JPS6291193A

JPS6291193A - Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法

Info

Publication number: JPS6291193A
Application number: JP1980186A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Katsumata; 勝亦　瞭一; Toru Mizukami; 水上　透; Masako Hara; 原　雅子; Yasuhiro Kikuchi; 泰弘菊池; Tetsuo Oka; 岡　徹夫
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1985-06-05
Filing date: 1986-01-31
Publication date: 1987-04-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のスレオニン生合戊に関与するホ
モセリンデヒドロゲナーゼ（以下ＨＤと略す）とホモセ
リンキナーゼ（以下ＨＫと略す）の両酵素をコードする
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有させ、
該微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−
スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを採取することを
特徴とするＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製
造法に関する。従って、本発明はバイオインダストリー
の産業分野に係り、特に、医薬１食品および飼料工業に
おいて有用なＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの
製造分野に関する。

従来の技術］す不ハクテリウム属やブレビバクテリウム属などの微
生物を用いる発酵法によるＬ−スレオニンおよびＬ−イ
ソロイシンを生産する方法については、該菌種の野性株
から透導された突然変異株を用いる方法がよく知られて
いる。Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産性
変異株としては、アミノ酸の栄養要求性変異やアミノ酸
のアナログに対する耐性変異あるいはそれらの変異を共
有する菌株が知られており、例えば、特開昭４７−１９
０８７や特公昭５４−３２０７０などに記載されている
う一方、このような突然変異の付与により育種された菌
株とは別に、組換えＤＮＡ技術により育種された菌株を
用いるＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの製造法
も知られている。

例えば、大喝菌のスレオニン生合成に係わる酵素の遺伝
情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドＤＮＡ
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に保有させ、該菌株を用いてＬ−スレオニンあるいは
Ｌ−イソロイシンを発酵生産する方法が開示されている
（特開昭５８−１２６７８９および特開昭６Ｏ−３０６
９３）。

また、ブレビバクテリウム属菌株のＨＤをコードする遺
伝子（以下ＨＤ遺伝子ともいう）を含む組換え体プラス
ミドＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属およびブレ
ビバクテリウム属菌種によるＬ−スレオニンおよびＬ−
イソロイシンの製造法も開示されている（特開昭６Ｏ−
１２９９５）。

発明が解決しようとする問題点近年、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンに対する
需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の製造法の改
良がますます望まれている。本発明者らは、この課題に
対処するために、組換えＤＮＡ技術によりコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種によるＬ−ス
レオニンおよびＬ−イソロイシンの生産能力を向上させ
るべく研究を行った。

一問題点を解決するだめの手段］リネハクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物のＬ−スレオニン生合成に係わる酵素のうち
、ＨＤとＨＫの遺伝情報を同時に含む組換え体プラスミ
ドＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌種に導入することにより、Ｌ−スレオニンおよ
びＬ−スレオニンを前駆体として生合成されるし一イン
ロイシンの生産能が著しく向上することを見出し、本発
明を完成するに至った。コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種由来の遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いるＬ−スレオニンあるいはＬ−イ
ソロイシン生産菌としては、前記のごと＜ＨＤ遺伝子を
適用した例が知られているが、ＨＤ遺伝子とＨＫをコー
ドする遺伝子（以下ＨＫ遺伝子ともいう）の両遺伝子を
使用した例は知られておらず、両遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡがＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンの生産
性に顕著に寄与することは、本発明により初めて見出さ
れたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子
を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
スレオニンあるいはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、
該培養物からＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを
採取することにより、高収率でＬ−スレオニンまたはＬ
−イソロイシンを製造することができる。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種としては、コリ゛ネ型グルタミ
ン酸生産菌として知られる微生物は全て用いることがで
きるが、好適には下記の菌株が使用される。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウム・アセトアンドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１，５９９０ブレビバクテリウム・ディバリカラムＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣｌ
　３８６９ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０宿主微生物としては、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン非生産性の菌株を用いることもできるが、好まし
くはＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−ＩＪ
リジン産性を有する菌株を用いる。Ｌ−スレオニン、Ｌ
−イソロイシンまたはＬ−ＩＪリジン産性を存する菌株
は、アミノ酸要求性変異、アナログ耐性変異またはこれ
らの変異を組み合わせる公知の変異誘導法によって造成
できる〔ブレスコツト・アンド・ダンズ・インダストリ
アル・ミクロバイオロジイ（ＰＲＥＳＣＯＴＴ　ａｎｄ
ＤＩＪＮＮ’　Ｓ　ＩＮＤｔｌＳＴＲＩＡＬ　ＭＩＣＲ
ＯＢＩＯＬＯＧＹ　）第４版、ジー・リード（Ｇ、　Ｒ
ｅｅｄ　）　綱、ザ・ニー・グイ・アイ・パブリッンン
グ・カンバー？−−（Ｔｈｅ　ＡＶＩ　Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ、　　Ｃｏｎｎ、）　　
１９８２．　　ＰＰ、７４８−８０１．　　ケイ・ナカ
ヤ７　（Ｋ、Ｎａｋａｙａｍａ）　〕。

本発明において、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子の供給源とな
る微生物としては、コリ２型グルタミン酸生産菌でＨＤ
およびＨＫ活性を有するものであればいかなる微生物で
もよく、例えばコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物の野生株あるいはそれから誘
導したＬ−ＩＪジン、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロ
イシン生産性変異株を用いることができる。これらの菌
株の染色体ＤＮＡは、本発明者らが特開昭５８＝１２６
７８９に示したように、培養中にペニシリン処理した菌
体をリゾチームおよび界面活性剤で処理して溶菌した後
、常法て除蛋白し、次いでエタノールで沈殿させること
により単離できる。

染色体ＤＮＡからＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ
断片を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製
できるものであれば特にじ長足されないが、例えば本発
明者らが開発したｐＣＧｌ（特開昭５７−１３４５００
）、ｐＣＧ２　（特開昭５８−３５１９７）、ｐｃＧ４
．ｐｃＧｌｌくいずれも特開昭５７−１８３７９９）、
ｐＣＥ５４、ｐｃＢｌｏｌ　（いずれも特開昭５８−１
０５９９９）、ｐｃＥ５１　（特開昭６Ｏ−３４１９７
）およびｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３　Ｃいずれもモレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジ工不ティクｘ　（Ｍｏｌ
、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　）　１９６．１７５　（１
９８４））などのプラスミドを使用することができる。

プラスミドベクターは、本発明者らが特開昭５７−１３
４５００あるいは特開昭５７−１８６４８９に開示した
ように、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌後、
クリヤード・ライゼートを調製し、ポリエチレングリコ
ールでＤＮＡを沈殿させ、しかる後にセシウムクロライ
ド−エチジウムブロマイド密度匂配遠心にかけ、ＣＣＣ
−ＤＮＡとして単離ｖｉ製することができる。

ＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタープ
ラスミドとの組換え体は、染色体ＤＮＡとベクタープラ
スミドを制限酵素で切断した後、ＤＮＡ　リガーゼで処
理するか、あるいはその切断末端をターミナルトランス
フェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、Ｄ
ＮＡ！Ｉガーゼを作用させて結合するなどの常法〔メソ
フヅ・イン會エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、　５３（１９７９）　）に
より、種々の組換え体混成物とともに生成せしめること
ができる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の菌
株から通常の変異操作によって誘導したホモセリン（す
るいはメチオニンとスレオニン）要求性のＨＤ欠損変異
株またはスレオニン要求性でホモセリンを分泌生産する
ＨＫ欠損変異株を上記組換え体混成物を用いて形質転換
し、ホモセリンまたはスレオニンに対して非要求性とな
った形質転換株を選択することによって、ＨＤおよびＨ
Ｋ両遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを取得する
ことができる。コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌株の形質転換法としては、本発明者らが開
発したプロトプラストを用いる方法（特開昭５７−１８
６４９２および特開昭５７−１８６４８９．具体的には
実施例に示す）により実施することができる。かくして
得られた組換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ、の中から、Ｈ
Ｄ欠損変異株とＨＫ欠損変異株を再度形質転換したとき
菌株の欠損形質を復帰させるものを選ぶことにより、Ｈ
ＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組換え体プラスミドを入手
することができる。

以上のようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源とし
た場合には、野生型のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体が得られ、これをコリネバクテリウム嘱またはブ
レビバクテリウム属菌株に保有させ、Ｌ−スレオニンま
たはＬ−イソロインンの生産性を向上させることができ
る。しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌１重において、スレオニン生合成ニ係
ワるＨＤはスレオニンでフィードバック阻害を受け、ス
レオニン合成を制御することが知られている〔アグリカ
ルチユラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、　３８　（５）、　
９９３（１９７４）　）ので、この阻害から解除された
変異型のＨＤをコードする遺伝子を有する組換え体プラ
スミドを用いる方がＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイ
シンの生産性は高まる。

このような変異型のＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドは、アグリカルチユラル・バイオロジカル・ケミスト
リイ（Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、　３
８（５）、９９３　（１９７４）に記載されているよう
に、スレオニンのアナログ例えばα−アミノ−β−ヒド
ロキシ吉草酸（以下ＡＨＶと略す）に耐性となった変異
株、すなわちＨＤ活性のスレオニンによる阻害が解除さ
れた菌株を分離し、その染色体ＤＮＡを供与源として、
野生型の遺伝子から出発したと同様な方法で取得できる
。あるいは野生型の遺伝子を含む組換え体プラスミドを
保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を常法通り変異処理し、スレオニンアナログ耐
性を付与することによっても、スレオニンによる阻害を
受けなくなったＨＤ遺伝子を含む組換え体プラスミドを
調製できる。

野生型あるいは変異型のＨＤおよびＨＫ遺伝子を含む組
換え体プラスミドは、前記のごときプロトプラストを用
いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物に導入できる。これらの組換え
体プラスミド保有株によるＬ−スレオニンまたはＬ−イ
ソロイシンの生産は、従来の発酵法によるＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシン製造に用いちれる培養方法に
より行うことができる。すなわち、該形質転換株を炭素
源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有す
る通常の培地で、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節
しつつ培養を行えば、培養物中にＬ−スレオニンまたは
Ｌ−イソロイシンが生成蓄積するのでこれを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、ａ粉、
ｉｌ、粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコ
ール、ピルビン酸、フマール酸。

乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いることができる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
　’ａＮＦｍアンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含を物ならびにペプ
トン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、フィッンユミ
ールあるいはその消化物、＠加水分解物などの窒素含有
物など種々のものが使用可能である。

さらにｔｉｌｔ物としては、リン酸第−水素カリウム、
リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。

塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルンウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培
養期間は通常１〜５日間で培地にＬ−スレオニンおよび
／またはＬ−イソロイシンが蓄積する。培養終了後、菌
体を除去して活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公
知の方法で培養液からＬ−スレオニンおよび／またはＬ
−イソロイシンを回収する。

かくしてコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物のＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含む組
換え体プラスミドを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属の微生物を用いることにより
、高収率でＬ−スレオニンおよび／またはＬ−イソロイ
シンを生産することができる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例（１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
３１８３３の染色体ＤＮＡとベクターｐＣＥ５４の調製ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを純水
１βに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で増殖した
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
の種培養を４０　Ｑｍｌの半合成培地ＳＳＭ　（グルコ
ース２０　ｇ、　（Ｎ　Ｈ４）２３０．１０ｇ、尿素３
ｇ、酵母エキスＩｇ。

ＫＨｚＰＯ４１ｇ、　ＭｇＣｌ２・６）１２０　０．４
ｇ。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ、Ｍｎ３Ｏ４・４〜６８
２０　０．２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＜・７８２０　０．９ｍｇ
、Ｃｕ　ＳＯ４・５　Ｈ２Ｏ０，４ｍｇ、Ｎ　ａｚＢａ
ｏｔ・　１０　Ｈ２Ｏ０，０９ｍｇ、（ＮＨｌ）ｉＭＯ
ｔＯｚ＜　・４＋−４２００，０４ｍｇ、ビオチン　３
０ｘｒおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１１に含み、
ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕に接種して３０℃で振盪
培養した。東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度
（００）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養液
中０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリンＧを
添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるま
で生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液〔０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）、０．００５Ｍ　　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム）。

０．０５Ｍ　　ＮａＣＣｐＨ８，０〕で洗浄後、リゾチ
ーム溶液（２５％シヨ糖、０．ＩＭ　ＮａＣｊ！。

０、０５　Ｍ　）リス、　０．８　ｍｇ／ｍＩリゾチー
Ａ、ｐ）（８，０，以下同じ”）　１０ｆｆｌｌに懸濁
し、３７℃で４時間反応を行った。集菌した菌体から斉
藤らの方法（Ｓａｉｔｏ、　Ｈ９ｅｔ　　ａｌ、：バイ
オキミカ・工・バイオフィジカ畢アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ＞、　７２．６１９　（１９６３））　ｌ、：
従って高分子染色体ＤＮＡを単離した。

ベクターとして用いたｐＣＥ５４（特開昭５８−１０５
９９９）は、本発明者らが先に特許出願したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドｐＣＣ；２（特開
昭５８−３５１９７）とニジエリシア・コリのプラスミ
ドｐｃＡ２２〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（
Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１４０．４００　（１９７
９）　〕を連結せしめたプラスミドである。詳しくは１
）ＣＧ　２とｐＧＡ２２の各々１ケ所しかないＰｓｔＩ
切断部位で両者を和合連結したプラスミドである（第１
図参照）。このｐＣＥ５４はその保有株コリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣ’Ｃ３
１８３３から誘導したリゾチーム感受性変異を有する菌
株）の培養菌体から次の方法で単離した。

４ＱＱｍｌＮＢ培地で３０℃で振盪培養し、ＯＤ約０．
７になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ緩衡液で
洗浄後、リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で２
時間反応させた。反応液に５Ｍ　ＮａＣ１２，４ｍｌ、
０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、４％ラ
ウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ　　ＮａＣｊ！からな
る溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから
氷水上に１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃
で６０分間６９．４００Ｘｇの遠心分離にかけ上澄液を
回収した。これに重量百分率１０％相当のポリエチレン
グリコール（ｐＥＧ）６．０００（半井化学薬品社製）
を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０
時間後、１．５００×ｇで１０分間遠心分離してペレッ
トを回収した。ＴＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてベレットを
静かに再溶解してから１．５＋ｎｇ／ｍｌエチジウムブ
ロマイド２．Ｑｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加
えて静かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を１０５．０００ｘｇ、１８℃で４８時間超遠
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面か
ら注射器で抜きとることによってｐＣＥ５４プラスミド
ＤＮＡを分離した。この分画液を等容量のインプロピル
アルコール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコー
ル、１０％ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解度の塩
化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマ
イドを抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透
析した。

（２）ＨＤ遺伝子とＨＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクロ
ーニング上記で調製したｐＣＥ５４プラスミドＤＮＡ３μｇを含
む制限酵素５ａｌＩ用反応液（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣ
ｊ！２６ｍＭ、ＮａＣｌ２００ｍＭ、ｐＨ７，５）６０
ｔｔｌに６単位のＳａβ■（全酒造社製）を添加し、３
７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応
を停止させた。一方、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡ８μｇを含むＳａ
ｊ！Ｉ用反応液１４０μｌに４単位の５ａｊ２　Ｉを添
加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温
して反応を停止させた。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４’Ｊガーゼ用緩衝
液（トリス（ｉ　６０ｍＭ、ＭｇＣＬ５５ｍＭ、ジチオ
スレイトール１００ｍＭ。

ｐＨ７，６＞４０ｔｔｌｌ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０μｃ
Ｔｌガーゼ（宝酒造社製、１単位／μＩ）０．３μβお
よび純水１２０μｌを加え、１２℃で１６時間反応させ
た。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム、・グル
タミクムＡＴＣＣ３１８３３由来のリゾチーム感受性変
異株から誘導されたに５３株〔本菌株はホモセリン要求
性（ＨＤ欠損）とロイシン要求性の変異を有している〕
の形質転換に供した。Ｋ５３株は昭和６０年５月２３日
付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）１：Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ　　８２５７として寄託しである。

形質転換には次のように調製されるプロトプラストを用
いた。Ｋ５３株の種培養をＮＢ培地に植菌して３０℃で
振盪培養し、ＯＤが０．６になった時点で集菌した。菌
体をＲＣＧＰ培地°〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ
、酵母エキス２．５ｇ　、　Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ＋　
Ｋｌ−（２Ｐ○＜ｔ、５ｇ。

ＭｇＣＬ・６Ｈ２００゜４１ｇ、Ｆｅ５０＊・７　Ｈｚ
ｏ　　１０ｍｇ、　Ｍｎ　５０４　・４〜６　Ｈ２Ｏ２
ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＊’７Ｈ２００，９ｍｇ。

（ＮＨ４）６ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，Ｏ４ｌｌ１ｇ
。

ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸
二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量
１０．ＯＱＱ）３０ｇを水１２に含む培地〕に１ｍｇ／
ｍｌのりゾチームを含む溶液（ｐ　Ｈ７，６）に約１０
９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して
３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化
した。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（
ＭｇＣｌ２　１０ｍＭ、ＣａＣｊ！２３ＱｍＭ、）リス
５０ｍＭ、　　ショ糖４００ｍＭ。

ｐＨ７，５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
緩衝液０．１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度
のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液
１００μβを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に
２０％ＰＥＧ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して
混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌ
を添加し、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上
澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣ
ＧＰ培地に懸濁してから、Ｑ、２ｍｌをカナマイシフ３
００　Ａｕｇ　／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＣ
，Ｐ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗
抹し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｎ＋１に懸濁した。こ
の菌液をロイシン５０μｇ　／ｍｌおよびカナマイシン
２０μｇ　／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍｌ　〔グル
コース１０ｇ。

ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１ｇ、ＫＣｊ２　０．２ｇ、ＭｇＳ○
。

・７Ｈ２００，２ｇ、ＦｅＳＯ４’７ＨｚＯ１Ｏａｒ、
Ｍｎ５ＯＢ４〜６１−１２０　０．２ｍｇ、ＺｎＳ○、
・７Ｈ２００，９ａ＋ｇ、ＣｕＳ○４・５Ｈ２００，４
ｍｇ。

Ｎａ２ＢｓＯｔ’１ＯＨ２００，０９ｍｇ、（ＮＨｌ）
ｓＭＯｔＯｚ４・４Ｈ＊ＯＯ，０４ｍｇ、ビオチン５０
μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２．５　ｍｇ　、サイアミン
塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを１β中に含み、ｐ　Ｈ
７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃で３日培
養し、ホモセリン非要求性でカナマイシンに耐性となっ
た形質転換株を選択した。

これらの形質転換株をＮＢ培地で培養し、その菌体から
上記（１）でｐＣＥ５４を単離したのと同様な方法でプ
ラスミドＤＮＡを単離した。

形質転換株の一株から得られ、ｐｃｈｏｍｌと命名した
プラスミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５４の唯一の５ａｊ２
１切断部位に３．６キロベースの５ａｊ７１ＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドであることがわかった。このＳ
ａｊ！　Ｉ切断片は第１図に示すような位置に２ケ所の
ＰＳｔＩ切断部位と１ケ所のＥＣ０ＲＩ切断部位を有し
ていた。

ｐｃｈｏｍｌＤＮＡを用い、上記と同様な方法でに５３
株のプロトプラストを形質転換し、カナマイシン耐性で
選択された形質転換株は、同時にホモセリン非要求性を
示し、それから単離されたプラスミドはｐｃｈｏｍｌと
同一の構造を有していた。このことからコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３のＨＤ遺伝子が
ｐｃｈｏｍｌ上にクローン化されていることが明らかと
なった。

ＨＫ遺伝子がｐｃｈｏｍｌ上に存在することは次のよう
に確認した。ｐｃｈｏｍｌＤＮＡを用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３から誘導した
スレオニン要求性でホモセリン生産性のＨＫ欠損変異株
に５４（本菌株は昭和６０年５月２３日付で微工研にＦ
ＥＲＭＰ−８２５８として寄託しである）のプロトプラ
ストを形質転換した。本枕のプロトプラストは以下のよ
うにペニシリン処理菌体から調製した。ＮＢ培地での種
培養０．１ｍｌをスレオニン１００μｇ／ｍｌを含むｌ
　０ｍ１（７）　Ｓ　Ｓ　Ｍ培地に接種し３０℃で振盪
培養した。ＯＤが０．１５になった時点で０．４５単位
／ｍｌとなるようにペニシリンＧを添加した。さらに培
養を続けＯＤが０．６になったところで集菌し、以後前
記でに５３株のプロトプラストを調製したのと同様な方
法でリゾチーム処理してプロトプラスト化した。形質転
換も前記と同様に行い、カナマイシン３００μｇ　／ｍ
ｌを含むＲＣＧＰ寒天培地で形質転換株を選択した。カ
ナマイシン耐性形質転換株は同時にスレオニン非要求性
であった。

この形質転換株を４００ｍｌＳＳＭ培地で振盪培養し、
ＯＤが０．２になったところで０．５単位／＋ｎｌとな
るようにペニシリンＧを添加し、さらにＯＤ約０．６ま
で培養し、集菌した菌体から上記（１）で記載したのと
同じ方法で溶菌し、塩化セシウム−エチジウムブロマイ
ド密度匂配遠心でプラスミドを単離した。このプラスミ
ドを各種制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動で解
析した結果、ｐｃｈｏｍｌと同一のプラスミドであるこ
とが確認された。

以上の結果からｐｃｈｏｍｌとしてクローニングされた
３、６キロベースの５ａｌｌＤＮＡ切断片にはＨＤおよ
びＨＫ両遺伝子が存在していることが判明した。

（３）宿主菌に高度のα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草
酸耐性を与える変異型プラスミドの作製　・ｐｃｈｏｍ
ｌを保有するに５３株をカナマイシン２５μｇ　／ｍＩ
を含むＮＢ培地で対数増殖の後期まで増殖させた。菌体
を５０　ｍ　Ｍ　）　ＩＪス・マレイン酸緩衝液（ｐ　
Ｈ６，０）で２回遠心後、Ｎ−メチル−Ｎ’−二トロー
Ｎ−二トロソクアニジン４００μｇ　／ｍｌを含む５０
ｍＭ）リス・マレイン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）に懸濁
し室温で３０分間処理した。処理菌体を同じ緩衝液で２
回遠心洗浄後、ＮＢ培地に懸濁し３０℃で２時間振盪培
養した。培養菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄し生理食
塩水に懸濁した。菌懸濁液をカナマイシン２０μｇ　／
ｍ＋とα−アミン−β−ヒドロキ／吉草酸（以下ＡＨＶ
と略す）６ｍｇ／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍ１に塗抹し
て３０℃で３日間培養した。出現した１つのコロニーを
純化後、前記と同様にして培養菌体からプラスミドを単
離し、このプラスミドをｐｃｈｏｍｌ。

と命名した。

ｐｃｈｏｍｌあるいはｐｃｈｏｍｌＯを保存するに５３
株の培養菌体を生理食塩水で遠心洗浄後、約１０４細胞
相当の菌をＡＨＶ２ｍｇ／ｍ＋。

４ｍｇ／ｍｌおよび６ｍｇ／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍ
１に塗抹し、雨林のＡＨＶ耐性変性度較した。

３０℃で３日間培養した結果、ｐｃｈｏｍｌ保有株はＡ
　ＨＶ　２　ｍｇ／ｍｌを含有するＭｌ寒天培地で生育
したが、４ｍｇ／ｍｌを含む寒天培地では生育できなか
った。一方、ｐｃｈｏｍｌＯ保有株はＡ　ＨＶ　６　ｍ
ｇ／ｍｌを含有するＭ１寒天培地でも生育した。

ｐｃｈｏｍｌｏは、各種制限酵素での切断解析の結果、
ｐｃｈｏｍｌと同一の構造を有しており、スレオニン要
求性のＨＫ欠損変異株に５４の相補能も保持していた。

（４）　　ｐ　Ｃｈ　ｏ　ｍ　ｌあるいはｐｃｈｏｍｌ
ｏを導入した菌株によるスレオニンの生産コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９およびリジン生産性菌株ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ２１４７５（チアリジン耐性）を
ｐｃｈｏｍｌおよびｐｃｈｏｍｌｏで形質転換した。プ
ロトプラストは上記（２）でに５４株のプロトプラスト
を調製したのと同様の方法で調製した。即ち、３３Ｍ培
地での培養中途でペニシリンＧ（０，４５車位／＋ｎｌ
　）を添加して処理した培養菌体をリゾチーム処理して
調製した。プロトプラストをプラスミドＤＮＡ　１ｇｇ
を用いて前記と同様の方法で形質転換し、ＲＣＧＰ寒天
培地でカナマイシン耐性の形質転換株を選択した。形質
転換株から、上記（２）でに５４株のｐｃｈｏｍｌ形質
転換株からプラスミドを単離したのと同様の方法で、プ
ラスミドを単離し、各種制限酵素での切断解析により、
形質転換株がｐｃｈｏｍｌあるいはｐｃｈｏｍｌＯを保
有することを確認した。

形質転換株と各々の親株のスレオニン生産試験を次のよ
うに行った。ＮＢ培地で３０℃。

１６時間振盪培養した種培養Ｑ、５ｍｌを生産培地〔グ
ルコース１００　ｇ、（ＮＨａ）＊ｓｏｓ　　２０　ｇ
。

ＫＨ２Ｐ０．０．５ｇ、に２ＨＰＯ，０，５ｇ。

Ｍｇ５Ｏｓ’７ＨｚＯＩｇ、Ｆｅ５０−７Ｈｚ０１０ｍ
ｇ、　Ｍｎ　ＳＯ４・４〜６　Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ビオチ
ン１００μｇおよび炭酸カルシウム２０ｇを水１１に含
み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕５ｍｌの入った試験
管に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、
培養Ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒ
ドリン発色による比色定量法によりＬ−スレオニン生成
量を測定した。結果を第１表に示す。

７．５）２０μ、ｆにＥｃｏＲＩ　（宝酒造社製）を３
単位添加し、３７℃で６０分間反応後、７０℃で１５分
間加温して反応を停止させた。これにデオキシＡＴＰと
デオキシＴＴＰを各０．０５ｍＭ添加し、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩラージフラグメント（宝酒造社製）を３
単位加え、３７℃で３０分間反応させ、７０℃で１５分
間加温して反応を停止させた。

一方、ｐｃｈｏｍｌプラスミドＤＮＡ３／ｊｇを含むＳ
ｍａ　Ｔ用反応液（トリス１０ｍＭ。

ＫＣ！ｌ　２０ｍＭ、ＭｇＣ１１２６ｍＭ、ｐＨ７，５
）２０μｌにＳｍａｌ（宝酒造社製）を３単位およびＰ
ｖｕ［（宝酒造社製）を１単位添加し、３７℃で６０分
間反応させた。反応物中から、モレキユラー・クローニ
ング（コールドスプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
１９ｇ２）　１６４頁に記載されている方法を用いて、
２．６キロベースのＤＮＡ切断片を分画、精製した。す
なわち、反応物をアガロースゲル電気泳動にかけ、２．
６キロベースのバンドを切り出し、透析膜中で電気泳動
することによりゲルからＤＮＡ切断片を抽出した。抽出
液に３倍量のエタノールを添加し、−８０℃、１０分間
冷却したのち、遠心により沈殿を集めた。真空中でエタ
ノールを蒸発させ、２０μｐのＥｃｏＲＩ用反応液に溶
解した。

両反応物を混合し、５ｍＭ　　ＡＴＰを５μ！とＴ４’
Ｊガーゼ（宝酒造社製）を１単位添加し、１２℃、１６
時間反応させた。前記の方法によりに５３株のプロトプ
ラストを作成し、このリガーゼ反応物を用いて形質転換
を行った。カナマイシン耐性かつホモセリン非要求性を
示した形質転換株の１株からプラスミドＤＮＡを前記の
方法により調製した。

ｐｃｈｏｍ２０と命名したこのプラスミドＤＮＡを用い
て、Ｋ５３株およびに５４株を再度形質転換して調べた
ところ、ＨＤおよびＨＫ両遺伝子の相補能を存すること
が確認された。

制限酵素ＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で
解析した結果、ｐｃｈｏｍ２０はｐｃｈｏｍｌの３ａｊ
！Ｉ３．６キロベ一ス挿入断片のうち第３表に示すＰｓ
ｔｌｌ、０キロベ一ス断片を含む領域をサブクローニン
グしていることがわかった。

（７）ＨＤおよびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ切断片の塩
基配列ｐｃｈｏｍ２０にサブクローニングされたＨＤお
よびＨＫ両遺伝子を含むＤＮＡ切断片の全塩基配列をメ
ソッズ・イン・エンザイモロジ−１０１巻、２０頁、１
９８３年に記載されている方法を用いて決定した。すな
わち、常法により制限酵素切断地図を作成したのち、Ｍ
１３ファージ・ベクターにサブクローニングして一本鎖
Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、ジデオキシヌクレオチドによるチ
ェーンターミネーション法により塩基配列を決定した。

その結果を第３表に示す。第３表は２６１５塩基対より
成るＳｍａ　Ｉ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片の塩基配列とそ
の中に存在する２つのオーブンリーディングフレーム（
塩基３２２から塩基１５５７までおよび塩基１５７１か
ら塩基２４９７まで）に対応するアミノ酸配列を示して
いる。これらのオープンリーディングフレームがそれぞ
れＨＤおよびＨＫ構造遺伝子に相当する。

箪　３　表Ｐｒｏｌｈｒ＾１ａＡｓｐＶａｌムＩｕＬｊｌｙＨ＋５
ＡｓｐＡｌａＡｌａｂｅｒＬｙｓＡｌａ＾１１１１１ｅ
Ｌｌ！ｕＭｌａｂｌｌｒｌＩｌｌＧＣＴＴＴＣＣＡＣＡ
ＣＣＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡ
ＣＴＧＣＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴｃＡａＥ
Ａ　＋ａＰｈａＨｒｓＴｈｒＡｒ−ｇＵａ　ｌ　Ｔｈｒ
Ａ　ＩａＡｓｐＡｓｐｕａ　Ｉ　ＴｙｒＣｙａＧ　ｌ　
ｕＱ　Ｉ　ｙ目ａｓｅｒＡａｎ　Ｉ　ｌ　ｅｓｅｒＧＩ
ｙ（ｊｌｕＶａｌＰｒｏＬ＠ｕＡｓｐＬｊｌｙｓｅｒＨ
ｉｓＬｓｕＶａｌνａｌＬｙｓ＾１ｍｌ　Ｉｓ＾ｒｇＡ
ｌａｌｊｌｙＬｅｕＬｙｓＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧ
ＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣ丁Ｇ発明の
効果本発明によれば、コＩＪ　２ハタチリウム属およびブレ
ビバクテリウム属に属する微生物のスレオニン生合成に
関与するＨＤおよびＨＫの遺伝情報を担うＤＮＡとベク
タープラスミドとの組換え体ＤＮＡを保有させることに
より、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
属菌種におけるし−スレオニンあるいはそれを前駆体と
して生合成されるＬ−イソロイシンの生産性を付与ある
いは向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃｈｏｍｌの制限酵素５ａｆＩ。Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの切断地図とそ
の作製工程を示す。プラスミドの分子量はキロベース（
Ｋｂ）で表示されている。ｐｃｈｏｍｌの太い実線部分
の染色体ＤＮＡ断片上にＨＤおよびＨＫ両遺伝子が含ま
れている。第１図（１４，５１０１（旧、ＶＯ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物のホモセリンデヒドロゲナーゼおよび
ホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有す
るコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニ
ンまたはＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該培養物か
らＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン
の製造法。
（２）ベクターが、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属に属する微生物内で複製可能なｐＣＧ１
、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＣＥ５１、ｐＣ
Ｅ５２、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１および
それらから誘導されるプラスミドから選ばれる特許請求
の範囲第１項記載の方法。
（３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼお
よびホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する宿主微生物にスレオニンまたはイ
ソロイシンのアナログに対する耐性を付与することがで
きるＤＮＡ断片であることを特徴とする組換え体ＤＮＡ
。
（４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物由来のホモセリンデヒドロゲナーゼお
よびホモセリンキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担
うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物。
（５）第３表で示されるホモセリンデヒドロゲナーゼの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（６）第３表で示されるホモセリンキナーゼのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ。