JPS6112296A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野Ｊ 本発明ＩＤ−、Ｌ−又はＤＬ−５−ベンジルヒダントイ
ンより１．−７エニルアラニンを製造する方法に関する
。

【従来技術１ Ｌ　−’フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つであり
、栄養上ちるいは医薬上重要な物質である。 本発明方法の原料である５−ベンジルヒダントインは有
機合成化学的に容易に合成される物質であり、従来、５
−ペンジルヒグントインからＬ−フェニルアラニンの製
造法として畦、フラボバクテリウＩａ・アミ／ゲネス［
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｉｎｏ　−−ｇｅ
ｎｅｓ　）　Ｆ　ＥＲＭ　−Ｐ　３１３３を５−ベンジ
ルヒｆ　７　’ｊ−インに作用させてＬ−フェニルアラ
ニンを製造するが法が知られている（特公昭５４−２２
７４）。 （発明の目的） 本発明は酵素法によすＤ−、Ｌ−又はＤＬ−５−ベンジ
ルヒダントインからし一フェニルアラニンを効率よく製
造する方法を提供するものである。 （発明の構成及び効果） 本発明者らしよ、０−０Ｌ−又はＤＬ−５−ベンジルヒ
ダントインを極めて効率よ（Ｌ−フェニルアラニンに転
換する酵素を有する新菌種、フラボバクテリウｔｈ・エ
フ、ピーＩ−３（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｌｐ
Ｉ−３３’ｉ土壌から分離することに成功し１本発明を
完成するに至った。 即し１本発明はＤ−、Ｌ−又はＤＬ−５−ペンジルヒグ
ントインからＬ−フェニルアラニンを生成せしめる能力
を有するフラボバクテリウム・エスピーＩ−３閑の培養
液１、亥培養液から採取した菌体又は該菌体処１事物を
、Ｄ−０Ｌ−又はＤＬ　−５−ペンジルヒグントインに
作用させ、生成したＬ−７ヱニルＹラニンを採取するこ
とからなるＬ−７ヱニル了ラニンの製造法である。 木発明に使用される７ラボバグテリウム・エスピー１−
：３菌は木発明＆らにより、新たに分離された新菌種で
あり、その菌学的諸性質は以下の通りである。尚１本新
隋種フラボバクテリウム・エスピー１ニー３１ｉｄｌ′
ｇＲＭ−Ｐ６９０１　（微工研菌寄第６９０１号）とし
て寄託されている。 ｌａｌ　　　形　　　態 細胞の形および大きさ：桿菌、０．４〜０．９　Ｘ　１
゜０〜２．０μ 細胞のＡ形性：なし 運動性：あり０周鞭毛 １泡子：形成しない ダラム染色性：陰性 抗酸性：なし ｆｂｌ　　各培地における生育状態 （１）肉汁寒天下板培養： 生育は適度、金縁、わずかに隆起０表面は消らか、不透
明、うずい衆牙色、光沢あり（２）肉汁寒天斜面培養二 生育は適度、糸状、貨色、光沢あシ （３）肉汁液体培養： 皮膜形成しない、沈殿生成、内層混濁、管壁に沿う輪形
成 （４）肉汁ゼラチン穿刺培蟇： 液化する。 （５）　リ　　ト　マ　ス　　・　　ミ　ル　り　　：
＋Ｉ　トマス金還元する。液化する ｉａｌ　　生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：還元する。・ （２）脱窒反応：陰性 ＋３１　Ｍ　Ｒテスト：陰性 １４１ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 ：６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：陰性 （８）クエン酸の利用： コ−ｆ　−培地、シモン培地、クリステンセン培池の（
ハずれでも利用する。 １９）無機窒素源の利用： ６ｔ［塩及びアンモニウム塩金利用する。 （１１色色素生成：水溶性色素を生成しない１１．１１
ウレアーゼ：陰・性 ・１ｚオキシダーゼ：弱陽性 ）１３）カタラーゼ：陽性 （１４）ｌｔ　＊　ノ範囲：’ｐＨ６−９３７℃では′
を育しない セ１５）酸素に対する態度：血性、嫌気性＋１６１　ｔ
Ｊ　−Ｆテスト二オキシデイテイブ１１７）ａｆｆｌか
ら酸及びガスの生成：以上、■−３菌の菌学的、渚性質
の特徴として（１）桿菌１２）運動性、（３）ダラム陰
性、（４）集落は黄色、（５）カタラーゼ陽性、（６）
嫌気性・通性、（７）グルコースを酸化的に徐々に分解
する。などがめげられる。これらの諸性状を基準として
Ｂ　ｅｒ　ｇ　＠　７’Ｂ　Ｍａｎ　ｕ　ａｌｏｆ　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
第８版に基づき検索すると、Ｉ−３菌はフラボバクテリ
ウムＣＦｌａｖｏｂａｃｔｓｒｉｕｍ　）　１ｆｉ４に
属する細菌であると判断される。しかし７ラボバクテリ
ウム属に含まれる種について史に検索しても上記Ｂｅｒ
ｇθｙ′ｓ　ｍｎｕａｌ　　第８版には１−３菌と一致
する菌種の記載を見出せない。 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　Ｋ　８版の記載によ
ると、７ラボバグテリウム属に属する１２ｍ種のうち、
運動性のあるのはフラボバクテリウム・リゲンゼ（Ｆ・
ｒｉｇｅｎ＋ｉｅ　＋　、フラボバクテリウム・インド
ルセチカム（Ｉｔ’　−ｉｎｄｏｌｔｈｅｔｉｃｕｍ　
）　＋　７ラボバクテリウム・チレニカム（Ｆ　１　ｔ
ｉｒｒｅｎｉｃｕｍ　）及び７ラボバクテリウムｅデボ
ランス（Ｆ　−ｄｓｖｏｒａｎｓ　］　　の４菌種であ
る。しかし、■−３閑は３７℃で生育しないので明らか
に７ラボバクテリウム・リゲンセトは相違する。７ラボ
バクテリウム・インドルセチカムとは、デンプンの加水
分解性、シヨ糖及（Ｄ　還元性の点で相違する。フラボ
バクテリウム・チレニカムとはゼラチン液化性、Ｄ−グ
ルコースる。又、フラボバクテリウム・デボランスとは
ショ糖と麦芽糖からの酸の生成性及び硝酸塩の遺児性の
点で相違する。更にＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ第
８版には記載されていないが、特公昭５４−２２７４に
５−ベンジルヒダノドインよりＬ−７エニルアラニンを
生成する酵素を有すると記載されているフラボバクテリ
ウム・アミノゲ′ネス（Ｆ・ａｍｉｎｏ８ｓｎｅｇ　ｌ
　ｉ’　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ　３１３３とは、運動性、コー
ヂー培地でのクエン酸の利用性及び瀾機窒票源の利用性
の点で相違する。 以上のことがらＩ−３菌を７ラボバクテリウム・４に属
する新ｍ４ｆｔと認め、７ラボバクテリウム・エスピー
■−３（Ｆ’ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　８ｐ　Ｉ　
−３）と命名した。 本発明で使用する微生物を培養する培地としては、炭素
源、窒素源、無機塩類、更に必要ならば５−ベンジルヒ
ダントイン等のアミノ酸ヒダントイン化合物を含有する
通常の培地が使用できる。 炭素源としてはＩ−３菌の利用可能なものであればいず
７Ｌも使用することができ８例えばグルコース、７ラク
トース、シュクロース、マルトース。 デ゛＋ストリン、グＩＩセリン、ソルビトールなどのむ
、曙もしくｒｔＩ唐アルコール どの汀餞酸が好適に使用できる。窒素源としては、ｍ化
＝ンモニ・７ム、ｂｌＥｅ−ｒン亡ニウム、リン酸アン
モニウｌ”　−　／ｉ１Ｍ１１アンモニウム、炭酸アン
モニウム等の無（浸酸アンモニウム塩，フマル酸アンモ
ニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸アンモニウム
塩等を使用することができる。史には．肉エキス、酵母
工←ス．コー　システィープリカー。カゼイン加水分解
物ＩＪどの天然有■窒素源を使用することもＣきるっ 尚．尺然有（幾窒素源は多くの場合．窒素源であるとと
もＶＣ炭素源にもなシうる。又，無機塩類としては．例
えば゛硝酸第一鉄．硫設マグネシウム、硫酸マンノメン
。リン酸ーカリウム．リン酸二ナトリウム．塩化ナトリ
ウム、塩化力＋１ウムなどを適宜（史用することができ
る。咀にＤＬ−５−ベンジルヒダノドイン．ＤＬ’７５
−（インドール−３−イル−メチル）ヒダントイン等の
アミノ酸ヒダントイン化合物を培地に生殖添加すること
により，よシ高い活性を得ることができる。 培養は．常法により実施すればよく．例えば培地のｐＨ
を５〜８．好ましくは６〜７．５に調整し。 菌株を接種し；ｋＣ．後２０〜３３℃．好ましくは２６
〜３０°Ｃで．曲気．攪拌ト１６〜７２時間行なう。 この様にして得られる培養液は．そのま壕酵累源として
，　、Ｄ　−　、Ｌ−又はＤＩ，−５−ベンジルヒダノ
ドイン；’）ｈ　ラＬー７℃ニルアラニンへの転換反応
に使用してｔよいが．゛また粗酵累標品．精製酵素標品
はもちろん．該培養液から採取した菌体又は該菌体の処
理物【例えば、凍結乾燥菌体，アセトン乾燥菌体，アセ
トン乾燥菌体．菌体磨砕物。 洗浄菌体．菌体の自己消化物．菌体の超音波処理物．菌
体抽出物など】を酵素源として用＾ることもできる。更
に．菌体Ｊ）るいは歯体処理物？．例えばカラギーナン
ゲル法．ポリアクリルアミド法などの公知方法によＦ）
４定化して使用することもできる。 Ｄ−、Ｌ　−又！、−ｆ　ＤＬ−５−ベンジルヒダント
インｆ　Ｉ、　−７１ニルｒラニンに転換する反応は、
Ｄ−、Ｌ−’、７−はＤＬ−５−ベンジフレヒダントイ
ンと上記：１ｉ￥′Ａ源のいｆｆ−１−かとを用い水性
媒体中で実施することができる。該反応は温度２０〜６
０℃。 好ましくは３０〜４５°Ｃ、ＰＨ６〜１０、好ましくは
８〜９に味って行なう。ｌ）　−、Ｉ、−又、まＤＬ−
５−ベンジルヒダントインの濃Ｊｉｌｄ、ｉｏ、ｔ％〜
３０幅で実舟することができる。基質を高濃度で用いる
Ｑ＆には、該、：に′〆が完全１で溶媒に溶解せず不溶
物となっていＣも本反応の；ｆ上行には何ら支障はない
。更に酵素源とじ−Ｃ１！■定化した菌体を用いる場合
は、同市化菌体をカラムに充填し７た後、基質含り溶液
に流ドさせる連続法により実施することもできろ。 又１本発明方法においては１反応液中に、適宜界面活性
剤（例えば、臭化セチルＩ−ＩＪメチルアンモニウム、
トリトンｘ−ｉｏｏなど］、有１幾溶媒１Ｔｊｔば、ジ
メチルスルホキシドなど】、補酵累

【例工ば、ピリドキ
サールリン酸など茅、無機イオン（ｍ）えば、マンガン
イｔン、マグネシウムイオンなど】を１憬加することに
より反応時間の短縮あるいシまＬ−フェニルアラニンの
蓄積量の増加に有効な場合がある。 かくして反応開始後１〜１００時間で、供したＤ−、Ｌ
−又１ｄＤＬ〜５−ベンジルヒダントインは完全ＫＬ−
フェニルアラニンに転換され１反応液中に蓄積される。 生成したＬ−フェニルアラニン（徒１通常の結晶化法、
イオン交換（支）脂性その他公知方法全適宜使用するこ
とにより容勿知分離精製することがで与る。。 以下、実施例をあげて本発明方法全具体的に説明する。 尚、実施例中のＬ−フェニルアラニンの定置ハ液体りロ
マトグラフィー及ヒロイコ／ストック・メツセンチロイ
デスｐ−６０に用いタハイオアフセイ法により行なった
。又Ｌ−フェニルアラニンの確認は１反応液からｉ得し
た結晶Ｌ−元元素分析値化比旋光度ＮＭＲ，ＩＲスペク
トル等と標品のそれと全比較することによジ行なった。 実施例１１ １１）種菌の培養 グルコース５％、７マル酸アンモニウム０．１％、リン
酸−カリウム０．３＜、リン酸二カリウム０゜７呪、硫
胃マグネシウム・７水和物ｏ、ｏｉ％、ＤＬ−５−＋（
ノド−ルー３−イルーメチル］ヒダントイン０．２％を
含りする培地をｐＨ７，０に調整し。 該培地５０Ｗｔを５０〇−容坂ロフラスコに入れ。 １２０℃で１０分間減菌した。これにｆめ肉汁塞天斜面
培池に充分生育させたフラボバクテリウム・エスピー１
−３菌（微工研菌寄第６９ｏ１号］を一白金耳接種し、
３０℃で２４時時間上り（１４Ｑ　ｒｐｍ　、振幅７Ｃ
１＋３培養した。 （２）本培養 デキストリン２％、塩化アンモニウム０．４％。 イーストエキス０．１％、ペプトン０．１％、リン酸−
カリウム０．３％、リン酸二カリウム０．７％、硫酸マ
グネシウム・７′水和物０．０１％、＠酸第−鉄・７水
和物０．００１％、硫酸マンガンｏ、ｏｏｉ鴫、ＤＬ−
５−（インドール−３−イルーメチル］ヒダントイン０
．５％を含有する培地をＰＨ７，０に調整し、該培地５
０−を５０〇−容坂ロフラスコに入れ、１２０℃で１０
分間滅菌した。こ几に（１）で得られた種培養液０．５
４を接種し、３０℃で２４時時間上う培養した。 （３）酵素反応 （２）の培養液に０Ｌ−５−ベンジルヒダントイン１．
５ｙを加え、水酸化す）　ＩＩウムで液性をｐＨ８，５
に調整した後、３７℃で１６時間反応させた。反応終丁
後１反応液中にはＬ−フェニルアラニン１゜３ｙ−が生
成蓄積していた（転換率：９８％ン。該反応液を遠心分
離により除菌した後、濃縮してＬ−フェニルアラニンの
粗結晶１．３９’ｉ得た。該粗結晶を少曖のアンモニア
水に溶解し、酢酸で中和して結晶化さぜ、−夜冷蔵庫に
放置した後、結晶をろ取することによりＬ−７エニルア
ラニンの結晶１．１りを取得した。　収率：８４呪〔α
）Ｄ＝−３３，８°（Ｃ＝２．水〕実施例　２ 実施例１−　（１１、（２１と同様にして得た本培養液
５゜−から遠心分離にて菌体を採集し、水でけん濁して
１０４とした。一方、ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン
５７及ヒ臭化七チルトリメチルアンモニウム５ｍ９ｉ２
　Ｎ　７に酸化ナトリウム約１５−に溶解し、２Ｎ塩酸
で液性をｐＨ８，５に調整した後、水を加えて４０−と
した。両者を混合し、液性をｐＨ８゜５に保持して、３
７℃で１６時間反応させた。反応終了後０反応液中には
Ｌ−フェニルアラニンが４．３７生成蓄積していた（転
換率＝９７％）。 実施例　３ ＤＬ−５−１インドール−３−イル−メチル】ヒダント
イン’１ＤＬ−５−ベンジルヒダントインに代える以外
は実施例１−ｔｌ）及び（２）と同じ組成の培地を用い
て実施例１−　＋１１　、　＋２１と同様に培養した。 該培ａ液２００ＴｒＪと火施−２と同様に調整したＤ［
、−５−ベンジルヒダントイン液４０−とを混合し、液
性をＰＨ８，５に保持したまま３７℃で１６時間反応さ
せた。反応終了後０反応液中にはＬ−フェニルアラニン
４．１５９が生成蓄積していた（転換率＝９３呪］。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｄ−、Ｌ−又はＤＬ−５−ベンジルヒダントインからＬ
   −フェニルアラニンを生成せしめる能力を有するフラボ
   バクテリウム・エスピー I −３（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
   ｅｒｉｕｍ　ｓｐ　 I −３）菌の培養液、該培養液か
   ら採取した菌体又は該菌体の処理物を、Ｄ−、Ｌ−又は
   ＤＬ−５−ベンジルヒダントインに作用させ、生成した
   Ｌ−フェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−
   フェニルアラニンの製造法。