JPH0523744B2

JPH0523744B2 -

Info

Publication number: JPH0523744B2
Application number: JP2147881A
Authority: JP
Inventors: Masao Motoki; Atsushi Okyama; Masahiko Nonaka; Haruo Tanaka; Ryosuke Uchio; Akira Matsura; Hiroyasu Ando; Koichi Umeda
Original assignee: AMANO SEIYAKU KK
Current assignee: AMANO SEIYAKU KK
Priority date: 1987-03-04
Filing date: 1990-06-06
Publication date: 1993-04-05
Also published as: JPH0343080A

Description

【発明の詳細な説明】

［利用分野］本発明は、ストレプトベルチシリウム属由来の
新規トランスグルタミナーゼの製造法に関する。
更に詳しくは、新規トランスグルタミナーゼ生産
能を有するストレプトベルチシリウム属に属する
菌株を栄養培地に培養し、該培養物より新規トラ
ンスグルタミナーゼを採取することを特徴とする
ストレプトベルチシリウム属由来の新規トランス
グルタミナーゼの製造法に関する。トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあ
るグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のア
シル転移反応を触媒する酵素である。このトランスグルタミナーゼは、アシル受容体
としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基
が作用すると、分子内及び分子間にε−（γ−
GIu）−Lys架橋結合が形成される。また水がアシ
ル受容体として機能するときは、グルタミン残基
が脱アミド化されグルタミン酸残基になる反応を
進行させる酵素である。また、本発明の新規トランスグルタミナーゼを
利用して製造されるタンパク質のゲル化物は、従
来のゲル状食品、ゲル状化粧料をはじめとしてヨ
ーグルト、ゼリー、チーズなどとして用いられ
る。［従来の技術］トランスグルタミナーゼはこれまで動物由来の
ものが知られている。例えばモルモツトの肝臓
〔Connellan et al.、ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Journal of
Biological Chemistry）246巻４号1093〜1098頁
（1971）〕及び哺乳動物の臓器、血液に広く分布し
〔Folk etal.、アドバンセス・イン・エンザイモ
ロジー（Advances in Enzymology）38巻109〜
191頁（1973）、Folk et al.、アドバンセス・イ
ン・プロテイン・ケミストリー（Advances in
Protein Chemistry）31巻１〜133頁（1977）〕、
その酵素の特徴も研究されている。しかし、現時点ではストレプトベルチシリウム
属由来のトランスグルタミナーゼについては報告
されていない。［発明が解決しようとする問題点］従来トランスグルタミナーゼの供給は動物に由
来しているため実用性を考慮した場合、供給量、
供給費用、保存費用、精製の困難さ等の種々の面
から不利でありこのままでは産業上の利用への可
能性はほとんど考えられなかつた。従つて、本発明の課題は供給量、コストの面、
精製の容易さ等のいずれの面からも問題はなく、
しかも反応にCa²⁺を必要としなくともよい点等、
実用性の高いストレプトベルチシリウム属由来の
新規トランスグルタミナーゼの製造法の提供であ
る。［問題点を解決するための手段］これまで動物由来の酵素が検討されてきたが実
用性に欠けるため、本発明者等は給源を微生物に
求め広く検索を行つた結果、ストレプトベルチシ
リウム属の菌についてCa²⁺非存在下でもペプチ
ド鎖内のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド
基のアシル転移反応を触媒する従来にない新規ト
ランスグルタミナーゼ生産能があることを見い出
し、本発明を完成するに至つた。すなわち、本発
明はCa²⁺非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反
応を触媒する新規トランスグルタミナーゼ生産能
を有するストレプトベルチシリウム属に属する菌
株を栄養培地に培養し、該培養物より該新規トラ
ンスグルタミナーゼを採取することを特徴とする
ストレプトベルチシリウム属由来の新規トランス
グルタミナーゼの製造法に関する。ストレプトベルチシリウム属の菌を具体的に示
すと、ストレプトベルチシリウム・グリセオカル
ネウム（Streptoverticillium griseocarneum）
IFO12776、ストレプトベルチシリウム・シナモ
ネウム・サブ・エスピー・シナモネウム
（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.
cinnamoneum）IFO12852、ストレプトベルチシ
リウム・モバラエンス（Streptoverticillium
mobaraense）IFO13819等があげられる。これら微生物を培養し、ストレプトベルチシリ
ウム属由来のトランスグルタミナーゼ（尚、以後
BTGaseと記す）を取得するための培養法及び精
製法等について述べる。本発明を実施するにあたり、その培養形態とし
ては液体培養、固体培養いずれも可能であるが、
工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利であ
る。又、使用する栄養培地の培養源としては一般に
微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩
及びその他の微量栄養源の他、ストレプトベルチ
シリウム属に属する微生物の利用出来る栄養源で
あれば全て使用出来る。培地の炭素源としてはブ
ドウ糖、シヨ糖、可溶性デンプン「ラスターゲ
ン」（商品名、日電化学社製）、グリセリン、デキ
ストリン、澱粉等の他、脂肪酸、油脂、有機酸な
どが単独で又は組合せて用いられる。窒素源とし
ては無機室素源、有機窒素源のいずれも使用可能
であり、無機栄養源としては硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アン
モニウム等が挙げられる。又有機窒素源としては
大豆、米、トウモロコシ、小麦などの粉、糖、脱
脂粕をはじめコーンステイープリカー、ペプト
ン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス
等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素としては
リン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウ
ム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン界面活
性剤、消泡剤等の菌の生育やBTGaseの生産を促
進するものであれば必要に応じて使用出来る。培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し
BTGaseが産生する範囲であれば良く、好ましく
は25〜35℃である。培養時間は条件により異なる
がBTGaseが最も産生される時間まで培養すれば
良く、通常２〜４日程度である。 BTGaseは液体培養では培養液中に溶解されて
おり、培養終了後培養液より固形分を除いた培養
ろ液より採取される。培養ろ液よりBTGaseを精
製するには通常酵素精製に用いられるあらゆる方
法が使用出来る。例えばエタノール、アセトン、イソプロピルア
ルコール等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等
による塩析、透析、限外ろ過法、イオン交換クロ
マトグラフイー、吸着クロマトグラフイー、ゲル
ろ過、吸着剤、等電点分画等の方法が使用出来
る。又これらの方法を適当に組合せることにより
BTGaseの精製度が上る場合は適宜組合せて行う
ことができる。こうしてこれらの方法によつて得られた酵素液
に安定化剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂
質、界面活性剤等を加えあるいは加えることな
く、限外ろ過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結
乾燥、噴霧乾燥の方法を施すことにより液状又は
固形の精製BTGaseを得ることが出来る。 BTGaseの活性測定はベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルア
ミン基質としてCa²⁺非存在下で反応を行い、生
成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で
鉄錯体を形成させ525nmの吸収を測定し、ヒドロ
キサム酸の量を検量線より求め活性を算出する。 BTGase活性は特に記載しないかぎり以下に記
載する方法により測定した。＜活性測定法＞試薬Ａ 0.2Mトリス塩酸緩衝液（PH6.0） 0.1Mヒドロキシルアミン 0.01M還元型グルタチオン 0.03Mベンジルオキシカルボニル −Ｌ−グルタミニルグリシ
ン試薬Ｂ 3N塩酸 12％トリクロロ酢酸５％FeCI₃・6H₂Ｏ（0.1NHCIに溶解）上記溶液の１：１：１の混合液を試薬Ｂとす
る。酵素液の0.05mlに試薬A0.5mlを加えて混合し37
℃で10分間反応後、試薬B0.5mlを加えて反応停
止とFe錯体の形成を行つた後525nmの吸光度を
測定する。対照としてあらかじめ熱失活させた酵
素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測
定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液
のかわりにＬ−グルタミン酸γ−モノヒドロキサ
ム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差によ
り生成されたヒドロキサム酸の量を求め、１分間
に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性
を１単位とした。このようにして得られる精製BTGaseの酵素化
学的性質を以下に述べる。尚、ストレプトベルチ
シリウム属内の菌株の種類によりBTGaseの酵素
化学的性質について若干の相違点がみられるの
で、それぞれの菌株の生産するBTGase、即ちス
トレプトベルチシリウム・モバラエンス
（Streptoverticillium mobaraense）IFO13819の
トランスグルタミナーゼ（BTG−１と命名）、ス
トレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム
（Streptoverticillium griseocarneum）IFO12776
のトランスグルタミナーゼ（BTG−２と命名）、
ストレプトベルチシリウム・シナモネウム・サ
ブ・エスピー・シナモネウム
（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.
cinnamoneum））IFO12852のトランスグルタミ
ナーゼ（BTG−３と命名）についての酵素化学
的性質を記載するとともに、それらを包含したも
のをBTGaseの酵素化学的性質とする。ａ至適PH：６〜７基質としてべンジルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを使用
し、37℃、10分反応で作用至適PH範囲を求めた。
尚、BTG−１の至適PHは６〜７にあり、BTG−
２の至適PH６〜７付近にあり、BTG−３の至適
PHは６〜７付近にある（第１図、第５図及び第９
図参照）。ｂ至適温度：45〜55℃ 基質としてべンジルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを使用
し、PH６、10分反応での作用至適温度範囲を求め
た。尚、BTG−１の至適温度は55℃付近であり、
BTG−２の至適温度は45℃付近であり、BTG−
３の至適温度は45℃付近にある。（第２図、第６
図及び第１０図参照）。ｃ PH安定性：PH５〜９ 37℃、10分間処理でのPH安定性を求めた。尚、
BTG−１はPH５〜９で安定であり、BTG−２は
PH５〜９で安定であり、BTG−３はPH６〜９で
安定である（第３図、第７図及び第１１図参照）。ｄ温度安定性 PH７で10分間処理での温度安定範囲を求めた。
40℃では80％以上、50℃では50〜80％の活性がそ
れぞれ残存した。尚、BTG−１は40℃では88％
活性が残存し、50℃では74％活性が残存し、
BTG−２は40℃では86％活性が残存し、50℃で
は56％活性が残存し、BTG−３は40℃で80％活
性が残存し、50℃では53％活性が残存する。（第
４図、第８図及び第１２図参照）。ｅ基質特異性 BTGaseの各種合成基質とヒドロキシルアミン
との反応を調べた。合成基質がベンジルオキシカルボニルアスパラ
ギニルグリシン、ベンジルオキシカルボニルグル
タミン、グリシルグルタミニルグリシンの場合反
応しない。しかし、合成基質がベンジルオキシカルボニル
グルタミニルグリシンの場合反応性は最も高い。
この時の各種合成基質濃度は5mMとした。結果は表−１に示される。尚、表−１中の
CBZはベンジルオキシカルボニル基の略であり、
Glnはグルタミル基の略であり、Glyはグリシル
基の略であり、Asnはアスパラギニル基の略であ
る。

【表】

【表】ｆ金属イオンの影響活性測定系に1mM濃度になるように各種金属
イオンを加えて影響を調べた。結果は表−２に示される。BTGaseはCa²⁺，
Zn₂₊により活性が阻害される。

【表】ｈ阻害剤の影響各阻害剤を1mMになるように加え、25℃、30
分放置後、活性を測定した。結果は表−３に示される。BTGaseはパラクロ
ロマーキユリー安息香酸（PCMBと略する）、Ｎ
−エチルマレイミド（NEMと略する）、モノヨ
ード酢酸により活性が阻害される。

【表】表−３中PMSFはフエニルメチルスルホニルフ
ロオライドの略である。ｉ）等電点：8.9〜9.9 アンホライン等電点電気泳動により求めた。
尚、BTG−１の等電点（pI）は９付近であり、
BTG−２の等電点（pI）は９、７付近であり、
BTG−３の等電点（pI）は9.8付近である。ｊ）分子量：約38000〜約41000 SDSデイスク電気泳動法により求めた。尚、
BTG−１の分子量は約38000であり、BTG−２
の分子量は約41000であり、BTG−３の分子量は
約41000である。次に、BTGaseとモルモツト肝由来のトランス
グルタミナーゼ（以後MTGaseと記す）との性
質を比較する。尚、MTGaseは特開昭58−
149645号に記載された方法で調製した。表−４には各酵素化学的性質の比較を、表−５
にはCa²⁺の活性に及ぼす影響を示す。表−４及
び表−５より明らかなように従来主として研究さ
れているMTGaseとストレプトベルチシリウム
属由来のBTGaseとでは酵素化学的性質において
種々の差が見られ、特に温度安定性、分子量、等
電点、基質特異性に差が見られる。また、Ca²⁺
の存在下及び非存在下のいずれにおいても本発明
のトランスグルタミナーゼは作用する点等でも明
らかな差がみられる。従つて、本発明のBTGase
はMTGaseとはその性質を明らかに異にするも
のであり、新規トランスグルタミナーゼである。

【表】

【表】以下に本発明のBTGaseの製造法について実施
例にて具体的に説明する。実施例１ストレプトベルチシリウム・モバラエンス
（Streptoverticillium mobaraense）IFO13819を
培地組成ポリペプトン0.2％、グルコース0.5％、
リン酸二カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1％
からなる水性培地（PH７）200mlに接種し30℃、
48時間培養し、得られた種培養液をポリペプトン
2.0％、「ラスターゲン」0.2％リン酸二カリウム
0.2％、硫酸マグネシウム0.1％。酵母エキス0.2
％、消泡剤としてポリオキシアルキレングリコー
ルの「アデカノール」（商品名、旭電化社製品）
0.05％からなる水性培地20（PH７）に加え30℃
で３日間培養後ろ過し、培養液18.5得た。この
ものの活性は0.35ユニツト／mlであつた。培養液を塩酸でPH6.5に調製し、予め0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH6.5）で平衡化しておいたメタア
クリル酸系ポーラス型陽イオン交換樹脂の「アン
バーライトCG−50」（商品名、ローム・アンド・
ハース社製品）のカラムに通した。この操作でト
ランスグルタミナーゼは吸着された。さらに同緩
衝液で不純蛋白質を洗い流した後、更に0.05〜
0.5Mの同緩衝液の濃度勾配をつくり、通液して
溶出液を分画回収し、比活性の高い分画を集め
た。電導度を10ms以下になるように稀釈後「ブル
ーセフアロースCL−6B」（商品名、フアルマシ
ア・フアインケミカル社製）のカラムに通した。
この操作でトランスグルタミナーゼは吸着され
た。更に0.05Mリン酸緩衝液（PH７）で不純蛋白
質を洗い流した後、０〜1Mの食塩濃度勾配をつ
くり通液して溶出液を回収し比活性の高い画分を
集めた。限外濾過膜の「AIL1010」（商品名、旭化成工
業(株)製）を使い濃縮し、０，5Mの食塩を含む
0.05Mリン酸緩衝液（PH７）を用いて平衡化させ
た。得られた濃縮液を同緩衝液で予め平衡化してお
いた「セフアデツクスＧ−75」（商品名、フアル
マシア・フアインケミカル社製）を含むカラムに
通し、同緩衝液を流して溶出液を分画した。この結果活性画分は単一のピークとして溶出さ
れた。このものの比活性は培養ろ液に対し625倍
であり、回収率は47％であつた。実施例２実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウ
ム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium
griseocarneum）IFO12776を30℃で３日間培養
後ろ過し培養液19を得た。このものの活性は
0.28u／mlであつた。実施例１と同様な方法で酵素を精製してSDSデ
イスク電気泳動で単一の酵素を得た。実施例３実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウ
ム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナモネウ
ム（Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.
cinnamoneum）IFO12852を30℃で３日間培養後
ろ過し、培養液18.5を得た。このものの酵素活
性は0.5u／mlであつた。実施例１と同様な方法で酵素を精製してSDSデ
イスク電気泳動で単一の酵素を得た。［発明の効果］本発明のストレプトベルチシリウム属由来の
BTGaseは安価に供給され、かつ精製も容易であ
るので実用性が大である。また、BTGaseを用いることにより、カルシウ
ム非存在下でも酵素（BTGase）濃度及び基質濃
度が非常に低いところで品質の優れたゲル化物を
製造できるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は本願発明
のBTG−１の至適PH曲線、至適温度曲線、PH安
定曲線及び温度安定曲線を示すものであり、第５
図、第６図、第７図及び第８図は本願発明の
BTG−２の至適PH曲線、至適温度曲線、PH安定
曲線及び温度安定曲線を示すものであり、第９
図、第１０図、第１１図及び第１２図は、本願発
明のBTG−３の至適PH曲線、至適温度曲線、PH
安定曲線及び温度安定曲線を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ Ca²⁺非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反
応を触媒する新規トランスグルタミナーゼ生産能
を有するストレプトベルチシリウム属に属する菌
株を栄養培地に培養し、該培養物より該新規トラ
ンスグルタミナーゼを採取することを特徴とする
ストレプトベルチシリウム属由来の新規トランス
グルタミナーゼの製造法。