JPWO2008062559A1 - 栄養補助食品、抗疲労作用剤又は持久力増強剤、機能性食品又は化粧料 - Google Patents

Abstract

抗疲労剤又は持久力増強剤、或いは、抗疲労作用又は持久力増強効果を有する機能性食品の提供を課題とする。本発明は、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤又は持久力増強剤、或いは、該化合物を有効成分として含有する抗疲労作用又は持久力増強効果を有する機能性食品、さらには抗疲労作用又は持久力増強用組成物を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用、そして該化合物を有効成分として含有する組成物を摂取することによる抗疲労作用又は持久力増強方法を提供する。

Description

本発明は、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する栄養補助食品、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤、或いはホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労作用又は持久力増強作用を有する機能性食品、化粧料、さらには抗疲労作用又は持久力増強作用を有する組成物を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用、そしてホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する組成物を摂取または塗布することを特徴とする抗疲労作用又は持久力増強方法に関する。

ホスファチジルイノシトールは大豆レシチンに含まれ、細胞の情報伝達と深く関与していることが報告されている。近年、ホスファチジルイノシトールの摂取が血中のトリアシルグリセロール（ＴＧ）濃度を減少させ、ＨＤＬ−Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）濃度を上昇させることが報告されている（非特許文献１）が、他の機能については報告されていない。
一方、コエンザイムＱ１０はベンゾキノン誘導体であり、広く生物界に分布していることからユビキノン（酸化型コエンザイムＱ１０）と命名された。これを２電子還元したヒドロキノン体がユビキノール（還元型コエンザイムＱ１０）である。イソプレノイド側鎖の長さ（ｎ）の違いにより多数の同族体が存在するが（ｎ＝１〜１２）、生合成されるため、主たる同族体は種によって決まっている。哺乳類ではｎ＝９，１０が主であり、例えばマウス、ラットではｎ＝９が多く、ウサギでｎ＝１０が多い。ヒトはｎ＝１０である。
コエンザイムＱ１０は、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として存在する生理学的成分であり、生体内において酸化と還元を繰り返すことで電子伝達系における伝達成分としての機能を担っている。コエンザイムＱ１０は生体内において、エネルギー生産及び抗酸化活性を示すことから、その有用性は広く知られている。コエンザイムＱ１０はヒトの体内で生合成される分子であるが、加齢と共に生合成量が低下すること、あるいはさまざまな疾患における生体中のコエンザイムＱ１０量の減少が報告されている。このような疾患では外部からのコエンザイムＱ１０の供給が良好な結果をもたらしている。更に、罹患時だけでなく老人あるいは肉体的に疲労したときなど、平常時でもコエンザイムＱ１０の補給が必要であると考えられている。更に、生体内においては抗酸化作用を持つ還元型コエンザイムＱ１０の比率を上昇させることが重要である。
酸化型コエンザイムＱ１０は、鬱血性心不全薬として医薬用途に用いられている。医薬用途以外では、更に、痴呆症などの老人性の疾患、アレルギー疾患に対する有用性、あるいは運動能力の増加等も報告されており、また、その安全性が高いことから外部から補給する事は有用な手段とされ、還元型コエンザイムＱ１０を含有する多くの製品が開発されている
近年、健康志向の高まりとともに、各種の天然素材を用いて様々な効能を示す機能性食品の開発が進められている。一方、積極的に健康を維持し、体力を高めることを目的としてスポーツがますます盛んになりつつある。このような背景の中で、健康を目指す人々のスポーツライフのあり方と食生活の影響、スポーツ栄養学に関する研究が進みつつあり、また関心も高まりつつある。
しかしながら、各種機能性食品の中で、抗疲労及び／又は持久力の増強等を目的とし、またその効果を裏付けたものはないのが現状である。例えば、コエンザイムＱ１０及びカルニチンを含有する疲労改善剤（特許文献１）やコエンザイムＱ１０、シアノコバラミン、葉酸及びピリドキシン塩酸塩を配合した栄養補助食品（特許文献２）等が知られている。
特開平７−３３０５８４号公報 特開２００３−１６９６３３号公報 Jim W. Burgessら、Journal of Lipid Research (46) 350-355(2005)

本発明の目的は、従来知られている抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する医薬、機能性食品、又は化粧料に比べて優れた医薬、機能性食品、又は化粧料を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、全リン脂質中における含有率が一定以上であるホスファチジルイノシトール、及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取すると、それぞれ単独で摂取するより抗疲労作用又は持久力増強作用効果が高まることを見出し、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する医薬、機能性食品、又は化粧料について本発明を完成するに至った。また、これとは別に、全リン脂質中濃度が一定以上であるホスファチジルイノシトールがコエンザイムＱ１０の生体内への吸収を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
〔Ａ１〕少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物。
〔Ａ２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕に記載の組成物。
〔Ａ２−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕に記載の組成物。
〔Ａ２−３〕全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトール、及びコエンザイムＱ１０とから実質的になる上記〔Ａ１〕に記載の組成物。
〔Ａ２−４〕全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトール、及びコエンザイムＱ１０とから実質的になる上記〔Ａ１〕に記載の組成物。
〔Ａ３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の組成物；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が５０モル％以上とせしめる工程。
なお、上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔Ａ２−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔Ａ２−２〕の枝番号を有する項も引用されることを意味する。
〔Ａ３−２〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の組成物；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ３−３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕に記載の組成物であって、かつ下記の工程に由来する以外のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸を含有しない組成物である上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の組成物；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ３−４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の組成物であって、かつ下記の工程に由来する以外のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸を含有しない組成物である上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の組成物；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ４〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物を含有する栄養補助食品。
〔Ａ４−２〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物から実質的になる栄養補助食品。
〔Ａ５〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物を含有する機能性食品であって、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する機能性食品。
〔Ａ５−２〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物から実質的になり、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する機能性食品。
〔Ａ６〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物を含有する化粧料。
〔Ａ６−２〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物から実質的になる化粧料。
〔Ａ７〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物を含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ａ７−２〕上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の組成物から実質的になる抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ａ８〕少なくともホスファチジルイノシトールを有効成分とするコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ａ９〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ａ９−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ａ９−３〕全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールから実質的になる上記〔Ａ８〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ａ９−４〕全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールから実質的になる上記〔Ａ８〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ａ１０〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１０−２〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１０−３〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤であって、かつ下記の工程に由来する以外のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸を含有しないコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤である上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１０−４〕ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤であって、かつ下記の工程に由来する以外のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸を含有しないコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤である上記〔Ａ８〕又は〔Ａ９〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１１〕少なくともホスファチジルイノシトールを有効成分とするコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
〔Ａ１２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１１〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
〔Ａ１２−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１１〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
〔Ａ１３〕
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである〔Ａ１１〕又は〔Ａ１２〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１３−２〕
ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである〔Ａ１１〕又は〔Ａ１２〕に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１４〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を組み合わせてなるキット。
〔Ａ１５〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤が同梱されたキット。
〔Ａ１６〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１４〕又は〔Ａ１５〕のキット。
〔Ａ１６−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１４〕又は〔Ａ１５〕のキット。
〔Ａ１７〕少なくとも下記の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が５０モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１７−２〕少なくとも下記の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法；
大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が８５モル％以上とせしめる工程。
〔Ａ１７−３〕下記１）〜３）の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程。
〔Ａ１７−４〕下記１）〜３）の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法；
１）大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルセリン等のリン脂質のいずれをも選択的に分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程；
２）有機溶媒を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程；
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒でホスファチジルイノシトールを沈殿回収する工程；
４）ホスファチジルイノシトールの製造中酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加する工程。
〔Ａ１７−５〕２）において、有機溶媒がヘキサン及び低級アルコールの混合溶媒である上記〔Ａ１７−３〕又は〔Ａ１７−４〕に記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
〔Ａ１７−６〕２）において、有機溶媒がヘキサン及びエタノールの混合溶媒である上記〔Ａ１７−３〕又は〔Ａ１７−４〕に記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
〔Ａ１７−７〕３）において、有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒が低級アルコールである上記〔Ａ１７−３〕〜〔Ａ１７−６〕のいずれかに記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
〔Ａ１７−８〕３）において、有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒がエタノールである上記〔Ａ１７−３〕〜〔Ａ１７−６〕のいずれかに記載のホスファチジルイノシトールの製造方法。
〔Ａ１８〕抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する食品、化粧料、あるいは抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用。
〔Ａ１８−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１８〕に記載のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用。
〔Ａ１８−３〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１８〕に記載のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用。
〔Ａ１９〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取することを特徴とする疲労改善及び／又は持久力増強方法。
〔Ａ１９−２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１９〕に記載の疲労改善及び／又は持久力増強方法。
〔Ａ１９−３〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が８５モル％以上のホスファチジルイノシトールである上記〔Ａ１９〕に記載の疲労改善及び／又は持久力増強方法。
〔Ａ１９−４〕
ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時摂取するに先立ち、ホスファチジルイノシトールを事前に摂取しておくことを特徴とする疲労改善及び／又は持久力増強方法。
〔Ａ２０〕
上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物を含有するアルコール代謝促進剤。
〔Ａ２０−２〕
上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物を含有する肝機能改善剤。
〔Ｂ１〕少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する栄養補助食品。
〔Ｂ２〕ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ１〕に記載の栄養補助食品。
〔Ｂ３〕ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ｂ４〕さらに、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する前記〔Ｂ３〕記載の抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ｂ５〕さらに、水溶性物質を含有する前記〔Ｂ３〕又は〔Ｂ４〕記載の抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ｂ６〕ホスファチジルイノシトールが全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ３〕〜〔Ｂ５〕いずれか１項に記載の抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
〔Ｂ７〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を組み合わせてなるキット。
〔Ｂ８〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤が同梱されたキット。
〔Ｂ９〕ホスファチジルイノシトールが全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ７〕又は〔Ｂ８〕記載のキット。
〔Ｂ１０〕少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する機能性食品。
〔Ｂ１１〕ホスファチジルイノシトールが全リン脂質中の純度が５０モル％以上であるホスファチジルイノシトールである前記〔Ｂ１０〕記載の機能性食品。
〔Ｂ１２〕抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する食品、化粧料あるいは抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用。
〔Ｂ１３〕ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取することを特徴とする抗疲労作用及び／又は持久力増強方法。
〔Ｂ１４〕少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する化粧料。
〔Ｂ１５〕ホスファチジルイノシトールが、大豆由来リン脂質にホスフォリパーゼＢ活性を有するキャンディダ属由来の酵素を作用させることによって得られたものである前記〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の栄養補助食品。
〔Ｂ１６〕ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
〔Ｂ１７〕ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有するコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
〔Ｂ１８〕下記１）〜３）の工程を含む高純度ホスファチジルイノシトールの製造方法。
１）リン脂質混合物にホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないホスフォリパーゼＢ作用を持つ酵素を作用させる工程。
２）有機溶媒（例えばヘキサン及びエタノール）を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程。
３）有機層にホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質が以外の不純物が溶解する溶媒（例えば低級アルコール）で沈殿回収する工程。
〔Ｂ１９〕下記１）〜３）の工程を含む高純度ホスファチジルイノシトールの製造方法。
１）リン脂質混合物にホスファチジルイノシトールのみを実質的に分解しないホスフォリパーゼＢ作用を持つ酵素を作用させる工程。
２）有機溶媒（例えばヘキサン及びエタノール）を用いてホスファチジルイノシトールを効率よく抽出、回収する工程。
３）ホスファチジルイノシトールが吸着せず、遊離脂肪酸やリン脂質が以外の不純物が吸着する吸着剤（例えばシリカゲル）を用いてホスファチジルイノシトールを分離回収する工程。

本発明により、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する栄養補助食品、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤、或いはホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する機能性食品、化粧料、さらには抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する組成物を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用、そしてホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する組成物を摂取することを特徴とする抗疲労作用及び／又は持久力増強方法を提供することができる。

参考例４に基づく本発明のＰＬＢのゲル濾過クロマトによるクロマトパターンを示す。 参考例５に基づく本発明のＰＬＢの最適ｐＨを示す。 参考例５に基づく本発明のＰＬＢのｐＨ安定性の結果を示す。 参考例５に基づく本発明のＰＬＢの熱安定性の結果を示す。 参考例５に基づく本発明のＰＬＢの等電点電気泳動の結果を示す。 参考例８に基づくＴＬＣの結果示す。 参考例９に基づくＴＬＣの結果を示す。

本発明について、以下具体的に説明する。
本発明により、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物が提供される。組成物としては、栄養組成物又は医薬組成物が例示され、これらに限定されるものではないが、栄養組成物であることが好ましい。また医薬組成物が好ましい別の態様もある。栄養組成物は栄養補助食品や後述する機能性食品に例示されるように、例えば食品に用いることができる。また、医薬組成物は例えば医薬品に用いることができる。
本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物は、組成物全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が高ければ特に限定されない。組成物全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率としては、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましく、９０モル％以上であることがこの上なく好ましい。
本発明の組成物中におけるホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の含有量は、1日のコエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトールの摂取量が１〜２０００／１〜５００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５００／１０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜３００／５０〜１０００ｍｇとなるような量が挙げられる。
すなわち、コエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトール比は、３／１００〜６０が好ましいが、そのうちでも１／５〜１が特に好ましい。
本発明に用いるホスファチジルイノシトールは医薬又は食品として服用又は食用可能なホスファチジルイノシトールであればその由来および製法は何ら限定されるものでは無いが、大豆リン脂質から熱エタノール法（特開２０００−３００１８６号公報）により製造したもの、またはホスホリパーゼＢ（以下、ＰＬＢと略すことがある）活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素を用いて大豆リン脂質から製造したものを用いることが望ましい。「ホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない」又は「ホスファチジルイノシトールを実質的に分解しない」とは、ホスファチジルコリンに対する活性とホスファチジルイノシトールに対する活性との比（ホスファチジルイノシトールに対する活性／ホスファチジルコリンに対する活性）が、上限としては１５％以下であることが例示され、１０％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましく、３％以下であることが特に好ましく、１％以下であることが最も好ましく、下限としては０．０１%以上であることが例示され、０．１％以上であることが好ましい。
ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素としては、具体的には以下の（１）〜（４）のようなものがあげられる。
（１）ＰＬＢ活性を有するキャンディダ属由来の酵素であって、下記の物理化学的性質を有する酵素。
１）作用：リン脂質を２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）至適ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
（２）下記工程により得られる酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂを含有するフォスホリパーゼＢ。
１）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）を培養する工程
２）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）の培養液を濃縮する工程
３）有機溶媒により酵素を沈殿させる工程
４）３）の工程により得られる粗酵素液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程
５）４）の工程で得られる酵素をイオン交換クロマトグラフィーで酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂに分離精製する工程
（３）配列表配列番号１のアミノ酸配列を有するフォスホリパーゼＢ。
（４）配列表配列番号２のアミノ酸配列を有するフォスホリパーゼＢ。

上記以外にも、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素としては、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せず、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解する酵素が挙げられる。当該酵素はキャンディダ属由来の酵素であることが好ましい。
リン脂質は細胞膜の構成成分であり重要な生理機能を担っている。特にホスファチジルイノシトールは細胞膜中の細胞内外のシグナル伝達に深く関っている。医薬・食品用途でのリン脂質の給源は主に大豆、鶏卵卵黄、魚卵等である。これらのリン脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等複数の分子種の混合物として得られる。これらのリン脂質混合物から高純度ホスファチジルイノシトールを分離するには有機溶媒分画、シリカゲル、アルミナ等の担体でのクロマトによる分離などが知られている。比較的含量の多いＰＣやＰＥはこれらの方法でも効率良く取得できるが、含量の少ないホスファチジルイノシトールなどのリン脂質成分を取得するには極めて効率が悪い。またクロロホルムのようなハロゲン系の有機溶媒を大量に使用する必要があり製品の用途が限定される。ＰＣ、ＰＥ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＩ等を含有するリン脂質からホスファチジルイノシトールを効率よく製造するためにはホスファチジルイノシトール以外のＰＣ、ＰＥ、ＰＡ、ＰＳ等のリン脂質を選択的に加水分解しホスファチジルイノシトールを残存させればよい。

本発明に使用されるホスファチジルイノシトールは具体的には以下の工程で製造することができる。すなわち、大豆由来のリン脂質混合物に、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素、例えば、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめることにより、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめることができ、本発明に使用されるホスファチジルイノシトールを取得することができる。
また、例えば、上記方法で取得したホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を用いることにより本発明の組成物となすことができる。より具体的には以下の工程にて製造すればよい。大豆レシチンにＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない前記酵素を作用させる工程、有機溶媒（例えばヘキサン及びエタノールの混合溶媒）を用いてホスファチジルイノシトールを抽出する工程（例えば抽出時のｐＨはｐＨ４．５〜８．５が好ましい）、抽出溶媒をｐＨ４〜６の緩衝液で洗浄する、または抽出溶媒を含水エタノールと混合した後、ｐＨを４．０〜５．０に調整する工程、ホスファチジルイノシトールが溶解せず、遊離脂肪酸やリン脂質以外の不純物が溶解する溶媒（例えばアセトン又はエタノール等）で沈殿回収する工程、及び溶媒を乾燥除去する工程を含む方法が挙げられる。

また、ホスファチジルイノシトールの製造中での酸化を防止する目的でビタミンＥ（トコフェロール）等の酸化防止剤を酵素反応液又は各製造工程に添加しても良い。酸化防止剤としては、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸エステル、ＢＨＡ、ＢＨＴ、没食子酸プロピル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム（結晶、無水）、又はビタミンＥ（トコフェロール）が例示され、ビタミンＥ（トコフェロール）が好ましい。ビタミンＥとしてはトコフェロールであれば特に限定されないが、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、又はこれらの混合物が挙げられ、α−トコフェロールが好ましい。また、γ−トコフェロールが好ましい場合もある。添加量はホスファチジルエタノールの酸化が防止できる量であれば良く、好ましくは０．０００１％〜１０％、より好ましくは０．００１％〜１％である。

ＰＬＢ活性を有する酵素であって実質的にホスファチジルイノシトールに作用しない酵素をリン脂質混合物に作用させることにより、リン脂質混合物のうちホスファチジルイノシトールのみを選択的に残存させ、効率良くホスファチジルイノシトールを取得することができる。リン脂質混合物は予めホモジナイザー等を使用して水に分散させてもいいし強制的な攪拌によって均一な水溶液を調製できる。リン脂質濃度は水に分散したリン脂質混合物に前記酵素が作用しうる濃度であれば良いが、１〜２０％の範囲、好ましくは５〜１０％、特に好ましくは６〜８％である。

反応のｐＨは前記酵素がリン脂質混合物に作用しうるｐＨであれば良いが、ｐＨ３〜１０、前記酵素の活性が最大になるｐＨ５．５〜６．５付近に調整することが好ましい。特に好ましくはｐＨ６付近である。反応のｐＨを一定に保つために緩衝液を使用することも好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の範囲で緩衝能を有する緩衝液であればその種類は特に限定されないが、食品用途の観点からは酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液の使用が特に好ましい。

また、反応中にアルカリ溶液を適宜添加して反応液のｐＨを好ましい範囲にコントロールすることもできる。酵素反応を活性化、又は酵素の安定化のために塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム等のカルシウム塩やマグネシウム塩を添加しても良い。

酵素反応時の撹拌速度は酵素反応が良好に進む速度であれば何ら問題はない。水に対する溶解性が低い基質を乳化させる目的で界面活性剤を添加することもできる。

本発明において使用される、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素の使用濃度は、リン脂質１ｋｇあたり１０００〜１００００００００単位の範囲で使用することができるが２０００〜５００００００単位の範囲が好ましい。使用するＰＬＢの形態は水溶性の形で添加してもよく、セライト又はイオン交換樹脂等の不溶性担体に固定化された形態でもよい。

酵素反応の温度は前記酵素が失活しない範囲で使用することができるが、上限としては６０℃以下であることが好ましく、４５℃以下であることがより好ましく、また下限としては１０℃以上であることが好ましく、３０℃以上であることがより好ましい。

反応時間は上記の酵素反応条件によって異なり、通常１〜１５０時間であるが、基質の残存量を定性的に把握して反応を止めればよい。反応終了後、熱処理、ｐＨ処理などにより前記酵素を失活させても何ら問題は無い。加水分解反応の状態を確認するにはシリカゲル薄層クロマト（ＴＬＣ）法が最も簡便である。ＴＬＣを用い、ヨウ素発色して基質の残存量を定性的に確認する場合、ホスファチジルイノシトール以外のリン脂質を示すスポットがＴＬＣ上でほぼ確認できなくなった時点で反応を止めるのが好ましい。反応後の生成物中には遊離の脂肪酸、グリセリルホスフォリルコリン（ＧＰＣ）、グリセリルホスフォリルエタノールアミン（ＧＰＥ）、グリセロリン酸（ＧＰ）と反応せずに残ったホスファチジルイノシトールおよび糖脂質等が混合して存在している。

該混合物からホスファチジルイノシトールを簡便に回収する方法として、ホスファチジルイノシトールが溶解し、水と分離し得る有機溶剤を含有する溶剤を添加し分液して得た有機層からホスファチジルイノシトールを取得する方法が良い。分液操作の工程では酵素と接触せしめた混合物をそのまま用いても良いし、あらかじめ混合物を濃縮又は乾燥などの操作を行ってから分液操作の工程を行っても良い。

ホスファチジルイノシトールを抽出する溶媒としてはクロロホルム、エーテル、又はヘキサン等の有機溶媒を使用することができるが、食品用途の観点からは水と分離し得る有機溶剤を含有する溶剤が、ｎ−ヘキサンと親水性溶媒の混合物であることが好ましい。また当該親水性溶媒としてはエタノールのような低級アルコールである事が特に好ましい。低級アルコールとしてはメタノール、エタノール、１−プロパノール、又は２−プロパノールが例示され、エタノールが好ましい。

水溶性有機溶媒の量は水と分離しうる有機溶剤１００容量部に対して下限としては通常１０容量部位上、好ましくは２０容量部位上、更に好ましくは３０容量部位上、上限としては特に限定されないが、通常は４００容量部以下、好ましくは３００容量部以下、更に好ましくは２００容量部以下、特に好ましくは１００容量部以下が例示される。

また、抽出工程後の分液操作においては遠心分離等の機械的な分離操作の他に自然放置により水層と有機層を分離させることも可能である。自然放置による分離の場合には、水層とホスファチジルイノシトールを含む有機層の分離をよくする目的で抽出前に反応液のｐＨを変化させることもできる。このためのｐＨとしては、好ましくはｐＨ６．０〜１１、更に好ましくはｐＨは６．５〜８．０付近である。

遊離脂肪酸とホスファチジルイノシトールは有機溶媒に可溶でありＧＰＣ、ＧＰＥ、ＧＰなどはヘキサン等の有機溶媒に不溶であり水に可溶性である。
抽出操作およびその後の静置の温度は有機層と水層の分離が良好となる温度であれば良いが２０℃以上、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃で行えば有機層と水層の分離が良好となる。

ホスファチジルイノシトールの抽出操作を行った後、ｐＨ５．０以下の適当な緩衝液とエタノールの混合液と有機溶媒を混合し、混合液のｐＨを５．０以下にする（ｐＨの低下が不十分のときは酢酸又はリン酸などの適当な酸を用いてｐＨを５以下にする）ことが遊離の脂肪酸を効率的に除去する点で好ましい。また、有機溶媒層を減圧濃縮して、溶媒を留去した後に、上記と同じ方法でｐＨを５以下としても良い。

有機溶媒層に回収されたホスファチジルイノシトールと遊離脂肪酸は減圧濃縮等の操作により溶媒を留去する。ホスファチジルイノシトールは水溶性アルキルカルボニル溶剤又は水混和性アルキルカルボニル溶剤、または低級アルコール溶剤に不溶性であり、遊離脂肪酸はこれらの溶剤に可溶性であるので、これらの溶剤を用いればホスファチジルイノシトールは沈殿物として回収することができる。水溶性アルキルカルボニル溶剤又は水混和性アルキルカルボニル溶剤としては、アセトン又はメチルエチルケトン等、低級アルコール溶剤としてはエタノール、メタノール又はプロパノール等が例示されるが、アセトンまたはエタノールが好ましい。遊離の脂肪酸の除去と、未反応の原料もしくは不純物の除去（酵素反応由来のホスファチジルイノシトール以外の不純物、例えば糖脂質等）を同時に行うためにはエタノールが最も好ましい。

エタノールによる、原料もしくは不純物の除去操作時の温度は、これらの除去が良好に行われる温度であれば問題無いが、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃が良い。濃縮液または濃縮物に５０℃のエタノールを添加し、よく撹拌した後、そのまま又は温度を室温まで低下させた後に沈殿物を回収すれば良い。ホスファチジルイノシトールの回収は遠心分離法でも濾過法の固液分離操作いずれの方法をとってもよい。

また、酵素反応終了後の混合物から有機溶媒でホスファチジルイノシトールを抽出した後、水層と有機層を分離し、更に有機溶媒を濃縮させた後、ホスファチジルイノシトールが吸着し、ホスファチジルイノシトール以外の糖脂質等の不純物は吸着しないシリカゲルを用いてホスファチジルイノシトール以外の糖脂質等の不純物を除去しても良い。また、濃縮液をアセトン洗浄した後、エタノール洗浄し、このエタノール洗浄液を濃縮乾燥させることにより、原料もしくは不純物を分離取得することも可能である。

リン脂質混合物は特に限定されない。鶏卵卵黄由来のリン脂質、イクラ等の魚卵由来リン脂質、又は大豆由来のリン脂質等を使用することができるが、原料リン脂質の安定供給の面で鶏卵卵黄由来のリン脂質又は大豆由来のリン脂質が好ましく、大豆由来のリン脂質が特に好ましい。本発明において使用される、ＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素はＰＬＢ活性の他に強いリパーゼ活性を有することが好ましいが、リパーゼ活性を有することは大豆リン脂質からホスファチジルイノシトールやグロセリルホスフォリルコリンを製造する上では全く問題はない。大豆リン脂質はトリグリセリドとの混合物でも供給されており、該混合物を原料とした場合に、トリグリセリドとリン脂質を同時に加水分解することができる点で、リパーゼ活性とＰＬＢ活性を併せ持つことは有意である。なお、ＰＬＢ活性は高いが、リパーゼ活性が低い、あるいは有さない場合には、別途リパーゼを添加することでトリグリセリドとリン脂質を同時に分解することができる。

本発明の上記方法により、高純度のホスファチジルイノシトールが提供される。ホスファチジルイノシトールの含有率は高純度であれば特に限定されないが、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率が、下限としては５０モル％以上であることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましく、９０モル％以上であることがこの上なく好ましく、高純度のホスファチジルイノシトールは機能性リン脂質として有用である。ホスファチジルイノシトールは分子中に水酸基を豊富に含むイノシトールを有するため、ＰＣ又はＰＥ等の他のリン脂質と比較して水への分散又は溶解が良好であったり、他の脂質成分の溶解性等が極端に異なりリン脂質としての応用範囲が広げられるという利点が考えられる。ホスファチジルイノシトール濃度の測定法としては、通常、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）又は高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）が挙げられるが、ＨＰＬＣ法が好ましい例として挙げられる。ＨＰＬＣ法としては、後述する参考例７に記載の基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、基準油脂分析試験法2003年版）が挙げられる。

そのようなＰＬＢ活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素としては、具体的には以下の（１）〜（４）のようなものがあげられる。
（１）ＰＬＢ活性を有するキャンディダ属微生物由来の酵素であって、下記の物理化学的性質を有する酵素。
１）作用：リン脂質を２モル比の遊離脂肪酸と等モル比のグリセリルホスフォリルコリンとに加水分解する作用
２）分子量：５３，０００±３，０００（ＳＤＳ電気泳動法による）
３）等電点：ｐＨ４．２１±０．２
４）至適ｐＨ：ｐＨ５．５から６．５付近
５）ｐＨ安定性：ｐＨ５から９付近（３７℃、９０分間処理）
６）安定性：５５℃（ｐＨ５で１０分間処理）
７）基質特異性：ホスファチジルイノシトールに対する活性比がホスファチジルコリンの場合の１０％以下
（２）下記工程により得られる酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂを含有するホスフォリパーゼＢ。
１）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）菌株を培養する工程
２）キャンディダ・シリンドラッセ（ルゴーサ）菌株の培養液を濃縮する工程
３）有機溶媒により酵素を沈殿させる工程
４）３）の工程により得られる粗酵素液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程
５）４）の工程で得られる酵素をイオン交換クロマトグラフィーで酵素画分Ａ又は酵素画分Ｂに分離精製する工程
（３）配列表配列番号１のアミノ酸配列を有するホスフォリパーゼＢ。
（４）配列表配列番号２のアミノ酸配列を有するホスフォリパーゼＢ。
これらの精製酵素を用いてもよいし、これらの活性を示す微生物菌体や培養液、これらの粗精製物を用いてもよい。また市販されたＰＬＢ活性を持つ酵素を用いることも簡便であり好ましい。

本発明の組成物を含む、機能性食品、抗疲労剤及び／又は持久力増強剤について、抗疲労作用の有無、及び持久力増強作用の有無は以下の方法により調べることができる。すなわち、マウスを予備飼育後、本発明の組成物を含む抗疲労剤等を強制経口投与した群(投与群)と投与しなかった群（非投与群）について、投与後３週目にマウスに体重の８．５％の重りを付加して強制水泳させ、疲労困憊し、頭部（鼻）が完全に７秒間水中に沈むまでの時間を測定し投与群と非投与群を比較して、本発明の作用効果の有無を判定することができる。

ホスファチジルイノシトールの医薬及び食品中の含有量は、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、1日のホスファチジルイノシトールの摂取量が１〜５００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは５０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。
また、本発明に用いるホスファチジルイノシトールは、全リン脂質中の含有率が下限としては５０モル％以上のホスファチジルイノシトールであることが好ましく、６０モル％以上であることがより好ましく、７０モル％以上であることがさらに好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましく、８５モル％以上であることが最も好ましく、９０モル％以上であることがこの上なく好ましい。

本発明に用いられるコエンザイムＱ１０は医薬又は食品として服用又は食用可能なコエンザイムＱ１０であればその由来および製法は何ら限定されるものでは無いが、好ましくは市販のものが良い。本発明に用いられるコエンザイムＱ１０としては、酸化型又は還元型が挙げられるが酸化型が好ましい。また、還元型が好ましい別の態様もある。その他、生体内でコエンザイムＱ１０に変換する化合物であってもよい。

コエンザイムＱ１０の医薬及び食品中の含有量は、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、1日のコエンザイムＱ１０の摂取量が１〜２０００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜３００ｍｇとなるような量が良い。

コエンザイムＱ１０は融点の低い親油性の固体であり、水に難溶性のために経口投与における吸収性が低いことが知られている。このため、医薬製剤及び食品中のコエンザイムＱ１０の分散安定性、結晶析出防止性などの性状の安定性及び生体吸収性を向上させることが好ましい。本発明において、コエンザイムＱ１０の性状を安定化したものを用いても良い。例えば、コエンザイムＱ１０を鶏卵タンパク質、乳タンパク質、肉タンパク質等の動物性タンパク質、大豆タンパク質もしくは大豆ペプチド等の植物性タンパク質又はこれらの加水分解物と配合する、又は、更に糖質等と配合することによりコエンザイムＱ１０を安定化し、更に生体吸収性を向上させた後に使用しても良い。

コエンザイムＱ１０を乳化組成物として用いる場合には、例えばコエンザイムＱ１０を油相成分としてショ糖酢酸イソ酪酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、中鎖脂肪酸エステル等に溶解し、多価アルコール及び乳化剤を用いて乳化処理するか、又は有機酸等の添加剤の存在下又は不存在下に、アラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、デンプン、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、デキストリン、カルメロールナトリウム、ポリビニルピロリドン等の水溶性物質中にコエンザイムＱ１０を分散、乳化することにより、性状の安定性及び生体吸収性を向上させた後に使用すれば良い。

本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取及び／又は塗布するためのキットとしては、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を組み合わせてなるキットであれば何ら限定されないが、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤が同梱されたキットが好ましい。

本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を有効成分として含有する医薬、食品又は化粧料は、摂取及び／又は塗布によって、ホスファチジルイノシトール単独、或いはコエンザイムQ１０単独の摂取及び／又は塗布によって得られる抗疲労作用及び／又は持久力増強作用に比べて、少なくとも相加的な抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を示すものである。即ち、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有し、疲労及び／又は持久力の改善作用を有するものであることを特徴とする疲労及び／又は持久力の改善用医薬、食品、又は化粧料である。

ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の医薬及び食品中の含有量は、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、1日のコエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトールの摂取量が１〜２０００／１〜５００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５００／１０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜３００／５０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。
すなわち、コエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトール比は、３／１００〜６０が好ましいが、そのうちでも１／５〜１が特に好ましい。

該組成物を摂取することを特徴とする抗疲労作用及び／又は持久力増強方法も本発明の範囲内である。摂取には経口、非経口いずれも含まれ、非経口には、注射、点滴、経鼻、皮膚または頭皮への塗布などによるものがある。

また、本発明の摂取及び／又は塗布の仕方には、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の両方を含む食品、製剤の摂取でもよく、また、片方のみを含む食品、製剤を同時に摂取してもよい。また、同様に両方を含む化粧量、製剤の塗布でもよく、また、片方のみを含む化粧量、製剤を同時に塗布してもよい。また、塗布と摂取は組み合わせて行ってもよい。

また、本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用は、本発明の抗疲労作用又は持久力増強作用を有する食品、抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を調製するための使用であれば特に限定されない。抗疲労作用及び／又は持久力増強作用に有効な組成物としては、抗疲労剤及び／又は持久力増強剤としての医薬、抗疲労作用及び／又は持久力増強効果を有する機能性食品、化粧料などが挙げられる。

その他、本発明における全リン脂質中における含有率が一定以上であるホスファチジルイノシトールは、コエンザイムＱ１０を効率的に吸収するための吸収促進剤として使用できる場合がある。ホスファチジルイノシトールの吸収促進剤中の含有量としては、コエンザイムＱ１０の吸収促進効果が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、1日のホスファチジルイノシトールの摂取量が１〜５００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは５０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。

また、本発明により少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有するアルコール代謝促進剤が提供される。アルコール代謝促進剤に使用されるホスファチジルイノシトールは、本発明の組成物中において使用される態様が好ましい。
アルコール代謝促進剤におけるホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の含有量は、アルコール代謝促進作用が得られる量であれば何ら限定されるものではないが、1日のコエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトールの摂取量が１〜２０００／１〜５００００ｍｇとなるような量、好ましくは１０〜５００／１０〜１００００ｍｇ、さらに好ましくは３０〜３００／５０〜１０００ｍｇとなるような量が良い。
すなわち、コエンザイムＱ１０／ホスファチジルイノシトール比は、３／１００〜６０が好ましいが、そのうちでも１／５〜１が特に好ましい。

本発明のアルコール代謝促進剤としての効果は、以下の方法により調べることができる。すなわち、ＩＣＲマウスに対してエタノールを投与し、投与２０分後にマウスを加速式ロータロッド上に乗せ、回転するロータロッド上に滞在することができる時間（ロータロッドに乗せてから落下するまでの時間）を測定することにより、アルコールによる平衡運動機能低下の程度を調べることができる。ロータロッド回転開始後、落下までの時間が長い程、平衡運動機能の低下が少ない、つまりアルコール代謝が促進されていると判断することができる。アルコール代謝促進作用は肝機能改善作用と考えることもできる。

本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する食品としては、これらを含有するものであれば何ら限定されるものでは無く、例えばホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有サプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、ホスファチジルイノシトール含有菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有油、ホスファチジルイノシトール含有油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有ケチャップ、ホスファチジルイノシトール含有ソース、ホスファチジルイノシトール含有流動食、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、ホスファチジルイノシトール含有パン類、コエンザイムＱ１０、ホスファチジルイノシトール含有麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、やきそば、きしめん、そーめん、ひやむぎ、ビーフン等）、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有スープ類（味噌汁、コーンスープ、コンソメスープ等）、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有ふりかけ等が挙げられる。

本発明に用いられるホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン、酸化チタニウム等）、食物繊維、各種糖類（セルロース、デキストリン、キチン等）、各種多価不飽和脂肪酸（アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸等）、各種共役脂肪酸類（共役リノール酸、共役リノレン酸、共役アラキドン酸、共役ＤＨＡ、共役ＥＰＡ、共役ＤＰＡ等）、各種リン脂質（レシチン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルＤＨＡ等）、各種糖脂質類（セレブロシド等）、各種カロチノイド類（β-カロチン、リコピン、アスタキサンチン、β−クリプトキサンチン、カプサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、各種フラボノイド類（ケルセチン、ルテオリン、イソフラボン等）、各種アミノ酸類（グリシン、セリン、アラニン、グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、システイン等）、その他の各種栄養素（還元型コエンザイムＱ１０、カルニチン、セサミン、α−リポ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、クルクミン、γ−オリザノール、グルタチオン、γ−アミノ酪酸、シネフリン、ピロロキノリンキノン、カテキン、カプサイシン等）、各種分散剤、各種乳化剤等の安定化剤、各種甘味料（ソルビトール、ショ糖等）、各種呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、蜂蜜、蜜ロウ、プロポリス、アガリクス、高麗人参、バイオペリン等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモンミール、ラベンダーなどのハーブ類を配合してもよい。また、テアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。

本発明の栄養補助食品とは、毎日の食事だけでは十分に取る事のできない栄養素を補うための食品が挙げられ、ミネラル又はビタミンが具体的に例示される。そして、人間が本来、持ちあわせている自治癒力を高め、免疫力を向上させ、病気の予防、病気の回復を手助けすることを目的とする食品も挙げられる。

本発明でいう機能性食品とは、保険機能食品が例示され、健康食品のうち、国が安全性や有効性などを考慮して設定した規格基準などを満たした食品が挙げられる。保健機能や栄養機能を表示することを認められ、食品の目的や機能等の違いにより、「特定保健用食品」と「栄養機能食品」に分けられる。

本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する食品には、ホスファチジルイノシトールを含有する食品と、コエンザイムＱ１０を含有する食品を含有する食品を組み合わせたキットも含まれ、また同梱されたキットも含まれる。

本発明のホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する医薬としては、これらを含有するものであれば何ら限定されない。該医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いてもよい。更に、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の吸収性を高めるために、賦型剤（アラビアガム、デキストリン、カゼイン等）の存在化又は非存在化、平均粒子系を１ミクロン程度まで微粉砕して用いることも可能である。

製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、マルトース、レシチン、アラビアガム、デキストリン、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。

注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ポーラス投与のいずれであってもよい。

本発明の、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有化粧料としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、ハップ剤、入浴剤などが挙げられ、香料等を混合してもよい。

本発明を製剤例、食品製造例、化粧料製造例、及び試験例に基づいて説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
［参考例１］ホスファチジルイノシトールの製造に用いるホスフォリパーゼＢ（ＰＬＢ）活性を有する酵素であってホスファチジルイノシトールに実質的に作用しない酵素の製造方法
３０リットル容積のジャーファメンターに、３％脱脂綿実粉、０．３％食塩、０．２％リン酸２カリウム、０．２％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、消泡剤０．３％から成る滅菌した培地２０リットルを入れ、同一培地で前培養（２８℃、４日間）したキャンディダ・シリンドラッセＡＴＣＣ１４８３０株の培養液１００ｍｌを無菌的に植菌した。植菌した培地に、１分間２０リットルの無菌空気を通気し、１分間３００回転で攪拌しながら２８℃で培養を行った。５０時間後、ＰＬＢ活性は最大値（０．２Ｕ／ｍｌ）を示した。得られた培養液を５０００回転、１０分間遠心分離を行い、１６リットルの上清を得た。この上清を限外濾過法により濃縮を行った。得られた濃縮液３リットルに９リットルの冷アセトンを添加し生じた沈殿物について、５０００回転、１０分間遠心分離を行って沈殿物を回収し、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと略す）（ｐＨ７．５）２リットルに溶解した。不溶物を遠心分離により除去し、予めカラムに充填したオクチルセファロース（ベッド容積；３００ｍｌ）に通しＰＬＢを吸着させた。次いで、２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄した。カラムに吸着されたＰＬＢは２％アデカトールＳＯ１２０を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出された（疎水クロマトによる精製）。次いで、溶出液（1リットル）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（ベッド容積；２００ｍｌ）に通してＰＬＢを吸着させ、前記の緩衝液でカラムを洗浄後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をかけてＰＬＢ酵素を溶出した。塩化ナトリウムが約０．１Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ａ、塩化ナトリウムが約０．２５Ｍ付近でＰＬＢ酵素画分Ｂを得た（イオン交換クロマトによる分離精製）。
酵素画分Ａ及び酵素画分ＢのＮ末端アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサーにより特定したところ、酵素画分Ａのアミノ酸配列は配列表配列番号１に示す配列であることが、また、酵素画分Ｂのアミノ酸配列は配列表配列番号２に示す配列であることがわかった。さらに、GENETEX WIN 5.2（ソフトウエア株式会社製）による相同性解析により、酵素画分Ｂの酵素画分Ａに対する相同性を解析したところ、８８．５％であることがわかった。

［参考例２］ＰＬＢ活性の測定法
ＰＬＢの酵素活性は、レシチンから生成されるＧＰＣを酵素法により測定した。すなわち、１Ｍ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ＭＥＳ−ＮａＯＨと略す）（ｐＨ６）０．０５ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ卵黄ホスファチジルコリン０．０５ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．２％ＴＯＤＢ０．０５ｍｌ、０．２％ ４−アミノアンチピリン０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．１ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．１ｍｌ、６Ｕ／ｍｌ ＧＰＣホスフォジエステラーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０５ｍｌからなる反応液０．５ｍｌを３７℃で２〜３分間予備加温した後、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し同一緩衝液で希釈したＰＬＢ溶液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加して反応を始め、正確に１０分後に０．５％ＳＤＳ１ｍｌを加えて反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、ＰＬＢ活性１単位は、１分間に１μＭｏｌのＧＰＣを遊離する活性とした。

［参考例３］リパーゼ（ＬＰ）活性の測定法
リパーゼ活性は、ジグリセリドを基質にして生成されるモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼでグリセリンに変換後、酵素法により測定した。すなわち１Ｍ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）０．１ｍｌ、３％トリトンＸ１００に溶解した１０ｍＭ１，２ジグリセリド０．０５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化カルシウム０．０２５ｍｌ、０．０５Ｍ塩化マグネシウム０．０２５ｍｌ、０．０５ＭＡＴＰ０．０５ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌモノグリセリドリパーゼ０．０５ｍｌ、５Ｕ／ｍｌグリセロキナーゼ０．０５ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌグリセロリン酸オキシダーゼ０．０２５ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ０．０２５ｍｌ、０．３％ＴＯＯＳ０．０２５ｍｌ、０．３％４−アミノアンチピリン０．０２５ｍｌから成る反応液０．５ｍｌに、０．０５％ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで希釈した酵素液（０．０３〜０．１５Ｕ／ｍｌ）２５μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた後、０．５％ＳＤＳを用いて反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、リパーゼ活性１単位は１分間に１μＭｏｌのグリセリンを遊離する活性とした。

［参考例４］ＰＬＢ酵素画分Ａのゲル濾過クロマトによる精製
参考例１で得たＰＬＢ酵素画分Ａを遠心型の限外濾過装置にかけ濃縮を行った。濃縮した液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で予め平衡化したゲル濾過クロマト（スーパーデックス７５）にかけ1分間あたり０．５ｍｌの流速で分離を行い活性画分を得た。
各分画において、参考例２及び３の方法によりＰＬＢ活性及びＬＰ活性をそれぞれ求め、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。各分画におけるＰＬＢ活性、ＬＰ活性、及び蛋白濃度の結果を図１に示した。
その結果、２８０ｎｍで測定した蛋白濃度（図中、Ａ２８０ｎｍで示す）とＬＰ活性及びＰＬＢ活性は、一致した溶出パターンを示し、ＬＰ活性とＰＬＢ活性を有する蛋白は同一酵素蛋白であることがわかった。

［参考例５］ＰＬＢの諸性質
５−１（反応の至適ｐＨ）
参考例２に示した反応液組成のうち、緩衝液として酢酸緩衝液（以下、Ａｃｅｔａｔｅと略す）、ホスファチジルイノシトールＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、ホスファチジルイノシトールＰＥＳ−ＮａＯＨと略す）、又はＭＥＳ−ＮａＯＨを用いて各ｐＨにおけるＰＬＢ酵素画分ＡのＰＬＢ酵素活性を測定し、ＭＥＳ−ＮａＯＨｐＨ６．０を使用したときの活性に対する各緩衝液での相対活性を求めた。その結果を図２に示した。
図２に示したように、ＭＥＳ−ＮａＯＨについてはｐＨ６付近で最大の酵素活性を示し、またホスファチジルイノシトールＰＥＳ−ＮａＯＨ及びＡｃｅｔａｔｅについてもｐＨ６付近で最大の酵素活性を示すことが予想された。

５−２（ｐＨ安定性）
Ａｃｅｔａｔｅ、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（以下、Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨと略す）の１０ｍＭの各種緩衝液に、５Ｕ／ｍｌになるようにＰＬＢ酵素画分Ａを溶解して３７℃に９０分間静置した後、参考例２の方法に基づきＰＬＢ活性を測定し、Ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ５における活性に対する各種ｐＨでの相対残存活性を求めた。その結果を図３に示した。
図３に示したように、ｐＨ５からｐＨ８の広い範囲で安定であることがわかった。

５−３（熱安定性）
５Ｕ／ｍｌになるように１０ｍＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）に酵素画分Ａを溶解し、参考例２の方法により０〜７０℃の温度範囲で１０分間加温した後ＰＬＢ活性を測定した。その結果を図４に示した。冷蔵保存した酵素画分ＡのＰＬＢ活性を１００％とした時の相対残存活性は、５５℃までの処理で９０％以上であり、熱に対して安定な酵素であることがわかった。

５−４（基質特異性）
参考例２に記載のＰＬＢ活性測定法により、参考例１のイオン交換クロマトで得られた２種類のＰＬＢ（酵素画分Ａ及び酵素画分Ｂ）の、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対する各種リン脂質についての相対活性を測定した。その結果を表１に示した。
その結果、酵素画分Ａ及び酵素画分ＢともにＰＣに対するホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の相対活性は他のリン脂質に比べて特に低く、ＰＬＢ酵素画分Ａ及び酵素画分Ｂは、リン脂質の中でもＰＩに対する活性が低いという基質特異性があることがわかった。また、表１の結果より、いずれの画分もＰＬＢ活性を有することからＰＬＢとしては両画分の混合物を用いることもできることがわかる。

５−５（分子量）
参考例１に記載した方法によって得られた酵素画分ＡはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で単一のバンドが得られた。分子量既知の蛋白をマーカーにして得られた分子量は５３キロダルトンであった。

５−６（等電点）
参考例１に記載した方法によって得られた酵素画分Ａについて、キャリアアンフォライトを用いたｐＨ勾配を作製して行う等電点電気泳動法により酵素画分Ａについての等電点を測定し、さらに２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白濃度を測定した。酵素画分Ａの等電点及び酵素濃度との関係を図５に示した。その結果、２８０ｎｍの吸光度で測定した蛋白が示すｐＨとリパーゼ活性及びＰＬＢ活性は完全に一致し、そのｐＨ値（等電点）は４．２１であった。図５からわかるようにＰＬＢ、リパーゼと蛋白（図５中のＡ２８０ｎｍで示すピーク）は全く同じピークを示したことからＰＬＢとＬＢは同じ酵素蛋白であることが明らかとなった。

［参考例６］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の定量法
１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）０．１ｍｌ、１０ｍＭ ＮＡＤ ０．０５ｍｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム０．０５ｍｌ、２％トリトンＸ１００ ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ ホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼ０．０５ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌイノシトールデヒドロゲナーゼ０．０５ｍｌ、５％ニトロテトラゾリウムブルー０．０５ｍｌ、精製水０．１５ｍｌから構成される発色液０．５ｍｌに、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含有する被検体（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を２％トリトンＸ１００に溶解してできたＰＩ溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応を行い０．５％ＳＤＳ０．５ｍｌで反応を止め、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知濃度のイノシトール水溶液をキャリブレーターに用いてＰＩ量を定量した。

［参考例７］ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の製造方法
１）４０グラムの大豆由来リン脂質を４００ｍｌの１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．８）に攪拌し懸濁させた後１４００単位のＰＬＢ（参考例１で得た酵素画分Ａ）を添加して４５℃で反応を開始した。反応終了後、固形物が生成し、液の流動性が悪いので、ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．５に調整する。
２）２０時間後に反応を止めエタノール２００ｍｌ、ヘキサン４００ｍｌを加え、５０℃、１時間攪拌した。ヘキサン層と水層とを分離して有機溶媒層を回収した。
３）この有機層に１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）３００ｍｌとエタノール３００ｍｌの混合液を添加し、ｐＨを酢酸を用いてｐＨ５．０に調整し、５０℃で、１時間撹拌させ、１時間静置し、ヘキサン層と水層を分離した。
４）回収した有機溶媒を減圧下で濃縮を行った後、濃縮物にエタノール４００ｍｌを加え、５０℃で１時間撹拌させた後、沈殿物をろ過回収し、更に４００ｍｌのエタノールを添加して、同様の操作を行い、生じた沈殿物を集め乾燥させ、ホスファチジルイノシトールを高濃度に含有する粉末６．２グラムを得た。得られたリン脂質の純度を基準油脂分析試験法（日本油化学会制定、基準油脂分析試験法2003年版）により測定した結果、全リン脂質中８８．９モル％であった。

［参考例８］参考例７の工程３）を実施しない製造方法
参考例７において工程３）の有機溶媒層の酢酸緩衝液とエタノールの混合溶媒による洗浄を実施せず、有機溶媒層を濃縮し、エタノール洗浄、沈殿物ろ過乾燥した場合のホスファチジルイノシトールのＴＬＣ分析結果を図６に示す。これより工程３）を実施した場合は遊離の脂肪酸を完全に除去できることがわかる。

［参考例９］参考例７の工程４）においてエタノールの代わりにアセトンを使用した場合の製造方法
参考例７の工程４）においてエタノールの代わりにアセトンを使用した場合のホスファチジルイノシトールのＴＬＣ分析結果を図７に示す。これよりエタノールを使用した場合はホスファチジルイノシトール以外の不純物（糖脂質等）を完全に除去できることがわかる。

［参考例１０］参考例７の工程４）の代わりにシリカゲルで不純物を除去した場合の製造方法
参考例７の工程３）の次に回収した有機溶媒を減圧下で濃縮した後、ヘキサン４００ｍｌを添加し、これを４００ｍｌのヘキサンで平衡化させたシリカゲルにチャージして、素通りするホスファチジルイノシトール画分を採取し、濃縮し乾燥させた。得られたサンプルをＴＬＣ分析したところ、参考例７のエタノールを使用した場合と同様にホスファチジルイノシトール以外の不純物（糖脂質等）が除かれた高純度ホスファチジルイノシトールを得ることができた。

［製剤例１］
＜錠剤＞
ホスファチジルイノシトール １２０ｇ
コエンザイムＱ１０ １２０ｇ
結晶セルロース ３３０ｇ
カルメロース−カルシウム １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース １０ｇ
精製水 ６０ｍｌ
上記の組成となるようにこれらを通常の方法にて配合、乾燥した後、１０ｇのステアリン酸マグネシウムを添加し、打錠を行い、１錠あたりホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０をそれぞれ２０ｍｇ含有する１００ｍｇの錠剤を得ることができる。

［製剤例２］
＜ソフトカプセル＞
ホスファチジルイノシトール２００ｇ及びコエンザイムＱ１０の２００ｇをオリーブオイル２００ｇに添加して、約６０℃で溶解、均一に撹拌した後に冷却し、コエンザイムＱ１０含有素材を得る。ゼラチン７０％、グリセリン３０％を混和、膨潤させ、溶解ゼラチンシートを作成する。このゼラチンシートに内溶液としてコエンザイムＱ１０含有素材を１カプセルあたり３００ｍｇの内容量になるように充填し、乾燥させ、１カプセルあたりホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０をそれぞれ１００ｍｇ含有するソフトカプセルを得ることができる。

［キット例］
製剤例１に記載した錠剤又は製剤例２に記載したソフトカプセルにおいて、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する代わりに、ホスファチジルイノシトール単独又はコエンザイムＱ１０単独を含有する以外は同様にして製剤（錠剤又はソフトカプセル）を作成することができる。該ホスファチジルイノシトール単独含有錠剤（又はソフトカプセル）及び該コエンザイムＱ１０単独含有錠剤（又はソフトカプセル）のそれぞれ１〜５個ずつを梱包して、ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０同梱キットを作成することができる。

［食品製造例１］
＜飲料＞
ホスファチジルイノシトール２５００ｇ及びコエンザイムＱ１０の５００ｇを６０℃に加温したグリセリン脂肪酸エステル１０ｇ及びグリセリン３０ｇに溶解させた。混合液に水を加えて１００ｍｌとし、乳化機（加圧ホモジナイザー）を用いて乳化処理して乳化組成物を得る。この乳化組成物１ｇに水を加えて１００ｍｌとし、撹拌してホスファチジルイノシトール（２５０ｍｇ／１００ｍｌ）及びコエンザイムＱ１０（５０ｍｇ／１００ｍｌ）含有飲料を得ることができる。

［食品製造例２］
＜パン＞
ホスファチジルイノシトール１ｇ及びコエンザイムＱ１０の１ｇ、砂糖１５ｇ、食塩２ｇ、脂肪粉乳５ｇを湯７０ｇに溶かし、鶏卵２個を添加してよく混ぜる。これを小麦粉１３０ｇとドライイースト２ｇを混合した混合物に加え、手でこねた後、バター約３０ｇを加えて更にこね、３０個のロールパン生地を作る。ついで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で１５分間焼き、ロールパンを得ることができる。

［食品製造例３］
＜うどん＞
小麦粉４００ｇに対して、水２００ｇにホスファチジルイノシトールを２ｇ、コエンザイムＱ１０を２ｇ及び食塩２０ｇを添加して、よくこねて寝かす。この後、生地を延伸し、幅約６ｍｍで切断してうどんを製造することができる。

[食品製造例４]
＜ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有飲料＞
コエンザイムＱ１０３０ｇ及び参考例７で得られるホスファチジルイノシトール３０ｇを５倍量のオリーブオイルに懸濁して５０℃に加温し、油相を得る。グリセリン９０ｇに乳化剤としてグリセロール脂肪酸エステル１０ｇを添加し、７０℃に加温して溶解させる。この溶液に先の油相を撹拌しながら徐々に添加する。混合液を、乳化機を用いて高圧乳化処理して乳化組成物を得る。この乳化組成物２０ｇに水１８０ｍｌを添加、撹拌してホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有飲料を得ることができる。

［化粧料製造例１］
＜クリーム＞
コエンザイムＱ１０、ホスファチジルイノシトール、ステアリルアルコール、プロピレングリコール、ソルビトール、パラベン、ビタミンＥ、香料、精製水を適当量、定法に従って配合し、クリームを得ることができる。
なお、製剤例１、製剤例２、キット例、食品製造例１〜４、及び化粧料製造例１については、コエンザイムＱ１０として酸化型のコエンザイムＱ１０を用いても、還元型のコエンザイムＱ１０を用いてもそれぞれ製造することができる。

［試験例１］抗疲労作用及び持久力増強効果試験
６週齢の雄性Ｓｌｃ：ｄｄＹマウス（日本チャールスリバー社）を用い、７日間の予備飼育後、１群１０匹で４群に分けた。群構成は、水を投与した群（対照群）と、酸化型コエンザイムＱ１０を５０ｍｇ／ｋｇ／日となるように投与した群（比較例１、ＣｏＱ１０単独投与群）、ホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように投与した群（比較例２、ホスファチジルイノシトール単独投与群）、及び酸化型コエンザイムＱ１０を５０ｍｇ／ｋｇ／日及びホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように同時に投与した群（試験例、ＣｏＱ１０＋ホスファチジルイノシトール投与群）とし、これらの投与条件で週５日間、強制経口投与を行った。投与後３週目にマウスに体重の８．５％の重りを付加して強制水泳させ、疲労困憊し、頭部（鼻）が完全に７秒間水中に沈むまでの時間を測定した。その結果を表１に示す。なお、試験例の酸化型コエンザイムＱ１０及びホスファチジルイノシトールは同時投与を行った。 表２に示す通りホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０含有食品投与群（試験例）は、対照群やコエンザイムＱ１０単独投与群（比較例１）あるいはホスファチジルイノシトール単独投与群（比較例２）と比較して、遊泳時間の顕著な延長効果が認められた。

［試験例２］
７週齢の雄性Ｓｌｃ：ＳＤラットを用い、７日間の予備飼育後、４匹のラットにホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように1週間強制経口投与（反復経口投与）後、ホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように同時に強制経口投与した（ＰＩ投与群）。ホスファチジルイノシトールと酸化型コエンザイムＱ１０を同時に強制経口投与した後、０、２、４、６時間後にジエチルエーテル麻酔下にてヘパリン処理した注射針及び注射筒を用いて後大静脈腹部より全採血する。採取した血液は直ちに遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を分取する。分取した血漿サンプルをＨＰＬＣ法を用いてコエンザイムＱ１０の分析を行った。比較例として、ホスファチジルイノシトールの代わりに大豆レシチンを５００ｍｇ／ｋｇ／日（ホスファチジルイノシトール換算で１００ｍｇ／ｋｇ／日）となるように1週間強制経口投与（反復経口投与）後、ホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように同時に強制経口投与した群（大豆レシチン投与群）、及びホスファチジルイノシトールを事前投与せずに、ホスファチジルイノシトールを１００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように同時に強制経口投与した群（ＰＩ非投与群）についても同様の操作を行った。
表３、表４の示す通り、ＰＩ投与群はＰＩ非投与群に比較して、血中のコエンザイムＱ１０濃度が高く、ホスファチジルイノシトールがコエンザイムＱ１０の生体内吸収性を促進していた。また、コエンザイムＱ９の酸化率はＰＩ投与群がＰＩ非投与群に比較して低い傾向にあった。大豆レシチン投与群は血中のコエンザイムＱ１０濃度は若干上昇したが、コエンザイムＱ９の酸化率（酸化型コエンザイムＱ９の総コエンザイムＱ９に対する値（％））はＰＩ非投与群と差がなかった。

［試験例３］
７週齢の雄性ＩＣＲマウスを用い、７日間の予備飼育後、１０匹のラットにホスファチジルイノシトールを２００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日となるように同時に６日間反復経口投与した。６日目投与後初速４ｒｐｍ、６分間で４０ｒｐｍに到達する条件で加速式ロータロッド上での落下速度を測定した。７日目投与後、１５％エタノールを２．０ｇ／ｋｇの用量で強制経口投与し、エタノール投与２０分後に６日目と同様に初速４ｒｐｍ、６分間で４０ｒｐｍに到達する条件で加速式ロータロッド上での落下速度を測定した。エタノール投与前日のロータロッド上での落下速度はホスファチジルイノシトールを２００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日投与した群と非投与群では落下速度に差は認められなかった。エタノール投与後のロータロッド上での落下速度はホスファチジルイノシトールを２００ｍｇ／ｋｇ／日と酸化型コエンザイムＱ１０を１００ｍｇ／ｋｇ／日投与した群は非投与群に比べ表５に示すとおり明らかに落下速度の延長が認められた。

本発明の抗疲労剤又は持久力増強剤、或いは、抗疲労作用又は持久力増強効果を有する機能性食品は、医薬及び／又は食品の分野で好適に利用できる。

Claims (20)

1. 少なくともホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を含有する組成物。
2. ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１に記載の組成物。
3. ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１又は２に記載の組成物；
   大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有する栄養補助食品。
5. 請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有する機能性食品であって、抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する機能性食品。
6. 請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有する化粧料。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤。
8. 少なくともホスファチジルイノシトールを有効成分とするコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
9. ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項８に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤。
10. ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項８又は９に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進剤；
    大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
11. 少なくともホスファチジルイノシトールを有効成分とするコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
12. ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率が５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１１に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品。
13. ホスファチジルイノシトールが、少なくとも下記の工程を含む製造方法によって製造されたホスファチジルイノシトールである請求項１１又は１２に記載のコエンザイムＱ１０の生体内吸収促進作用を有する機能性食品；
    大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
14. ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を組み合わせてなるキット。
15. ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取するために、ホスファチジルイノシトールを有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤と、コエンザイムＱ１０を有効成分として含有する抗疲労剤及び／又は持久力増強剤が同梱されたキット。
16. ホスファチジルイノシトールが、全リン脂質中における含有率を５０モル％以上のホスファチジルイノシトールである請求項１４又は１５記載のキット。
17. 少なくとも下記の工程を含むホスファチジルイノシトールの製造方法；
    大豆由来のリン脂質混合物に、ホスファチジルイノシトールを実質的に分解せずかつホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジン酸のいずれをも分解するキャンディダ属由来の酵素を作用せしめ、全リン脂質中のホスファチジルイノシトールの含有率を５０モル％以上とせしめる工程。
18. 抗疲労作用及び／又は持久力増強作用を有する食品、化粧料、あるいは抗疲労剤及び／又は持久力増強剤を調製するためのホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０の使用。
19. ホスファチジルイノシトール及びコエンザイムＱ１０を同時に摂取することを特徴とする疲労改善及び／又は持久力増強方法。
20. 請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有するアルコール代謝促進剤。

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