JPS63503035A - 原核細胞中でプラスミノーゲンアクチベータを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原核細胞中でプラスミノーデンアクチベータを製造する方法 本発明は、原核細胞中でプラスミノ−ｒンアクチベータを製造する方法に関する 。

プラスミノーデンアクテベータは人間及び動物の組織及び体液中に広く分布して いる。これはフィブリツリシスで中心的な役割を果たし、かつゾラスミノーデン をプラスミンに変化させる。プラスミンは血栓溶層作用に１要である。それ故、 プ゛ラスミノーデンアクチベータは血栓による血管閉塞の一床治療に非常に１袂 である。

例えは、公知のプラスミノ−ｒンアクチベータはプロウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ） 並ひに組織プラスミノーデンアクチペータ（ｔ−ＦＡ）である。

プロウロキナーゼは、プラスミンにより活性化石れる一本Ｍ型のセリンプロテア ーゼである（　’　Ｅｕｒ、　Ｊ。

（１９８５年）、ヨーロッパ公開特許第００９２１８２号〕。

ｔ−ＦＡも、種々の変態形で産出するセリンプロテアーゼ゛である〔ゝ動脈は化 （ＡｒｔｅｒｉＯａＣ１ｅｒｏａｉ８　）　’、４巻、５７９〜５８５頁（１９ ８４年）〕。

Ｍｉ＃又は細胞培養物から早離したｔ−ＦＡは低い活性（酵素前駆体）の形で一 本釦ｔ−ＰＡとしてグリコジル化されて存在する（分子量約７００００ダルトン ）。

プラスミン、トリジシン又はカリクレインによるこの酵素前駆体に対する制＠さ れた作用により、この前駆体は完全活性状態（二本鎖ｔ−ＦＡ）Ｋ変換される。

その際に、Ａｒｇ２７５と工ｌθ２７６との間の結合が切断される。貰い釦（Ａ −鎖）と牡い釦（Ｂ−鏝、プロテアーゼドメイン）か生じる。両方の釦はジスル フイＶ架橋により結合している〔ゝＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　’、２５６ 巻（７０３５〜７０４１頁（１９８１年）〕。

更に、ｔ−ＦＡとは僅かに異なる天然誘導体が公知である。分子の約５０％がＧ ｌｙ−Ａ：Ｌａ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（Ｌ−釦）で囲始し、ｔ−Ｐ Ａの他の約５０％ではＧｌｙ−Ａｈａ−Ａｒｇが欠けておりかつアミノ酸配列は Ｇｌｙ／Ｓθｒ−Ｔｙｒ−Ｇ４ｎ　（Ｓ−釦）で開始する。Ｉ、−４位もしくは ｓ−１位でＧｌｙ／Ｓｅｔの交換が行なわれていることもある［　’　ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ　’、１５６巻、４７〜５０負（１９８３年）〕。しかしこの 僅かな変態はｔ−ＦＡの生物学的作用に対して作用しない。

自然界の天然プラスミノーデンアクチベータは極く僅かな童（例えは血しよう中 でｔＰＡ約６ｎμ／１）でしか産出されないので、臨床的な適用及び科学的な目 的に必要とされる童のこのアクチベータを遺伝子工学的に製造すると有利である 。例えは、ｔ−ＦＡに関しては原核細胞中でのクローニング及び発現の方法〔Ｐ θｎｎ１ｃａ及びその他共著、′ネイチャー（Ｎａｔ、ｕｒｅ　）　’、３０１ 巻、２１４〜２２１頁（１９８３年）〕及び真核細胞中での発現法〔１バイオテ クノロジー（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　’、１２月８４．１０５８〜 １０６２頁〕が記載されている。真狙細胞中で発現されるプラスミノーデンアク チベータはグリコジル化されているが、原核細胞中で発現させる際にはグリコジ ル化は行なわれない。

原核細胞中で発現されたプラスミノーデンアクチベータは、グリコジル化された 天然産生アクチベータと同様に生物学的に作用すると考えられる。それという（ １９８４年）〕又はグリコジル化の阻害後〔１皿栓症及び止血（Ｔｈｒｏｍｂｏ ｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈ”ａｅｍｏａｔａｓｉｓ　）　’、５４巻、７８８〜７９１ 頁（１９８５年）〕のｔ−ＦＡでは、そのように製造されたグリコジル化されて いないｔ−ＰＡがグリコジル化された天然ｔ−ＦＡと同一の特注を有するからで ある。

従って、原残生物による問題のない醗醇及び子側される高い収呂故に、プラスミ ノーデンアクチベータを原核生物中で発現させるだめの方法に対して大きな関心 が寄せられている。しかし従来公知の方法〔例えばｔ−ＰＡＫ関して１ネイチヤ ー（Ｎａｔｕｒｅ　）　’、３０１巷、２１４〜２２１員（１９８３年）及びヨ ーロッパ特許第００９３６１９号参照〕は、主として所望の連鎖長を有していな い蛋白質が発現されるという欠点を有している。ベクターとしてのｐＢＲ３２２ によりＥ、コリ（ｃｏｌｉ　）甲でｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡを発現させる際に発現し た蛋白質の８０％より多くのものが僅か３２０００〜３６０００ａの分子蓋ヲ有 し、それ故ｔ−ＰＡの分解生成物より成ることが認められた。２０％より少ない 発現蛋白質は一本８　ｔ−ＰＡであり、その分子量は５７０００ｄである〔前記 のゝＮａｔｕｒθ′中に記載の配列に相当〕。

このように類似の化合物の混合物の謂裂は不経済で経費がかかる。

観察されるｔ−ＰＡ誘導体の形成は、原核生物中で組換え蛋白質を発現させる際 に長い間公知である現象との類似性を有する。つまり、種々のこのような蛋白質 に関して、蛋白質が完全に発現されるけれども、蛋白質分解作用を受けるので宿 主細胞中でのその半減期が極めて低いということが報告されている（ゝバイオテ クノロジーの１回（Ｔｒｅｎｄｓ　、ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　 ’、１巻、１０９〜１１３負（１９８３年）〕。この蛋臼質の分層を回避するた めに、様々な方法が提案されて−る。１つの方法は、分解に関与する蛋白貴分解 系を有していない宿生細胞の使用である。例えば、Ｅ、コリの１ｏｎ−変異株を 宿生細胞として使用することができる。この狸の変異株は欠失であるかもしくは 針先型で産生するプロテアーゼの１つである。Ｅ、コリには少なくとも７ａの他 のプロテアーゼが存在する〔ゝＪ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　’、１４９巻、１０２７〜１０３６頁（１９８２年）〕 ので、この方法は、発現される蛋白質がこれらの他のプロテアーゼにより分解さ れない場合にだけ適している。更に、好適な宿主細胞の選択は非常に限定されて いる。

蛋白質の分解は、蛋白質中でアミノ酸交換（ｃＤＮＡレベル（１ｂｅｎθ）で） によりプロテアーゼ切断位置を除去することにより回避することもできるはずで ある。

しかしそのためにはこの切断位置を初めにロスの多い方法により決定しなければ ならない。更に、アミノ酸の交換は蛋白質の活性及び完投学的特性を激しく変化 させ得る。

更に、クローニングベクター中にＴ、　７アージのアンチプロテアーゼ遺伝子を 組み込むことが公知である［　’　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｌ、　８ ｃｉ、　’、８０巻、２０５９〜２０６２頁（１９８３年）〕。この方法も一定 の組換え蛋白質にだけ好適であり、しかも蛋白質分解を不十分にしか抑制しない 。

更に、発現ベクターのコピー数を高めることにより、プロテアーゼを臭大な量の 組換え蛋白質で満たしてそのプロテアーゼの作用が比較的僅かなパーセントの組 換え蛋白質でだけ展開されるようにして発現を高めることが提案された。しかし この方法の欠点は、僅か１〜２世代で発現を莫大に高めなけれはならずかつより 長い時間実施することができないということである〔前記文献ゝバイオテクノロ ジーの方向（Ｔｒθｎｄｓ　ｉｎＢｉＯｔｅｃｈｎＯＩＯｇ７　）　’　：ｌ。

蛋白質分触を回避するための他の方法は、組換え蛋白質を既にｃ　ＤＮＡレベル で他の蛋白質との融合により保護することである。例えば、この方法はペプチド ホルモンのインシュリン及びンマトスタチンについて記載されており、その際に 融合成分としてβ−ガラクトシダーゼが使われる〔ゝサイエンス（５ｃｉｅｎｃ ｅ　）　’、１９８巻、１０５６〜１０６３頁（１９７７年）〕。

しかしこの方法は、保！！ｌ！蛋白質が一緒に発現しかつ精美する際に初めに分 離して除去しなければならないという欠点を有し、これは付加的な高い経費を意 味する。

遺伝子工学的に製造した蛋白質の分解を回避するために従来提案された方法のい ずれもが、蛋白質混合物からこうして製造されるＰム（プラスミノーデンアクテ ベータ）の問題を解決するのに好適ではないように思われる。

それ故、本発明のｖＫ題は、原槙生物中で先金でほぼ均一なプラスミノーデンア クチベータの発現を可能にしかつ生成物の分解を回避するだめの前記の方法の欠 点を有してｂない方法を開示することである。

ところで、複製が宿主ａ胞の染色体の複製から脱共役（θｎｔｋｏｐｐｅｌｎ　 ）　Ｌないか又は一時的にだけ脱共役し、それ故ｍＲＮムの形成が著しく低減す る発現ベクターを使用する際に１あるいはｍＲＮＡ形成が同様に低水準に低下す るようにプロモータが調節されるベクターを使用する際に、原核生物中での発現 で一本鎖プラスミノーデンアクチベータが高純度で生成するということが判明し 、かつ本発明はこれに基いている。

それ故、宿主細胞に好適であるベクター中に挿入されて存在している、プ２スミ ノーデンアクチベータをコードするｃＤＮＡを原核細胞中で発現させることによ りこのアクチベータを製造する本発明方法は、緊Ｍ調節（５ｔｒｉｋｔｅ　ｘｏ ｎｔｒｏ１１θ）されて込て、それ故複製が宿主細胞の染色体の複製から脱共役 しないか又は一時的に脱共役するに過ぎないベクターを使用し、かつ緩和調節（ ｒＱｌａＸｉｅｒｔｅ　ＫＯｎｔｒＯ１’ｌｅ　）が起らないかもしくはベクタ ーのプロモータが、説共役したシラスミドのｍＲＮＡ形成が緊縮調節下の場合よ りも大きくないよ５に調節される条件下で培＊１−実施することを特徴とする。

不発明は、望ましくない蛋白質混合物の形成は、極々の組成のｍＲＮＡ釦の混合 が惹起されることに帰因しておりかつ相応して低い転写速夏に調節することによ り回避し得るという驚くべき認識に基いている。

緊Ｍ−節されるベクターは、宿主細胞の成長の早期にそのコピー数を係数１０、 殊に係数６よりも多くは高めない。それは、一般に遺伝子工学で使用される、１ 　ローコピ（ＩＯＷ　ｃｏｐｙ　）−プラスミドと表わされる。

不発明方法に好適なそのようなベクターは、それが活性な蛋白質の生合成あるい はＤＮＡ−プロテアーゼｌをその増殖のために必要とするかどうかを試験して見 出すことができる。

ｑ″１．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　′、１１０巻、６６７〜６７６頁（１９７２ ４）から、クロラムフェニコール又はスペクチノマイシンのような蛋白質生合成 の阻害物質を添加することにより、緩和調節されているベクター（例えばＣＯ’ ＬＥ　ｌ屋のベクター、］）ＢＲ３２２）ではプラスミド複製が染色体の複製か ら脱共役されかつベクターのコピー数が１００〜１０００よりも多く増幅し得る ことが知られている。主にこの％ａが、合成にこれらのベクターを優先釣に使用 する理由である。しかし本発明による使用に好適な、緊縮調節されているベクタ ーはこの方法により係数１０倍、殊に係数６倍よりも多くなく最高給５０のコピ ー数に増幅することができる。

成長の開始前に、ベクターは１ｍ胞当りコピー１〜５０、殊に２〜２０、特に２ 〜１０のコピー数で存在する。ベクターの開始コピー数が下のａ曲（１０又はそ れ以下）である場合、増幅係数がその範曲の上限（１０近く）にあるようなベク ターが優れている。開始コピー数が既に約２０〜５０である場合には、増幅係数 を可能な限り低くすると有利である。増幅係数が６又はそれ以下だと特に好適で ある。

ベクターとしては特に原核生物のプラスミドベクター、ファージベクター及び両 方の組合せが好適である。

緊線される優れたプラスミドベクターはｐＲ８Ｆ　１０１０　％ｐＫＮ　４０２ 及びｐＡＯＹｏ　１７７並びにこれらから誘導される、有利にその特徴的な配列 １０ｒｉとして有するプラスミドである。プラスミドＰＫＮ　ｄ　０２及びｐＡ ｃＹｃ１７７は特に優れている。１）ＫＮ　４０２の複製は温度上昇により染色 体の複製から脱共役することができる。それ故、コピー数を簡単な方法で高める ことができる。しかしこの際に一本録ではなＬｎＰａの著しい上昇が認められる 。それ故、脱共役が起らない温風を培養に選択しなければならない。表１及び２ は、緊縮調節又は緩和−節されている数種のベクターに関してコど一数及び−不 知Ｐａの形成をこれらのベクターにより発現される蛋白質の％で示している。

場合により、ｔ−Ｉ’ＡＩ色体のｍＲＮＡコピーの形成を、高いコピー数で存在 するベクター（ハイコピーベクター　：　ｈｉｇｈ−ｃｏ、ｐｙ−Ｖｅｋｔｏｒ ｅｎ　）を使用する際に所望通り低くするには、ベクターのプロモータを、ｍＲ ＮＡ形成（転写）が前記の緊縮８１１節されるベクターと同じ程度に低いｍＲＮ Ａ形成となるようにｈｍすることである。

それ故、強力なプロモータを有するこのようなハイコピーベクターを使用する吻 合に、不発明ではプロモータは弱く誘発されて、ｔ−ＦＡ遺伝子のｍＲＮＡへの 低い転写が行なわれるに過ぎない。例えば、このためにノ・イコピーベクターの プロモータを相応して阻害するリプレッサーを形成する宿主細胞を使用し、その 際に、この阻害は相応して低い量の誘導物質の添加により抑えることができる。

例えはこのためには、１ａＣ−ベルミアーゼを生成せずかつ１ａｃ−リプレッサ ーを過剰生産するように形質転換し得るＥ、コリ変異株が好適である。それ故、 強力な１ａｃ−プロモータを有するハイコピープラスミドと一緒に使用する場合 、プロモータは強く抑制されて、ｍＲＮＡの形成は抑えられる。それ故、誘導物 質の添加により所望の低いｍＲＮＡ形成が達成される。このような変異株の代表 的な例はＥ、コ！ｊＫ１２株、ＤＳＭ２１０２又はＤＳＭ　２０９３である。こ れをプラスミドｐｅｔａ　１１９　（ＤＢＭ　３６９　ｔ　Ｐ　）で形質転換す る場合には、１ａｃ−リプレッサー過剰生産者が該当する。これは、ｔ−ＦＡ遺 伝子が１ａｃ−プロモータのコントロール下に置かれてｂるハイコピーシラスミ ドで、所望のｍＲＩＪＡ形成のために、必要な誘導物質、例えは工ＰＴＧ　（イ ングロビルーβ−Ｄ−チオが２クトシド）を相応する少り量で又は１ａｃ−ベル ミアーゼ朱ＩＩ要求変異株では２クトースを添加して使用することができる。後 者の場合、誘導物質ラクトースの少い配量はその極めて緩慢な細胞への浸透によ り行なわれる。

ｔａｃよりも低い効ぶのプロモータを使用する場合、完全に誘導される際には相 応して高いベクターのコピー数が許容される。プロモータ強度はコピー数に反比 例して選択し得るか又はプロモータの使用は相応して低い誘導により制限しなけ ればならない。

発現ベクターのコピー数を限定することにより達成される、ｔ−ＦＡ断片が産生 じないという効果は次のようにして達成することもできる： 強力なプロモータ（ｔａｃ　）を有するハイコピー発現クトース等）の添加によ りｔ−ＰＡ合成が誘導される。

これは培地中で工ＰＴＧ　Ｏ，５〜５ミリモルの量で完全に行なわれる。これに 対し、ローコピーベクターを同じの形成が認められるが、屈折体中へのｔ−ＰＡ の断片のとり込みは認められない。ハイコピーベクターで工ＰＴＧ添加量ｔ　ｏ 、ｏ　ｉミリモルに低下させる際に、完全な工ＰＴＧ誘導ではローコピー系と同 じ純粋な屈折体が得られる。この効果は、ｔａｃより不良のプロモータでも同様 に遅成嘔れる。ベクターのコピー数は、そのプロモータがｔａｃ−プロモータよ りも低い動量である分だけ上昇し得る。部ちプロモータの効慝”１０では可能な プラスミドコピー数の上昇は、使用されるローフビープ２スミドに対し【係数１ ０である。

本発明方法の両方の方法ではローコピー系の使用が優れている。本発明による強 力なプロモータを有するローコピー系の利点は、醗酵における系の易取扱い性で ある。この際に誘導は低す経費で実施することができる。それというのも誘導物 質の量は調節により強く制御する必要はなく、記載したように、単槽系（Ｅｉｎ ｔｏｐｆ−８ｙｓｔｅｍ　）が機能するからである。また、ｌａｃ系を介するこ の誘導はｔｒｐ系を介する制御よりも優先する。それというのもラクトースの使 用により細胞の成長が一緒に制御され得るからであり、これはｔｒｐ−欠乏技術 （ｔｒｐ−Ｖｅｒａｒｍｕｎｇｓｔｅｃｈｎｉｋ：Ｇｅｎａｎｔｅｄｒ）ではあ まり簡単には可能ではない。

一般に、ベクターの分子、量は１０６〜１０８ダルトンである。ベクターはプラ スミノ−ｒンアクチベーターｃＤＮＡ、例えばｔＰＡ−ｃＤＮＡ以外に有利には 調節−及び天端配列並びに選択マーカを含有してよい。特に、プロモータとして はｔａｃ−及びｔｒｐ−プロモータが好適であることが明らかになった。このベ クター中へのｃＤＮＡの挿入は任意の配向で行なうことができる。

宿主細胞としては原核細胞が好適である。Ｅ、コリ、クレー７’シエラ争プノイ モニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ　）　、シンイドモナス・ エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｅ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　、プソイ ドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕａｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｌａａ　）及びバチルス０ スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌｉｓ　）が有利であることが明ら かＫなった。Ｅ、コリの例えば菌株ＤＳＭ　３６８９並びにシンイドモナス・プ チダの菌株ＤＳＭ　２１０６が特に優れている。

宿主細胞は、使用されるベクターに相応して、ベクターが宿主中で良好に複写さ れるように選択すると有利である。好適なベクター／宿主の組合せは当業者に公 知である。その都度使用するプロモータに好適な調節体（リプレッサー）、例え ば１ａｃ−又はｔａｃ−プロモータに対して１ａｃ−リプレッサーを含有する宿 主を使用すると有利である。

不発明の範囲でプラスミノーデンアクチベータとしては、ゾラスミノーデンを活 性化する作用を前記の意味で有するすべての蛋白質、殊にｔ−ｐム及びプロウロ キナーゼ並びにそれらの誘導体である。

誘導体では、例えは１個又はそれ以上のドメインが部分的にもしくは全部欠損し ている天然誘導体並びに人工的に製造された誘導体が挙げられる。この方法は、 １個又は数個のアミノ酸が又換されている誘導体にも好適である。

この方法は、天然ｔ−ｐム並びに公知の天然ｔ−ＦＡ分子から誘導されている（ 第１囚参照）が、アミノ酸４６〜７２０１つで開始しかつアミノ酸１７９〜１１ ３０１つで終結している完全ｔ−ＰＡ分子の連鎖の断片が欠損しているｔ−ｐム 誘導体を発現するのに特に好適である。例えはそれは西ドイツ国特許出動第Ｐ３ ６４３１５８．３号に記載されている。この命名法はＰｅｎｎ１ｃａ　（前記文 献）により記載された命名法と同じである。

プラスミノーデンアクチベータをコードｊ　ルｃＤＮＡのベクター中への挿入は ここで詳説する必要のない当業者に常用の方法により行なう。例えばｔＰＡ誘導 体を製造する際に、完全ｔＰＡ分子に比べて該誘導体に欠けているアミノｅｋｔ 配列をコーＦする断片をｔ−ＰＡ−ＤＮＡから、相応する制限エンドヌクレアー ゼにより切断し、所望のｔＰＡ誘導体をコードする断片を結合させ、このようＫ して得られたｔＰＡ誘導体−〇ＤＮＡを本発明により好適なベクターを介して原 核生物中に尋人しかつそこで発現させて行なう。この場合、ｌ！′Ｉｌ咋エンド ヌクレアーゼとしては符にｃＤＮム配列の範囲ｂｐ　３１５〜ｂｐ　７２６　（ Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｋ、’　Ｎａｔｕｒｅ　’、３０１　巻、２１４〜２２１頁（ １９８３年）参照〕において切断するような酵素が好適である。

制限エンドヌクレアーゼの組合せＤｒａ　ｉｌｌとＭａθｍはアミン＆４５〜１ ７９の除去に、又はＤｄｅＩとＭｎｌ　ｌはアミノ酸４５〜１７１の除去に韮ひ にＤｄｅ　ｌはアミノ酸４５〜１７４及びＦｎｕ　Ａ　Ｅはアミノ酸５２〜１６ ８の除去に及びＲｓａ　ｌはアミノ酸６７〜１６２の除去に特に好適である。

ベクター中での再結合に当って、殊にリンカ−の使用下に公知方法を適用する。

引続いて、このベクターを原俵生物中に公知方法により導入しかつ例えばｔＰＡ 誘導体のようなプ２スミノーｒンアクチベータを発現させる。

−製ベクタＴの製造に当っても、イントロンを含有する完全ＤＮＡから出発する ことができる。このためにＤＮＡ　、例えばｔＰＡ−ＤＮＡをマニアチス・デン バンク（Ｍａｎｉａｔｉｓ−Ｇｅｎｂａｎｋ　）から単離し、選択したベクター 中に挿入する。

更に、ＰＡ産生細胞系（Ｐｅｎｎ１ｃａ　者、′＠記文献）からｍＲＮＡ　ｆ単 離しかつ多量分別（Ｇｒ″６Ｂｅｎｆｒａｋｔｉｏｎｉｅｒｕｎｇ）により分離 することができる。それからｃＤＮＡ　ｈ造しかつ生成りローンを試験すること により、ＦＡのコード領域を官有するクローンを見出すことができる。そのため に、相応して構成されているオリゴヌクレオチドで雑種形成するクローンを選択 する。

不発明により、アミノ酸４５〜１７９が欠損しているｔＰＡ誘導体を製造すると 特に優れている。例えは、これはｃ　ＤＮＡレベルで、？！ｉｌＪ限エンドヌク レアーゼＤｒａｌｌｌできる。引続いて、リガーゼで連結する。その後、不発明 によるベクター系で原核生物中で発現させる。真核生物中で発現させる際にこの ように生成したｔＰＡ誘導体は分子量約４３０００Ｄを有する。

本発明により、実質的に純粋なプラスミノ−ｒンアクチベータが主として不溶注 不活性形（屈折体）で得られ、これは分離後に可溶性の活性形に変換することｔ ＰＡ用発現プラスミドのｖｊｉ製： ａ）　ｐＢＲ３２２０ｒｉ　ｔ−有するプラスミドの使用下に発現プラスミドの ＷＡ製： 出発プラスミドとしてプラスミドｐＢＴ　９５　（ＤＢＭ３６１１Ｆ、西ドイツ 国特許第３５４５１２６号）を使い、このプラスミドからプラスミドｐｅＰａ　 ９８．１１”次のように製造した：このシラスミドを酵素Ｂｇｌｆｌで切断しか つヌクレアーゼＳ１で後処理する。更に′ｆ＃素Ｓｃａ　ｌで切断することによ り、フラグメントａが調製的に得られ、これは約７６０個の塩基対を有しかつｔ ＰＡ　’ｉコードするヌクレオチド配列１９２〜９５２（Ｐｅｎｎｌｃａ者、前 記文献）を富有する。７ラグメントｂも同様にｐＢＴ　９５からＳｃａ　ｌ及び Ｈｌｎｄｍで切断することにより得られる；これによりｔＰＡヌクレオチド配列 ９５６〜２１６５を含有する約１２００の塩基対の７ラグメントが得られる。パ ートナ−Ｃはリンカ−として合成されかつ次の配列を含有する：５　’　ＧＡＡ ＴＴＯＴＴＡＴＧＴＯ３’３’　ＧＡＡＴＡＣＡＧ５’ 構成中のパートナ−ｄとしてはシラスミＹ　ｐＫＫ２２３−６（ＤＳＭ　３６９ ４　Ｆ　）を＃累ＢａｏＲｌ及びＨｌｎｄ　［１によりポリリンカーで切断する 。パートナ−ａ　％　（Ｌを連結する。連結反応バッチを常法によりＴ４−リガ ーゼで処理し、引続いてＥ、コリ細胞（ＤＳＭ３６８９）中で形質転換させる。

形質転換細胞を培地上で５０μ、９／ゴーアンピシリンの添加下に培養する。

得られたクローンから、プラスミドｐｅＰ＆　９８．１を担持するクローンを選 択する。このｐｅｔａ　９８．１は出発７’／ＦスミｒｐＢＴ　９５及びｐＫＫ 　２２３−３とは、シラスミ）’　ｐＫＫ　２２３−３のポリリンカーにお込て ＥｃｏＲｌとＨｌｎｄ　ｍ−切断部位との間にｔＰＡヌクレオチド配列１９２〜 ２１６５を正しい配列で富有することにより異なっている。

ｂ）　１ｍ度感受性複製−加注を有するｔＰＡ用発現プラスミドのｖ！４表： ｉａ）で製造したｆ２スミドｐｅＰａ　９８．１から、Ｘｈｏｌで切断すること により約１．８５ｋｂの７２グメントが得られ、これはｔＰＡをコードしかつｔ ａｃグロモータを官有する。この７″）グメント中にはｔＰＡをコードするヌク レオチド配列１９２〜１８０９が変化せずに官有されている。デッキジヌクレオ シドトリホス７エート４個全部の存在においてフレノウ酵素で処理することによ り、Ｘｈｏ　ｌ切断部位の５′−突出（’１ｉｂｅｒｈ＾ｎｇｅｎｄ　）末端が 満たされる。復興と、それ故コピー数が温度−節により作用される受容シラスミ Ｐ　ｐＲＥＭ　２３５４（ＤＳＭ　３６９０　Ｍンを酵素Ｃ１ａ　ｌにより線状 にしかつ５′−突出（Ｍｂｅｒｓｔθｈｅｎｄ　）天端はデソキシヌクレオシｒ トリホスフェート４個全部の存在においてクレノウ＃素により満たされる。この ように準備したパートナ−分子を連結反応バッチ中で合する。Ｅ、コリ細胞（Ｄ ＡＭ　３６８９　）中での形質転換後、細胞をクロラムフェニコール２５μ９／ ＩＬｔｔ−含有する培地上で培養する。

温度は僅か６０℃である。このようにして得られたクローンのうち、シラスミド ｐｅｔａ　１００−１を含有するものを選択する。このシラスミドは出発プラス ミド］）ＲＩＭ　２３３４とは、ｔＰＡをコードするｘｂｏ　Ｉ　７２グメント を含有する点で異なっている。このことは、このクローンのプラスミド管単離し かっＢａｎ　Ｅ工で切断することにより検査する。その際にｐｅｔａ　ｉ　ｏ　 ｏ、ｉ分子は約６．８５及び２．１５　ｋｂである２つの７，７グメントに切断 される。

ｃ）　Ｅ、コリ中でもプンイドモナス・グチダ中でも使用することのできるｔＰ Ａ用発埃ベクターの一製：クレノク＃素で処理した例１　ｂ）に記載のＷｈｏ　 Ｈ７ラグメントを再度使用する。受容プラスミドとしては、Ｈｐａ　ｌで線状に なるプラスミドｐＲＩｃＭ　３０６１　（ＤＳＭ３６９２Ｆ）を使う。両方のパ ートナ−分子を一緒に連結反応バッチ中でＴ４−！ｊガーゼで処理する。Ｅ。

コリ細胞（ＤＳＭ　３６８９　）中で形質転換しかつ良好に形質転換された細胞 をカナマイシン２５μｇｉｒｎｔを含有する培地で培養することによりクローン が得られた。

これらのクローンから７′ラスミドｐｅｔａ　１０７−８　ｔ”含有する細胞を 選択する。このシラスミドに出発ベクター　ｐＲＥＭ　３０６１とは、記載のＸ ｈｏ　ｌ　７ラグメントを含有するので異なっている。プラスミドをａｌｌ胞か ら取得しかつ酵素Ｂｓｔ　Ｅ　Ｉにより分析的に切断する。そＧ゛際に１０．８ 及び１．３ｋｋ＋のおおよその大きさの２つの７２グメントが得られる。このプ ラスミドは菌株シンイドモナス・プチダの細胞中で形質転換することにより導入 することができる。

そのために、菌株プソイドモナス・プチダ（ＤＳＭ２１０６）の細胞を初めにグ ラスミドｐｅｔａ　１１９（ＤＳＭ　３６９１　Ｆ　）で形質転換しかつカナマ イシン２５μｊｌ／ｌｔを含有する培地上で選択する。いまやこのプンイドモナ ス・プチダ細胞は１ａＣ−リゾレッサーを多１に産生ずる状態のグラスミドを官 有する。

形質転換体をストレプトマイシン５０μ、９／ＨＪを含有ｊる培地上で選択し、 その後プラスミドｐｅｔａ　１１９並びにｐｅｔａ　１０７−８　ｋ含有する。

シラスミドｐｅＰａ　１１９の存在はｌａｃ　−１）プレツサー蛋白質の生成に より細胞中でのｔＰＡの生成を抑制する。この蛋白質はｔａｃ　−７’ロモータ からの転写をプンイドモナス・プチダ中でも抑制し得る。

ｄ）　ｐＡ（！ＹＣ１７７０ｒｉを含有するｔＰＡ用発現プラスミドの胸裏 フレノウ酵素で処理した約Ｌ８５ｋｌ）のＸｈｏ　ｌ　７ラグメントを使用する （例１　ｂ）から）。これを７ラグメントａと表わす。７ラグメントｂはｐＫＫ 　２２３−３から調製し、つまりＢａｎ　ＨＩで切断しかつＳ１ヌクレアーゼで 処理する。引続いて酵素Ｐｖｕ　ｌで後切断し、このようにして約１．０５ｋｂ の７２グメントが得られ、これは転写読み終り暗号（Ｔｒａｎｓｋｒｉｐｔｉｏ ｎｓｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　）及びβ−ラクタマーゼ遺伝子の５′−ポーション （Ｐｏｒｔｉｏｎ　）　を含有する。フラグメントＣはプラスミドｐＡＯＹｏ　 ｌ　７７　（ＤＳＭ　３７５９３　Ｐ　）　ｆ　Ｂａｎ　Ｈｌで切断しかつ引続 いてＳ１ヌクレアーゼ消化により得られる。

このバッチを部分的ＫＰｖｕＪで後切断する。調製的に約２．９　ｋｂの７２グ メントが得られる。７ラグメントａＸ　ｂ及びＣを連結反応バッチ中で合する。

Ｔ４−！Ｊガーゼで処理した後で、この連結反応バッチをＥ、コＩＪ　（ＤＳＭ 　３６８９　）の細胞中で形質転換する。引続いてこの細胞をカナマイシン２５ μＩ／ｄ及びアンピシリン５０μ／ｉ／ＨＡを含有する培地上に塗布する。生成 りローンから、シラスミドｐｅＰａを担持するものを選択する。これは出発プラ スミＹ　ｐＡＣＹＣ！　１７７とは、ｔＰＡをコードする１９２〜１８０９の配 列を変らずに含有しかつ付加的にプラスミドＰＫＫ　２２３−３からの転写読み 終り暗号を含有する点で異なっている。プラスミｒを単離しかつ酵素Ｂｓｔ　Ｉ Ｃｌで分析的に切１！ｆｒｊる。大きさ約６．９及びｉ、９ｋｔ＋の２つの７ラ グメントが得られる。

例　２ 原核細胞中でのｔＰＡ蛋白質の発現 ａ）ｉａ）、ｂ）、Ｃ）及びｄ）で製造したプラスミドをｌａｃ　ｌ　−プラス ミドを含有するＥ、コリ（ＤＳＭ３６８９）甲で形質転換する。形質転換体を、 １ａ）゛、Ｃ）及びｄ）からのプラスミドに関してはアンピシリン５０μ９／ｘ ｔｌを含有しあるいは１ｂ）からのプラスミドに関してはクロラムフェニコール ２５μ９７ｍ１．を含有する培地で選択する。プラスミドｐｅｔａ　９８．１、 ｐｅｔａ　１００．１、ｐｅｔａ　１０７．８又はｐｅＰ＊　１３３を官有する ｍ胞を培養ブイヨン中でＯＤｓｓｏｎｍ　＝　０．４まで通気下に培養し、かつ その後工ＰＴＧ１００！Ｊモルの添加下に誘導する。

恒温保持をニブラスミドｐｅＰａ９８−１　、ｐｅｔａ　１０７−８及びｐｅＰ ａ　１３３では３７℃で及びシラスミドｐｅｔａ１００．１では６０℃で行なう 。工ＰＤＧの存在において通気下に４時間恒温株付した後で、細胞を採取しかつ 砕解する。そのために１５分間水上でリゾチーム０．５　ｔｔＭ／ｒｄテ処理す るｌａｌｍｘＯＤｌ　０／ａｊ）、）リス緩衝液ｐＨ８，６を使用する（　ＥＤ ＴＡ　１００ミリモル／ｌ及び１Ｊ３ｃｌ　１００ミリモル／ｌを含有するトリ ス−ＥＣ１０，１モル／／）。その後、細胞を超音波処理により砕解する。この ようにして得られた懸濁液を１０分間２００００．９で遠心しかつ上漬みを廃果 する。沈積物はｔＰＡを不活性形で含有する。これは西Ｖイツ国特許３５３７７ ０８号に記載の方法により溶解しかつ回復させることができる。しかしまたペレ ットを５ＤＳ１％及びメルカプトエタノール１００ミリモル／ｌ”を添加するこ とにより溶解しかつ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離す ることもできる。

この電気体動の後で蛋白質をクマシープルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｓｂｌｕｅ　） により着色することＫより蛋白質バンドを可視化することができる。主に、プラ スミドｐｅｔａ　１００．１、ｐｅｔａ　１０７．８又はｐｅＰａ　１３３を有 する細胞からの抽出液はグリコジル化されていないｔＰＡ−蛋白質の大きさに相 当する約５７０００ダルトンの分子量の蛋白質１ｉを含有する。プラスミドｐｅ ｔａ　９　ｓ、ｉ　ｔ−有する細胞からの抽出液は主に大きさ３２０００〜３４ ０００ダルトンの物質と僅少量の５７０００ダルトンを含有する。同足した蛋白 質パンＦは、ウェスタン・ブロード伝（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ−Ｖｅｒｆａ ｈｒｅｎ　）によりヤイからの抗ｔＰＡ−ＰＡＫ−接合体で等価的に免疫学的に 検出することができる。

ｂ）例Ｉ　Ｃ）によりシラスミドｐｅｔａ　１１９及びｐｅｔａ　１０７．８で 形質転換したプソイドモナスφプチダ細胞（ＤＳＭ　２１０９　）を３０℃で培 養ブイヨン中で’　Ｄｓ５ｏｎｍ　””　０−４まで通気下に培養し、その後工 ＰＴ０１０ミリモルの象加下に誘導する。工ＰＴＧの存在において３０℃で通気 下に４時間恒温保持した後で起胞を採取しかつ砕解する。史に例２　＆）に記載 したように行なう。細胞抽出液のゲル電気泳動及びクマシープルーによる蛋白質 の染色後に、主に抽出液中に分子量約５７０００ダルトンの蛋白質が認められる 。この蛋白質はウェスタン・ブロード法によりヤギからの抗−ｔＰＡ　−ＰＡＫ −接合体でｔＰＡ−蛋白質として免疫学的に検出可能である。５７０００ダルト ンより小さい蛋白質は一般に免疫学的に記載の方法でｔＰＡとして検出すること はできない。

例　３ 高いコピー数及び低ｂコピー数を有するベクタープラスミドのｔＰＡ発現の比較 プラスミドｐｅｔａ　１００．１を含有するＥ、コリ菌体（ＤＳＭ　３６８９　 ）を使用する。この細胞を培養ブイヨン中ＯＤ５ｓｏｎｍ　−０−４まで通気下 に６０℃で培養する。

工ＰＴ０１０ミリモルの添加により誘導する。このバッチｔ３４ｆＡの同−容量 部に分ける。それぞれ１／Ｉずつを６０℃、３７℃又は４２℃で４時間ＩＰＴＧ 　ｏ存在において更に恒温株持する。引続いて、細胞を採取しかっ例２に記載し たように砕解する。抽出液の５ＤＳ−デル電気泳動後、ｔＰＡ−蛋白質バンドを クマシー・ｆルーで可視化することができる。３０’Ｃバツチからの抽出液は主 に分子量５７０００ダルトンの蛋白質を含有ｊる。６７℃及び４２℃のバッチか らの抽出液は大きさ５７０００ダルトンの蛋白質を僅少割合で含有するだけであ り、大部分は３２０００〜３４０００ダルトンである。これらの蛋白質パンｒは ウェスタン・ブロード法によりヤギからの抗−ｔＰＡ　−ＰＡＫ−接合体で等価 であることを免疫学的に証明することができる。

プラスミドｐｅＰａ　１００−１は高い温度で強く複製され、これは細胞中での プラスミドのより高ｂコピー数に案内する。この高いコピー数は、大きさ５７０ ００ダルトンの不活性ｔＰＡ−蛋白質を取得する際に不利に作用する。

例　４ 原核生物からｔＰＡ−蛋白質の復元 例２及び３により得られたｔＰＡ−蛋白質を含有する細胞フラクションを西ドイ ツ国特許第３５３７７０８号に記載の方法により溶解しかつ回復させることがで きる。その際に、３０℃で培養させたｐｅｔａ　１０７．８、ｐｅｔａ　１３３ 又はｐｅｔａ　１００．１を含有する細胞ｏｍ出液から、３７℃又は４２°Ｃで 培養させたｐｅ’Ｐａ　９８．１あるいはｐｅｔａ　１００−１を含有する細胞 よりも約１０倍活性のｔＰＡが得られる。得られた活性ｔＰＡはそれぞれフィブ リンにより刺激性である。一般に、その刺激性は１０倍より太きい。

例　５ ｔＰＡの半減期を決定するドメインの欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　） ａ）　ｔＰＡ−突然変異蛋白質−遺伝子の調製出発物質としてプラスミドｐｅＰ ａ　９８−１を使用する。

このプラスミｒから、Ｘｈｏ　ｌ切断を介してｔａｃ−プロモータを有するｔＰ Ａ−コードの７２グメントが得られる。このフラグメントは約１．８５ｋｂの大 きさでありかつ突出末路で、ダンキシヌクレオシドトリホスフェート４個すべて の存在においてクレノウｗ＃素で処理することにより完全に浩だされる。工程Ａ では、このフラグメントを酵素Ｄｒａ　■で切断しかつ突出天端をヌクレアーゼ Ｓ１で消化させる。グル電気泳動により塩基対約６７０の大きさの７ラグメント が得られる。工程Ｂでは同じＸｈｏ　ｌ出発フラグメントを酵素Ｍａｅ　［１で 切断しかつ同じように８１で後ｍ化させる。引続いて付加的にこのバッチを酵素 Ｓａｃ　ｌで処理する。グル電気泳動によりこのバッチから塩基対約７００の大 きさの７ラグメントが単離する。バッチＣではベクタープラスミｒｐθＰａ　９ ８−１を酵素Ｂａｎ　Ｈｌで切断しかつ突出、１ｌｔ−テンキシヌクレオシドト リホスフェート４個全部の存在においてフレノウ＃紫により満たしかつ＃索８ａ Ｃｌで後切断する。引続いて、グル電気泳動により最大フラグメントがこのバッ チから得られる。連結反応バッチ中でバッチＡ、Ｂ及びＣから得られたフラグメ ントを一緒にしかつＤＮＡ　−リガーゼの添加下に連結させる。

連結混合物をｌａｃ　ｌｑ−プラスミｒｔ−含有するＥ、コ’Ｊ　ＤＳＭ　３６ ８９中で形質転換させかつ生成した形質転換体をアンピシリン５０μ９／１を含 有する培地上で選択する。このようにして得られたクローンから、Ｗｒ望のプラ スミドｐｅｔａ　１２９を含有するものを選択し、このプラスミドはｔＰＡ　ｃ ＤＮム−配列３０１〜７２６の間のＤＮＡ配列をもはや含有していない点で出発 ゲラスミｈ”　ｐｅｔａ　９８．１と異なっている。第１図はこのようにして得 られた突然変異蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

ｂ）　Ｅ、コリ中で発現させるための突然変異蛋白質用の発現ベクターの調製 ａ）により製造したプラスミドｐｅｔａ　１２９から、制限酵素Ｂａｎ　Ｈｌ及 びＰｖｕ　ｌによる消化でｔＰＡをコードするフラグメントが得られる。プラス ミドｐＡｃＹｏ　１７７（ＤＳＭ　３６９３　Ｆ　）も同様にＢａｍ　Ｈｌ及び Ｐｖｕで切断する。両方のフラグメントを遅箱させかっｌａｃ　ｌｑ−プラスミ ドを含有するＥ、コリーＤＳＭ　３６８９中で形質転決する。カナマイシン及び アンピシリンをそれぞれ２５μｌ／Ｉｌｌもしくは５０　ｐｊｉ／ｄ含有する培 地で選択することにより形質転換体が得られ、そのうちのプラスミドｐｅｔａ　 １３７を含有するものを選択する。これは、ｐｅｔａ　１２９からの突然変異蛋 白質遺伝子７ラグメントとプラスミドｐＡＣＹｃ　１７７の配列とをそれぞわＣ ）プソイＦモナス・プチダ中で発現させるための突然変異蛋白質用の発現ベクタ ーの一裏プソイトモナス・プチダのベクターとしては、付加的にｐＡＯＹｃ　１ ７７からのカナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＲ８，Ｆ　１０１０ の誘導体を使用すＺこのベクターはｐＲＥＭ　５０６１　（ＤｓＭ　３６９２　 Ｆ　）と表わされる。このプラスミドは制限酵素Ｅｐａ　ｌを使うことにより粉 状化されている。

ａ）により製造したベクターｐθＰａ　１２９からＸｈｏ　ｌ切断により約１． ４５ｋｂの７ラグメントが得られ、これはｔａｃ−プロモータ及び完全な突然変 異蛋白質遺伝子配列を含有する。デツキジヌクレオシドトリホスフェート４１面 金部の存在においてフレノウ・７ラグメントで処理することによりＸｈｏ　ｌ− 切断部位は完全に満たされる。このように処理した７ラグメントｋｍ状ベクター ｐＲＫＭ　３０６１と連結しかつＥ、コリ細胞（ＤＳＭ３６８９）中で形質転換 させる。この形質転換体を刀ナマイシ７２５μｇ／威を含有する培地上で選択す る。

プラスミドｐｅｔａ　１４３全宮有する形質転換体を選択する。このプラスミド １４６は、ｔａｃ−プロモータを有する完全突然変異蛋白質遺伝子配列を含有す る点で出発ベクターｐＲＥＭ　３０６１とは異なっている。このシラスミドを単 離しかつ形質転換により菌株シンイドモナス・プチダＤＡＭ　２１０６の細胞中 に挿入する。形質転換体をカナマイシン２５　ｔｔＭ／ｒｎｔを含有する培地上 で選択し、引続いて分析する。これはプラスミド１４３を含有する。付加的に、 この形質転換体細胞中に同様に形質転換により、ｐｅＰａ１４３と適合性であり かつｌａｃ　ｌ　−遺伝子を含有するプラスミ）ＦｐｅＰａ　１１９（ＤＳＭ　 ３６９１　Ｐ　）を導入する。このプラスミドはプラスミドＲＰ４の誘導体であ る。このプラスミＦの存在は、１ａｃ−リプレッサー蛋白質の産生により該細胞 中での突然変異蛋白質の産生を抑制する。これは、ｔａｃ−ゾロモータからの転 写を抑制することができる。

例　６ 熱湯のｔＰＡを大腸劇中で強力なプロモータを有するハイコピーベクターにより 発現 突然ｆ異を１ａＣ−遺伝子中に有しかつ１ａｃ−ベルミアーゼを産生することの できないＥ、コリに−１２の誘導体を使用する。菌体はＥ　Ｄ　８６５４　（Ｄ ＳＭ　２１０２）又はｃ　６００　（ＤＳＭ　２０９３　）である。この菌株か ら変異株を製造することができ、この変異体はそれをｐｅｔａ　１１９　（ＤＳ Ｍ　３６９１　Ｆ　）で形質転換すルコトにより１ａｃ−リプレッサーを返刺生 産する（１ａ参照）。

このようにして得られた細菌中でプラスミドｐｅＰａ９８．１を形質転換すると （Ｉａ訴照）、１ａｃ−リプレッサーを過剰生産しかつｔＰＡを合成する絽菌が 得られる。

この細菌を２已に記載されているように培養ブイヨン中、６７℃で通気下に増養 する。

ａ）　ＯＤ５ｖ。−０−４で２クトース０．２％を培地に象加しかつ恒崗保付を ４時間継続する。１ａｃ−ベルミアーゼが欠損することによりラクトースは細胞 中に稜汝に吸収されるに過ぎない。引紐いて、例２１Ｌに記載されているように 、細胞を採取し、砕解し、ｔＰＡ−フラクションを取得しかつ５ＤＳ−ポリアク リルアミドダル中で分析する。

定性的かつ定量的に、例２の完全誘導されたロウコピーベクターからの佃出准と 同じ結果がｔＰＡ生産にｌして得られる。

ｂ）同じように、この時点で僅少量のＩＰＴＧの添加によりｔＰＡ発現に閃して 相応して低い＠尋速度が達成される。工ＰＴＧ　Ｑ、Ｑ　５〜５ミリモル及びそ れ以上の量で完全な誘導が連敗され、０．００２〜０．０１　ミ！ｊモルの量で 相応して低い誘導が達成される。この低い誘導は、例２からのロウコピーベクタ ーの完全誘導と定性的かつ定量的に同じ結果をもたらす。ｔａｃとしてより低い 効峯のプロモータを使用する際に、完全誘導ではベクターの相応して高いコピー 数が可能である。ゾロモータの強さはコピー数に反比例して選択するか又はプロ モータの使用を相応して低い誘導により制限すべきである。

ｔＰＡ切片が産生されないという発現ベクターのコピー数の制限による作用効果 は、次のようにして達成することもできる： 強力なプロモータ（ｔａｃ　）　ｆ有するハイコピー発現ベクターをｌａｃ　− リゾレッサー逼刺生産（ｌａｃｌ）する菌株中で使用する際に、誘導物＊Ｃ工Ｐ ｒａｚ　ラクトース等）の添加によりｔＰＡ合成を誘導しなければならない。こ れは培地中の工ＰＴＧ　９．５〜５ミリモルの量で完全に達成される。これに対 してロウコピーベクターを同じ系（ｔａｃ−プロモータ、ｌａｃ工ｑ）中で使用 する場合、屈折体の形成が此められるが、同じ工ＰＴＧ添加量でｔＰＡ切片の屈 折体中へのとり込みは認められない。工ＰＴＧ添加童をハイコピーベクターでｏ 、ｏ　ｉ　ミリモルに低める場合、完全工ＰＴＧ誘導でロウコピー系と同じ純粋 な屈折体が得られる。この効果は、ｔａｃよりも不良なプロモータを用いても達 成される。ベクターのコピー数は、プロモータがｔａｃ−プロモータよりも低い 効悪の分だけ高めることができる。ＨＤち１４ｏのグロモータ効墓で可能なプラ スミドコピー数の上昇は使用したロウコピープラスミドに対して係数１０である 。

不発明による強力なプロモータを有するロウコピー系の利点はｍ酵における糸の 取扱いの容易さにある。

この際に１誘導を実施するのに経費が少ない。それというのも誘導物質のｉＩｋ を調節により散しく制御する必要はなく、記載したように単槽系が機能するから である。ｌａｃ　；ｆｌ、を介するこの銹等はｔｙｐ系を介する制御よりも好ま しい。それとじうのも２クトースの使用により細胞の成長を一緒に制御すること ができるからであり、これはｔｙｐ−欠乏技術（Ｖｅｒａｒｍｕｎｇｓ−ｔｅｃ ｈｎｉｋ　：Ｇｅｎ８ｎｔ１３ｅｈ　）ではあまり簡単ではない。

ＦＩＧ、２ 国際調査報告 ■ ＡＪＧＪＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ ＰＯＲＴ　０ＮＦｏｒ　ｍｏｒａ　ｄａｔａｉｌｓ　ａｂｏｕｔ　ｔｌｓＬｍ　 ａｎｈｅｘ　！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主細胞に好適なベクター中に挿入されて存在している、プラスミノーゲン アクチベータをコードするｃＤＮＡを原核細胞中で発現させることによりプラス ミノーゲンアクチベータを製造する方法において、緊縮調節されていて、それ故 複製が宿主細胞の染色体の複製から脱共役しないか又は一時的に脱共役するに過 ぎないベクターを使用し、かつ緩和調節が起らないかもしくはベクターのプロモ ータが、脱共役したプラスミドのｍＲＮＡ形成が緊縮調節下のプラスミドの場合 よりも大きくないように調節される条件下で培養を実施することを特徴とする、 原核細胞中でプラスミノーゲンアクチベータを製造する方法。 ２．増幅係数が３より大きくはないベクターを使用することを特徴とする、請求 の範囲第１項記載の方法０３．ベクターとして、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＫＮ４０ ２、ｐＡＣＹＣ１７７又はＯｒｉを有するそれらから誘導されるプラスミドを使 用することを特徴とする、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４．プラスミノーゲンアクチベータのｃＤＮＡをｐＫＮ４０２中に挿入し、この ベクターに好適な原核宿主細胞中に導入しかつ宿主細胞を温度３０℃で培養する ことを特徴とする、請求の範囲第３項記載の方法。 ５．宿主細胞としてＥ．コリＤＳＭ３６８９を使用することを特徴とする、請求 の範囲第３項又は第４項記載の方法。 ６．ｐＲＳＦ１０１１では宿主細胞としてプソイドモナス・プチダＤＳＭ２１０ ６を使用することを特徴とする、請求の範囲第３項記載の方法。 ７．ラスミドｐｅＰａ１００．１又は／及びｐｅＰａ１０７．８又は／及びｐｅ Ｐａ１３３又はｐｅＰａ１３７を含有するＥ．コリＤＳＭ３６８９を培養するこ とを特徴とする、請求の範囲第５項記載の方法。 ８．プラスミドｐｅＰａ１０７．８又はｐｅＰａ１４７を単独で又はプラスミド ｐｅＰａ１１９と一緒に含有するプソイドモナス・プチダＤＳＭ２１０６を培養 することを特徴とする、請求の範囲第６項記載の方法。 ９．プラスミドｐｅＰａ１００．１ １０．プラスミドｐｅＰａ１０７・８ １１．プラスミドｐｅＰａ１３３ １２．プラスミドｐｅＰａ１３７ １３．プラスミドｐｅＰａ１４７発明の詳細な説明