬ−ＨＡＣ／ＩＧＨＭ^−／−ＩＧＨＭＬ１^−／−ウシ（Ｎｏ．１８７４、Ｎｏ．１８８４、Ｎｏ．１８８６）および二頭のｃＫＳＬ−ＨＡＣΔ／ＩＧＨＭ^−／−ＩＧＨＭＬ１^−／−ウシ（Ｎｏ．１９２２、Ｎｏ．１９２３）に対し、３ｍｇ／回のＣＥＭ膜調製物で免疫した。

該ＣＥＭ膜調製物は、サポニン由来免疫誘導物質ＱｕｉｌＡ(Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ)との水中油型エマルジョンとしたＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２５アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ）により調製された。ウシは４週間の間隔をおいて４回免疫された。

ワクチンを頸部に筋肉注射により接種した（２ｍＬ／回）。抗体力価の測定のため、各回の免疫前および免疫後１０日目と１４日目に血清試料を採取した。血液を血清分離チューブへ静置して凝固させた後、遠心分離により血清を分離した。さらに血清を０．５−１ｍＬずつ分注し、アッセイを行うまで凍結保存した。抗ＣＥＭ抗体の力価をＣＥＭ細胞特異的ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより決定した。

（４）ＣＥＭ細胞特異的ＥＬＩＳＡアッセイ
血清試料より５％ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）緩衝液を用いて４通りの希釈系列を調製した。標準曲線を作成するため、予め最終力価が決定されているCEM免疫動物１頭から得た高力価の血清を標品とし、５％ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳを用いて、２７５倍から６７，１３９倍まで２．５倍ずつ希釈された７段階の濃度系列を調製した。

終濃度の逆数を力価の単位として採用し、標品の場合に決定した最終力価を５５，０００ユニットとした。陽性対照血清および陰性対照血清についても５％ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳで希釈系列を調製し、アッセイの整合性を確認するための内部標準として用いた。

ＣＥＭ特異的ヒトＩｇＧの力価を決定するため、Ｕ字底９６穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）へ試料（校正用標品血清希釈液、陽性対照血清希釈液、陰性対照血清希釈液、測定試料血清希釈液）５０μＬを２組ずつ注入し、さらにＣＥＭ細胞（４×１０^６個／ｍＬ）５０μＬを添加した。

該プレートを４℃で６０分間静置した後、１００−２００μＬのＰＢＳで３回洗浄することにより非結合のタンパク質を除いた。各洗浄操作の後、プレートを２８５０×ｇで５分間遠心分離し、各穴より上清を注意深く吸引除去した。３回の洗浄操作後、５％ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｌｏｃｋ／ＰＢＳ緩衝液で５０，０００倍希釈したＨＲＰ標識ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬを各穴に加え、細胞ペレットをＨＲＰ溶液に再懸濁した。

該プレートを４℃で３０分間静置した後、上記と同様にＰＢＳで３回洗浄した。最後に、該プレートへＴＭＢ＋Ｈ_２Ｏ_２基質混合液（ＫＰＬ）１００μＬ／穴を分注することにより、結合した抗ＣＥＭ抗体を検出し、さらに該プレートを２５℃で１５分間静置した。該発色反応を１０％リン酸１００μＬ／穴により停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて４５０ｎｍを測定した。

７段階の希釈系列の値より４パラメーター標準曲線を作成し、該曲線へＧｅｎ５Ｓｅｃｕｒｅソフトウェアで内挿することにより血清試料の値を算出した。各測定血清試料に対し３−４回の検定希釈を行うことで平均力価を算出した。

結果を図１９に示す。３回目の抗原投与後にはウシ血清中に抗原特異的ヒトＩｇＧが、総ヒトＩｇＧ中、ＫＳＬ−ＨＡＣウシで約１０００〜２０００Ｕ／ｍｇ ＩｇＧ、ｃＫＳＬ−ＨＡＣΔウシでは約５５０Ｕ／ｍｇ ＩｇＧ生産されていることが示された。

［参考例］
参考例１．ヒト２番、１４番および２２番染色体を保持するマウスＡ９細胞の樹立
国際公開第１９９８／０３７７５７号に記載の方法に従い、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（理化学研究所細胞バンク、寄託番号ＲＣＢ０２５１）へプラスミドｐＳＴｎｅｏ［Katohら, Cell Structure and Function, 12, 575-580, 1987;Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏf Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＪＣＲＢ）バンク、寄託番号ＶＥ０３９］を導入し、形質転換細胞を取得した後、該形質転換細胞とマウス繊維芽細胞Ａ９（Oshimuraら, Environmental Health Perspectives, 93, 57-58, 1991;ＪＣＲＢ細胞バンク、寄託番号ＪＣＲＢ０２１１）との細胞融合を行い、雑種細胞を作製する。

次に、国際公開第１９９８／０３７７５７号に記載の方法に従って、該雑種細胞より微小核を調製してマウスＡ９細胞と融合し、得られたクローンよりゲノムＰＣＲ、ゲノムサザン解析、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などにより、目的とするヒト２番、１４番および２２番染色体を含む各クローンを同定する。

参考例２．ヒト２番染色体断片を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞ｋＴＬ１の作製
国際公開第２００８／０１３０６７号に記載の微小核融合法により、参考例１で得たヒト２番染色体を含むＡ９細胞よりニワトリＢ細胞ＤＴ４０（ＪＣＲＢ細胞バンク、寄託番号ＪＣＲＢ２２２１）へヒト２番染色体の導入を行う。

次に、国際公開第２００８／０１３０６７号に記載のテロメアトランケーション法を用いて、該ＤＴ４０ハイブリッド細胞へターゲティングベクターｐＴＥＬＰｕｒｏＣＤ８Ａ（Kuraiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000）を導入することにより、ヒト２番染色体上のＣＤ８Ａ遺伝子座にテロメア配列を挿入し、該挿入部位にて染色体の断裂を生じさせる。本操作により、ＣＤ８Ａ遺伝子座からテロメア端に至る領域を欠失したヒト２番染色体を含む、ＤＴ４０ハイブリッド細胞ｋＴＬ１を作製することができる。

参考例３．ヒト２２番染色体を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞５２−１８の作製
国際公開第２００８／０１３０６７号に記載の微小核融合法により、参考例１で得たヒト２２番染色体を含むＡ９細胞よりニワトリＢ細胞ＤＴ４０（ＪＣＲＢ細胞バンク、寄託番号ＪＣＲＢ２２２１）へヒト２２番染色体の導入を行う。本操作により、ヒト２２番染色体を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞５２−１８を作製することができる。

参考例４.ヒト１４番染色体断片を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞Ｒ５６の作製
黒岩らの報告（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000）の記載に従って、ヒト１４番染色体断片ＳＣ２０を含むＤＴ４０細胞（産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５８３）へターゲティングベクターｐＲＮＲ２ｌｏｘＰｂｓｒ（Kuroiwaら, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000）を導入することにより、ヒト１４番染色体上のＲＮＲ２遺伝子座にｌｏｘＰ配列を挿入する。本操作により、ＲＮＲ２遺伝子座にｌｏｘＰ配列を有するＳＣ２０を含む、ＤＴ４０ハイブリッド細胞Ｒ５６を作製することができる。

参考例５．ヒト１４番染色体を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞＃１４／ＤＴ４０の作製
国際公開第２００８／０１３０６７号に記載の微小核融合法により、参考例１で得たヒト１４番染色体を含むＡ９細胞よりニワトリＢ細胞ＤＴ４０（ＪＣＲＢ細胞バンク、寄託番号ＪＣＲＢ２２２１）へヒト１４番染色体の導入を行う。本操作により、ヒト１４番染色体を含むＤＴ４０ハイブリッド細胞＃１４／ＤＴ４０を作製することができる。

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２００９年１１月１７日付けで出願された米国仮出願（６１／２６１，９３５）に基づいており、その全体が引用により援用される。

本発明により、ヒト抗体重鎖をコードする遺伝子、ヒト抗体軽鎖をコードする遺伝子および非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子を含み、かつ動物に導入した場合に、高効率でヒト抗体を作製することのできるヒト人工染色体ベクターが提供される。本発明のヒト人工染色体ベクターにより作製された動物に、任意の抗原を免疫することにより、ヒトポリクローナル抗体を大量供給することが可能となる。

Claims (8)

1. ヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト抗体軽鎖遺伝子およびヒト抗体代替軽鎖遺伝子を含む、ヒト人工染色体ベクター。
2. ヒト抗体代替軽鎖遺伝子がＶｐｒｅＢ遺伝子およびλ５遺伝子である、請求項１記載のヒト人工染色体ベクター。
3. 非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子を含む、請求項１または２記載のヒト人工染色体ベクター。
4. 非ヒト動物由来のＩｇＭ重鎖定常領域の遺伝子がウシＩＧＨＭ由来である、請求項３記載のヒト人工染色体ベクター。
5. 請求項１または２に記載のヒト人工染色体ベクターを有する動物。
6. 請求項３または４に記載のヒト人工染色体ベクターを有するウシ。
7. 請求項５記載の動物に目的の抗原を投与し、該抗原特異的なヒト抗体を該動物の血清中に生成、蓄積させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を生産する方法。
8. 請求項６記載のウシに目的の抗原を投与し、該抗原特異的なヒト抗体を該ウシの血清中に生成、蓄積させ、該血清中より該抗原特異的なヒト抗体を回収することを含む、ヒト抗体を生産する方法。

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