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JPS6174596A - γ−グルタミルシステインの製造法 - Google Patents

γ−グルタミルシステインの製造法

Info

Publication number
JPS6174596A
JPS6174596A JP19828184A JP19828184A JPS6174596A JP S6174596 A JPS6174596 A JP S6174596A JP 19828184 A JP19828184 A JP 19828184A JP 19828184 A JP19828184 A JP 19828184A JP S6174596 A JPS6174596 A JP S6174596A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
glutamic acid
cysteine
glutamylcysteine
medium
cystine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP19828184A
Other languages
English (en)
Inventor
Tatsuro Fujio
達郎 藤尾
Mineyuki Hayashi
峰之 林
Yasuhiro Tomiyoshi
冨吉 康弘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority to JP19828184A priority Critical patent/JPS6174596A/ja
Publication of JPS6174596A publication Critical patent/JPS6174596A/ja
Pending legal-status Critical Current

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はr−グルタミルシステイン(以下r−GCと称
す)の製造法に関する。r−GCは抗酸化作用に基づく
食品添加物としての用途があるほか、制癌剤と併用して
その副作用を軽減する薬理作用があるので、食品工業お
よび医薬品工業において利用される。
従来の技術 生化学的手段によるr−GCの製造方法としては、酵素
反応による方法、たとえばラット腎臓由来のT−グルタ
ミルシステインンンセターゼ(E。
C,6,3’、2.2>(以下r−GC3と弥す)を固
定化して用いる方法(特開昭55−77888)。
化合物AとBとから化合4mA−8を生成させる能力を
存する微生物の作用によりアミノ酸誘導体を生成させる
方法(特開昭56−58495)、グルタチオンによる
r−GC5へのフィードバック阻害が解除された大腸菌
を用いる方法(特開昭58−20197)、グルタチオ
ンによるフィードバック阻害を受けなくなったr−GC
Sをコードしている遺伝子をプラスミドベクターに組み
込み大腸菌に含有させることにより、同酵素活性を強化
した微生物を用いる方法(特開昭58−20188>な
と゛が知られている。
発明が解決しようとする問題点 従来の酵素反応を用いるr−GC合成反応は、エネルギ
ー要求反応であるため、いずれの場合もエネルギー供与
体として高価なアデノシン三燐酸(以下ΔTPと称す)
あるいはATPとア七チル燐酸を用いており、工業的製
法として必ずしも満足し得るものではない。そのため、
より実用的なエネルギー供給系の開発が必要である。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、r−GC製造のための新たなエネルギー
供給系を開発すべく研究を行った結果、細菌の培養物、
菌体またはそれらの処理物が燐酸化物以外の各種化合物
をATP再生系のエネルギー供与体として利用し辱るこ
と、ならびにこのATP再生活性と、同培養物、菌体ま
たはそれらの処理物が併有するγ−GC合成活性とを共
役させることによりr−GCを製造することができるこ
とを見出し本発明を完成した。
〕ニーー月 本発明は、グルタミン酸、/スティンおよび/または/
スチン、およびATPからr−GCを生成する能力を有
し、かつ燐酸化物以外のエネルギー供与体を利用してア
デノシン三燐酸(以下ADPと称す)をA T P +
、::変換する能力(以下ΔTP再生能と称す)を有す
る細菌を用いてγ−GCを製造する方法を提供する。
具体的には、上記細菌の培養物、菌体またはそれらの処
理物を、L−グルタミン酸、L−システィンおよび/ま
たはL−ンスチン、および非燐酸化エネルギー供与体を
含む水性培地中で接触させ、培地中にr−GCを生成蓄
禎させ、該培地中からr−QCを採取する。
本発明に用いられる細菌としては、L−グルタミン酸、
L−システィンおよび/またはL−ンスチン、および燐
酸化物以外のエネルギー供与体とからr−GCを生成す
る能力を有するものならばいずれでも使用でき、またr
−GC3をコードしたDNAをプラスミドペターに組み
込んだプラスミドを含むもの、あるいはまた、部分的な
改変を受けたr−GC3蛋白をコードしたDNAを組み
込んだプラスミドベクターを含むものなども、同様の能
力を有する限り好適に使用することができる。具体的に
例示すれば、次のような菌株が用いられる。
エシェリヒア・コリ K12   ATCC1079g
エシェリヒア・コリ W    ATCC9637エ’
7s !I ヒフ ・−’ リB    ATCC11
303エンエリヒア・コリ RC912微工研条寄第4
7号工/エリヒア・コIJ  RC912P  微工研
条寄第48号エンテロバクタ−・アエロゲネス ATC
C13048プロテウス・ブルガリス  微工研菌寄第
3447号エルウィニア・ヘルヒ゛コーラへTCC21
434これらの細菌を通常の培養方法によって培養する
ことによって、L−グルタミン酸、L−システィンおよ
び/またはL−ンスチン、および燐酸化物以外のエネル
ギー供与体とからr−GCを生成する強力な活性を有す
る培養液、菌体、またはそれらの処理物を得ることがで
きる。すなわち、これらの大腸菌を炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミン等を含有する通常の培地中に
おいて、好気的条件下にて温度、pHなどを調節しつつ
培養を行えばよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース。
/:L−クロース、マルトース、マンニトール、ソルビ
トールなどの炭水化物、aアルコール、グリセロール1
m粉加水分解物、1!蜜などが使用でき、またピルビン
酸、乳酸、クエン酸などの各種有機酸、さらにはグルタ
ミン酸、メチオニン等の各種アミノ酸も用いつる。
窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどの
アミノ酸、あるいはペプトン、NZ−アミン、コーン・
スチープ・リカー、肉エキス。
酵母エキス、カゼイン加水分解物、フィフン二・ミール
あるいはその消化物、雉加水分解物などの含窒素有機物
などの種々のものが使用可能である。
さらに、無機物としては燐酸二水素カリウム。
燐酸−水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅。
塩化マンガン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを
必要に応じて添加する。微生物の生育に必要なビタミン
、アミノ酸、核酸その他のものは前記したような池の培
地成分に伴って培地に供給されれば特に加えな(でもよ
い。
培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下に行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは28
〜42℃がよい。培養中の培地のpHは中性付近に維持
することが望ましい。培養時間は通常1〜24時間であ
る。
かくして得られる細菌の培養物、菌体、またはそれらを
種々処理して得られる処理物を用いて、これとL−グル
タミン酸、L−システィンおよび/またはL−ンスチン
、および燐酸化物以外の工茅ルギー供与体とを接触させ
る。
処理物としては、培養物の濃縮物、もしくは乾繰物、培
養物を遠心分離機で処理して辱られる菌体、菌体の乾燥
物、アセトン処理物、界面活性剤および/または有機溶
剤処理物、溶菌酵素処理物。
固定化菌体あるいは菌体からの抽出酵素標品などがあげ
られる。
接触反応は水性媒体中であればいずれでも行うことがで
き、最も好適には細菌の培養液中にL−グルタミン酸、
L−システィンおよび/またはL−シスチン、および燐
酸化物以外のエネルギー供与体を加え、さらに必要に応
じて燐酸イオン、マグネシウムイオン、さらには界面活
性剤および/または有機溶剤を加え、20〜50℃にて
1〜48時間反応させることにより、r−GCを蓄積さ
せることができる。この際pHを6〜10、より好まし
くは7〜8に調節することが望ましい。培地中および反
応液中の各基質濃度は、L−グルタミン酸100 g/
j!以下、L−システィンおよびL−ンスチン100g
/f以下、POa3−50g/l以下(燐酸二水素す)
 IJウムとして)、Mg”″′30g71以下(硫酸
マグネシウム7水塩として)が適当である。
エネルギー供与体としては、非燐酸化物であって、1吏
用する細菌によって利用されるものであれば、グルコー
ス、アラビノース、ラクトース、マルトース、ンユーク
ロース、7ンニトール、ソルビトール、トレハロース、
a蜜、I&粉粉氷水分解物ピルビン酸、乳酸、酢酸、f
f−ケトゲルタール酸などの有機酸、グリ/ン、アラニ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸など
が1〜200 g/jの濃度で用いられる。
界面活性剤としては、ポリオキンエチレン・ステアリル
アミン(例えばNIM  S−215,日本油脂社製)
、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド等のカチ
オン系界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸等の
アニオン系界面活性剤、ポリオキシエチレンソルピクン
・モノステアレート(例えばノニオン5T−221,日
本油脂社製)等の両性界面活性剤等が用いられ、これら
は通常0.1〜50g/It、好ましくは1〜20g/
j!の濃度にて用いられる。
有機溶剤としては、トルエン、キンレン、脂肪1フルコ
ール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられ、その濃度
は1〜5Qml/nがよい。
水性反応液中に蓄積したr−GCを採取する方法として
は、例えば銅塩沈澱またはイオン交換樹脂等を用いて精
製し、真空凍結乾燥により粗粉末を寿て、アルコール沈
ab作を数回繰り返すことにより精製r−GCを得る。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1゜ 第1表に示した菌株をL培地(バクト・トリプトン10
g/j!、酵母エキス5g/l、塩化ナトリウム5g/
l : pH7,2)を200ml含む11三角フラス
コに植菌し、28℃にて1晩往復振盪培養を行った。菌
体を遠心分離(3,OOOrpm。
10分)にて集め、凍結保存(−20℃)した。
凍結菌体を最終濃度が湿潤重量にて2QOg#!となる
ように水に懸濁した液に、L−グルタミン酸100mM
、 L−システィン100mM、  リン酸ニナトリウ
ム5g/I!、硫酸マグネンウム5g/!、グルコース
50g/l!となるように各成分を溶解し、200++
+lビーカーに20m1ずつ分注した。各々を恒温水槽
にて37℃に保温し、マグ不チックスターラーにて95
(lrpmにて攪拌し、かつ5Nの苛性ソーダを用いて
pHを7.3に調節しながら、2時間保ち、r−GCを
生成せしめた。
その結果第1表に示した結果を碍た。
第1表 エシェリヒア・コリK12八TC[: 10798  
 +5.8〃W   ATC[:  9637   1
2.9〃B   ATCC1130319,2実施例2
゜ エシェリヒア・コリB555株から誘導され、グルタチ
オンによるr−GC3に対するフィードバック阻害が解
除された変異株(RC912株)および、そのフィード
バック阻害が解除されたT−CCSをプラスミドにつな
ぎ込んだベクターを用いてRC912株を形質転換して
得られた変異株(RC912F)を用いた。各菌株を実
施例1と同様に培養して得られた凍結菌体を用い、実施
例1と同様に反応して辱られた結果を第2表に示第  
  2    表 工/エリヒア・コリ B555    15.2エンエ
リヒア・コリ RC91220,0工/エリヒア・コリ
 RC912P  81.4実施例3゜ エシェリヒア・コリATCC11303株を実施例1と
同様に培養し、得られた菌体を直接又は凍結融解処理を
加えて反応に用いた。実施例1に示した反応液組成をそ
のまま、または同反応液組成に界面活性剤(ポリオキ/
エチレン・ステアリルアミン、日本油脂社製NIM  
S−215)および/またはキンレンをそれぞれ4u+
g/m1. 10μl /ml加えた組成を用い、実施
例1と同様に反応し、第3表に示す結果を得た。
第3表 −5,0 、−、lO,5 +        12.8 −         十+  、          
2 5. 0+−−19,2 +++      27.2 実施例4゜ エシェリヒア・コリATCC11303株を実施例1と
同様に培養し、得られた菌体を凍結保存して反応に用い
た。
グルコースの代わりに第4表に示す各種エネルギー供与
体を用いた他は、実施例1と同様の反応液組成を用いて
反応を行い、第4表に示す結果を辱た。
第    4    表 −痕跡

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)下記イとロとハを水性培地中で接触させて培地中
    にγ−グルタミルシステインを生成蓄積させ、該培地中
    からγ−グルタミルシステインを採取することを特徴と
    するT−グルタミルシステインの製造法。 イ:グルタミン酸とシステインおよび/またはシスチン
    とからアデノシン三燐酸の存在下にγ−グルタミルシス
    テインを生成する能力を有し、かつ燐酸化物以外のエネ
    ルギー供与体を利用してアデノシン二燐酸をアデノシン
    三燐酸に変換する能力を有し、さらにこれら両能力を同
    時に共役して発揮しうる細菌の培養物、菌体またはそれ
    らの処理物 ロ:グルタミン酸とシステインおよび/またはシスチン ハ:燐酸化物以外のエネルギー供与体
  2. (2)水性培地中に界面活性剤および/または有機溶剤
    を存在せしめる特許請求の範囲第1項記載の方法。
JP19828184A 1984-09-21 1984-09-21 γ−グルタミルシステインの製造法 Pending JPS6174596A (ja)

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