JPS63264426A

JPS63264426A - Ｂ型肝炎ワクチン

Info

Publication number: JPS63264426A
Application number: JP26804187A
Authority: JP
Inventors: Atsuhiko Machida; 町田　篤彦; Tetsuo Nakamura; 徹雄中村
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1987-10-23
Publication date: 1988-11-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｉ（ＢＶ）に対す有効な
ワクチンに関するものであり、詳しくはＢ型肝炎ウィル
スの感染機作に関する新たな知見にもとづいて、その感
染を防止するための新しいタイプのワクチンを提供する
ものである。

Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するウィルス性疾
患である。

Ｂ型肝炎ウィルスは、１９７０年にＤａｎｅらによって
、オーストラリア抗原（へＵ抗原、ＨＢｓ抗原）陽性皿
内に確言′７Ｊされたものであって、二重構造をした球
形ＤＮＡウィルスである。

ＨＢＶに感染したヒトの血清を遠心して電子顕微鏡下で
観察すると、直径４２ｎ＋ａの大型球形粒子（Ｄａｎｅ
粒子）、直径２２ｎｍの小型球形粒子および管状粒子が
見出される。

Ｄａｎｅ粒子は、中心に直径２７ｎｍの内部粒子（ｃｏ
ｒｅ粒子）を有し、また表面には外殻がある。　ｅｏｒ
ｅ粒子内には、分子量約１．６Ｘ１０６の２本鎖ＤＮＡ
とＤＮＡポリメラーゼが含まれている。

Ｄａｎｅ粒子の外殻は、ＨＢｓ抗原（ＨＢｃＡｇ）活性
を有し、これとは別にｅｏｒｅ粒子表面にはＨＢｅ抗原
（ＨＢｃＡｇ）活性がある。またｅｏｒｅ粒子には分子
量約１９．０００　（Ｐ２Ｏ）の単位核蛋白が存在する
が、Ｐ２Ｏの一部はｅｏｒｅ粒子の表面に露出して、そ
のＮ末端側の部分はＨＢｅ抗原（［ｉＢｅＡｇ）活性を
もつ。ＨＢｃＡｇは血中に出現することがある。

したがって、ＨＢＶ関連抗原としては、ＨＢｃＡｇ、ｌ
ｌＢｓＡｇ、　ＨＢｅＡｇ、の三種類が現在知られてい
る。

また、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇには共通抗原としてｒａＪがあ
るが、さらに抗原性の違イからａｄｒ、　ａｄｗ、　ａ
ｙｗ、　ａｙｒの４種のサブタイプが知られている。こ
れらサブタイプは、Ｉ（ＢＶ株の違いによって、産生さ
れろＨＢｓＡｇのアミノ酸配列に多少の違いが生じたも
のと考えられろ。

Ｂ型肝炎は１（ＢＶキャリアの血液が輸注されろことに
より、受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリ
の刃についた微量の血液によって感染することがありう
る。

日本において、年間激痛肝炎４，４００例、急性肝炎１
８万例、慢性肝炎３０万例、肝硬変１２万例が存在する
と推定される肝疾思のうち、各３０％程度が、また原発
性肝癌８．４００例のうち約５０％がＢ型肝炎ウィルス
によって発生すると推定されている。

さらに無症候の１τＢＶ千ヤリア（ＨＢＶ保有者）は世
界で約２億人、わが国では約３００万人も存在すると推
定され、全人口に対するキャリアの割合は日本が先進国
中最高の値を示している。したがって、ＨＢＶキャリア
の血液を介してＢ型肝炎が感染する危険が大きい。

そのため、Ｂ型肝炎ウィルスに対して、ワクチネーショ
ンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の少ないワクチン
の研究と開発が切望されていた。

現在供用されているＢ型肝炎ワクチンは、ＩｔＢＶ陽性
血からＨＢｓ抗原を分離精製し、不活性化したものであ
るが、ＨＢＶが現在培養増殖できず、原料であるＨＢＶ
陽性血を大量に確保することが回軸であるとともに、コ
ストが高いこと、異物蛋白や未知のウィルス等が混入す
ることによる危険を完全に免れない欠点があった。

したがって、＋ＩＢＶに対する合成ワクチンの必要性が
示唆されてきたが、本願の発明者らは、Ｂ型肝炎ウィル
スに対して有効であり、かつ安全性に侵れたポリペプタ
イドワクチンを発明した。

本願は本願発明者らによる、Ｂ型肝炎ウィルスとヒｌ−
肝細胞の付着に関する新たな知見に基礎を置（ものであ
る。すなわち、Ｂ型肝炎ウィルスが、肝細胞表面のＰｏ
１ｙ−ＩＳＡ（重合したと１・血清アルブミン）を介し
て、ヒトの肝細胞に特異的に付着することを突き止め、
さらにＢ型肝炎つィルス粒子上のＰｏ１ｙ−ＨＳ人受容
体が、［（ＢｓＡｇの如何なる部位に位置するかの探索
をつづけた。

その結果、ＨＢｅ人ｇ陽性血漿由来のＨＢｓＡｇ粒子か
ら精製したＰ３１ポリペブタイド上に、Ｐｏ１ｙ−ＩＩ
Ｓ人に対する受容体が存在することを解明した。これに
対し、ＨＢｓλｇ粒子から精製したＰ２２ポリペブタイ
ドはＰｏ１ｙ−ＩＳＡにイ寸着せず、したがってＰ２２
上にはＰｏ１ｙ−ＩＳＡに対する受容体が存在しないこ
とを見出した。

さらにＰ３１ポリペプクィドとＢ型肝炎ウィルスの遺伝
情報との関係を探索した結果、Ｐ３１はＨＢＶ−ＤＮＡ
のＳ領域によりコードされる２２６残基のアミノ酸から
なるＰ２２とその上流に存在するＰｒｅ−Ｓ隣接領域に
よってコードされる５５個のアミノ酸によって構成され
ることを解明した（図１）。

したがって上記５５個のアミノ酸からなる部分にＰｏ　
Ｉ　ｙ−ＨＳ人受容体が存在する事が推測された。事実
Ｐ３１をＣＮＢｒで切断する事により単離した上記５５
個のアミノ酸からなるベプタイドはＰｏ１ｙ−ＩＳＡと
結合する事が解明された。

以上の知見にもとづき、本願の発明者らは、Ｂ型肝炎ウ
ィルスに対する新しいワクチン、ポリペプタイドワクチ
ンＰ３１を発明した。

本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１はＢ型肝炎ウィ
ルスのＰｏ１ｙ−Ｉｓ人受容体をブロックすることによ
りＨＢＶがヒト肝細胞に付着するのを防止するワクチン
である。

さらに、本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１は、そ
のＰｒｅ−３領域ＤＮＡによりコードされるペプタイド
部分（Ｎ末端より第４番目アミノ酸残基Ａｓｎ）に多糖
類が結合している状態（Ｐ３５）においても、ｔ（ＢＶ
に対するワクチンとして使用することができるものであ
る。

ポリペプタイドワクチンＰ３１の製造方法は次のとお９
である。

ＨＢｅＡｇが陽性で、かツＨＢｓ人ｇ価（Ｒ−ＰＨＡ価
）の高い血漿を遠心して、Ｄａｎｅ粒子を除去して得ら
れた上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖によるレート遠
心によって得ろ。

精製した小型粒子（ＨＢｓＡｇ粒子）を１％（、／ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１％（ｖ／ｖ
）　２−メルカプトエタ／−ル（２−ＭＥ）を含むトリ
ス−塩酸緩衝液中でインキユペートシ、構成ペプタイド
に分解する。

ポリペブタイドはＭａ　ｉ　ｚｅ　ｌの方法により、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によ吻、分画し、Ｐ３１
３１ポリペブタイドを得ろ。セファデックスＧ２５　（
ファルマシア：スウェーデン）を用い水を溶媒として上
記分画をゲル濾過し、遊離のＳＤＳや電気泳動緩衝液に
用いた試薬を除く。ボイドボリュームに溶出したＰ３１
は、凍結乾燥する。

ポリペブタイドＰ３１の物理化学的性質は次のとおりで
ある。

アミノ酸残基。　　１０μｇのＰ３１を６Ｎ−ＨＣＩで
減圧下１１０℃で２４．４８．７２時間加水分解し、日
立アミノ酸分析計８３５で測定シた。ロイシン、イソロ
イシン、バリンは最高値を、スレオニンとセリンは０時
間に内そうした値を用いた。

（近似値）アスパラギン酸　　　　　　　５アスパラギン　　　　　　　　９スレオニン　　　　　　　　２４セリン　　　　　　　　　３１グルタミン酸　　　　　　　　　２グルタミン　　　　　　　　　　８グリシン　　　　　　　　　１８アラニン　　　　　　　　　　９バリン　　　　　　　　　１４メチオニン　　　　　　　　　フイソロイシン　　　　　　　１６０インン　　　　　　　　　３８チロシン　　　　　　　　　　６フェニルアラニン　　　　　２０リジン　　　　　　　　　　　２ヒスチジン　　　　　　　　　２アルギニン　　　　　　　　１０プロリン　　　　　　　　　　３２トリプトフアン　　　　　　　１４システイン　　　　　　　　１４末端アミノ酸。Ｎ末端アミノ酸は手動エドマン分解法に
より調べた。Ｃ＊端アミノ酸配列は０．２Ｍ、エチル・
モルフォリン−酢酸（ＰＩ（、８，５）中で２５℃、１
５分、３０分間カルボキシペプチダーゼＡを作用させた
後、アミノ酸分析により決定した。Ｎ末端アミノ酸はメ
チオニン、Ｃ末端アミノ酸配列ハーバリン−チロシン−
イソロイシンであった。

九ヱｆｉ　　　　　３１，０００ダルトン（測定法　５
ＤＳ−ＰＡＧＥ）屋ＬＬｔ３；　　　　１００℃　２０　ｍｉｎ　　５ｔ
ａｂｌｅ吸収特性　　　２８０ｎｍ　　λｍａχ２　９
　０　　Ｈ５ｈｏｕｌｄｅｒ本願の発明者らはさらにＰ３１のＰｒｅ−Ｓ領域のアミ
ノ酸配列のうち、親水性部位で各サブタイプ間に共通の
部分を選び、これを化学的に合成してそのＰｏ１ｙ−Ｕ
ＳＡとの反応性と免疫冷性を調べた。その結果、＾Ｓｐ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａ　Ｉ　−Ａｒ　ｇ−Ｇ　Ｉ　ｙ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ　（ｏｒ−Ｌｅｕ）　−Ｐｒ
ｏ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌのンーケンスを含有する
合成ポリペブタイド（Ａｓｐペプクィド）とＰｏ１ｙ−
ＩＳＡ受容体を持たないｆｌＢｓＡｇ小型粒子との結合
物は人ｓｐペプタイドを介してＰｏ１ｙ−ＵＳＡと結合
する事が明らかになっｔこ（表１）。　まｔここの人ｓ
ｐペプタイドは免疫原性をも有することを見出し、これ
をＢ型肝炎ウィルスに対するワクチンとすることを発明
した。即ち、この人ｓｐペプタイドをモルモットに免疫
して得られた抗血清ば、ＨＢｅＡｇ陽性血清から精製し
たｆｆＢｓＡｇと結合したが、　ＨＢｅＡｂ陽性血清か
ら精製したＨＢｓＡ４とは殆ど結合しなかった。このこ
とにより、とのＡｓｐペプタイドに対する抗体がＢ型肝
炎つィルス上のＰｏ１ｙ−■ＳＡ受容体をブロックしＢ
型肝炎ウィルスがＰｏ１ｙ−ＵＳＡを介してヒト肝細胞
に付着するのを阻止できろ効率の高いワクチンであるこ
とが明らかになった。

更に、Ａｓｐペプタイド、精製Ｐ３１、ＳＤＳ＋２ＭＥ
処理したＨＢｓＡｇを免疫して得られたモノクローナル
抗体のうちＡｓｐペプタイドに対する抗体は金側Ｐｏ１
ｙ−ＨＳ人とＨＢｓＡＨの結合を阻止した（表２）。即
ち、＾ｓｐペブクイドは非常に効率の高い合成ワクチン
であることが明らかになった。なお特許請求の範囲第１
項記載のベプタイドのうち、第９番目のアミノ酸残基は
ロイシンに置き換えることができる。

これはＰｒｅ−５領域のアミノ酸配列がサブタイプ間で
異なり、ａｄｒでフェニルアラニンであるのに対しａｄ
ｗではロイシンであることに基づく。シカし、１９残基
のアミノ酸からなル合成ペプタイドを免疫して冑られる
抗体ハ、＆ｄｗ型ＨＢｓＡｇとも結合し、サブタイプ共
通のものであることがわかった。特許請求範囲第１項の
ベプタイドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄらの方法（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ　　ＲＢ　　Ａｄｖ、Ｅｎｚｙ＋ｍｅ。

１ヱ　２２１−２９６，１９６９）によろ固相法で合成
され、合成後、６Ｎ−ＩＣ＋、１１０℃、２４時間、減
圧下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したものである
。

以下、本発明にかかる各ペプクィドについて製造及び免
疫学的検定の実施例を述べる。

実施例１本発明のポリペブタイドＰ３１．　Ｐ３５を次の方法に
よって製造した。

ｔｌｌ　　’ＨＢｓＡｇ粒子の精製［（ＢｅＡｇ陽性で、サブタイプがａｄｒのｊ（Ｂｓ抗
原価（Ｒ−ＰＨＡ価）が高い血漿をプールし、３７．　
Ｇｏ。

×ｇ、１６時間の遠心を行い、Ｄａｎｅ粒子をベレット
として除去した。上清中の小型粒子を、ＫＢｒによる浮
上超遠心と蔗糖のよるレート（ｒａｔｅ）超遠心によっ
て得た。

（２）　　アクリルアミドゲル電気泳動６００ｍｇの精
製ＨＢｓ抗原粒子を１％（、／Ｖ）ＳＯＳおよび１％（
ｖ／ｖ）　２　ＭＥを含む０．０１Ｍトリス−塩酸ｍ衝
液（ＰＨ８、０）で９０ｍ１にして３７℃３０分インキ
ュベートして構成ポリペブタイドに分解した。そのポリ
ペブタイドをＭａｉｚｅｌの方法に従ってＭａｅｒｏ　
　Ｐａｇｅの装置を用い、直径９ｃｍ高さ９ｅ＋ｏのポ
リアクリルアミドカラムによる調製用ゲル電気泳動にか
けた。サンプルを９％ポリアクリルアミドゲルで作った
分離用ゲルの上に作製した濃縮ゲル（３％）上にアプラ
イした。５０Ｖ定電圧で２℃で泳動し、３０分毎に分画
した。ＨＢｓＡｇポリペブタイドはセファデックスＧ−
２５で脱塩後、凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動は５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより、Ｈｏｅｆｆｅｒ
社スラブゲル電気泳動装置を用いて行った。

（即ち、サンプルに指示薬としてブロモフェノールブル
ーを加え、その指示薬が濃縮ゲル（３％）内を通過して
いる間は１５ｍＡで、また分離用ゲル（１０％）に入っ
てからは３０＋ｎＡで泳動した。泳動後、蛋白質は、０
０５％（ｗ／ｖ）クーマンンーブリリアントブルー染色
し、糖はＺａｅｈａｒｉｕｓらの方法によるＰＡＳ染色
により染色した。これにより構成ポリペブタイドの１つ
としてＰ３１．　Ｐ３５を得た（第２図）。構成ポリペ
ブタイド量は蛋白染色したゲルをＡｕｔｏ　　５ｃａｎ
ｎｅｒ　（ヘレナ社）を用い５５０ｎｍの波長でスキャ
ンして求めた。不純物除去ののち精製した。

実施例２Ａｓｐペプタイドを次の方法によって製造した。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法に基づき、ベプタイドの
Ｃ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させて
おき、ついでＮ末端の方向に向かって、ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ酸を１個ずっ１：に次縮むさせていき、
Ａｓｐ−Ｐｒｏ−人ｒｇ−Ｖａｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ
のシーケンスからなるポリペブタイド（人ｓｐペプタイ
ド）を合成した。

またＡｓｐペプタイドの第９アミノ酸残基をＬｅｕに置
換えしたポリペブタイドを合成した。

合成後、６Ｎ−［（ＣＩ、１１０℃、２４時間、減圧下
で加水分解後、アミノ酸組成を確認した。

実施例３ポリペブタイドＰ３１．　Ｐ３５の免疫原性（ワクチン
効果）を次の方法により確認した。

（１）本発明のポリペブタイドＰ３１のＰｏ１ｙ−４１
Ｓ八に対する反応性をＨＢｅＡｇ陽性の血漿から分離し
たＨＢｓＡｇ粒子、Ｐ３５（ポリペブタイドＰ３１に糖
が結合したもの）　、Ｐ２２　（第２図参照）　、Ｐ２
７　（Ｐ２２に糖が結合したもの）のＰｏ１ｙ−Ｉｓ人
に対する反応性と比較した。固相としてＰｏ１ｙ　Ｈ５
Ａ、ラベル第２抗体として抗ＨＢｓ抗体を用いてサンミ
ニウィッチ法により調べた。

その結果、Ｐ３１．　Ｐ３５の滴定曲線はＨＢｅＡｇ陽
性血から得た［（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子のものと同一であ
って、Ｐｏ１ｙ−ＨＳ人に対する反応性が認められた。

他方１Ｐ２２．　Ｐ２７は、いずれもＰｏ１ｙ−ＨＳ人
と反応しなかった（第３図）。

また、ＨＢｓＡｇ粒子および上記各ポリペブタイト；ヨ
モノメリツクな血清アルブミンとは結合しなかった。

（２）種特異性ヒトおよびチンパンジーのみがＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ
Ｖ）に感受性を有し、その他の動物はＨＢＶに対する感
受性を有しない。

そこで、本発明のＰ３１の種特異性を調査した。

種々の動物の重合アルブミンをマイクロタイタープレー
トの穴にツー１−シてＰ３１との反応性を検査したとこ
ろヒトおよびチンパンジーの重合アルブミンはＰ３１と
結合したが、ウサギ、牛、マウス、馬、卵白、ウッドチ
ャックの重合アルブミンはＰ３１と結合しなかった（第
４図）。

実施例４Ａ　ｓ　ｐペプタイドの免疫原性（ワクチン効果）を次の方法により確認した。

（１）卵白アルブミ：／　（ＯＶＡ　　ｏｖａｌｂｕｎ
＋ｉｎ）とベプタイドのカップリングペブクィドはカップリング試薬として１−エチル−３（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｇ
ｍａ　　ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いて
、キャリアープロティンである卵白アルブミン（Ｓｉｇ
ｍａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に結合させた
。

即ち合成ペプタイド５ｍｇとＯＶＡ１　、５　ｍｇを０
５ｍ１の生理的食塩水に溶がし、１５ｍｇのカップリン
グ試薬を加えた後、室温で、１晩反応させた後、生理的
食塩水に対し２日間透析した。

（２）免疫メスのＨａｒｔｌｅｙ系のモルモジ１・に１ｍｇペプク
イドー卵白卵白アルブミン物０．１ｍｌを０　、２　ｍ
ｌフロイントの完全アジュバントとのエマルジョンとし
て皮下に接種した。４週間後に同様に追加免疫を行い、
更にその１週間後に心臓穿刺により採血し、血液を凝固
させ遠心分離により血清を得た。

（３１検定（ラジオイムノアッセイ）ポリビニルマイクロタイタープレートを用いサンドウィ
ッチ法去、インヒビジョン法でアッセイした。

即ち、サンドウィッチ法では固相として重合ヒトアルブ
ミン、マウス抗Ｐｒｅ−ｓモノクローナル抗体、精製＋
（ＢｓＡｇ　（ａｄｒ、　ｆｌＢｅｌＢｅ人血陽性血清
（Ｒｅ　Ａ　ｂ陽性血清由来）精製ｔ（ＢｓＡｇ（ａｄ
ｗ、　ＨＢｅＡｇ陽性血清）、プロナーゼ処理！（Ｂｓ
Ａｇ　（ａｄｒ）、ｆ［ＢｓＡｇポリペブタイドＰ３１
、Ｐ２２、合成ペプクイドを各々につき、１００μｇ／
ｍｌの濃度の溶液１００μｍをウェルに入れ室温１時間
吸着させたものを用いた。

テストサンプル５０μｌを穴に入れ、３７℃９０分イン
キュベート後１２５■ラベル抗ＨＢｓ抗体、抗Ｐｒｅ−
Ｓモノクローナル抗体あるいはＰ３１を各７２につき１
００μｌ入れ、３７℃、９０分、インキュベートした。

ウェルを切り取りその放射活性を測定した。

各ステップの間は生理的食塩水で５回洗浄した。

インヒビジョン法では、テストサンプル５０μｌと１２
５Ｉラベル抗Ｐｒｅ−Ｓモノクロナール抗体５０μｍを
３７℃、９０分インキュベートし、その混合物５０μｌ
をＰ３１でコートシたウェルに入れ３７℃、９０分、イ
ンキュベートした。サンプルのかわりに、緩衝液を用い
た０％インヒビジョンをもとにテストサンプルの結果を
％インヒビシランで示した。尚、ヨード（１）ラベルは
クロラミンＴ法（Ｇｒｅｅｎ＊ｏｏｄ、Ｆ、Ｃ，（１９
６３）Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａ１．　Ｊ、　　８９　。

１１４−１２３）により行い、得られた放射ラベル物質
の比活性は５μＣｉ／μｇであった。

（４）　　モノクローナル抗体の作成りａｌｂ／ｃマウス（雌）の腹腔に、Ａｓｐペブタ、イ
ド、Ｐ３１、ＳＤＳ＋２ＭＥ処理ＨＢｓ人ｇを各々、７
　”　インド（７）完全アジュバントとのエマルジョン
として注入した。３週後人ｓｐペプタイド他各々で追加
免疫し３日後に牌鐵細胞（ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌ）を
得た。

融合（＋（ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）　、クロ“ニン
グ、およびそれに続く培養はＯｉ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅ
ｎｂｅｒｇの方法（Ｏｉ、Ｖ、Ｔら　Ｉｍｍｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ　　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　　ｈｙｂｒｉｄ
　　ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅｓ、　　Ｉｎ　　５ｅｌｅｃ
ｔｅｄ　　ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　ｃｅｌｌｕｌａｒ　
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　Ｆｒｅｅｍａｎ　　ａｎ
ｄＣｏ、　Ｓａｎ　　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　　３５１−
３７２．１９８０）に従って行っｔ二。

各々の抗体の選択は、例えばＰ３１ではＨＢｅＡｇ陽性
血漿から精製した１１　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子とそれをプ
ロナーゼＥ（科研科学！！りて軽く処理しＰ３１とＰ３
５を消失させたＨＢｓＡｇ粒子をヒツジ赤血球に結合さ
せたものを用いＰＨＡ法　（Ｖｙａｓ　Ｇ、Ｎら　５ｃ
ｉｅｎｃｅ１７０　３３２−３３３　１９７０）で行っ
た。

抗体の特異性はＰ３１あるいはＰ２２を固相化し１２５
Ｉラヘルの抗マウスＩｇＧ　（Ｒａｂｂｉｔ）を２次抗
体としたラジオイムノアッセイにより調べた。

各々の抗体を分泌するクローンはマウスの復腔で増殖さ
せた。腹水を得、１３３Ｍ硫安で塩析後セフアゾ・マウスＧ２００　　（ファルマ
シア社製）のゲル濾過を行った。

（５）　　モノクローナル抗体と各ペブタイドとの反応入ｓｐベプタイドと反応をよくするモノクローナル抗体
ＩｇＧクラスの８種類を使って、ＰＯ１３１−ＨＳ人と
ＨＢｓＡｇの反応を阻害するかをラジオイムノアッセイ
、サンドイツチ法て調べｔ：ところ全鋼が結合を阻止し
た（表２）。

強力なワクチン効果が得られｔこ。

（６）　　ペブクイドの免疫原性特性ペプタイドの免疫原性特性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉ
ｔｙ）を調べるために、ペプクイドをＯＶＡに結合させ
た結合物（１＋Ｈ）をフロイントの完全アジュバントと
の懸濁液として、３匹のモルモットの皮下に免疫した。

４週間後に追加免疫しその１週間後、採血した。　凝塊
（ｃｌｏｔ）後、得られた血清について、サンドウィッ
チ法によるラジオイムノアッセイにより、抗体の検定（
ａｓｓａｙ）を行った。

即ち、固相に、ＨＢｅ人ｇ陽性血から精製したＨＢｓＡ
ｇ（ａｄｒ、　ａｄｗ）そのＨＢｓＡｇ　（ａｄｒ）を
プロナーゼ処理したもの、ＨＢｅＡｇ陽性血から精製し
たＨＢｓ　（ａｄｒ）、およびｒｆ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇポ
リペブタイドＰ３１．　Ｐ２２を用いて、サンプルをイ
ンキュベーション後、”’Ｉ−Ｐ３１と反応させ、放射
活性を測定した（表３）。

ペプクィドを免疫された３匹のモルモットがら得られた
血ｌｎはいずれも合成ペプタイドと反応した。更にＰ３
１　（ａｄｒ）およびＨＢｅ八ｇへ性血から精製したＨ
ＢｓＡｇ　（ａｄｒ、　ａｄｓ）　とも結合した。

しかし、一方Ｐｒｏｎａｓｅ処理する事によりＰ３１と
Ｐ３５が消失したＨＢｓＡｇ　（ａｄｒ）　、ｔ［Ｂｅ
Ａｂ陽性血から精製したＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇおよびＰ２
２との反応性は低かった。この結果から、このペプタイ
ドはモルモットに主としてポリペブタイドＰ３＋、Ｐ３
５含量の多いＨＢｅＡｇ陽性１「［中のＩＴ　Ｂ　ｓＡ
ｔと結合し、しかもａｄｒとａｄｗの共通部分と反応す
る抗体を作らせろことが解った。

第９アミノ酸残基をＬｅｕとしたＡｓｐペゴタイドにつ
いても検査し、その免疫原性を確認した。

実施例５Ｐ　ｒ　ｅ　Ｓｖｔ域ペプタイドの反応性について調べ
た。

（１１Ｐ３１のＰｒｅＳ領域に対するモノクローナル抗
体ｎｙｔ＋４４ｏｓの特異性を（表４）に示した。この
抗体はＰ３１との反応性は高いがＰ２２との反応性は低
い事からＰｒｅＳ領域に特異的であることがｔｒ？　っ
　を二。

（２１Ｐ３１からのＰｒｅ−ｓ領域ペブクイドの分離。

Ｐ３］はＰ２２のＮ末端アミノ酸Ｍｅｔの上流に５５残
基のアミノ酸からなるペプタイドが結合したものと推測
され、また、Ｐｒｅ−Ｓ領域にはＭｅｔはＮ末端にのみ
存在するので、Ｐ３１をＣＮＢｒで開裂することにより
Ｐｒｅ−Ｓ領域のベプタイドを単離した。ここでＨＢｓ
Ａｇ粒子およびＰ３１を７０％ギ酸、０　、１　ＮＨＣ
ｌで処理するとＰｏ１ｙ−ＩＩＳＡ受容体は完全に失活
するのでＳＤＳ溶液中でＣＮＢｒ開裂を行った。このペ
プタイドのアミノ酸分析値から、アラニンを４残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。

その結果、ＨＢＶ−ＤＮ人塩基配列から推定されるＰｒ
ｅＳ領域のアミノ酸組成（ａｄｒ）とよく一致した。

（３）　　抗ｐｒｅＳモ／クローナル抗体とＰ３１のＰ
ｒｅＳペプクイドとの反応。

単離したＰｒｅＳベプタイドとＰ３１を免疫して得たモ
ノクローナル抗体Ｈｙｂ−４４０８との反応をインヒビ
ジョンテストによって調べた。即ち、種々の濃度のＰｒ
ｅ−Ｓベプタイドと１２５ＩラベルＨｙｂ−４４０８を
予めインキュベートしておき、この混合物をＰ３１を固
相したウェルに入れ、インキュベート後カウントを測定
した。Ｐｒｅ−Ｓペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものをθ％インヒビシミンコンｌ−ｏ−ノνとし
、表５に示した。Ｐｒｅ−Ｓペプタイドの濃度が増加す
るにっれＰ３１と１２５１　ｕｙｂ４４ｏｓとの反応の
阻害は大きくなり、３〜１００μｓ／ｍｇでははゾ直線
関係が見られた。この事により単離されたＰｒｅＳペプ
タイドは抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナ、し抗体（Ｈｙｂ４
４０ｇ）と結合することが解った。

（４１Ｐｏ１ｙＨＳＡとＰｒｅ−Ｓペプタイドとの結合
。

単離したＰｒｅＳペプタイドとＰｏ１ｙ）ＩＳＡの反応
性をｐｏｌｙＨｓＡを固相に、第２ラベル抗体として抗
Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体を用いｔこサントイ・フ
チ法によるラジオイムノアッセイ法で調べた。

（表６）に示したようにＰｒｅＳペプタイドはＰｏ　ｌ
　ｙ−ＩＳＡと結合することが明らかになり、Ｐ３１の
Ｐｒｅ−３領域にＰｏ１ｙ−ＵＳ人受容体が存在する乙
とが解った。

表−１人ｓｐペプクイド−ＨＢｓ、　ＨＢｓ抗原（ＦＡ
レセプクーｅ）Ｐ３１と重合アルブミンの反応方法　　固相に重合アルブミン、ラベル第２抗体に抗Ｈ
ＢＳ抗体（ウマ）を使ったサンドイツチ法抗体（ウマ）（ｅｐｍ）ａ：　Ａｓｐ−ペプタイドーＨＢｓｂ＝　ＨＢｓ抗原（ＰＡＬ、セプター６）　　　＃８０
ｅ：　ＨＢｓ抗原（ＰＡレセプター６９）＃１２２ｄ＝
　　Ｐ３１Ｅ：陰性コントロール及二胆　抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体の性状方法人３ｐ。

固相に人ｓｐポリペブタイド、ラベル第２抗体に抗マウ
ス血清を用いたサンドイツチ法。

２人阻害固相にｐ−Ｈｓ人（又はＰ−ＣＳＡ）　、ラベル第２抗
体に抗ＨＢｓ抗体を用い、Ｐ人しセプクーをもっＨＢｓ
Ａｇを試料と混和した阻止法（ｃｐｎ） ※　Ａｓｐペプタイドを免疫して得られたモノクローナ
ル抗体及ユ３　０ＶＡ結合ペプタイドの免疫原性抗　　　体　
　　価（ｃｐＩＩＩ）表、１４　　Ｆ［ＢＶ・ＤＮＡのＰｒｅ−Ｓ領域にコー
ドされろアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体（Ｎ
。

４４０８）の特異性※１ ※１　様々な材料から得たＨＢｓ抗原と［（Ｂｓ抗原ポ
リペブタイド（５０μｇ／ｍｌ）をマイクロプレー１・
のウェルにツー１−シ、アイソト−プラベルシタＰｒｅ
−Ｓアミノ酸配列に対するモノクロナル抗体（ａｎｔｉ
−Ｐｒｅ−Ｓ　Ｎｏ、４４０８：　ＩＸ　１０’ｃｐｍ
）との反応性を調べた。

※２　正常マウス血清のＩｇＧ分両 ※３　プロナーゼ処理によりｐｏｌｙ−ｆ（ＳＡへのレ
セプターを失ったＨＢｓ抗原粒子＋１ＢＶ、ＤＮＡ＝　Ｂ型肝炎ウィルスデオキシリボ核
酸ＨＢｅＡｇ　　＝　Ｂ型肝炎ｅ抗原！ＩＢｓへｇ　　＝Ｂ型肝炎Ｓ抗原ＴｇＧ　　　＝免疫グロブリンＧＬｕ　　抗Ｐｒｅ−Ｓモ／クローナル抗体Ｈｙｂ−４４
０８と★　試料（５０μｌ）と１２５Ｉ抗Ｔ’ｒｅ−Ｓ
モノクロナル抗体（５０μｌ）を３７℃、９０分で混合
、インキュベート後５０μｌをとり、Ｐ３１で固相され
たウェルに入れ、３７℃、９０分の阻止反応によった。

友二６　　Ｐｒｅ−Ｓペプタイド上にｐｏｌｙ−ＨＳ人
レセプターが存在する証明 ※　５０μｌのサンプルをｐｏｌｙ−ＨＳ人でコートし
たウェルに入れた。アイソトープラベル抗ＰｒｅＳモノ
クローナル抗体（Ｈｙｂ−４４０８）を第二抗体として
用い、ウェルの放射能活性を測定

【図面の簡単な説明】

第１図は、ポリペブタイド（Ｐ２２．　Ｐ２７）とＰｏ
１ｙ−）Ｉｓ人への結合部位を持つポリペブタイド（Ｐ
３１゜Ｐ３５）の構成図（ａａはアミノ酸残基）。第２図は、ＨＢｓ抗原ポリペブタイドのＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動構成ペプタイドに分解されたＨＢｓ抗原粒子（Ａ）をＰ
３５　（Ｂ）　、　Ｐ３１　（Ｃ）　と同様に分析用Ｓ
ＤＳゲル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色
を行った。（Ａ’、　Ｂ′、　Ｃ’）矢印はＰ３５．　
Ｐ３１．　Ｐ２７．　Ｐ２２の位置を示す。第３図は、ＨＢｓ抗原ポリペブタイドとヒト血清重合ア
ルブミンの反応性を示す。ＨＢｅ抗原陽性血漿より得た２０ｎｍのｌＩｎ５抗原粒
子と３種のＨＢｓ抗原ポリペブタイド（Ｐ３１゜Ｐ３５
．　Ｐ２２）をｐｏｌｙ−１（ＳＡテ：２−　トしたウ
ェル中でインキュベートした。結合したポリペブタイド
、および粒子はアイソＩ・−プラペル抗ＨＢｓ抗体で検
出した。黒丸（１）はＰ３１．白丸（２）はＰ３５．白三角（３
）はＰ２２゜黒三角（４）はＨＢｓ抗原粒子を示す。Ｐ２７はＰ２２と類似した結合曲線を示した。第４図は、種々の動物種の重合アルブミンによるＰ３１
のヒト血ｉｉ１重合アルブミンへの結合の阻害を示す。Ｐ３１はｌ震度を段階的に上げたヒト血清重合アルブミ
ン、チンパンジー重合アルブミンとインキュベートし、
Ｐｏ１ｙ−１（Ｓ人でコートシたウェルへ移した。ウェ
ルは洗浄し、結合したＰ３１をアイソト−プラベル抗Ｈ
Ｂｓ抗体で検出した。固定化したＰｏ１ｙ−［ｒＳ八とＰ３１の結合阻害率（
％）で結果を示した。黒丸Ａはヒト重合アルブミン、白四角Ｂはチンパンジー
重合アルブミンを示す。他の動物の重合アルブミンによる阻害は１濃度（１ｍｇ
７／＋ｌ）で行い矢印で示した。Ｃはウサギ、Ｄはウシ、Ｅはマウス、Ｆはウマ、Ｇは卵
白、Ｈはウッドチャックを示す。第３図 ↓ ＨＢｓ杭）７１μ３　々ぴ　ポリペブタイドのメ訪　０
；ｙ／ｓＬ）不牛図６　補正の対象特許庁長官　　小　川　　邦　夫　　殴１　事件の表示昭和６２年特許願第２６８０４１号３　補正をする者事件との関係　　　特許出願人東京都杉並区荻窪４−２８−１４−７０１中村　徹雄４　代理人東京都港区赤坂２丁目１７番５４号パレロワイヤル赤坂１号館９１９号室５　補正命令の日付７　補正の内容別紙添付の第２図のとおり８　添付書類の目録第２図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の理化学的性質を有する、Ｂ型肝炎ポリペプタ
イドワクチンＰ３１。（ｉ）作用重合したヒト血清アルブミン（Ｐｏｌｙｍｅｒｉ−ｚｅ
ｄ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ．ｐｏｌ
ｙ−ＨＳＡ）に対する受容体を有し、Ｂ型肝炎ウィルス
の肝細胞に対する付着を阻止する。（ｉｉ）ＤＮＡコードＨＢＶ−ＤＮＡ上の表面蛋白質の主要ポリペプタイドで
あるＰ２２をコードしているＳ領域（２２６残基のアミ
ノ酸をコードしている）と、その上流に位置するＰｒｅ
−Ｓ領域（１６３残基のアミノ酸をコードしている）の
うちＰ２２のＮ末端から上流に遡った５５残基（Ｐ８）
のアミノ酸をコードしている領域。（ｉｉｉ）構成アミノ酸；アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、
アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、システイン；（ｉｖ）１モル中のアミノ酸モル数；アスパラギン酸、約５；アスパラギン、約９；スレオニン、約２４；セリン、約３１；グルタミン酸、約２；グルタミン、約８；グリシン、約１８；アラニン、約９；バリン、約１４；メチオニン、約７；イソロイシン、約１６；ロイシン、約３８；チロシン、約６；フェニルアラニン、約２０；リジン、約２；ヒスチジン、約２；アルギニン、約１０；プロリン、約３２；トリプトファン、約１４；システイン、約１４；（ｖ）分子量；約３１，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）（ｖｉ）安定ＰＨ；中性（ｖｉｉ）温度安定性；１００℃、２０ｍｉｎ、ｓｔａ
ｂｌｅ（ｖｉｉｉ）吸収特性；２８０ｎｍにピーク２９
０ｎｍにショルダー
（２）特許請求の範囲第１項のポリペプタイドワクチン
において、Ｎ末端より第４番目アミノ酸残基（Ａｓｎ）
に糖鎖が結合したポリペプタイドＰ３５（分子量約３５
，０００ダルトン）。