JPS6128397A - 発酵法による脂肪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、工業製品、医薬、香料、化粧品の製造等、広
範な化学工業において使用されている脂肪酸の製造方法
に関する。

（従来の技術） 現在、工業原料として用いられる脂肪酸の製造方法とし
て、ノｆラフイン類を酸化して高級脂肪酸を合成する方
法、精製した天然油脂を高圧分解法、トイッチェル分解
法等非酵素的方法により分解する方法、及び天然油脂を
９・ぐ−ゼ製品によシ酵素的に分解する方法等が知られ
ている。

しかしながらパラフィン類を酸化して合成する方法には
製品品質上の問題がある。また、天然油脂を非酵素的に
分解して脂肪酸を製造する方法においては、一旦生成し
た脂肪酸や原料油脂中に含まれていた不純物が分解し、
又はこれらが相互に反応して種々の不純物が生成し、こ
のために製品脂肪酸が毒性、刺激性、着色、臭気等を有
し、この脂肪酸を医薬、化粧品等に安全に使用するには
難点がある。他方、油脂をリパーゼで分解して脂肪酸を
製造する方法においては、反応が穏和な条件で行われ、
しかも油脂のみが特異的に分解され、反応中に有害不純
物が生成しないので、高純度の脂肪酸を製造するのに有
利な方法であると考えられる。

しかしながら、リバーぜ製品は比較的高価であり、しか
も従来のり・９−ゼを使用した場合油脂が完全に分解さ
れずモノグリセリド及びジグリセリドが残留して脂肪酸
収率が低い等のため、リパーゼ分解法は経済性の点で問
題があった。このような経済性の問題点を解決する手段
の１つとしてり・ヤーゼを用いて油脂類を分解する際に
１分解反応系に水に不溶性の有機溶媒を添加することに
よシリパーザの使用量を低減せしめる方法が提案されて
いる（特開昭５９−９１８８９　）が、この方法は必ず
しも実用的とは言えない。

（発明により解決しようとする問題点）この発明は、従
来技術のり・や−ゼ分解法が有する上記Ωような欠点を
有しないり・９−ゼ分解法による脂肪酸の製造方法を提
供するものであシ、特に、モノグリセリドやジグリセリ
ドを残留せしめることなくトリグリセリドを完全に脂肪
酸とグリセリンとに分解する酵素を使用すること、及び
該酵素を最も経済的な態様で使用することに向けられる
。

（問題点を解決するための手段） することができる細菌を油脂類を含有する培地に培養し
、又は該細菌を培地に培養しその中途において油脂類を
添加し、そして培養液から脂肪酸を採取することを特徴
とする脂肪酸の製造方法によシ解決することができる。

微生物 この発明の方法においては、スタフィロコ、力る属に属
しり・ぐ−ゼ金生産することができる細菌を使用する。

このような細菌であれば、いずれも使用することができ
、例えばスタフィロコッカス・パーザ、キャンディダ（
’Ｃａｎｄｌｄａ　）属の酵母由来のリパーゼ等を使用
してトリグリセリドを分解した場合、分解物としてかな
シの量のモノグリセリド及びジグリセリドが生成し、こ
のために脂肪酸の収率が低下する。これに対してスタフ
ィロコッカス属の細菌に由来するり・ぞ−ゼによシトリ
グリセリドを分解した場合、ジグリセリドはほとんど生
成せず、モノグリセリドは生成するとしてもその量は極
めて少ない。特に、スタフィロコッカス・キャビテイス
由来のリパーゼでトリグリセリドを分解した場合、モノ
グリセリド及びジグリセリドは実質上全く生成しない。

従って、この発明の方法に使用する微生物としてはスタ
フィロコッカス・キャビテイスが最も好ましい。

この発明の方法に使用することができる乙！り１巳三Ｌ
ｐ！・アウレウスの菌株としては例えばＩＡＭ１０１１
株、ＩＡＭ１０９８株、ＩＡＭ　１２０８２株等を挙げ
ることができる。また、スタフ　ココ１．カス・１１旦
デ土２の菌株としては例えばＡＴＣｏ　２７８４０株、
ＡＴＣＣ２７８４１株、ＡＴＣＣ２７８４２株、ＡＴＣ
Ｃ２７８４３株、Ｔ−１−１株等を挙げることができる
。

このスタフィロコッカス・キャビテイスＴ−１−１株は
本発明者等がヒトの頭皮から分離した新菌株であって次
のような性質を有する。

（〜　形態 （１）大きさ；直径０．８〜１．２．ｃｎ＋ｚの球菌、
２〜４個集って存在。

（２）運動性；なし。

（３）胞子形成；観察されず。

（４）　　ダラム染色性；陽性。

（５）　　抗ば性；なし。

（均　生育状態 （１）肉汁寒天平板培養；やや凸状、円形、表面平滑、
不透明白色のコロニーを形成。コロニーは小さく、径１
〜３％である。

（２）肉汁液体培養；生育良好、液全体が混濁。

（３）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化せず、線
状に生育。

（４）肉汁寒天斜面培養：やや凸状、表面平滑。

不透明白色。生育良好。

（５）ＩＪ）マスミルク；色調変化せず。凝固又は液化
を認めず。

（６）　　メチルレッド（ＭＲ）テスト；陽性（７）　
　フォーダス・プロスカラエル（ｖｐ）テスト；陽性 （８）インドール生成；なし。

（９）硫化水素生成；なし。

（６）デンプン分解能；なし。

αめ　クエン酸利用能；コーザー・クリステンセン反応
陽性。

（６）無機窒素源利用能；硝酸塩を利用するが、アンモ
ニウム塩を利用せず。

０　色素産生能；なし。

α◆　ウレアーゼ反応；陰性。

（ロ）オキシダーゼ反応；陰性。

（ロ）カタラーゼ反応；陽性。

ＣＬｆ）生育範囲；ｐＨ５〜９、温度２０℃〜４０℃最
適生育温度３２℃〜３５℃。

（至）酸素要求性；通性嫌気性。

（至）糖利用能； 酸生成（＋）：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ
−マンノース、シュクロース、グリセリン 酸、ガス生成（−）：Ｄ−がラクトース、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、マルトース、ラクトース、トレ
ハロース、Ｄ−ソルビット、イノジット、デンプン。

Ｄ−グルコースから乳酸を生成。

（ホ）耐塩性；あｆｉ（１０〜２０％の食塩水中生育） ぐ）　リ・母−ゼ活性；あシ。

に）　レシヂナーゼ活性；あり。

に）　コアグラーゼ活性；なし。

（ハ）フォスファターゼ活性：ナシ。

に）デオキシリがヌクレアーゼ活性；あシ。

なお、本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄託番号第７７２３号（ＦＥＢＭ　Ｐ−７７２３）と
して寄託されている。

培養及び反応 この発明においては、前記の細菌が生産するリパーゼに
よりて油脂類を分解して脂肪酸を生成せしめるのである
が、分解方法の態様として例えば次の方法が挙げられる
。

（１）前記の細菌が増殖することができる培地に原料と
なる油脂を含有せしめ、これに前記の細菌を接種して、
細菌の増殖と併行して油脂の分解を行う。

（２）前記の細菌が増殖することができる培地に前記の
細菌を増殖せしめ、次に原料油脂を添加し、引き続き培
養を行い、これと併行して油脂の分解を行う。

前記（１）の方法においては、原料油脂のすべてを最初
に培地に加えることができるが、まず最初に油脂の一部
分を培地に加えて培養を開始し、その後細菌の増殖とす
でに加えた油脂の分解の程度を監視しながら残シの油脂
を連続的又は段階的に加えることができる。

前記（２）の方法においても、前記（１）の場合と同様
、原料油脂を１度に添加することもでき、又は段階的も
しくは連続的に添加することもできる。これらの場合に
おいて、油脂を添加する（又は添加を開始すり時期とし
ては、例えば細菌が増殖を開始した培養初期でもよく、
又細菌の増殖がほぼ終了した時期でもよく、これらの中
間の任意の時期であってもよいシ この発明の方法において使用する培地は、前記の細菌が
増殖し、そしてリパーゼを生産することができるもので
あればよく、例えば炭素源としてグルコース、フラクト
ース、スクロース、グリセロールなどがあげられ、窒素
源としてはカゼイン、大豆などに由来する種々のペプト
ン、酵母エキスなどを選択利用することができる。リン
酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩や食塩などの無機塩
類、あるいは各種ビタミン類など菌の生育を促す化合物
をさらに添加してもよい。

培養にあたっては、あらかじめ油脂を含まない液体培地
を用いて、この発明の細菌を前培養したものを油脂を加
えた、又は加えてない本培養用培地に接種して本培養を
行なう方法がとられる。

培養及び反応の条件は、使用する菌株によって異るが通
常２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃の温度、
培地中ｐＨ５，０〜９．０、好ましくは６．０〜７．０
とし、通気・攪拌、振とり等による好気的条件下で、液
体培養するのが好ましい。

培養時間は、最初から油脂を加えて培養を行う場合は約
２０〜７０時間であり、培養の中途において油脂を加え
る場合は、油脂の添加が終了した後さらに油脂が完全に
分解するまで培養を継続し、又は培養と同様な条件で反
応を継続する。

この発明の方法に使用する油脂は、グリセライドを含有
するものであれば、なんでもよく、植物性油脂、動物性
油脂又はこれらの混合物を使用することができる。油脂
の添加量は、培地中に生成されるり・ぐ−ゼの力価等に
より異るがおよそ０．５〜５．０　（ｖ／ｖ　）　％と
するのが好ましい。

脂肪酸の採取 本発明によって、脂肪酸は培養液中に蓄積し、培養液を
濾過あるいは遠心分離して除菌した後得られる培養液上
澄よシ常法に従い簡単に精製でき。

る。

遊離脂肪酸の培養上澄からの抽出は酢酸エチル、クロロ
ホルム、ベンゼン等極性が低く水と混ざり合わない有機
溶媒を用いて行なう。抽出後溶媒を減圧溶去した後の残
渣をメタノール等のアルコールと混合攪拌することによ
り脂肪酸はアルコール層に移行するが、油脂はアルコー
ル層に移行しない。このようにして未分解の油脂を除去
したアルコール可溶性画分からの脂肪酸の精製は圧搾法
、分別結晶洗液・液抽出法等によって行なり事ができる
が、シリカダル等を用いた順相カラムクロマトグラフィ
ーあるいはＲＰ　−１８等を用いた逆相カラムクロマト
グラフィーによっても行なう事ができる。

次に、実施例によシこの発明をさらに具体的に説明する
。

加する例 （ＦＥＢＭ　Ｐ−７７２３）を、５００ｄ溶のフラスコ
に２００ＩｎｌのＰ培地〔酵母エキス０．５　％　（ｗ
／ｖ）、ポリイブトンＩ　Ｚ　（ｗ／ｖ）、グルコース
ｏ、　ｉ　ｑＡ　Ｃｗ／ｖ）、ＮａＣ２０，５％　（ｗ
／ｖ）、ｐＨ６，３）を入れあらかじめ１２０℃、１５
分間加圧滅菌したもの３本に接種し、３０℃にて２４時
間、２４０　ｒｐｍで回転振盪培養を行なった。得られ
た培養液を下記組成の培地３０１を含む５０１容ジャー
ファーメンタ−に加え、更にあらかじめ１２１℃にて１
５分間加圧滅菌したオリーブ油３００ｄを加え、３０℃
にて３０時間、３００　ｒｐｍ、１．　Ｏｖｖｍで攪拌
通気培養味の素＠）製）　５　％　（ｗ／ｖ）、ＮａＣ
１０，５％　（ｗ／ｖ）、ｐ）（６，３ｏ本培養培地３
０１を５０１容ジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃
にて２０分間加圧蒸気滅菌を行なっておく。

得られた培養物は遠心分離によシ除菌した・上澄液に３
０Ａ？の酢酸エチルを加え、１時間混合攪地１ｆｒ−Ｓ
姓、８１曲間静偕１．て→鮒１−た酢酸エチル層を取シ
、減圧溶去して得られた残渣に３１のメタノールを加え
、５℃で一晩混合攪拌した。これを遠心分離して得られ
るメタノール層を減圧溶去後、残渣を２１のｎ−ヘキサ
ンに溶解させた。

ｎ−ヘキサン可溶画分を減圧溶去した後、残渣を１００
ｄのベンゼンに溶解し、シリカダルカラム（５Ｘ５５ｃ
Ｉｎ）の上にのせた。カラムを１１のベンゼンテ洗い、
２１のベンゼン・クロロホルム１：１混合溶液で溶出後
、３１のクロロホルムで溶出した両分よシ混合脂肪酸１
００ｇが得られた。

上記方法で得られた本混合脂肪酸のガスクロマトダラム
を図１に示す。

上記方法で得られた本発明物をシリカダルクロマトグラ
フィーに上記と同条件で再度付し、オレイン酸両分を集
めることによシ、オレイン酸７６ｇが得られた。

添加する例 ２７８４０　）を、実施例１と同様に２００ｄのＰ培地
で回転振盪培養した。１４１容ジャーファーメンタ−中
に実施例１と同様の本培養用培地７ノを入れ、あらかじ
め１２０℃、１５分間加圧滅菌しておいた培地中へ、前
記の前培養液を加え、３０℃にて２４時間、３００　ｒ
ｐｍ、　　２．Ｏｖｖｍで攪拌通気培養を行なった。得
られた培養液に１００ｍｌΩオリーブ油を加えて、３０
℃にて１２時間、３００ｒｐｍで攪拌を行なった。得ら
れた結果物を実施例１に準する方法で精製を行ない、混
合遊離脂肪酸３８ｇが得られた。

上記方法で得られた本発明物質のガスクロマトダラムを
図２に示す。

１０　％　ＡＦＦペプトン培地（ＡＦＦペゾトン１０チ
及びＮａＣｌ２．５　％　）に１％のオリーブ油を加え
、次の菌株を接種して３０℃にて、３日間振とう培養し
た。

（１）　　スタフィロコッカス（Ｓｔ、　）・キャビテ
イスＡＴＣＣ２７８４０ （２）　、　Ｓｔ、キャビテイス　ＡＴＣＣ２７８４１
（３）　　Ｓｔ、キャビテイス　ＡＴＣＣ２７８４２（
４）　　Ｓｔ、　キャビテイス　ＡＴＣＣ２７８４３（
５）　　Ｓｔ、キャビテイスＴ−１−１（ＦＥＲＭ　Ｐ
−７７２３）（６）　　Ｓｔ、アウレウス　ＩＡＭＩＯ
ＩＩ（７）’Ｓｔ、アウレウス　ＩＡＦｉｌ　１０９８
（８）　　Ｓｔ、アウレウス　ＩＡＭ　１２０８２（９
）　　Ｓｔ、エビデルミゾイス　Ａ２ａｎ　　ｓｔ、エ
ビデルミゾイス　Ａ３Ｕや　Ｓｔ、エビデルミゾイス　
Ａ５ （ロ）　Ｓｔ、エビデルミゾイス　Ａ８（１１Ｓｔ、エ
ビデルミゾイス　扁ｉｉ培養２日目及び３日目にサンプ
ルを採り、クロロホルムで脂肪酸を抽出し薄層クロマト
グラフィーにより脂肪酸組成を調べた。薄層クロマトグ
ラフ系は次の通シとした。

溶媒系：クロロホルム／アセトン（９６：４）。

発　色＝１％Ｃｏ　Ｃ３Ｏａ　）　２　／　１０％Ｈ２
ＳＯ４加熱。

薄層板ニジリカダルＫｌ　ｅ　ｓｅ　１　ｇ　ｅ　１６
０　Ｆ　２５４（Ｍｅｒｋ社製）。

この結果を第３図に示す。この図から明らかな通り、い
ずれの菌株においてもジグリセリド（１，３−ジオレイ
ン及び１．２−　（２，３−）ジオレイン）は検出され
ず、モノグリセリド（モノオレイン）もほとんど検出さ
れず、脂肪酸（オレイン酸）が主として生成した。

例３に記載したのと同様にして（但し培地にオリーブ油
を加えない）、例３に記載したスタフィロコッカス属細
菌を培養し、培養後遠心分離により菌体を除去し、上清
液を得、これを酵素液として使用した。この酵素液のＩ
Ｊ　ｔ４−ゼカ価は次の通シであった。

以下余白 なお、上記のリノ’？−ゼカ価は次のようにして測定し
た。

大型試験管（φ２３Ｘ２００１１１Ｋ）に２５　ｍＭ　
Ｔｒｌｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８，０）／　１０　ｍＭ
　ＣａＣｔ２５　Ｉｌｌを含む反応液にオリーブ油１ｄ
を添加し、ミキサーで激しく攪拌した後、酵素液０．５
　ＩＩＬｌを加え、毎分３００回転の速度で往復振トウ
しながら３０℃にて３０分間反応させる。その後、２０
ｄのエタノールを加えて反応を止め、生成脂肪酸を０．
０５　Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定する。Ｈ検値は
上記組成の反応液にエタノールを加えた後に酵素液を加
えたものをアルカリ滴定して求める。す・ヤーゼ活性の
単位（Ｕｎｉｔ）は、国際生化学連合（Ｉ。

Ｕ、Ｂ）の酵素委員会の提案に従い、上記の反応条件で
１分間に１μｍｏｌｅ　の脂肪酸を遊離する活性をＩＵ
ｎｉｔと定める。

次に、各酵素液につき、す・ザーゼカ価が３以下のもの
を除き、総力価が３Ｕ〜となるように稀釈した。

他方、比較のため市販の酵素標品（ペーリンガー社）を
用いて、これを総力価が３．ＩＵ／２１１＋７となるよ
うに溶解して酵素液を調製した。酵素標品として次の３
種類を用いた。

（１）　　リゾシス・アルビダス（４ ａｒｒｈｉｚｕｇ　）由来のりノ４−ゼ（２）　　キャ
ンディダ・シリンドラセ−（Ｃａｎｄｌｄａｃｙｌｌｎ
ｄｒａｃｅａ　　）由来のソノ９−ゼ（３）　　シュー
ドモナスｌＩｐ、　（Ｐ、ａｅｕｄｏｍｏｎａｇ　ｓｐ
、）由来のリパーゼ。

酵素液の調製にあたっては、前記の酵素標品（１）及び
（２）については０．１　Ｍ　ＭＯＰＳ−ＨＣ６緩衝液
（ｐＨ６，０）を使用し、（３）については２５ｒｎＭ
ＴｒＬｓ−ＨＣ１緩衝液（ＰＨｓ、　ｏ、１０　ｍＭＣ
ａＣ２２）を使用した。

この発明の培養液から得た酵素液については、３　Ｔ、
Ｕのす・臂−ゼを含有する酵素液１ｒｎｌにトリオレイ
ン１０μＪ’ｔ−加えて３０℃にて振とうし、０分、１
０分、３０分、６０分、及び１２０分目にサンプリング
し、これをクロロホルムで抽出し、クロロホルム相２μ
ノを例３に記載した薄層クロマトグラフィーによフ分析
した。市販酵素標品については、３．Ｉ　ＴＵ／２ｄの
酵素液２ｄを使用したほか、上記と同様とした。

結果を第５図に示す。この図から明らかな通９、市販酵
素によりトリオレインを分解した場合、かなシの量のモ
ノオレイン及びジオレインが生成したが、この発明のス
タフィロコッカス由来の酵素を使用した場合、これらの
生成が極めて少なく、特にスタフィロコッカス・キャビ
テイス由来の酵素を使用した場合には、モノオレイン及
びジオレインが全く検出されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はこの発明の方法により製造した脂肪
酸のクロマトグラムであシ、第３図はスタフィロコッカ
ス属の各種の菌株を用いて、この発明の方法によジオリ
ーブ油を分解した場合の分解生成物を示す薄層クロ４ト
ゲラムであり、そして第４図はスタフィロコッカス属の
各種の菌株由来のすｔ４−ゼ、及び市販のす・臂−ゼを
用いてトリオレインを分解した場合の生成物を示す薄層
クロマトグラムである。 鯨１図′ＲＩｒメ筺２図中吊はオレイン酸、小は・母ル
ミチン酸そして■はリノール酸のピークをそれぞれ示す
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
   ｓ）属に属し、リパーゼを生産することができる細菌を
   油脂類を含有する培地に培養し、又は該細菌を培地に培
   養しその中途において油脂類を添加し、そして培養液か
   ら脂肪酸を採取することを特徴とする脂肪酸の製造方法
   。 ２、スタフィロコッカス属の細菌がスタフィロコッカス
   ・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｃａｐ
   ｉｔｉｓ）である特許請求の範囲第１項記載の方法。