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JPS6137738A - Ｂ型肝炎ワクチン - Google Patents

Ｂ型肝炎ワクチン

Info

Publication number
JPS6137738A
JPS6137738A JP15912484A JP15912484A JPS6137738A JP S6137738 A JPS6137738 A JP S6137738A JP 15912484 A JP15912484 A JP 15912484A JP 15912484 A JP15912484 A JP 15912484A JP S6137738 A JPS6137738 A JP S6137738A
Authority
JP
Japan
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hepatitis
amino acid
polypeptide
peptide
virus
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Application number
JP15912484A
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JPH045653B2 (ja
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Atsuhiko Machida
町田　篤彦
Tetsuo Nakamura
徹雄 中村
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to DK345685A priority patent/DK345685A/da
Priority to EP85305457A priority patent/EP0171260B1/en
Priority to AT85305457T priority patent/ATE61938T1/de
Priority to DE8585305457T priority patent/DE3582284D1/de
Priority to IE191285A priority patent/IE58647B1/en
Publication of JPS6137738A publication Critical patent/JPS6137738A/ja
Priority to US07/239,028 priority patent/US5019386A/en
Publication of JPH045653B2 publication Critical patent/JPH045653B2/ja
Granted legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
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  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に対す有効なワ
クチンに関するものであり、詳しくはＢ型肝炎ウィルス
の感染機作に関する新たな知見にもとづいて、その感染
を防止するための新しいタイプのワクチンを提供するも
のである。
Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染するウィルス性疾
患である。
Ｂ型肝炎ウィルスは、１９７０年にＤａｎｅらによって
、オーストラリア抗原（Ａｕ抗原、ＨＢｓ抗原）陽性皿
内に確認されたものであって、二重構造をした球形ＤＮ
Ａウィルスである。
ＨＢＶに感染したヒトの血清を遠心して電子顕微鏡下で
観察すると、直径４２ｎｍの大型球形粒子（Ｄａｎｅ粒
子）、直径２２ｎｍの小型球形粒子および管状粒子が見
出される。
Ｄａｎｅ粒子は、中心に直径２７ｎｍの内部粒子（ｅｏ
ｒｅ粒子）を有し、また表面には外殻がある。ｅＯｒＥ
！粒子内には、分子量約１．６Ｘ１０６の２本鎖ＤＮＡ
とＤＮＡポリメラーゼが含まれている。
１）ａｎｅ粒子の外殻は、ＨＢｓ抗原（ｕｇｓＡｇ）活
性を有し、これとは別にｅｏｒｅ粒子表面にはＨＢｅ抗
原（ＨＢｃＡｇ）活性がある。またｅｏｒｅ粒子には分
子量約１９．０００　（ＰＩ３）の単位核蛋白が存在す
るが、ＰＩ３の一部はｅｏｒｅ粒子の表面に露出して、
そのＮ末端側の部分はＨＢａ抗原（ＨＢｅＡｇ）活性を
もつ。ｔ（ＢｅＡｇは血中に出現することがある。
したがって、ＨＢＶ関連抗原としては、［（ＢｅＡｇ、
ＨＢｓＡｇ、　ＨＢｅＡｇ、の三種類が現在知られてい
る。
また、ＨＢｓＡｇには共通抗原としてｒａＪがあるが、
さらに抗原性の違いからａｄｒ、　ａｄｗ、　ａｙｗ、
　ａｙｒの４種のサブタイプが知られている。これらサ
ブタイプは、［（ＢＹ株の違いによって、産生されるＨ
ＢｓＡｇのアミノ酸配列に多少の違いが生じたものと考
えられる。
Ｂ型肝炎は１（ＢＶキャリアの血液が輸注されることに
より、受血者に高率に発生するほか、注射針やカミソリ
の刃についた微量の血液によって感染することがありう
る。
日本において、年間激症肝炎４，４００例、急性肝炎１
８万例、慢性肝炎３０万例、肝硬変１２万例が存在する
と推定される肝疾患のうち、各３０％程度が、また原発
性肝癌８．４００例のうち約５０％がＢ型肝炎ウィルス
によって発生すると推定されている。
さらに無症候のＨＢＶキャリア（）ｔＢＶ保有者）は世
界で約２億人、わが国では約３００万人も存在すると推
定され、全人口に対するキャリアの割合は日本が先進国
中最高の値を示している。したがって、ｔ（ＢＶキャリ
アの血液を介してＢ型肝炎が感染する危険が大きい。
そのため、Ｂ型肝炎ウィルスに対して、ワクチネーショ
ンが望まれ、とくに有効でかつ副作用の少ないワクチン
の研究と開発が切望されていた。
現在供用されているＢ型肝炎ワクチンは、Ｉ（ＢＶ陽性
血からＨＢｓ抗原を分離精製し、不活性化したものであ
るが、ＨＢＶが現在培養増殖できず、原料であるＨＢＶ
陽性血を大量に確保することが困難であるとともに、コ
ストが高いこと、異物蛋白や未知のウィルス等が混入す
ることによる危険を完全に免れない欠点があった。
したがって、ＨＢＶに対する合成ワクチンの必要性が示
唆されてきたが、本願の発明者らは、Ｂ型肝炎ウィルス
に対して有効であり、かつ安全性に優れたポリペプタイ
ドワクチンを発明した。
本願は本願発明者らによる、Ｂ型肝炎ウィルスとヒト肝
細胞の付着に関する新たな知見に基礎を置くものである
。すなわち、Ｂ型肝炎ウィルスが、肝細胞表面のＰｏ１
ｙ−ＩＳＡ　（重合したヒト血清アルブミン）を介して
、ヒトの肝細胞に特異的に付着することを突き止め、さ
らにＢ型肝炎ウィルス粒子上のＰｏ１ｙ−ＩＳＡ受容体
が、ＨＢｅＡｇの如何なる部位に位置するかの探索をつ
づけた。
その結果、ＨＢｅＢｅ人件陽性血漿由来ＢｓＡｇ粒子か
ら精製しなＰ３１ポリペプタイド上に、Ｐｏ１ｙ−ＩＳ
Ａに対する受容体が存在することを解明した。これに対
し、ＨＢｓＡｇ粒子から精製したＰ２２ポリペプタイド
はＰｏ１ｙ−ＨＳＡに付着せず、したがってＰ２２上に
はＰｏ１ｙ−ＩＳＡに対する受容体が存在しないことを
見出した。
さらにＰ３１ポリペプタイドとＢ型肝炎ウィルスの遺伝
情報との関係を探索した結果、Ｐ３１はＨＢＶ−ＤＮ人
のＳ領域によりコードされる２２６残基のアミノ酸から
なるＰ２２とその上流に存在するＰｒｅ−Ｓ隣接領域に
よってコードされる５５個のアミノ酸によって構成され
ることを解明した（図１）。
したがって上記５５個のアミノ酸からなる部分にＰｏ１
ｙ−ＩＳＡ受容体が存在する事が推測された。事実Ｐ３
１をＣＮＢｒで切断する事により単離した上記５５個の
アミノ酸からなるペプタイドはＰｏ１ｙ−ＨＳＡと結合
する事が解明された。
以上の知見にもとづき、本願の発明者らは、Ｂ型肝炎ウ
ィルスに対する新しいワクチン、ポリペプタイドワクチ
ンＰ３１を発明した。
本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１１より型肝炎ウ
ィルスのＰ’ｏｌｙ−１（ＳＡ受容体をブ四ツクするこ
とによりＨＢＶがヒト肝細胞に付着するのを防止するワ
クチンである。
さらに、本発明のポリペプタイドワクチンＰ３１は、そ
のＰｒｅ−３領域１）ＮＡによりコードされるペプタイ
ド部分（Ｎ末端より第４番目アミノ酸残基入ｓ、ｎ）に
多ｔａ類が結合している状態（Ｐ３５）においても、Ｉ
（ＢＶに対するワクチンとして使用することができるも
のである。
ポリペプタイドワクチンＰ３１の製造方法Ｃよ次のとお
りである。
ＨＢｅＡｇが陽性で、かツＨＢｓＡｇ価（Ｒ−ＰＨＡ価
）の高い血漿を遠心して、Ｄａｎｅ粒子を除去して得ら
れｔコ上清中の小型粒子を浮上遠心と庶糖によるレート
遠心によって得る。
精製した小型粒子（ＨＢｓＡ４粒子）を１％（Ｗ／ｖ）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１％（ｖ／ｖ
）　２　　／　ルカプトエタ）　−ル（２−ＭＥ）を含
むトリス−塩酸緩衝液中でインキユベートシ、構成ペプ
タイドに分解する。
ポリペプタイドはＭａｉｚｅｌの方法により、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により、分画し、Ｐ３１３１ポ
リペプタイドを得る。セファデックスＧ２５　（ファル
マシア：スウェーデン）を用い水を溶媒として上記分画
をゲル濾過し、遊離のＳＤＳや電気泳動緩衝液に用いた
試薬を除く。ボイドボリュームに溶出しポリペプタイド
Ｐ３１の物理化学的性質は次のとおりである。
アミノ酸分析。　　１０μｇのＰ３１を６Ｎ−ＨＣｌで
減圧下１１０℃で２４．４８．７２時間加水分解し、日
立アミノ酸分析計８３５で測定した。ロイシン、イソロ
イシン、バリンは最高値を、スレオニンとセリンは０時
間に内そうした値を用いた。
（近似値） アスパラギン酸　　　　　　　５ アスパラギン　　　　　　　　９ スレオニン　　　　　　　　２４ セリン　　　　　　　　　３１ グルタミン酸　　　　　　　　　２ グルタミン　　　　　　　　　　８ グリシン　　　　　　　　　１８ アラニン　　　　　　　　　　９ バリン　　　　　　　　　１４ メチオニン　　　　　　　　　フ イソロイシン　　　　　　　１６ ０イシン　　　　　　　　　３８ チロシン　　　　　　　　　　６ フェニルアラニン　　　　　２０ リジン　　　　　　　　　　　２ ヒスチジン　　　　　　　　　２ アルギニン　　　　　　　　１０ プヮリン　　　　　　　　　３２ トリプトファン　　　　　　　１４ システイン　　　　　　　　１４ 末端アミノ酸。Ｎ末端アミノ酸は手動エドマン分解法に
より調べた。Ｃ末端アミノ酸配列１ｆ　０　、２　Ｍ、
エチル・モルフォリン−酢酸（ＰＨ，８，５）中で２５
℃、１５分、３０分間カルボキシペプチダーゼＡを作用
させた後、アミノ酸分析により決定した。Ｎ末端アミノ
酸はメチオニン、Ｃ末端アミノ酸配列は−バリン−チロ
シン−イソロイシンであった。
笈±３１　　　　３１，０００ダルトン（測定法　５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ） 温度安定性　　１００℃　２０　ｍｉｎ　　５ｔａｂｌ
ｅ吸収特性　　　２８０ｎｍ　　λｍａｘ２　９　０　
ｎｍ　　５ｈｏｕｌｄｅｒ本願の発明者らはさらにＰ３
１のＰｒｅ−Ｓ領域のアミノ酸配列のうち、親水性部位
で各サブタイプ間に共通の部分を選び、これを化学的に
合成してそのＰｏ１ｙ−ＵＳＡとの反応性と免疫原性を
調べた。その結果、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｙ−Ｐｈｒ　（ｏｒ−
Ｌｅｕ）−Ｐｒｏ−人１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（＋）　シ’
ｙンスを含有する合成ポリペプタイド（Ａｓｐペプタイ
ド）とＰｏ１ｙ−ＨＳＡ受容体を持たないＨＢｓＡｇ小
型粒子との結合物はＡｓｐペプタイドを介してＰｏ１ｙ
−ＩＳＡと結合する事が明らか１こなった１表１）。　
またこのＡｓｐペプタイドは免疫原性をも有することを
見出し、これをＢ型肝炎ウィルスに対するワクチンとす
ることを発明した。即ち、乙のＡ５Ｐペプタイドをモル
モットに免疫して得られた抗血清は、ＨＢｅＡｇ陽性血
清から精製したＨＢｓＡｇと結合したが、ＨＢｅＡｂ陽
性血清から精製したＨＢｓＡｇとは殆ど結合しなかった
。このことにより、この人ｓｐペプタイドに対する抗体
がＢ型肝炎つィルス上のＰｏ１ｙ−Ｉ（ＳＡ受容体をブ
ロックしＢ型肝炎ウィルスがＰｏ１ｙ−ＵＳＡを介して
ヒト肝細胞に付着するのを阻止できる効率の高いワクチ
ンであることが明らかになった。
更に、人ｓｐペプタイド、精製Ｐ３１．５ＩＩＳ＋　２
ＭＥ処理したＨＢｓＡｇを免疫して得られたモノクロー
ナル抗体のうちＡｓｐペプタイドに対する抗体は全鋼Ｐ
ｏ１ｙ−Ｈ３人とＨＢｓＡｇの結合を阻止した（表２）
。即ち、ＡＳｐペプタイドは非常に効率の高い合成ワク
チンであることが明らかになった。なお特許請求の範囲
第１項記載のベプタイドのうち、第９番目のアミノ酸残
基はロイシンに置き換えることができる。
これはＰｒｅ−５領域のアミノ酸配列がサブタイプ間で
異なり、ＩＬｄｒでフェニルアラニンであるのに対しａ
ｄｗではロイシンであることに基づく。しかし、１９残
基のアミノ酸からなる合成ペプタイドを免疫して得られ
る抗体は、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇとも結合し、サブタイプ
共通のものであることがわかった。特許請求範囲第１項
のベプタイドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄらの方法（Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ　　ＲＢ　　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ。
旦　２２１−２９６，１９６９）による同相法で合成さ
れ、合成後、６Ｎ−ＩＣＩ、１１０℃、２４時間、減圧
下で加水分解後、アミノ酸組成を確認したものである。
以下、本発明にかかる各ペプタイドについて製造及び免
疫学的検定の実施例を述べる。
実施例１ 本発明のポリペプタイドＰ３１．　Ｐ３５を次の方法に
よ７て製造した。
（１）　　■ＢｓＡｇ粒子省精製 Ｆ［ＢｅＡｇ陽性で、サブタイプがａｄｒの■Ｂｓ抗原
価（Ｒ−ＰＨＡ価）が高い血漿をプールし、３７．００
０Ｘｇ、１６時間の遠心を行い、Ｄａｎｅ粒子をペレッ
トとして除去した。上溝中の小型粒子を、ＩＣＢｒによ
る浮上超遠心と庶糖の−よるレート（ｒｉｔｅ）超遠心
によって得た。
（２）　　アクリルアミドゲル電気泳動６００ｍｇの精
製ＨＢｓ抗原粒子を１％（、／ｖ）ＳＤＳおよび１％（
ｖ／ｖ）　２−ＭＥを含む０，０１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ＰＨ８，０）で９０ｍ１にして３７℃３０分インキ
ュベートして構成ポリペプタイドに分解した。そのポリ
ペプタイドをＭａｉｚｅｌの方法に従ってＭａｃｒｏ　
　Ｐａｇｅの装置を用い、直径９ｃｍ高さ９ｃｍのポリ
アクリルアミドカラムによる調製用ゲル電気泳動にかけ
た。サンプルを９％ポリアクリルアミドゲルで作った分
離用ゲルの上に作製した濃縮ゲル（３％）上にアプライ
した。５０Ｖ定電圧で２℃で泳動し、３０分毎に分画し
た。ＨＢｓＡｇポリペプタイドはセファデックスＧ−２
５で脱塩後、凍結乾燥した。分析用ゲル電気泳動は５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルにより、Ｅ（ｏｅｆｆｅｒ
社スラブゲル電気泳動装置を用いて行った。
（−即ち、サンプルに指示薬としてブロモフェノールブ
ルーを加え、その指示薬が濃縮ゲル（３％）内を通過し
ている間は１５ｍＡで、また分離用ゲル（１０％）に入
ってからは３０ｍＡで泳動した。泳動後、蛋白質は、０
．０５％（ｗ／ｖ）クーマンジ−ブリリアントブルー染
色し、糖はＺａｅｈａｒｉｕｓらの方法によるＰＡＳ染
色により染色した。これにより構成ポリペプタイドの１
つとしてＰ３１．　Ｐ３５を得た（第２図）。構成ポリ
ペプタイド量は蛋白染色したゲルをＡｕｔｏ　　５ｅａ
ｎｎｅｒ　（ヘレナ社）を用い５５０ｎｍの波長でスキ
ャンして求めた。不純物除去ののち精製した。
実施例２ 特許請求の範囲第１．第２項のベプタイドを次の方法に
よって製造した。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法に基づき、ペプタイドの
Ｃ末端のアミノ酸をまず架橋ポリスチレンに縮合させて
おき、ついでＮ末端の方向に向かって、ｔ−ブトキシカ
ルボニルアミノ酸を１個ずつ順次縮合させていき、Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｔ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌのシ
ーケンスからなるポリペプタイド（Ａｓｐペプタイド）
を合成した。
また入ｓｐペブタイドの第９アミノ酸残基をＬｅｕに置
換えしたポリペプタイドを合成した。
合成後、０Ｎ−ＩＣｌ、１１０℃、２４時間、減圧下で
加水分解後、アミノ酸組成を確認した。
実施例３ ポリペプタイドＰ３１．　Ｐ３５の免疫原性（ワクチン
効果）を次の方法により確認した。
（１）本発明のポリペプタイドＰ３１のＰｏ１ｙ−ＵＳ
Ａに対する反応性をｔｉＢｅＡｇ陽性の血漿から分離し
た１（ＢｓＡｇ粒子、Ｐ３５（ポリペプタイドＰ３１に
糖が結合したもの）　、Ｐ２２　（第２図参照）　、Ｐ
２７　（Ｐ２２に糖が結合したもの）のＰｏ１ｙ−ＩＳ
Ａに対する反応性と比較した。固相としてＰｏ１ｙ−Ｉ
ＳＡ、ラベル第２抗体として抗ＨＢｓ抗体を用いてサン
ドウィッチ法により調べた。
その結果、Ｐ３１、Ｐ３５の滴定曲線はＨＢｅＡｇ陽性
血から得た■ＢｓＡｇ粒子のものと同一であって、Ｐｏ
１ｙ−ｔ（ＳＡに対する反応性が認められた。他方、Ｐ
２２．　Ｐ２７は、いずれもＰｏ１ｙ４Ｓ人と反応しな
かった（第３図）。
また、ＨＢｓＡｇ粒子および上記各ポリペプタイドはモ
ノメリックな血清アルブミンと【よ結合しなかっｔこ。
（２）種特異性 ヒトおよびチンパンジーのみがＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ
Ｖ）に感受性を有し、その他の動物ζよＨＢＶに対する
感受性を有しない。
そこで、本発明のＰ３１の種特異性を調査しｔコ。
種々の動物の重合アルブミンをマイクロタイタープレー
トの穴にコートしてＰ３１との反応性を検査したところ
ヒトおよびチンノ＜ンジーの重合アルブミンはＰ３１と
結合したが、ウサギ、牛、マウス、馬、卵白、ウッドチ
ャックの重実施例４ 特許請求の範囲第１項のベプタイドの免疫原性（ワクチ
ン効果）を次の方法により確認しな。
（１）卵白アルブミン（ＯＶＡ　　ｏｖａｌｂｕｍｉｎ
）とベプタイドのカップリング ペプタイドはカップリング試薬として１−エチル−３（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｇ
ｍａ　　ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｕ、Ｓ、人）を用いて、
キャリアープロティンである卵白アルブミン（Ｓｉｇｍ
ａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｕ、Ｓ、Ａ、）Ｌこ結合させた
。
即ち合成ペプタイド５ｍｇと０ＶＡ１．５ｍｇを０゜５
ｍｌの生理的食塩水に溶かし、１５ｍｇのカップリング
試薬を加えた後、室温で、１晩反応させた後、生理的食
塩水に対し２日間透析した。
（２）免疫 メスのＨａｒｔｌａｙ系のモルモットにＩＩＩＩｇペプ
タイドー卵白アルブミン結合物０．１ｍ１ｔｅ０．２ｍ
ｌフロイントの完全アジュバントとのエマルジョンとし
て皮下に接種した。４週間後に同様に追加免疫を行い、
更にその１週間後に心臓穿刺により採血し、血液を凝固
させ遠心分離により血清を得ｔこ。
（３１検定（ラジオイムノアッセイ） ポリビニルマイクロタイタープレートを用いサンドウィ
ッチ法、インヒビジョン法でアッセイした。
即ち、サンドウィッチ法では固相として重合ヒトアルブ
ミン、マウス抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体、精製Ｈ
ＢｓＡｇ　（ａｄｒ、ＨＢｅＡｇ陽性血清又は■ＢｅＡ
ｂ陽性血清由来）精製ｔ（ＢｓＡｇ　（ａｄｗ、　ＨＢ
ｅＡｇ陽性血清）、プロナーゼ処理ｔ（ＢｓＡｇ　（ａ
ｄｒ）、ＨＢｓｋｇポリペプタイドＰ３イドＰ２２、合
成ペプタイドを各々につき、１００μｇ／ｍｌの濃度の
溶液１００μｌをウェルに入れ室温１時間吸着させたも
のを用いた。
テストサンプル５０μｌを穴に入れ、３７℃９０分イン
キュベート後１２５Ｉラベル抗ＨＢｓ抗体、抗Ｐｒｅ−
Ｓモノクローナル抗体あるいはＰ３］を各々につき１０
０μｌ入れ、３７℃、９０分、インキュベートした。
つエルを切り取りその放射活性を測定した。
各ステップの間は生理的食塩水で５回洗浄した。
インヒビジョン法では、テストサンプル５０μｍと　　
１ラベル抗Ｐｒｅ−Ｓモノクロナール抗体５０μｌを３
７℃、９０分インキユペートシ、その混合物５０μｌを
Ｐ３１でコートしたウェルに入れ３７℃、９０分、イン
キュベートした。サンプルのかわりに、緩衝液を用いた
０％インとビシミンをもとにテストサンプルの結果を％
インヒビジョンで示した。尚、ヨード（Ｉ）ラベルはク
ロラミンＴ法（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｆ、ｃ、　（１９
６３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ、　Ｊ、　　８９　。
１１４−１２ｊ）により行い、得られた放射ラベル物質
の比活性は５μＣｉ／μｇであった。
（４）　　モノクリ−ナル抗体の作成 りａｌｂ／ｅマウス（雌）の腹腔に、人ｓｐペプタイド
、Ｐ３１、ＳＤＳ＋２ＭＥ処理ＨＢｓＡ処理釜ＢｓＡｇ
イントの完全アジユバントとのエマルジョンとして注入
した。３週後Ａｓｐペプタイド他各々で追加免疫し３日
後に牌臓細胞（ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌ）を得た融合（
ｆ（ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）　、クローニング、お
よびそれに続く培養はＯｉ　ａｎｄ　Ｈｅｒｚｅｎｂｅ
ｒｇの方法（Ｏｉ、　■、　’ｆら　　Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ　　ｐｒｏｄｕｃｉＢ　　ｈｙｂｒｉｄ
　　ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅｓ、　　Ｉｎ　　５ｅｌｅｃ
ｔｅｄ　　ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　ｃｅｌｌｕｌａｒ　
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　Ｆｒｅｅｍａｎ　　ａｎ
ｄＣＯ，Ｓａｎ　　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　　３５１−３
７２．１９８０）に従って行った。
各々の抗体の選択は、例えばＰＨ１ではＨＢｅＢｅ人件
陽性血漿精製したＨＢｓＡｇ粒子とそれをプロナーゼＥ
（科研科学製）で軽く処理しＰＨ１とＰＸ３を消失させ
た［（ＢｓＡｇ粒子をとツジ赤血球に結合させたものを
用いＰＨＡ法　（Ｖｙａｓ　Ｇ、Ｎら　５ｃｉｅｎｃｅ
１７０　３３２−３３３　１９７０１Ｆ行シな。
抗体の特異性はＰＨ１あるいはＰ２２を固相化し１２５
Ｉラベルの抗マウスＩｇＧ　（Ｒａｂｂｉｔ）を２次抗
体としたラジオイムノアッセイにより調べた。
各々の抗体を分泌するクローンはマウスの腹腔で増殖さ
せた。腹水を得、１３３Ｍ 硫安で塩析後セファデックスＧ２００　（ファ）　　ル
マシア社製）のゲル濾過を行った。
（５）　　モノクローナル抗体と各ペプタイドとの反応 Ａｓｐペプタイドと反応をよくするモノク四−ナル抗体
ＩｇＧクラスの８種類を使って、Ｐ。
Ｉｙ−Ｈ５ＡとＨＢｓＡｇの反応を阻害するかをラジオ
イムノアッセイ、サンドイツチ法で調べたところ金側が
結合を阻止した（表２）。
強力なワクチン効果が得られた。
（６）　　ペプタイドの免疫原性特性 ペプタイドの免疫原性特性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　ｉｃ
　ｉ　ｔｙ）を調べるために、ペプタイドをＯＶＡに結
合させた結合物（１ｍｇ）をフ四インドの完全アジュバ
ントとの懸濁液として、３匹のモルモットの皮下に免疫
した。４週間後に追加免疫しその１週間後、採血した。
　凝塊（ｃｌｏｔ）後、得られた血清について、サンド
ウィッチ法によるラジオイムノアッセイにより、抗体の
検定（ａｓｓａｙ）を行った。
即ち、固相に、　ＨＢｅＡｇ陽性血から精製したＨＢｓ
Ａｇ（ａｄｒ、　ａｄｗ）そのＨＢｓＡｇ　（ａｄｒ）
をプロナーゼ処理したもの、ＨＢｅＡｇ陽性血から精製
したｆ（Ｂｓ　（ａｄｒ）、およびＨＢｓＡｇポリペプ
タイドＰ３イド　Ｐ２２を用いて、サンプルをインキュ
ベーション後、１２’ｒ−ｐａ１ベプタイドを免疫され
た３匹のモルモットから得られた血清はいずれも合成ペ
プタイドと反応した。更にＰＨ１（ａｄｒ）およびＨＢ
ｅＡｇ陽性血から精製したＨＢｓＡｇ　（ａｄｒ、　ａ
ｄｓ）とも結合した。
しかし、一方Ｐｒｏｎａｓｅ処理する事により　ＰＨ１
とＰＸ３が消失したＨＢｓＡｇ　（ａｄｒ）　、ＨＢｅ
Ａｂ陽性血から精製したＨＢｓＡｇおよびＰ２２との反
応性は低かった。乙の結果から、このペプタイドはモル
モットに主としてポリペプタイドＰ３１、Ｐ３５含量の
多いＨＢｅＡｇ陽性血中のＨＢｓＡｇと結合し、しかも
ａｄｒとａｄｗの共通部分と反応する抗体を作らせるこ
とが解った。
特許請求の範囲第２項のベプタイドについ実施例５ ＰｒｅＳ領域ペプタイドの反応性について調べた。
（１）　　ＰＨ１のＰｒｅＳ領域に対するモノクローナ
ル抗体ｕｙｂ４ｔｏｇの特異性を（表４）に示した。乙
の抗体はＰＨ１との反応性は高いがＰ２２との反応性は
低い事がらＰｒｅＳ領域に特異的であることが解った。
（２１ＰＨ１からのＰｒｅ−ｓ領域ペプタイドの分離。
ＰＨ１はＰ２２のＮ末端アミノ酸Ｍｅｔの上流にｈ５残
基のアミノ酸からなるペプタイドが結合したものと推測
され、また、Ｐｒｅ−Ｓ領域にはＭｅｔ！ｆＮ末端にの
み存在するので、ＰＨ１をＣＮＢｒで開裂する乙とによ
りＰｒｅ−Ｓ領域のベプタイドを単離した。ここでＨＢ
ｓＡｇ粒子およびＰＨ１を７０％ギ酸、０　、１　ＮＭ
ＣＩで処理するとＰｏ１ｙ−ＨＳＡ受容体ば完全に失活
するのでＳＤＳ溶液中でＣＮＢｒ開製を打製た。このペ
プタイドのアミノ酸分析値から、アラニンを４残基とし
て他のアミノ酸残基数を計算した。
その結果、ＨＢＶ−ＤＮＡ塩基配列から推定されるＰｒ
ｅＳ領域のアミノ酸組成（ａｄｒ）とよく一致した。
（３）　　抗ＰｒｅＳ％／クローナル抗体とＰＨ１のＰ
ｒｅＳペプタイドとの反応。
単離したＰｒｅＳペプタイドとＰＨ１を免疫して得たモ
ノクローナル抗体Ｈｙｂ−４４０８との反応をインヒビ
ジョンテストによって調べた。即ち、種々の濃度のＰｒ
ｅ−Ｓペプタイドと１２５ＩラベルＨｙｂ−４４０８を
予めインキュベートしておき、この混合物をＰＨ１を固
相したウェルに入れ、インキュベート後カウントを測定
した。Ｐｒｅ−Ｓペプタイドのかわりに生理的食塩水を
用いたものを０％インヒビジョンコントロールとし、表
５に示した。Ｐｒｅ−Ｓペプタイドの濃度が増加するに
っれＰＨ１と１２５Ｉ　Ｈｙｂ４４０８との反応の阻害
は大きくなり、３〜１００μｇ／ｍｇでははゾ直線関係
が見られた。この事により単離されたＰｒｅＳペプタイ
ドは抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体（Ｈｙｂ４４０８
）と結合することが解った。
（４）　　Ｐｏ１ｙｔ（ＳＡとＰｒｅ−Ｓペプタイドと
の結合。
単離したＰｒｅＳペプタイドとＰｏ１ｙＨＳＡの反応性
をＰｏｌｙＨＳ人を固相に、第２ラベル抗体として抗Ｐ
ｒｅ−Ｓモノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法に
よるラジオイムノアッセイ法で調べた。
（表６）に示したようにＰｒｅＳペプタイドはＰｏ１ｙ
−ＨＳＡと結合する乙とが明らかになり、ＰＨ１のＰｒ
ｅ−３領域にＰｏ１ｙ−Ｈ３Ａ受容体が存在することが
解った０ 表−Ｉ　　ＡｓｐペプタイドーＨＢｓ、　ＨＢｓ抗原（
ＰＡＬ、セプターｅ）ＰＨ１と重合アルブミンの反応 方法　　固相に重合アルブミン、ラベル第２抗体に抗Ｈ
ＢＳ抗体（ウマ）を使っ たサンドイツチ法 （ｃｐ−） １１：　Ａｓｐ−ペプタイドーＨＢｓ ｂＨＢｓ抗原（ＰＡレセプターｅ）　　　＃８０Ｃ・Ｈ
Ｂｓ抗原（ＰＡレセプターの）＃１２２ｄ：　ＰＨ１ Ｅ−陰性コントロール 表−２抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体の性状−方法 Ａｓｐ。
同相に人ｓｐポリペプタイド、ラベル第２抗体（こ抗マ
ウス血清を用いたサンドイツチ法。
Ｐ、Ａ阻害 固相にＰ−ＩＳＡ　（又はｐ−Ｃ５Ａ）　、ラベル第２
抗体（こ抗ｔｌＢｓ抗体を用い、ＰＡレセプターをもつ
ＨＢｓＡｇ＠試料と混和した阻止法 （ｃｐ−） ※　Ａｓｐペプタイドを免疫して得られたモノクローナ
ル抗体 表−３０ＶＡ結合ペプタイドの免疫原性＊−４ＨＢＶＤ
ＮＡのＰｒｅ−Ｓ領域にコードされるアミノ酸配列に対
するモノクローナル抗体（Ｎ。
４４０８）の特異性※１ ※１　様々な材料から得たＨＢｓ抗原とＨＢｓ抗原ポリ
ペプタイド（５０μｇ／ｍｌ）をマイクロプレートのウ
ェルにコートシ、アイソトープラベルしたＰｒｅ−Ｓア
ミノ酸配列に対するモノクロナル抗体（ａｎｔｉ−Ｐｒ
ｅ−Ｓ　Ｎｏ、４４０８１Ｘ　１０１０５ｅｐとの反応
性を調べた。
※２　正常マウス血清のＩｇＧ分画 ※３　プロナーゼ処理によりｐｏｌｙ−１（ＳＡへのレ
セプターを失った■Ｂｓ抗原粒子 ＨＢＶＤＮＡ＝　Ｂ型肝炎ウィルスデオキシリボ核酸 ＨＢｅＡｇ　　＝　Ｂ型肝炎ｅ抗原 ＨＢｓＡｇ＝　Ｂ型肝炎Ｓ抗原 ＩｇＧ　　　＝免疫グ四プリンＧ 表−５抗Ｐｒｅ−Ｓモノクローナル抗体ｔｔｙｂ−４４
ｏｇと★　試料（５０μｌ）と１２５Ｉ抗Ｐｒｅ−Ｓモ
ノクロナル抗体（５０μｌ）を３７℃、９０分で混合、
インキュベート後５０μｌをとり、Ｐ３１で固相された
ウェルに入れ、３７℃、９０分の阻止反応によった。
表−６Ｐｒｅ−Ｓペグタイド上にｐｏｌｙ−ＨＳＡレセ
プターが存在する証明 ※　５０μｌのサンプルをｐｏｌｙ−ＵＳＡでコートし
たつエルに入れた。アイソトープラベル抗ＰｒｅＳモ／
クローナル抗体（Ｈｙｂ−４４０８）を第二抗体として
用い、つエルの放射能活性を測定した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ポリペプタイド（Ｐ２２．　Ｐ２７）とＰｏ
１ｙ−ＨＳＡへの結合部位を持つポリペプタイド（Ｐ３
１゜Ｐ３５）の構成図（ａａはアミノ酸残基）。 第２図は、ＨＢｓ抗原ポリペプタイドのＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動 構成ベプタイドに分解されたＨＢｓ抗原粒子（Ａ）をＰ
３５　（Ｂ）　、　Ｐ３１　（Ｃ）と同様に分析用ＳＤ
Ｓゲル電気泳動し、タンパクと炭水化物について染色を
行った。（Ａ’、　Ｂ′、　Ｃ′）矢印はＰ３５．　Ｐ
３１．　Ｐ２７．　Ｐ２２の位置を示す。 第３図は、ＦＩＢｓ抗原ポリペプタイドとヒト血清重合
アルブミンの反応性を示す。 Ｈｕｅ抗原陽性血漿より得た２０ｎｍのＨＢｓ抗原粒子
と３種のＨＢｓ抗原ポリペプタイド（Ｐ　３１　。 Ｐ３５．　Ｐ２２）をｐｏｌｙ−ＨＳＡでコートシたつ
エル中でインキュベートした。結合したポリペプタイド
、および粒子はアイソトープラベル抗ＨＢｓ抗体で検出
した。 黒丸（１）はＰ３１．白丸（２）はＰ３５．白玉角（３
）はＰ２２゜黒三角（４）はＨＢｓ抗原粒子を示す。 Ｐ２７はＰ２２と類似した結合曲線を示した。 第４図は、種々の動物種の重合アルブミンによるＰ３１
のヒト血清重合アルブミンへの結合の阻害を示す。 Ｐ３１は濃度を段階的に上げたヒト血清重合アルブミン
、チンパンジー重合アルブミンとインキュベートし、Ｐ
ｏ１ｙ−ＩＳＡでコートしたつエルへ移した。ウェルは
洗浄し、結合したＰ３１をアイソトープラベル抗ＨＢｓ
抗体て検出した。 固定化したＰｏ１ｙ−ＨＳＡとＰ３１の結合阻害率（％
）で結果を示した。 黒丸Ａはヒト重合アルブミン、白画角Ｂはチンパンジー
重合アルブミンを示す。 他の動物の重合アルブミンによる阻害は１濃度（１ｍｇ
／ｍｌ）で行い矢印で示した。 Ｃはウサギ、Ｄはウシ、Ｅはマウス、Ｆはウマ、Ｇは卵
白、Ｈはウッドチャックを示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ！１（凹 俸３図 ＨＢｓ扶旅粒子　陸６　片ぐリベプタイドの濃度　（ｔ
り／ｄす隼＋図 噛ＬＥＴルブ）ンシ１カロ（１重＋／ｗ手続補正書（方
式）（指令） 昭和５９年１２月２５日 特許庁長官　　志　賀　　学　　殿 １　事件の表示 昭和５９年特許願第１５９１２４号 ２　発明の名称 Ｂ型肝炎ワクチン ３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 東京都杉並区荻窪４−２８−１４−７０１中村　徹雄 ４　代理人 東京都港区赤坂２丁目１７番５４号 パレロワイヤル赤坂１号館９１９号室 ５　補正命令の日付 昭和５９年１１月７日 （発送日　昭和５９年１１月２７日）７〈ご二ニー゛、
。 ６　補正の対象 特許願添付の図面のうち「第２図」 ７　補正の内容 別紙添付の第２図のとおり ８　添付書類の目録 第２図

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇ１
    ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
    −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
    Ｖａｌのシーケンス（Ａｓｐペプタイド）からなり、重
    合したヒト血清アルブミンに対する受容体を有し、Ｂ型
    肝炎ウィルスの肝細胞に対する付着を阻止する、Ｂ型肝
    炎ポリペプタイドワクチン。
  2. （２）第９アミノ酸残基がＬｅｕである、特許請求の範
    囲第１項のＢ型肝炎ポリペプタイドワクチン。
  3. （３）次の理化学的性質を有する、Ｂ型肝炎ポリペプタ
    イドワクチンＰ３１。 （ｉ）作用 重合したヒト血清アルブミン（Ｐｏｌｙｍｅｒｉ−ｚｅ
    ｄ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ．ｐｏｌ
    ｙ−ＨＳＡ）に対する受容体を有し、Ｂ型肝炎ウィルス
    の肝細 胞に対する付着を阻止する。 （ｉｉ）ＤＮＡコード ＨＢＶ−ＤＮＡ上の表面蛋白質の主要ポリペプタイドで
    あるＰ２２をコードしているＳ領域（２２６残基のアミ
    ノ酸をコードしている）と、その上流に位置するＰｒｅ
    −Ｓ領域（１６３残基のアミノ酸をコードしている）の
    うちＰ２２のＮ末端から上流に遡った５５残基（Ｐ８）
    のアミノ酸をコードしている領域。 （ｉｉｉ）構成アミノ酸； アスパラギン酸、アスパラギン、スレオ ニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、
    アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシ
    ン、チロシン、フェ ニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アル ギニン、プロリン、トリプトファン、シス テイン； （ｉｖ）１モル中のアミノ酸モル数； アスパラギン酸、約５；アスパラギン、 約９；スレオニン、約２４；セリン、 約３１；グルタミン酸、約２；グルタ ミン、約８；グリシン、約１８；アラ ニン、約９；バリン、約１４；メチオ ニン、約７；イソロイシン、約１６； ロイシン、約３８；チロシン、約６； フェニルアラニン、約２０；リジン、約 ２；ヒスチジン、約２；アルギニン、 約１０；プロリン、約３２；トリプトフ ァン、約１４；システイン、約１４； （ｖ）分子量；約３１，０００ダルトン（ＳＤＳ−ＰＡ
    ＧＥ） （ｖｉ）安定ＰＨ；中性 （ｖｉｉ）温度安定性；１００℃、２０ｍｉｎ、ｓｔａ
    ｂｌｅ（ｖｉｉｉ）吸収特性；２８０ｎｍにピーク２９
    ０ｎｍにショルダー
  4. （４）特許請求の範囲第３項のポリペプタイドワクチン
    において、Ｎ末端より第４番目アミノ酸残基（Ａｓｎ）
    に糖鎖が結合したポリペプタイドＰ３５（分子量約３５
    ，０００ダルトン）。
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