JPS6324895A - Ｌ―アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 ルーム−アミノ酸を製造する方法廉びにＮ−カルバミル
アミノ酸から相当するし一アミノ酸を製造する方法に関
する。

〔従来の技術〕

従来、微生物を用いて５−置換ヒダントインが開昭６０
−２１４８８９）が知られている。このよういない。

ヒスチジンの製法（特開昭６ｌ−９２９２）あるの製法
（特開昭６ｌ−９２９３）が知られている。

しかし、その他のＬ−アミノ酸についてはＮ−カルバミ
ルアミノ酸からの製法は知られていない。

〔−本発明が解決しようとする問題点〕シアノエチルグ
リシンを製造する方法を提供すること、５−置換ヒダン
トインからＮ−カルバミル−Ｌ　−／４１Ｊン、　Ｎ−
カルパミ／Ｉ／　＝　Ｌ−ロイシン、Ｎ−カル・パミル
ーＬ−メチオニン、Ｎ−カルパミ′〃−ルグリシンを製
造する方法を提供すること、並びＩＣＮ−カルバミルア
ミノ酸からＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−７エニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニ
ン、−Ｌ−シフ／ルアラニンを製造する方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

体の５−置換ヒダントインから相当するＬ−アミアミノ
酸を効率良く生産するバチルス属菌株を新たに分離した
。本発明に使用する微生物には以下のものがある。

バチルス・エスピーＡ　Ｊ　−１２２９９（ＦＥＬ’ｖ
ｌ　ｌ）−舘３７）上記微生物は好気条件下でのみ生育
し、胞子形成能を有する細菌であることからバチルス属
に属することが判明した。゛５−゛置換ヒダントインあ
る゛いはＮ−カルバミルアミノ酸からのＬ−アミノ酸の
製造において、５−置換ヒダントインあるいはＮ−カル
バミルアミノ酸に本微生物を作用せしめる方法は、本微
生物を５−置換ヒダントインあるいはＮ−カルバミルア
ミノ酸を含む培地中に培養してもよいし、また本微生物
の菌体または菌体処理物を水溶液中で５−置換ヒダント
インあるいはＮ−カルバミルアミノ酸に接触せしめても
よい。

本微生物を培養することによシ５−置換ヒメンミノ酸に
変換せしめる方−ｅ＝ｈ培養当初より５−置換ヒダント
インあるいはＮ−カルバミルアミノ酸を含有する培地に
本発明の微生物を培養してもよいし、また培養途中に５
−置換ヒダントインあるいはＮ−カルバミルアミノ酸を
培地に添加してもよい。

本微生物の培養のために用いられ為培地は５−置換ヒダ
ントインあるいはＮ−カルバミルアミノ酸を含むほかは
通常の炭素源、窒素源、無機イオン更に必要ならば有機
栄養源を含む通常の培地である−０ 炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロー
ル等のアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、その他が用いられる。無機イオンとしては
、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリウムイオン、
鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使
用される。

有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれら
を含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
テイーグリカー、カゼイン分解物その他が適宜用いられ
る。

培養は好気的条件下に、ＰＨ５ないし８、温度２５ない
し４０℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結果
が得られる。

かくして工ないし１０日間も培養を行えば、５−置換ヒ
ダントインあるいはＮ−カルバミルアミノ酸はＬ−アミ
ノ酸のみに効率よく変換される。

一方、本微生物の菌体または菌体の処理物を、水溶液中
にて５−置換ヒダントインあるいはＮ−カルパミルアミ
−ノ酸と接触せしめて作用せしめる場合には、５−置換
ヒダントインあるいはＮ−カルバミルアミノ酸と菌体ま
たは菌体の処理物を溶解またはけん濁した水溶液を温度
１０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、ｐＨ５〜１１
、好ましくは６．５〜９に保ちつつ暫時静置または攪拌
すればよい。５−置換ヒダントインあるいはＮ−カルバ
ミルアミノ酸の濃度は０．１〜３０チ、好ましくは０．
５〜１０ｑ６であシ、必要ならば５−置換ヒダントイン
あるいはＮ−カルバミルアミノ酸は反応の間追補添加さ
れる。

菌体としては、菌体を含む培養液をそのまま用いてもよ
い。また、これを−旦培養液よシ分離して洗滌または洗
滌せずに使用してもよい。菌体処理物としては、機械的
摩砕菌体、超音波にて処理し九菌体、凍結乾燥菌体、ア
セトン乾燥菌体、リゾチーム等の酵素で処理した菌体、
界面活性剤、トルエン等で処理した菌体、菌体の蛋白画
分、その他が適宜用いられる。

このような菌体を得る方法は前記の培地及び培養方法が
その１ま採用できる。培地には更に本発明の５−置換ヒ
ダントインあるいはＮ−カルバミルアミノ酸を少量添加
すれば、５−置換ヒダントインあるいはＮ−カルバミル
アミノ酸をＬ−アミノ酸に変換する活性の高い菌体が得
られる場合がある。また培養時間はこの場合、微生物が
充分増殖すればよい゛ので、１２ないし４８時間程度で
培養を終えてもよい。

水溶液には必要に応じ界面活性剤、補酸素、ヒドロキシ
ルアミン、コーク茅トイオンその他の金属イオン等が添
加されると反応収率が向上する場合がある。

かくして５ないし１００時間も経過すれば、水溶液中に
は多量のＬ−アミノ酸が生成蓄積される。

このようにして得られたＬ−アミノ酸を培養液又は水溶
液よシ採取する方法は、本発明の方法によれば、Ｄ−ア
ミノ酸が副生じないので、イオン交換樹脂を用いる方法
、等電点にて沈澱せしめる方法等、通常の方法が採用で
きる。

Ｌ−アミーノ酸の定量は、液体クロマトゲラフィートロ
イコノスト、り・メセンテロイデスＡＴＣＣ８０４２を
用いる微生物定量法によった。

また、本微生物の菌体または菌体の処理物を水溶液中に
で５−置換ヒダントインと接触せしめて作用させる場合
において、水溶液の声を５．５〜６５に保つあるいは菌
体処理物を分画したものを用いる等の方法によシ５−置
換ヒダントインよりＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を製
造することができる。得られたＮ〜カルバミル−Ｌ−ア
ミノ酸を水溶液より採取するには、本発明の方法によれ
ば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が副生じないので、
イオン交換樹脂を用いる方法、等電点にて沈澱せしめる
方法環１適常の方法が採用できる。Ｎ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸の定量は、ｐ−ツメチルアミノベンズアルデ
ヒドの濃塩酸溶液を加え比色定量す為方法によった＠ 生成した各アミノ酸あるいはＮ−カルバミルアミノ酸が
５体である事は、それぞれの結晶につき懇スペクトル、
Ｘ線回折スペクトル、液体クロマトグラフィー、バイオ
アッセイの定量値（Ｎ−カルバミルアミノ酸については
化学的方法によジアミノ酸に変換した後の定量値）およ
び比旋光度などのデータがいずれもＬ−アミノ酸あるい
はＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸の標品のそれらと一致
する事によシ確認した。

一般に有機合成法で製造される５−置換ヒダントインあ
るいはＮ−カルバミルアミノ酸はラセミ体であるが、本
発明の方法によれば、ラセミ体の５−置換ヒダントイン
を相当するＬ−アミノ酸あるいはＮ−カルバミル−Ｌ−
アミノ酸に１また２セミ体のＮ−カルバミルアミノ酸を
相当するＬ−アミノ酸にそれぞれ変換できるものである
。

実施例１ グリセロール２．０１／仏（ＮＨ４，）２Ｓｏ４０．５
１１／仏ＫＨ２ＰＯ４０，１１／ｄｌ、　Ｋ２ＨＰＯ４
０，３１／ｄｔ、　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５ＪＦ
　／ｄｔ１Ｆ’　ｅ　Ｓ　Ｏａ　・７Ｈ２０１ｍ９／ｄ
１１Ｍｎ　Ｓ　Ｏ４・４Ｈ２０１−ｗ／ａ、酵母エキス
１．ｏｙ７仏ベグトン１．Ｏｊｉ／ｄｌ、　Ｄ　Ｌ　−
５−イソプロピルヒダントイン０．２　ｉ　／ｌｕ、　
炭ａカルシウム４．ＯＪＦ／ｄｔ（別殺菌）を含む培地
（声７゜０）を５０〇−容フラスコに５０−入れ、１２
０℃で１５分間殺菌した。

これにブイヨン寒天培地で３０℃にて２４時間ＩＸ゛斗
１しス・ニスＣ− 培養したガ喰羽乎ｐトＡ　Ｊ　−１２２９９を１白金耳
接種し３０℃で１６時間培養した。この培養液よシ菌体
を遠心分離によシ採取し、培養液と同量の生理食塩水で
一回洗浄し、菌体を集めた。この菌体’　　Ｌ−、Ｅ）
−，１ＴａＱ を　　　　　　　　　　　ＤＬ−イソプロピルヒダント
インを１１１７ｄｌ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）５−に５１１７ｄｔになるように添加し、４８時
間、３０℃に保持反応した。反応終了後遠心分離により
菌体を除いた。

生成し７？Ｌ−バリンをバイオアッセイ法で測定したと
ころＬ−、Ｄ−、友ぴＤＬ−イソプロピルヒダントイン
からそれぞれ０．２１１１７ｄｉ　、　０．２３１１／
ｄｌ　。

０．２２．！ｉｌ／ｄｔのＬ−バリンが生成した。

を用い実施例１と同様に３０℃、１６時間培養した。こ
の培養液よシ菌体を遠心分離し、培養液と同量の生理食
塩水で一回洗浄し、更に遠心分離して菌体を集めた。こ
の菌体を第１表に示すヒダントイン化合物１　ｇ／ｄｉ
を含む０．　Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）５
−に５１１／ｄｔとなるように添加し、４８時間、３０
℃に保持反応した。反応終了後、遠心分離により菌体を
除いた。

上清中に存在する各アミノ酸を前記の方法で測定した結
果を第１表に示す。また、これらのアミノ酸を分離精製
し、■スペクトル、Ｘ線回折スペクトル、バイオアッセ
イ、液体クロマトグラフィー及び比旋光度測定などの方
法で分析した結果いずれもＬ−アミノ酸標゛品と一致す
る事を認めた。

第１表 用い実施例１と同様に３０℃、１６時間培養し恋。

この培養液にＤＬ−５−イソプロピルヒダントインを０
．１７ｄｔとなるように無菌的に添加し、さらに３０℃
にて２４時間培養した。この結果培養液中には０．１１
１／ｄｔのＬ−バリンが生成していた。

菌体を遠心分離によシ採取し、培養液と同量の化コバル
トイオンを１００　ｐｐｍ含む０，１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）５−に５１１／ｄｉとなるように添加し、
２４時間、３０℃に保持反応した。反応終了後遠心分離
によシ菌体を除いた。生成したＬ−バリンをパイオア、
セイ法で測定したところＬ体＃＃ＰＤＬ体のＮ−カルバ
ミルバリンからそれぞれ０．２１１７ｄｌ　。

０．２０　ｉ／ｌｒｉのＬ−バリンが生成した。

実施例５　　　　　′ ｔＸ’子ルス・ニスじ− ｉ嗣看羽碑−ＡＪ−１２２９９を実施例１の培地を用い
実施例１と同様に３０℃、１６時間培養した。この培養
液よシ菌体を遠心分離し、培養液と同量の生理食塩水で
一回洗浄し、更に遠心分離して菌体を集めた。この面体
を５ｆｉ／ｄｉの濃度になるように１００　ｐｐｍのコ
バルトイオンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に添加
し、１０ｋａの超音波にて１０分間処理をした。この処
理物を遠心し上清液を取得した。この上清液５ｆｎｔに
第２表に示すＮ−カルバミル−ＤＬ−アミノ酸ｔ−１１
１／＃となるように添加し−を７．５に補正したのち３
０℃で２４時間反応させた。

反応液中に存在する各種アミノ酸を前記の方法で測定し
た結果を第２表に示す。またこれらのアミノ酸を分離精
製しＮＭＲスペクトル、Ｘ線回折スペクトル、パイオア
、セイ、液体クロマトグラフィー及び比旋光度測定など
の方法で分析した結果、いずれもし−アミノ酸標品と一
致する事を認めた。

第２表 実施例６ となるように無菌的に添加しさらに３０Ｃにて２４時間
培養した。この結果培養液中には０．０６１／ｄｉのＬ
−バリンが生成していた。

用い実施例１と同様に３０℃、１６時間培養した。

この培養液よシ菌体を遠心分離により採取し、培ルヒダ
ントインを１１１７ｄｌ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）５１１Ｌｔに５１！／ｄｔになるように添加
し、２４時間、３０℃に保持反応した。反応終了後遠心
分離により菌体を除いた。生成したＮ−カルバミル−Ｌ
−アミノ酸をｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃
塩酸溶液の添加によシ比色定量したところ、基質がＬ体
の場合９８〜／ｄｔ、Ｄ体の場合３５ｉ１ＤＬ体の場合
９６・マ／ｄｉであった〇実施例８ い実施例１と同様に３０℃、１６時間培養した。

この培養液よシ菌体を遠心分離し、培養液と同量の生理
食塩水で一回洗浄し、更に遠心分離して菌体を集めた。

この菌体を０．０５Ｍト１７ス緩衝液（ｐＨ７，０）に
懸濁し１０ｋｃの超音波にて１０分間処理をした。この
処理物を遠心し上清液を同じ緩衝液で透析した後陰イオ
ン交換クロマトグラフィーにより分画を行なった。５−
置換ヒダントインをＮ−カルパミルーＬ−アミノ酸に変
換する活性を有する画分を回収し、第３表に示すヒダン
トイン化合物を最終的にｉ　ｐ７ｃｔｔ含む０．１　Ｍ
　リン酸緩衝液（−６、Ｏ）に添加し、２４時間３０℃
に保持反応した。

上清中に存在する各Ｎ−カルバミル嘴Ｐアミノ酸を前記
の方法で測定した結果を第３表に示す。

また、これらのＮ−力ルパミル壬；エア！ノ酸を分離精
製し、毘スペクトル、Ｘ線回折スペクトル、液体クロマ
ドグ２フイー、及び比旋光度などの方法で分析した結果
、いずれもＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸標品と一致す
る事を認めた。

第３表 手続補正書 昭和６２年９月合日 ！、事件の表示 昭和６１年特許願第１６７５３５号 ２゜発明の名称 Ｌ−アミノ酸あるいはＮ−カルバミル−し−アミノ酸の
製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　東京都中央区京橋−丁目５番８号６、補正の
対象　　　明細書の発明の詳細な説明の欄７、補正の内
容 明細書第６頁６〜９行目「バチルス・エスピー・・・が
判明した。」を削除し、下記の記載を挿入する。

［上記微生物ＡＪ　１２２９９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８
３７）は、下記の菌学的性買を有している。

（凰）形態 １）細胞の形シよび大きさ： 桿菌、０．７〜０．９Ｘ２〜４μｍ ２）細胞の多形性の有無：なし ３）運動性の有無、鞭毛の着生状態：あ）、周鞭毛４）
胞子の有無、形状、大きさ、部位：あり、卵円形、０．
３　Ｘ　Ｏ，５Ｘ　Ｏ，４〜０．６　Ｊｉｍ、中立〜準
端立胞子のうは膨張する。

５）グラム染色性：陽性 ６）抗酸性二階性 （ｂ）　　各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養： 中程度の生育、不規則状、扁平状、波状〜裂片状、パフ
色、半透明、バター質、水溶性色素生成しない。

２）肉汁寒天斜面培養 中程度の生育、拡布状、台状、鈍光、パフ色。

３）肉汁液体培養： かすかに濁る。均一、菌膜形成し、ない。沈澱はない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 層状に液化する。液化の程度は弱い。

５）　リドマス・ミルク： アルカリ性になる。ペプトン化する。リドマスは還元さ
れない。

（ｃ）　　生理学的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト：陰性 ４）ＶＰテスト：陰性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：陰性 ７）デンプンの加水分解二分解しない ８）クエン酸の利用： Ｋｏｇｓｒ培地で利用しない。

Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地で利用する。

９）無機窒素源の利用： 硝酸塩を利用する アンモニウム塩を利用する。

１０）色素の生成：生成しない １１）ウレアーゼ：極めて弱く生成する１２）オキシダ
ーゼ：陽性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）生育の範囲二 温度　４０″で生育するが４５℃では生育しない。

ｐＨ７〜９ １５）酸素に対する態度： ＱＩｑＤ通性嫌気性、微好気性、嫌気性１６）　　Ｏ−
Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　＆しｅｌｆａｏＨ法による）二〇
、Ｆ １７）糖類から酸およびガスの生成の有無酸の生成　　
　ガスの生成 Ｌ−アラビノース　　　　　−− Ｄ−キシロース　　　　　−　　　　　　　−Ｄ−グル
コース　　　　　　−　　　　　　　　−Ｄ−マンノー
ス　　　　　−− Ｄ−フラクトース　　　　十　　　　　　　−酸の生成
　　　ガスの生成 り−ガラクトース　　　　　−　　　　　　　　−麦芽
糖　　　　−− ショ糖　　　−− 乳　　　糖　　　　　　　　−− トレハロース　　　　　　　−− Ｄ−ソルビット　　　　　　−− Ｄ−マンニット　　　　　　−− イノジット　　　　　　　−− グリセリン　　　　　　　−− デンプン　　　　　　−− １８）　　Ａｙｅｖ’ｓ培地に於ける糖類から酸の生成
Ｌ−アラビノース　　　　− Ｄ−キシロース　　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　　　＋ Ｄ−マンニット　　　　　＋ トレハロース　　　　　　　＋ １９）馬尿酸の分解二陰性 ２０）　　ｆロピオン酸の利用：陰性 ２１）食塩の耐性： ３チでは生育するが５％では生育しない。

以上の菌学的性質を、パージエイ式分類（Ｂｅｒｇ＊ｆ
ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙａｔｅｍａｔｌａ
　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７＋Ｖｏｌｕｍｅ　２　（
１９８６）参照〕に基づいて検索した結果、上記ＡＪ−
１２２９９菌株はバチルス・プレビス（Ｂａａ　ｉ　ｌ
　ｌｕｇｂｒｓｖｉｓ　Ｍｉｇｕｌａ　１９００　）に
該当するものと同定した。」以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、５−置換ヒダントインをＬ−アミノ酸あるいはＮ−
   カルバミル−Ｌ−アミノ酸に変換する能力を有するバチ
   ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物の培養液、
   菌体または菌体処理物を下記一般式 I ：▲数式、化学
   式、表等があります▼・・・〔 I 〕 （式中Ｒ＿１は式▲数式、化学式、表等があります▼、
   ▲数式、化学式、表等があります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、ＣＨ＿３−、また
   は ＮＣＣＨ＿２ＣＨ＿２−で表される基を示す）で表され
   る５−置換ヒダントインのＬ体、Ｄ体またはＤＬ体に作
   用せしめて相当するＬ−アミノ酸あるいはＮ−カルバミ
   ル−Ｌ−アミノ酸に変換せしめ、これを採取することを
   特徴とするＬ−アミノ酸あるいはＮ−カルバミル−Ｌ−
   アミノ酸の製造方法。 ２、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に変
   換する能力を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に
   属する微生物の培養液、菌体または菌体処理物を下記一
   般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 （式中Ｒ＿２は式▲数式、化学式、表等があります▼、
   ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
   表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼
   、▲数式、化学式、表等があります▼、ＣＨ＿３−、Ｎ
   ＣＣＨ＿２ＣＨ＿２−、▲数式、化学式、表等がありま
   す▼または▲数式、化学式、表等があります▼で表され る基を示す）で表されるＮ−カルバミルアミノ酸のＬ体
   またはＤＬ体に作用せしめて相当するＬ−アミノ酸に変
   換せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−アミノ
   酸の製造法。