JPWO2019092896A1

JPWO2019092896A1 - アッカーマンシア・ムシニフィラ増殖材

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Publication number: JPWO2019092896A1
Application number: JP2019551870A
Authority: JP
Inventors: 睦生市島; 寛人森田
Original assignee: Asahi Group Holdings Ltd
Current assignee: Asahi Group Holdings Ltd
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2020-12-03
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: TWI772384B; WO2019092896A1; TW201918251A; JP7171602B2

Abstract

本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させることが可能な新たな増殖材を提供することを目的とする。ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖材。

Description

本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させることが可能な増殖材に関する。

アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）は、０．６〜１．０μｍ程度の大きさを有し、芽胞を作らず、運動性を有さない偏性嫌気性のグラム陰性細菌である（非特許文献１）。アッカーマンシア・ムシニフィラは、ヒトをはじめとする多くの哺乳動物の腸内に通常存在する真性細菌である。

近年、アッカーマンシア・ムシニフィラは肥満や糖尿病の人の腸内においてはその量が減少していること、また、アッカーマンシア・ムシニフィラの投与によりマウスにおける脂肪増加の改善やインスリン抵抗性の改善が確認され（非特許文献２，３）、アッカーマンシア・ムシニフィラと肥満等の障害との関連性が指摘されている。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラは、虫垂炎の重症度と反比例していること、また、潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症を伴う疾患の患者腸内においては、その量が減少していることが報告されており（非特許文献４，５）、アッカーマンシア・ムシニフィラは抗炎症作用を有すると考えられている。

このため、これらの疾患や障害を予防又は改善するための有望な手段として、アッカーマンシア・ムシニフィラに対する関心が高まっている。

腸内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの数を、プレバイオティクスの観点から増やそうとする試みが行われている。例えば、特許文献１には、ポリデキストロースを含む組成物を摂取したヒトの腸内菌叢において、アッカーマンシア属細菌の比率が増加したことが記載されている。特許文献２には、キシロースを投与したマウスの腸内において、アッカーマンシア属細菌が増殖したことが記載されている。特許文献３には、レプチン欠損肥満マウス及び高脂肪摂食マウスに認められるアッカーマンシア・ムシニフィラ量の減少が、フラクトオリゴ糖を摂取させることにより回復したことが記載されている。特許文献４には、水溶性酢酸セルロースを摂取したラットの盲腸内容物の細菌叢において、アッカーマンシア属細菌の比率が増加したことが記載されている。非特許文献５には、高分子プロシアニジンを摂取したマウスの腸内菌叢において、アッカーマンシア属細菌の比率が増加したことが記載されている。

しかしながら、当該分野においては依然として、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させるための新たな手段が切望されている。

特表２０１４−５３２７１０号公報ＷＯ２０１６／１２２８８９公報特表２０１６−５０３４１８号公報ＷＯ２０１５／１４６８５３公報

ＩｎｔＪＳｙｓｔａｎｄＥｖｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１４６９−１４７６（２００４）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２３，１０７−１１３，２０１７ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０，９０６６−９０７１（２０１３）Ｇｕｔ．２０１１Ｊａｎ；６０（１）：３４−４０ＡｍＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１０Ｎｏｖ；１０５（１１）：２４２０−８

本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させることが可能な新たな増殖材を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、一部のポリフェノールにアッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させる作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖材。
［２］ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、［１］の増殖材。
［３］ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、［１］又は［２］の増殖材。
［４］飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物である、［１］〜［３］のいずれかの増殖材。
［５］ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む増殖材を用いて培養されたアッカーマンシア・ムシニフィラを含む、培養物。
［６］ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、[５]の培養物。
［７］増殖材がケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、［５］又は［６］の培養物。
［８］飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物である、［５］〜［７］のいずれかの培養物。
［９］アッカーマンシア・ムシニフィラを、ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む増殖材を用いて培養することを含む、アッカーマンシア・ムシニフィラ及び／又はその培養物の製造方法。
［１０］ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、［９］の製造方法。
［１１］増殖材がケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、［１０］の製造方法。

本発明によれば、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させることが可能な新たな増殖材を提供することができる。

図１−１は、ケルセチン配糖体の培地への添加による、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖への影響を評価した結果を示すグラフ図である。結果は、対照の増殖量を１００％とする相対値（増殖比率［％］）にて示す。ｎ＝４。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｖｓ対照、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定）図１−２は、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、又はタンニン酸の培地への添加による、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖への影響を評価した結果を示すグラフ図である。結果は、対照の増殖量を１００％とする相対値（増殖比率［％］）にて示す。ｎ＝４。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｖｓ対照、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定）図２は、ルチン、又はヘスペリジンの経口摂取による、生体内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖への影響を評価した結果を示すグラフ図である。結果は、水投与群（対照）、ルチン投与群、ヘスペリジン投与群より採取した糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラＤＮＡの定量結果を示す。ｎ＝４。＊＊：ｐ＜０．０５，＊：ｐ＜０．１（ｖｓ対照、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定）

１．増殖材
本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖材に関する。

「アッカーマンシア・ムシニフィラ」は公知であり、ＭｕｒｉｅｌＤｅｒｒｉｅｎら、ＩｎｔＪＳｙｓｔａｎｄＥｖｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：１４６９−１４７６．（２００４）等に記載される公知の菌学的性質に基づいて特徴付けられる。ＭｕｒｉｅｌＤｅｒｒｉｅｎら（上掲）には、基準株（ＡＴＣＣＢＡＡ−８３５株）について、グラム陰性、偏性嫌気性、非運動性、無芽胞、卵形、サイズ０．６〜１．０μｍ、ムチン添加培地中にて増殖、及び莢膜形成あり等の特徴を有することが記載されている。

また、アッカーマンシア・ムシニフィラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに開示されており、ＡＹ２７１２５４、ＮＲ＿０７４４３６として登録されている。これらの配列情報を利用して、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の分析を行うことにより、アッカーマンシア・ムシニフィラを同定することができる。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の分析は、定量的ＰＣＲ法、ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ法、ＦＩＳＨ法、１６ＳｒＤＮＡクローニングライブラリー法、Ｔ−ＲＦＬＰ法、ＦＩＳＨ−ＦＣＭ法、塩基配列決定法等の公知の手法に基づいて行うことができる。例えば、定量的ＰＣＲ法によれば、アッカーマンシア・ムシニフィラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の公知の塩基配列情報に基づいて、当該菌に特異的なプライマーを作製する。選択された菌より抽出されたＤＮＡを鋳型として、当該プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、意図されたサイズのＰＣＲ増幅産物の有無に基づいて当該菌がアッカーマンシア・ムシニフィラであるか否かを判断することができる。特異的なプライマーの設計やＰＣＲ条件の決定は、定法に従って行うことができる（バイオ実験イラストレイテッド３本当にふえるＰＣＲ：細胞工学別紙目で見る実験ノートシリーズ；中山広樹著株式会社秀潤社）。

本発明において「増殖材」とは、インビトロ又は哺乳動物の生体内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援し、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることを可能とする増殖作用を有する組成物を意味する。

本発明の増殖材は、ケルセチン配糖体、イソラムネチン（３’−О−メチルケルセチンとも称される）、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸、からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む。「一以上のポリフェノール」とは、上記より選択される１種のポリフェノール、あるいは、上記より選択される２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種又は１４種のポリフェノールの組み合わせを意味する。

ケルセチン配糖体は、ケルセチンに糖（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、フルクトース、グルクロン酸、キシロース、マルトース、ラクトース、ゲンチオビオース、ルチノース等）がグリコシド結合した構造を有する化合物であればよく、特に限定はされない。本発明に用い得るケルセチン配糖体としては、特に限定はされないが、例えば、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン（ケルセチン３−ルチノシドとも称される）、及びペルタトシド（ケルセチン３−О−α−アラビノピラノシル−β−グルコピラノシドとも称される）が挙げられる。好ましくは、ケルセチン配糖体は、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上（例えば、１種、又は２種、３種、４種、もしくは５種の組み合わせ）を含む。ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドはそれぞれ、以下の構造式で表される。

イソラムネチンはケルセチンのメチル化体であり、以下の構造式で表される。

シアニジングルコシドは、シアニジン配糖体の一種であり、以下の構造式で表される。

ヘスペリジンは、フラバノン配糖体の一種であり、以下の構造式で表され、ヘスペレチンは、ヘスペリジンのアグリコンであり、以下の構造式で表される。

アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、及びノビレチンはそれぞれ、フラボン配糖体のアグリコンであり、以下の構造式で表される。

タンニン酸は、グルコースに複数の没食子酸が結合してなるガロタンニンの一種であり、以下の構造式で表される。

これらのうち特に、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含むことが好ましい。ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、及びタンニン酸は、上記の他のポリフェノールと比べて、高い増殖作用を有する。

本発明において上記一以上のポリフェノールは、植物から抽出された天然物であってもよいし、化学合成されたものであってもよい。天然物である場合、その原料となる植物や抽出方法は特に限定されず、上記一以上のポリフェノールは植物から単離されたものや、抽出物の形態で用いることができる。

増殖材には上記一以上のポリフェノールを、０．００１〜９９重量％、好ましくは０．００１〜９０重量％、より好ましくは０．００１〜８０重量％、さらに好ましくは０．００１〜７０重量％の範囲より選択される量にて含めることができるが、その量は特に限定されず、ポリフェノールの種類や数、増殖材の形態や使途に応じて変化し得る。増殖材に２種以上のポリフェノールの組み合わせが含まれる場合、各ポリフェノールは任意の割合で含めることができる。本発明の増殖材は、液体、半固体、固体（粉体、粒体等）等、使途に適した任意の形態とすることができるが、例えば、増殖材が液体の形態を有する場合、１種のポリフェノールにつき、５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上となる量を含めることができる。上限は、特に限定されないが、例えば、２０００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１５００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは５００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。

増殖材に含まれる上記一以上のポリフェノールの量は、公知の質量分析法（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法、高速液体クロマトグラフィー法等）を用いて定量することができる。

本発明の増殖材には、上記一以上のポリフェノールに加えて、微生物培養に通常使用される炭素源、窒素源、無機塩類等を含めることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、スターチ、糖蜜等を利用することができ、窒素源としては、例えばペプトン、酵母エキス、トリプトン、カゼイン加水分解物、肉エキス、硫安等を利用することができ、無機塩類としては、燐酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、鉄、マンガン等の塩類を利用することができる。さらに、必要に応じて、寒天やゼラチン、ビタミン類、アミノ酸類、界面活性剤等を含めることができる。

また、本発明の増殖材には、アッカーマンシア属菌の増殖又は腸内比率の増大に効果を有することが知られているその他の成分を含めることができる。このような成分としては、ムチン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＭｕｒｉｅｌＤｅｒｒｉｅｎら（上掲））、ポリデキストロース（特表２０１４−５３２７１０）、キシロース（ＷＯ２０１６−１２２８８９）、フラクトオリゴ糖（特表２０１６−５０３４１８）、水溶性酢酸セルロース（ＷＯ２０１５／１４６８５３）、高分子プロシアニジン（ＭａｓｕｍｏｔｏＳｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，６，３１２０８（２０１６））等が挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の増殖材は、アッカーマンシア・ムシニフィラを培養するための培地として、又は、基本培地に添加して利用することができ、インビトロにおけるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援し、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることができる。

あるいは、本発明の増殖材は、医薬や飲食品、あるいは飼料又は飼料添加物の形態とすることができ、哺乳動物に投与又は摂取させることができる。

本発明の増殖材は、医薬や飲食品の製造において通常用いられている、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等の添加剤を含めることができ、企図される投与経路や摂取方法に適した剤型又は形態を有する医薬や飲食品として製造、提供することができる。

賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、ブドウ糖、コーンスターチ、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステル等のシュガーエステル類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリルアルコール、粉末植物油脂等の硬化油、サラシミツロウ等のロウ類、タルク、ケイ酸、ケイ素等が挙げられる。

結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

崩壊剤としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

また、本発明において利用可能な、医薬や飲食品の製造において通常用いられている添加剤の例としては、各種油脂（例えば、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油等の植物油、牛脂、イワシ油等の動物油脂）、生薬（例えばロイヤルゼリー、人参等）、アミノ酸（例えばグルタミン、システイン、ロイシン、アルギニン等）、多価アルコール（例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール、例としてソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール等）、天然高分子（例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテン又はグルテン加水分解物、レシチン、澱粉、デキストリン等）、ビタミン（例えばビタミンＣ、ビタミンＢ群等）、ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等）、食物繊維（例えばマンナン、ペクチン、ヘミセルロース等）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等）、精製水、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、湿潤剤、溶解補助剤、懸濁化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、香料、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料等が挙げられる。

医薬や飲食品の剤型又は形態は、特に制限されない。医薬としては例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤、坐剤等の剤型とすることができるが、好ましくは、経口剤である。液剤、懸濁剤等の液体製剤は、凍結乾燥化し保存し得る状態で提供され、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用されるものであってもよい。また錠剤等の固形の剤形を有するものは、必要に応じてコーティングを施されていてもよいし（例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠等）、公知の技術を使用して、徐放性製剤、遅延放出製剤又は即時放出製剤等の放出が制御された製剤としてもよい。

飲食品としては例えば、錠菓、錠剤、チュアブル錠、錠剤、粉剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の形態を有する健康飲食品（サプリメント、栄養補助食品、健康補助食品、栄養調整食品等）、清涼飲料、茶飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料、野菜飲料、果汁飲料、醗酵野菜飲料、醗酵果汁飲料、発酵乳飲料（ヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、菓子（例えば、ビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、チューインガム、タブレット）、ゼリー等の形態とすることができる（これらに限定はされない）。

飲食品は、保健機能食品（特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）、栄養機能食品、機能性表示食品や、健康食品、美容食品等とすることができる。

また、本発明の増殖材は、ヒト用の飲食品だけでなく、家畜、競走馬、ペット等の飼料又は飼料添加物の形態とすることもできる。

本発明の増殖材は飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物として、哺乳動物（例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）、好ましくはヒトに投与又は摂取させることができ、投与又は摂取された哺乳動物の生体内におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援し、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることができる。

本発明の増殖材の投与量又は摂取量は、対象の年齢及び体重、投与経路、投与・摂取回数、含まれるポリフェノールの種類や数等の要因に応じて変化し得、任意の投与量又は摂取量を採用し得る。例えば、経口的に投与又は摂取する場合には、含まれる１種のポリフェノールにつき、１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇより選択される量を１回又は複数回（例えば、２〜５回、好ましくは２〜３回）に分けて投与又は摂取することができる。２種以上のポリフェノールの組み合わせが含まれる場合、各ポリフェノールが、１日当たり上記範囲より選択される量にて１回又は複数回に分けて投与又は摂取されればよい。

本発明の増殖材は、微量かつ短期間で効果を奏することができるが、長期間にわたって投与又は摂取することができる。例えば、本発明の増殖材を、上記用法用量にしたがい、１週間以上、２週間以上、１か月以上、２か月以上、６ヶ月以上、１年以上、又はそれ以上の期間にわたって継続して投与又は摂取することができる。

２．培養物
また、本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラの培養物及びその製造方法に関する。

本発明において「培養物」とは、上記増殖材を用いて培養されたアッカーマンシア・ムシニフィラ、ならびに、培地成分及び代謝産物を含む組成物である。培地成分には、好ましくは、上記一以上のポリフェノールが含まれる。

本発明において「アッカーマンシア・ムシニフィラ」は、哺乳動物（例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）、好ましくはヒトの腸内より単離されたものを用いることができる。アッカーマンシア・ムシニフィラは公知の手法（ＭｕｒｉｅｌＤｅｒｒｉｅｎら（上掲））に準じて、哺乳動物の糞便、糞便物、又は便を含むサンプルを、ムチンを添加した培地中嫌気条件下での培養し、生育した菌体より単離することができる。

本発明においては、アッカーマンシア・ムシニフィラに分類される任意の菌株、又はその変異株もしくは育種株を利用することができる。本発明において利用可能なアッカーマンシア・ムシニフィラ株としては、ＡＴＣＣＢＡＡ−８３５株、ＹＬ４４株、ＪＣＭ３０８９３株などが挙げられるが、これらに限定はされない。

本発明の培養物は、アッカーマンシア・ムシニフィラを上記増殖材を用いて培養することにより得ることができる。増殖材はアッカーマンシア・ムシニフィラを培養するための培地として、又は、基本培地に添加して利用することができる。培地には、１種のポリフェノールにつき、５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上となる量を含めることができる。上限は、特に限定されないが、例えば、２０００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１５００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１０００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは５００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。培地には、必要に応じてさらに、寒天やゼラチンを添加してもよい。

培養は、ｐＨ５．５〜８．０、好ましくはｐＨ６．５、２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃にて、嫌気条件下で行うことができる。「嫌気条件」とは、アッカーマンシア・ムシニフィラが増殖可能な程度に低酸素環境であればよく、例えば、嫌気チャンバー、嫌気ボックス、脱酸素剤を入れた密閉容器もしくは培養容器等を用いて、嫌気条件とすることができる。

培養は、静置培養、振とう培養、タンク培養等の任意の形式で行うことが可能であり、また、培養時間は、特に制限されないが、例えば３時間〜７日間とすることができる。培養は、バッチ式行ってもよいし、連続式で行ってもよい。

培養後、得られた培養物をそのまま本発明の培養物として使用してもよいし、あるいは培養物よりアッカーマンシア・ムシニフィラを濃縮又は粗精製したものを本発明の培養物として使用してもよい。培養物からの菌体の濃縮又は粗精製は任意の手段を用いて行うことができ、例えば、遠心分離や濾過等を用いて行うことができる。

培養物は、低温殺菌に付してもよい。培養物の低温殺菌は、６０℃〜８０℃、好ましくは７０℃の温度にて、３０分間程度加熱することにより行うことができる。

上記培養法によれば、増殖材により、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援し、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることができ、アッカーマンシア・ムシニフィラの培養物を効率的に製造することができる。

本発明の培養物は、医薬や飲食品の製造において通常用いられている、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等の添加剤を含めることができ、企図される投与経路や摂取方法に適した剤型又は形態を有する医薬や飲食品として製造、提供することができる。賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等の添加剤は上述のものを利用することができ、上述の剤型又は形態を有する飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物を得ることができる。

本発明の培養物は飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物として、哺乳動物（例えばヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）、好ましくはヒトに投与又は摂取させることができ、投与又は摂取された哺乳動物の生体内における、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることができる。

本発明の培養物の投与量又は摂取量は、対象の年齢及び体重、投与経路、投与・摂取回数等の要因に応じて変化し得、任意の投与量又は摂取量を採用し得る。例えば、経口的に投与又は摂取する場合には、アッカーマンシア・ムシニフィラの菌体の数にして、１日当たり１×１０^５個／ｋｇ〜１×１０^１５個／ｋｇ、好ましくは１日当たり１×１０^６個／ｋｇ〜１×１０^１４個／ｋｇ、より好ましくは１日当たり１×１０^８個／ｋｇ〜１×１０^１３個／ｋｇから選択される量を１回又は複数回（例えば、２〜５回、好ましくは２〜３回）に分けて投与又は摂取することができる。

本発明の培養物は、微量かつ短期間で効果を奏することができるが、長期間にわたって投与又は摂取することができる。例えば、本発明の培養物を、上記用法用量にしたがい、１週間以上、２週間以上、１か月以上、２か月以上、６ヶ月以上、１年以上、又はそれ以上の期間にわたって継続して投与又は摂取することができる。

本発明の培養物は、上記増殖材と一緒に投与又は摂取されてもよい。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１．ポリフェノール添加によるアッカーマンシア・ムシニフィラ増殖効果
１．方法
（１）菌株
アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株は、ＭｕｒｉｅｌＤｅｒｒｉｅｎら（上掲）に記載の手法に従って、健常なヒト（成人）の糞便試料より、ムチン添加培地を使用してクローニングを行い、得られた菌株について１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ＧｅｎＢａｎｋに登録されたアッカーマンシア・ムシニフィラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（ＡＹ２７１２５４）との配列比較に基づいて、アッカーマンシア・ムシニフィラであることが確認された菌株を用いた。

（２）培地の調製
アッカーマンシア・ムシニフィラの培養培地（本培地）は、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ２３，１０７−１１３，２０１７に記載の合成培地に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で様々な濃度に希釈した各ポリフェノールを、培地全体の１質量％となる量にて添加した。

前記合成培地は公知の手法に準じて、１Ｌあたり、０．４ｇＫＨ_２ＰＯ_４、０．５３ｇＮａ_２ＨＰＯ_４、０．３ｇＮＨ_４Ｃｌ、０．３ｇＮａＣｌ、０．１ｇＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．１１ｇＣａＣｌ_２、１ｍｌアルカリ性微量元素溶液（アルカリ性微量元素溶液は以下の組成を有する：０．１ｍＭＮａ_２ＳｅＯ_３、０．１ｍＭＮａ_２ＷＯ_４、０．１ｍＭＮａ_２ＭｏＯ_４、及び１０ｍＭＮａＯＨ）、１ｍｌ酸性微量元素溶液（酸性微量元素溶液は以下の組成を有する：７．５ｍＭＦｅＣｌ_２、１ｍＭＨ_３Ｂ０_４、０．５ｍＭＺｎＣｌ_２、０．１ｍＭＣｕＣｌ_２、０．５ｍＭＭｎＣｌ_２、０．５ｍＭＣｏＣｌ_２、０．１ｍＭＮｉＣｌ_２、及び５０ｍＭＨＣｌ）、１ｍｌビタミン溶液（ビタミン溶液は以下の組成を有する：０．０２ｇ／Ｌビオチン、０．２ｇ／Ｌナイアシン、０．５ｇ／Ｌピリドキシン、０．１ｇ／Ｌリボフラビン、０．２ｇ／Ｌチアミン、０．１ｇ／Ｌシアノコバラミン、０．１ｇ／Ｌｐ−アミノ安息香酸、及び０．１ｇ／Ｌパントテン酸）、０．５ｍｇレザズリン、４ｇＮａＨＣＯ_３、０．２５ｇＮａ２Ｓ・７−９Ｈ_２Ｏを含む滅菌した基礎培地に、０．７％（ｖ／ｖ）の滅菌精製ルーメン液を添加し、さらに、１６ｇ／Ｌ大豆ペプトン、４ｇ／Ｌトレオニン、ならびにグルコース及びＮ−アセチルグルコサミンの混合物（それぞれ２５ｍＭ）を添加して調製した。

このようにして、ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、タンニン酸のいずれかを、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、又は５００μｇ／ｍＬの量で含む培地を調製し、以下の本培養に用いた。

ケルセチン配糖体としては、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、ペルタトシドを用いた。

コントロール培地は、公知の合成培地にポリフェノールを含まない同量のＤＭＳＯを添加して調製した。

（３）培養
菌株を、０．４％（ｖ／ｖ）のムチンを添加したＧＡＭ培地（ＧｉｆｕＡｎａｅｒｏｂｉｃＭｅｄｉｕｍ）に播種して、嫌気条件下、３７℃で２４時間、前培養した。

前培養終了後、前培養液（１０μＬ）を、上記本培地（２００μＬ）に添加して、嫌気条件下、３７℃で９０時間、本培養した。

対照は、本培地に代えてコントロール培地を用いて同様に培養した。

（４）増殖比率の測定
本培養終了後、本培養液より菌体を回収し、腸内細菌学雑誌２０：２４５−２５８，２００６に記載の手法に従ってガラスビーズ法により、菌体よりＤＮＡを抽出した。

次いで、得られたＤＮＡを鋳型にして、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７ｖｏｌ．７３ｎｏ．２３７７６７−７７７０に記載の手法に従って、アッカーマンシア・ムシニフィラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列に基づいて作製されたプライマーセットを用いて定量的ＰＣＲを行い、回収された菌体のＤＮＡ量を測定した。

対照についても、同様に、菌体よりＤＮＡを抽出し、回収された菌体のＤＮＡ量（対照ＤＮＡ量）を測定した。

得られたＤＮＡ量を、対照ＤＮＡ量を１００％とする相対値で示し（ｎ＝４）、各培地におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を評価した。

２．結果
添加したポリフェノールの種類及び量に関し、対照を超えるアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖が認められたものを、図１−１、図１−２に示す。

ケルセチン配糖体は、いずれの化合物についても、培地への添加により、対照を超えるアッカーマンシア・ムシニフィラのＤＮＡ量の増大が認められた（図１−１）。この結果は、ケルセチン配糖体はその化合物の種類を問わず、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を促すことが可能であることを示唆する。

また、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、又はタンニン酸の培地への添加によっても、対照を超えるアッカーマンシア・ムシニフィラのＤＮＡ量の増大が認められ（図１−２）、各ポリフェノールの添加によりアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖が促されたことが確認された。

特に、ケルセチン３−О−グルコピラノシド（３１．２５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ）、ルチン（６２．５μｇ／ｍＬ）、シアニジングルコシド（６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ）、ヘスペリジン（３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ）、アピゲニン（３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ）、タンニン酸（３１．２５μｇ／ｍＬ）において、良好な増殖が認められた（カッコ内の数値は、培地における含有量を示す）。

以上の結果より、ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、又はタンニン酸により、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援し、アッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることが可能であることが確認された。

実施例２．アッカーマンシア・ムシニフィラ増殖効果の検討
マウスに高脂肪食を与えて、ルチン及びヘスペリジンを８週間投与した際のアッカーマンシア・ムシニフィラ増殖効果を検証した。

１．方法
（１）使用動物
９週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）３０匹に対し、高脂肪食飼料Ｄ１２４９２（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）を摂取させた。それぞれ、水投与群（対照）、ルチン投与群、ヘスペリジン投与群に群分けし（１群１０匹）、ルチン投与群、ヘスペリジン投与群では、６００ｍｇ／ｋｇとなる量を水に懸濁し、毎日経口投与した。この経口投与は、投与開始から８週間行った。

（２）被験物質
ルチンは、αＧルチンＰＳ（東洋製糖）を使用した。ヘスペリジンは、αＧヘスペリジンＰＡ（東洋製糖）を使用した。

（３）ＤＮＡの抽出
経口投与から８週間後の糞便を採取し、糞便およそ１００ｍｇから、腸内細菌学雑誌２０：２４５−２５８，２００６に記載の手法に従ってガラスビーズ法により、ＤＮＡを抽出した。

（４）アッカーマンシア・ムシニフィラの定量
得られたＤＮＡを鋳型にして、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７ｖｏｌ．７３ｎｏ．２３７７６７−７７７０に記載の手法に従って、アッカーマンシア・ムシニフィラの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列に基づいて作製されたプライマーセットを用いて定量的ＰＣＲを行い、回収された糞便中の菌体のＤＮＡ量を測定した。

２．結果
８週間経口投与を行ったマウスから採取した糞便中のアッカーマンシア・ムシニフィラのＤＮＡ定量値を図２に示す。
ルチン投与群、ヘスペリジン投与群においては、対照群と比べて、アッカーマンシア・ムシニフィラのＤＮＡ量が増大していることが確認された。

以上の結果より、ルチンやヘスペリジンを経口摂取することにより、生体内のアッカーマンシア・ムシニフィラの増殖を支援することが可能であり、生体内のアッカーマンシア・ムシニフィラの絶対数を増加させることが可能であることが確認された。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１７−２１５５５８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む、アッカーマンシア・ムシニフィラの増殖材。
ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、請求項１に記載の増殖材。
ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、請求項１に記載の増殖材。
飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の増殖材。
ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む増殖材を用いて培養されたアッカーマンシア・ムシニフィラを含む、培養物。
ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、請求項５に記載の培養物。
増殖材がケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、請求項５に記載の培養物。
飲食品、医薬又は飼料もしくは飼料添加物である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の培養物。
アッカーマンシア・ムシニフィラを、ケルセチン配糖体、イソラムネチン、シアニジングルコシド、ヘスペレチン、ヘスペリジン、アピゲニン、クリシン、タンゲレチン、ノビレチン、及びタンニン酸からなる群から選択される一以上のポリフェノールを含む増殖材を用いて培養することを含む、アッカーマンシア・ムシニフィラ及び／又はその培養物の製造方法。
ケルセチン配糖体が、ケルセチン３−Ｄ−ガラクシド、ケルセチン３−О−グルコピラノシド、ケルセチン３，４ジグルコシド、ルチン、及びペルタトシドからなる群から選択される一以上を含む、請求項９に記載の製造方法。
増殖材がケルセチン３−О−グルコピラノシド、ルチン、シアニジングルコシド、ヘスペリジン、アピゲニン、又はタンニン酸を含む、請求項１０に記載の製造方法。