JPS61146198A - 触媒作用されたルミネセンスを用いるポリヌクレオチドハイブリツド形成分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は触媒標識された第１のポリヌクレオチドプロー
ブおよびアポルミネサ−標識された第２のポリヌクレオ
チドプローブを両方共生理学的試料中の相補性標的ポリ
ヌクレオチド被分析物とハイブリッド形成させることか
らなるポリヌクレオチドハイブリッド形成分析に関する
。

基質が試料に加えられそして触媒により変換基に変換さ
れこれが次にアポルミネサ−をルミネサ−に変換する。

試料を照射し、そしてルミネサ−により吸収された入射
光線を異なる波長で再発光させる。かかる二次的発光は
ハイブリッド形成が起った場合にのみ生じ、そしてそれ
ゆえ標的ポリヌクレオチドの存在は放射される二次的な
光線量に関連する。

ポリヌクレオチドハイブリッド形成分析は完全なるか、
フラグメントであるか、または混合された核酸の試料中
における独特のまたは特異的なポリヌクレオチド配列を
検出および同定するための研究道具として使用される。

、徨々のハイブリッド形成診断技法が開発された。

８ｏｕｔｈｅｒｎ氏のｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｊ
第９８巻第５０３頁（１９７５年）には放射線標識され
た核酸プローブを用いるポリヌクレオチドハイブリッド
形成技法が開示されている。この操作によりプローブ／
被分析物ハイブリッドのオートラジオグラフィーによる
検出および被分析物のポリヌクレオチド配列の同定がな
されうるものである。

しかしながら、５ｏｕｔｈｅｒｎ氏の操作、ならびに放
射線標識された核酸プローブを用いる他の診断操作は非
常に複雑で、時間がかかり、そして監視する人員および
処理のような放射性物質と一般に関連する付加的な問題
および出費がある。

従って、かかる分析は基本的な研究道具のままでありそ
して臨床的な診断のような応用ま友は商業的な領域には
一般に用いられない。

Ｗａｒｄ氏他のヨーロッパ特許出願筒８２５０１８０４
．９号にはプローブがポリＡプチドと検出しうる複合物
を形成しうる部分に共有結合したプリン、７−ジアザプ
リン−１友はピリミジンからなっており、前記した形成
しうる部分がプリン塩基に８−位で、デアザプリン塩基
に７−位で、またはピリミジン塩基に５−位で結合して
修飾されたヌクレオチドを形成するものであるところの
、生物医学的研究および組換えｆＪｌｉ　ＤＮＡ技術に
おけるプローブとして有用な組成物が開示されている。

得られる修飾されたヌクレオチドはニックトランスレー
ション技法によ５　ＤＮＡ中にとり込まれる。

Ｒａｎｋｉ氏のヨーロッパ特許出願筒８２５０６４８９
．５号には微生物からの一本鎖核酸を異なる核酸試薬の
一対と接触させることからなる核酸のサンドイッチハイ
ブリッド形成のための技法が開示されており、ここで一
対をなす両試薬は一本鎖でありそして微生物由来の核酸
と相補性でありそして対の一方はニド、ロセルロースフ
ィルターのような固形担体に結合した核酸フラグメント
であり、一方もう一方は放射性標識で標識された核酸フ
ラグメン−トであり、それにより試料中に存在する微生
物または微生物の群を同定するための、固形担体に結合
された標識されたノ・イブリッドが形成されるものであ
る。同定の正確さは固形担体に結合された標識されたノ
ーイブリッド形成の度合いを検出することにより試験さ
れる。

Ｔｃｈｅｎ氏他のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／？Ｒ８２１００
２２０号には核酸の塩基の１個に少くとも１個のＮ−２
−アセチルアミノフルオレン基を共有結合させることに
より化学的に修飾された核酸プローブ組成物が開示され
ている。標的である相同核酸配列とハイブリッド形成し
たのち、かかるノーイブリッド形成は酵素により標識さ
れ九抗体の使用により検出されうる。

Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ氏他のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＦＲ８
２／’００２２３号には修飾されたりボヌクレオチドの
オリゴマーまたは単一の修飾されたりボヌクレオチドの
共有結合により修飾されたＤＮＡ分子が開示されており
、このものにより他の分子または生成物により識別でき
る化学薬品に対するカップリング手段が提供される。

米国特許出願第５７４，６３０号にはチモーゲンを酵素
的に活性化して検出しうる酵素反応カスケードを開始さ
せうるポリペプチド部分を含有するポリヌクレオチドプ
ローブ組成物が開示されている。

Ｆａｌｋｏｗ氏他の米国特許第４，３５８，５３５号に
は臨床的・な試料を不活性支持体上に沈着および固定さ
せそして標的病原体の遺伝物質を標識され念核酸プロー
ブにノ・イブリッド形成させることによる前記試料中の
病原体の存在を検出する方法が開示されている。標識は
放射性同位元素、リガンド、螢光剤、化学ルミネサ−１
酵素、または抗体でありうる。

Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ氏他の米国特許出願第７９１３０３
１号にはハイブリッド形成反応に先立つかまたはそれに
続き酵素に結合されるＲＮＡプローブと求めるフラグメ
ントとのハイブリッド形成からなる試料中のＤＮＡ　７
ラグメントのありうる存在を検出する方法が開示されて
いる。標的核酸配列のありうる存在は色原体基質上への
酵素標識されたハイブリッド形成生成物の作用によシ示
されうる。

Ｈｅｌｌｅｒ氏他のヨーロッパ特許出願筒８２３０３７
０１．５号には固定された試料である一本鎖ボリヌクレ
オチドとハイブリッド形成させるためにルミネサ−標識
され友、−重鎖ボリヌクレオチド試薬を使用するヘテロ
戯ハイブリッド形成診断法が開示されている。ハイブリ
ッド形成されなかった試薬を分離したのち、試料を光線
に露出させる。何らかの続く発光は試料中の標的ポリヌ
クレオチド量に関連する。標識はよく知られ九ルミネッ
セント系のいずれ、でもよい。

Ｈｅｌｌｅｒ氏他のヨーロッパ特許出願筒８２３０３．
５９９．１号にはルミネサ−標識された第１および第２
の二本鎖試薬セグメントが、２糧の試薬セグメントの標
識間に非放射性エネルギー転移が生ずるような様式で生
理学的試料からの相補性標的一本鎖ポリヌクレオデドと
ハイブリッド形成されることからなるホモ型発光性ノ翫
イブリッド形成分析が開示されている。標識の少くとも
１方はもう一方の光線標識から吸収された光量子の形態
をしたエネルギーが異なる波長として再放射されるよう
な吸収体／発光体ををしている。かかる二次的発光はハ
イブリッド形成が起った場合にのみ起りうる。しかしな
がらこのシステムは測光的手段により１方を他の１方か
ら区別しうるに充分に明確である吸収体／発光体特性を
有する２糧類のルミネサ−標識されたプローブを必要と
するという欠点がある。かかる区別は複雑な生理学的試
料においては困翔でありうる。

アポルミネサ−のルミネサ−への酵素により触媒された
変換は知られている。Ｂｒａｎｄｔ氏他のｒＡｎａｌ、
　Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｊ第円巻第６〜９頁（１９６５年）
およびＫｅｓｔｏｎ氏他のｒＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｓ
ｍ、Ｊ第ｎ巻第１〜５頁（１９６５年）には超ミクロ量
の過酸化水素を螢光測定分析する九めの過酸化水素およ
びペルオキシダーゼによる非螢元性アポ螢光団ジアセチ
ル２／、　７／−ジクロロフルオレシンの螢光化合物へ
の変換が開示されている。

Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ氏他のｒＡｎａ　ｌ。Ｃｈｅｍ、Ｊ
匹（８）、１２５６〜１２６３頁（１９６８）、Ｂｒｕ
ｎＶＯ１１氏のｒＡｃｔａ　Ｃｈｅｍ。

８ｃａｎｄ、　Ｊ　２１　（３）　、　８２０〜８２１
頁（１９６７）およびＧｕｉｌｂａｕｌｔ氏他のｒＡｎ
ａｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　３９（２）、　２７１頁（１９
６７）には超ミクロ量の過酸化水素を螢光測定分析する
ための過酸化水素１念はペルオキシダーゼによる非螢光
性アポ螢光団であるホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフ
ェニル酢酸、チロシンまたはチラミ／の螢光性化合物へ
の変換が開示されている。

Ｃａｔｈｃａｒｔ氏のｒＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ第１３４巻第１１１〜１１６頁（１９８５年）にはピ
コモルレベルの過酸化水素を螢光測定により検出するた
めの過酸化水素およびヘマチンによる非螢光性アポ螢光
団の螢光性化合物への変換が開示されている。

このＣａｔｈｃａｒｔ氏の文献にはまたペルオキシダー
ゼまたはヘマチン用の基質として退散化水素の代りに代
替のペルオキシドが使用できたことも開示されている。

前出の文献のいずれにもポリヌクレオチドプローブ用の
標識としてのアポ螢光団の使用は開示も示唆もされてい
ない。

迅速で、簡単に実施できて、特異性が高くてそして高感
度の非放射測定によるホモ型分析に対する臨床的な診断
領域における要求が存在する。本発明の分析法はこの要
求を満たすものである。

本発明は式 ％式％） を有するポリヌクレオチドプローブ組成物に関するもの
である、ここで上式中ｎは２〜約５００の整数であり、
ｘ１〜Ｘｎは標的ポリヌクレオチド被分析物Ａの一本鎖
領域と実質上相補性であるポリヌクレオチド配列を集合
して形成する同一であるかまたは異なるヌクレオチド部
分である、但しヌクレオチド部分ｘ１〜Ｘユの少くとも
１個が部分Ｚ（ここで２は基質から変換基を生成させり
る結合された触媒を有するヌクレオチドからなり、而し
て該変換基は次にアポルミネサ−をルミネサ−に変換し
うるものである）からなるものとし、そしてＹ１〜Ｙｎ
　［ｘｌ〜ｘｎと相補性である領域とは異なるがそれに
最も近接したポリヌクレオチド被分析物Ａの一本鎖領域
と実質上相補性であるポリヌクレオチド配列を集合して
形成する同一であるかまたは異なるヌクレオチド部分で
ある、但しヌクレオチド部分Ｙ１〜Ｙｎの少くとも１個
が部分２／　（ここで２′は（Ｘｌ−−−ｘｎうの触媒
の作用により生成される変換基によりルミネサ−に変換
されうるアポルミネサ−を、結合されて有するヌクレオ
チドからなる）からなるものとし、さらに（Ｘエー−−
Ｘｎ）および（Ｙｌ　−−−Ｙｎ　）はＡとハイブリッ
ド形成する際（Ｘｌ−−−Ｘｎ）の触媒が適当な基質の
導入に際してアポルミネサ−のルミネサ−への所望の変
換を行うに充分に（ｔ１−−−Ｙｎ）のアポルミネサ−
に近接しているものとする。

本発明Ｆｉまた生理学的試料中の標的ポリヌクレオチド
被分析物の存在を検出するにあたり、（へ）試料をハイ
ブリッド形成条件下に、結合された触媒を有する第１の
プローブおよび結合されたアポルミネサ−を有する第２
のプローブ（両プローブは被分析物の実質上相互に排除
する一本鎖領域と実質上相補性である）と、両プローブ
が被分析物とハイブリッド形成するに際し触媒およびア
ポルミネサ−が相互に充分に近接して位置しておりその
結果触媒が基質と反応して変換基を放出せしめてそれが
次にアポルミネサ−をルミネサ−に実質的に変換するよ
うな様式で接触させ、 （ｂ）　　アポルミネサ−をルミネサ−に変換しうる変
換基に触媒により変換されうる触媒用基質を加え、 （Ｃ）　　試料をルミネサ−の吸収スはクトルの範囲内
の入射光線で照射し、そして （ｄ）　　ルミネサ−によシ放射される光線を測定する
、 ことからなる方法にも関する。

本発明はまた （転）結合された触媒を有しそして被分析物の第１の一
本鎖領域と実質上相補性である第１のポリヌクレオチド
プローブ、 （１））　　第２の一本鎖領域は第１の領域と実質上相
互に排除されているが、第１および第２のポリヌクレオ
チドプローブが被分析物とハイブリッド形成するに際し
、触媒およびアポルミネサ−が相互に充分に近接してお
シその結果触媒が基質に作用して変換基を放出せしめて
、これがアポルミネサ−をルミネサ−へに変換する様式
となっているところの、結合されたアポルミネサ−を有
しそして被分析物のｆＩｃ２の一本鎖領域と実質上相補
性である第２のポリヌクレオチドプローブ、および好ま
しくは （Ｃ）　　アポルミネサ−をルミネサ−に変換しうる変
・換基に触媒により変換されうる触媒用基質、からなる
生理学的試料中の標的ポリヌクレオチド被分析物の存在
を検出するための診断用具キットにも関する。

本発明は生理学的試料中における少くとも１個の標的ポ
リヌクレオチド被分析物の検出および同定において有用
なポリヌクレオチドプローブ組成物、診断用具キット、
および非放射測定ハイブリッド形成分析法を提供するも
のである。

本発明のプローブ、キットおよび分析法の感度および特
異性によりそれらは臨床的な診断および生物学的研究に
広く使用できる。本発明のプローブ、キットおよび分析
法の使用例には遺伝による障害の特性化、特定のウィル
ス、微生物または他の細菌の検出、および特定のヌクレ
オチド塩基起倒の同定が包含される。

ここで使用される「標的ポリヌクレオチド被分析物」な
る用語は生理学的試料中におけるその存在が検出および
／または同定されるべき遺伝要素に相当するヌクレオチ
ド塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドのセグメン
トを指すものとする。

ここで使用される「実質上相補性である」なる用語はポ
リヌクレオチドプローブおよびその標的被分析物の間で
安定なプローブ−被分析物ハイブリッドの形成を許容す
るに充分に相同なるヌクレオチド塩基配列を指す。

ここで使用される「生理学的試料」なる用語は関心のあ
るＤＮＡまたはＲＮＡを含有する未加工または加工され
た血液、尿、または他の生物学的組織の試料を意味する
。

ここで使用される「実質上相互に排除」なる用語は第１
および第２のプローブによるそれぞれの標的被分析物と
のハイブリッド形成に際し、この２種類のプローブがハ
イブリッド形成が阻止される程度にまで被分析物上の同
じヌクレオチド塩基配列に対し競合してはならないこと
を意味する。ある詳細な態様においては、２個のＤＮＡ
−１０−ブの間隔は第１のプローブの３′−末熾ヌクレ
オチドが第２のプローブの５′−末端ヌクレオチドから
約１０塩基離れているであろう。

このことは末端がらせんの同じ側（あシ従って触媒とア
ポルミネサ−基の位置が相互に関して最も好ましい位置
にあるように末端に間隔をおくことになろう。

ここで使用される「ハイブリッド形成条件」なる用語は
第１および第２のプローブが安定したプローブ−被分析
物ハイブリッドを形成することを可能にする条件を意味
する。適正なハイブリッド形成条件は用いられる触媒お
よびアポルミネサ−の性質、標識されたプローブのヌク
レオチド重合体の長さ、およびプローブおよび／または
標的ポリヌクレオチド被分析物のグアノシン＋シトシン
含量により判定されよう。

「螢光性」なる用語は一般に約１０−８〜１０−５秒内
で吸収された入射エネルギーを再放射する特性を指し、
一方「燐光性」なる用＠は吸収され九入射エネルギーを
再放射するのにより長く必要とするルミネセント化合物
を指す。また、入射エネルギー源（すなわち光量子、充
填された粒子、化学現象他）の如何に応じ、ルミネセン
ト化合物は化学ルミネセント、生物ルミネセント、電子
ルミネセント、光ルミネセント等として言及される。

「アポルミネサ−」なる用語は「変換基」による活性化
に際しルミネサ−に変換される任意の非ルミネセント化
合物を指す。同様にここで使用される「触媒」（例えば
酵素）なる用語はその触媒のための基質から適当な変換
基を放出させうる組成物を指す。

例えば、ヒドロ争シ（Ｏ）（−）変換基は適当な基質（
例えば分子状酸素、過酸化水素、ＭｅＯＯＨ。

ＥｔＯＯＨ、第三ブチルヒドロペルオキシド、リルン酸
ヒドロペルオキシド、コレステロール５−ヒドロペルオ
キシドおよびクメンヒドロはルオキシド）に作用する任
意のよく知られた触媒（例えばセイヨウワサビはルオキ
シダーゼ、ヘマチン、金属陽イオン特にＥＤＴＡ−Ｆｅ
　（ＩＩＩ）複合物、およびミクロペルオキシダーゼお
よびその他の酸化還元酵素）により生成されうる。次に
ＯＨ−基がアポルミネサ−を相当するルミネサ−に変換
しよう（例えば活性化され九ジアセチルジクロロフルオ
ンシンをジクロロフルオレシンに、ホモバニリン醗を２
，２′−ジヒドロキシ−３，３’−ジメトキシビフェニ
ル−５，５′−ジ酢酸に、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸
を２．２′−ジヒドロキシビフェニル−５，５′−ジ酢
酸に、チロシンを２．２′−ジヒドロキシビフェニル−
５，５′−ジ７ラニンに、チラミンを２．２７−シヒド
ロキシビフエニルー５．５’−ジエチルアミンに、ルミ
ノールを３−アミノ７タル酸十光線に、セしてｐ−ヒド
ロキシプロプリオン酸を２．２′−ジヒドロキシビフェ
ニル−５，５′−ジプロピオン酸にン。

これら触媒、基質およびアポルミネサ−は多くの商業上
の供給源から容易に入手しうる。

ここで使用される「ポリヌクレオチド」なる用語は場合
によシＤＮＡまたＦｉＲＮＡ重合体中に組み込まれうる
合成のか、非天然のかまたは変化されたヌクレオチドを
とり込むかまたはそれらを包含していてもよい一本鎖ま
たは二本鎖でありうるリボ核酸（ＭＡ）またはデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）の重合体を指す。プローブポリヌク
レオチドである（Ｘｉ　−−−Ｘｎ　）および（Ｙｌ−
−−Ｙｎ）は当業者には今や慣用である技法を用い、プ
ラスミドまたはファージはフタ−中で標的ポリヌクレオ
チドと相補性であるポリヌクレオチド配列をクローニン
グおよび増巾させることにより有用な量にて好都合に単
離されうる。ＤＮＡ取扱いの大抵の局面を包括する有用
な文献はＭａｎｉａｔｉｓ氏他のｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌＪ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、１９８２年）である。

有用なる量のプローブポリヌクレオチドを生成させる友
めのクローニングベクターの例はプラスミドｐＢＲ５２
２（ＡＴＣＣ３７０１７）であり、このものはＲｏｄｒ
ｉｑｕｅｚ氏他著、５ｃＯｔｔ編ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃ１ｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮ
ＡＪ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ出版、Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ＋　１９７７年〕第７３頁に詳細に記載されてい
る。このプラスミドは抗生物質テトラサイクリンおよび
アンピシリンに対する抵抗性を付与する遺伝子に加え、
１個のｐｓ　ｔ　ＩＳＢａｍ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、　Ｈｉ
ｎｄ厘およびＳａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を含有する。プラスミドＤＮＡはＣｌｅｗｅ１１氏の
ｒＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｊ第１１０巻第６６７頁
（１９７２年）記載の方法に従いクロラムフェニコール
の存在下（１７０μｔ／ｄｔ）に生育させることによυ
増巾され、そして適当なエンドヌクレアーゼでの消化に
先立ちＧｕｅｒｒｙ氏他の「Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｊ第１１６巻第１０６４頁（１
９７３年）記載の清澄化された溶解質操作（ｃｌｅａｒ
ｅｄ　１ｙｓａｔ、ｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により精製
されうる。例えば、Ｐｓｔｌでの消化によりアンピシリ
ン抵抗性標識が不活性化されそしてＰｓｔ　Ｉで同様に
開裂されたプローブポリヌクレオチドへの連結に適当な
「ステイツキーエンド」が生成される。得られる組換え
盟プラスミドは次に適当な宿主細菌、例えば大腸＃に１
２株ＨＢ１０１の形質転換に使用されうる。

クロラムフェニコールの存在下に生育させると、高いプ
ラスミドコピー数が得られ、組換え型プラスミドＤＮＡ
が単離されそして前記したようにして精製されうる。

しかしながら、プローブポリヌクレオチドの生成に特に
好ましいベクターは大腸菌ファージＭ１３（ＡＴＣＣ１
５６６９−Ｂ１）であり、このものはｐＢＲ３２２と同
様に今や商業的に入手しうる（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　
Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国マサ
チューセッツ州ボストン）。ファージＤＮＡの消化によ
り得られるＤＮＡ断片および関連する標的ＤＮＡと相補
性であるＤＮＡが接合され、増巾され、そして次にリポ
ータ−分子例えばペルオキシダーゼのような酵素的活性
化剤ボＩ）　ハプチドとの接合に先立ち一本鎖形態で精
製されうる。クローニングベクターとしてのＭ１３ファ
ージの使用はＭｅｓｓｉｎｇ氏によりｒＲｅｃｏｍｂｉ
ｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈ、Ｂｕｌｌ、Ｊ第２巻第４
３頁（１９７９年）に記載されている。

本発明の２および２′はそれぞれ（Ｘｉ−−−Ｘｎ）お
よび（Ｙｌ　−−−Ｙｎ　）内のヌクレオチド部分であ
る。

勿論、ｚおよび２′の触媒およびアポルミネサ−は触媒
の作用から生ずる変換基がアポルミネサ−をルミネサ−
に変換しうるようにＣ（Ｘｌ−−−Ｘｎ）および（Ｙｌ
−−−Ｙｎ）と標的被分析物とのハイブリッド形成後に
〕充分に近接している必要がある。

この関連で、プローブ（Ｘｌ−−−Ｘｎ）および（Ｙｌ
−−−Ｙｎ）上の２および２′の位置選定によりハイブ
リッド形成後に、２およびＺ′が約１ｏｏ個の塩基対以
内しか離れているべきでない。好ましくは、ＺおよびＺ
′はそれぞれ（Ｘｌ−−−Ｘｎ）の３′−末端位および
（ｙｌ−−−’Ｙｎンの５′−末端位（ま九はその逆）
に位置し、従って両方のプローブが標的被分析物とハイ
ブリッド形成すると一方のプローブの標識された６′−
末端位がもう一方のプローブの標識された５′−末端位
と連続したものとなろう（先端から末端へと一列になる
）。従って、触媒標識されたプローブがその５′−末端
位でＷ臓されるならば、アポルミネサ−標識されたプロ
ーブはその５′−末端位で標識されて、ハイブリッド形
成後に触媒はアポルミネサ−のゼロのまたは２〜３個の
被分析物ヌクレオチド塩基対形成性空間内にあるようで
なければならない。

２および２′はそれぞれ（Ｘｌ−−−Ｘユ）および（Ｙ
ｌ−−−Ｙり中に知られた方法（例えばニックトランス
レーションまたは直接合成経路）によシ挿入される独立
したヌクレオチドユニットであるか、′１九は（ｘｌ−
−−ｘｎ）および／または（Ｙｌ−−−Ｙｎ）内のヌク
レオチドが修飾されて２およびＺ′を生成することもで
きる。いずれの場合においても、Ｚおよび２′は式 Ｃ式中Ｒ１はＢＨ３である、ここでＢは塩基残基であシ
そしてＲ５ＦｉＨまたはＴ（ここでＴは２の場合には触
媒でありそして２′の場合にはアポルミネサ−である）
であり、Ｒ２およびＲ５はＨ，、ＯＨ。

Ｔ１ホスヘート基（群）、隣接ヌクレオチド部分、Ｔ部
分にまたは隣接ヌクレオチド部分に共有結合したホスヘ
ート基、またはＴ部分および隣接ヌクレオチド部分に共
有結合したホスヘートであり、Ｒ４はＨ，ＯＨ，ホスヘ
ート基またはＴであるが但しヌクレオチド部分Ｘ１−−
−Ｘｎの少くとも１個につきＲ１がＢＨ３でありセして
Ｒ５がＴ（触媒）であシ、そしてヌクレオチド部分Ｙｌ
−−−Ｙｎの少くとも１個につき、Ｒ１がＢＨ３であり
そしてＲ５がＴ（アポルミネサ−）であるものとする、
または代υにＲ２、Ｒ５ま念はＲ４が部分子を包含する
ものとする〕を有するヌクレオチド部分である。

隣接するヌクレオチドは３′〜５′ホスホジ工ステル結
合の形成によシ共有結合される。修飾されたかまたは修
飾されてないヌクレオチドの数を示す肩字ｎは２〜５ｏ
Ｏでありうる整数である。

好ましくは、ｎは５〜５０なる値を有しよう。

一般に、合成オリゴヌクレオチドからなるプローブは比
較的少数の総ヌクレオチドからなろうが、一方接酸消化
生成物に由来するプローブはより大きい数の総ヌクレオ
チドを有しよう。

塩基残基Ｂは実質的な相補性を有する標的ポリヌクレオ
チドとハイブリッドを形成するポリヌクレオチドの能力
に重大なる影響を与えることなく一重鎖ポリヌクレオチ
ド中に安定して組み込まれうる任意のプリン、修飾され
たプリン、ピリミジンまたは修飾されたピリミジン塩基
であることができる。しかしながら、本発明において有
用なすべての塩基残基Ｂの共通した特徴は、場合に応じ
触媒またはアポルミネサ−を、好ましくは共有で結合さ
せるに適するポイントまたはポイント類である。従って
、「古典的」な塩基であるアデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシンおよびチミンと別に、その他のあま９普遍
的でない塩基例えば５−メチルシトシン、５−ヒドロキ
シメチルシトシン、オロチン酸誘導体、メチル化された
塩基例えば１−メチルグアニン等が場合により本発明の
プローブ中にとシ込まれうる。

さらに、ヌクレオチド２および２′は、塩基または糖部
分のいずれかに結合できかつ得られるポリヌクレオチド
が相補性の標的ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成
する能力に有害な影響を及ぼさない種々の置換基を場合
により包含しうる。

触媒またはアポルミネサ−への接合にとって適当な多数
のヌクレオチドを包含する重合体「末端」は仔牛胸腺末
端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＴｄＴ
）の使用によりプローブポリヌクレオチドに添加されう
る。このトランスフェラーゼはＲｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒ
ｙ氏他のｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｏ　Ｒｅｓ、Ｊ第３
巻第１０１頁（１９７６年）に記載されるように一本鎖
ま念は二本鎖ＤＮＡの３′−ヒドロキシル末端へのデオ
キシヌクレオチドの付加を触媒する。

本発明の触媒およびアポルミネサ−は５′−ホスヘート
または３′−ヒドロキシル結合を介して（Ｘｉ　−一−
Ｘｎ　）ま念は（Ｙｌ−−−Ｙｎ）の１個またはそれ以
上のヌクレオチド部分に結合されうるし、または代りに
、直接にかまたはエステルまたは他の結合基によりかか
るヌクレオチド部分の１個またはそれ以上の２／　、３
／または５′炭素原子に結合されうる。

あるいはまた、触媒およびアポルミネサ−は交叉結合剤
ま念は結合基によってヌクレオチド部分に結合されるこ
ともできる。「交叉結合剤」または「結合基」は二官能
性分子Ｒ／−Ｌ−Ｒ／／　（式中νおよびｙ′は同一で
あるかま几は相異しておりそして−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ
、−ＣＯ２Ｒ、（ここでＲは２−ヒドロキシピリジン、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである）　、−ＣＯ２Ｍ
ｅ　、または他の活性エステル、アシルイミダゾール、
マレイミド、トリフルオロアセテート、ジケテン、イミ
ドエステル、スルホネートエステル、イミン、−ＣＨｏ
ｌｌ、２−シクロヘキサンジオン、グリオキサール、ス
ルフェニルハライド、α−ハロケトン、アジド等のよう
な官能基を表わし、そしてＬは好ましくは少くとも３個
の炭素原子を有するアルキレンまたは置換されたアルキ
レン基である）から誘導される部分を指す。アルキレン
鎖りはハロゲン（工、Ｂｒ、　ＣＬ、　Ｆ　）、ヒドロ
キシ、シアノ、フェニル、アミノ、カルボキシ、アルキ
ル、アルコキシおよびその他のような一般的な置換基で
置換されていることができる。さらに、リンカ−Ｌのア
ルキレン鎖には１個またはそれ以上の二価の基、例えば
−〇−、−８−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−１−〇■Ｃ
−、フェニル、−８Ｏ２−等が介在しうる。しかしなが
ら、官能基Ｒ′は適当な条件下に塩基残基Ｂの窒素原子
または炭素原子と、または糖部分上の炭素原子（５’−
ｃ　）と、または３′−〇のＯＨと共有結合を形成でき
なければならずそして官能基Ｉは適当な条件下に触媒ま
ｔはアポルミネサ−の側鎖または末端アミン、カルボキ
シル、スルフヒドリルま九は炭水化物基と共有結合を形
成できなければならない。従って、二官能性分子Ｒ／　
−Ｌ　−Ｒ／／　は適当な技法によジヌクレオチドの塩
基（または糖）残基とまたは修飾された塩基（またはＳ
）残基と反応して塩基残基Ｂ（または糖）と接合体を形
成しそしてアミド、エステル、アミン、イミン、スルホ
ンアミド、チオエステル、ホスヘートまたはチオホスヘ
ート結合基りにより結合された前記ヌクレオチドが集合
して場合に応じ部分２または２′を形成する。明らかに
、連結基Ｒ’−Ｌ−Ｒ“および特定の接合化学の選択は
得られるプローブ分子の完全無欠さにとって決定的に重
要である他の巨大分子結合、すなわちはプチド結合Ｎ−
グリコシド結合およびホスホジエステル結合を保存する
必要を反映せねばならない。

二官能性分子の例にはＮ−スクシンイミジル４−グリオ
キサリルベンゾエート、カルボニルイミダゾール、ジメ
テルスベリミデート、１−エチル−１，５−ジメチルア
ミノプロピルカルボジイミド（以下ＥＤＡＣと略記する
）、ｐ−二トロフェニル３−（２−７’ロモー３−ケト
ブチルスルホニル）プロプリオネートまたは他の活性エ
ステル、グルタルアルデヒド、一般式 ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有する置換アルケンおよび
他の適当な等何物が包含される。

ハイブリッド形成後に触媒用基質を加える。

次に触媒が基質に作用してそれを変換基に変換する。＊
ｍされたプローブがそれとハイブリッド形成する標的被
分析物の実質上相互に排除し合う領域が充分に近接して
おり従って適当な基質への触媒の作用により生成される
ヒドロキシ基がアポルミネサ−をルミネサ−に変換しう
るようでなければならないことを記憶しておくことが重
要である。

ハイブリッド形成が起ったのち、試料をルミネサ−を励
起させる手段に露出させねばならない。これは一般に試
料を適当な波長の光線で照射することにより達成されう
る。「適当な」なる用語はルミネサ−の吸収スペクトル
内の波長を意味する。ルミネサ−が試料中に存在する場
合は、それが元エネルギーを吸収しそしてかかるエネル
ギーを異なる波長の光線として再放射するであろう。こ
の光線応答の検出は商業的に入手しうる多数の検出装置
例えば分光螢光計により達成されうる。元エネルギーの
かかる二次的放射はハイブリッド形成が起った場合のみ
生じうる。それゆえ、標的ヌクレオチド被分析物の存在
はかかる二次的発光により示され、そして試料中の標的
ヌクレオチド被分析物の量は放射される二次光線量に関
連する。

本発明は生理学的試料中の少くとも１個の標的ポリヌク
レオチド被分析物の存在を検出するための診断用キット
を提供するものである。「キット」なる用語は少くとも
１個の標的被分析物の存在を検出するために必要な試薬
エレメントを保持する容器の一括された組み合せを意味
する。

１個以上の標的被分析物が探索されている場合は、キッ
トは各標的被分析物の第１の一本鎖領域と実質上相補性
である１個の触媒標識されたプローブがその中に存在す
る多数の触媒−標識され之プローブを包含しなければな
らない。

用いられる触媒標識は各標的被分析物に対して同じかま
たは異なりうる。このキットはまた実質上第１の１本鎖
領域とは相互に排除しあう各標的被分析物の第２の領域
と実質上相補性である１個の標識されたプローブがその
中に存在する多数のアボルミネサーー標識されたプロー
ブをも包含しなければならない。使用されるアポルミネ
サ−標識は各標的被分析物について異なっていなければ
ならない。終りに、キットはまた触媒（類）により変換
基に変換されうる触媒標識用基質をも包含しなければな
らない。

以下の例により本発明の種々の局面および態様について
説明する。実施例においては、すべて部およびチは別に
指示がなければ重量によるものとする。

ＤＮＡプローブｌおよび■の調製 ＤＮＡプローブは普通に実施される会成的なオリボヌク
レオチド合成により調製される。これは残基９７６〜残
基１０２５で表示されるＭ１３ｍｐ８領域に相当する５
０個の塩基配列である。この配列はｓ’、、Ａ呵Ｃ’Ｇ
ＡＣＧＧＡＴＣＣＣ品η晶買ＣＧＴ論ＣＡＴ所Ｃ后ＡＧ
ＣＴπＴＴＣＣＴＣ）、、、３’である。この配列はＭ
１３　ｍｐ８ゲノム中に存在するが野生型ファージには
存在しない。

プローブ川もまた標準的な合成によるオリゴヌクレオチ
ド合成技法により調製される。これも残基１０３５〜１
０８４に相当する５０個の塩基のオリゴマーである。こ
の配列は５’、、、Ｇ’１ＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡ
ＴＴＣ’ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧ
ＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡ　、　、　、３　’である。こ
の配列もまｆｔ　Ｍ１！ｌ　ｍｐＢ　ＤＮＡ中に存在す
るがしかし野性型ファージには存在しない。ＤＮＡＰＩ
の３′−末端ヌクレオチドからＤＮＡ　Ｐｎの５７−末
端残基までの間にある配列はヌクレオチド１０個である
が少ければ１または多ければ５０でありうる。

これらオリゴマーの５′−ホスヘート形は標準的な合成
操作または酵素を用いる操作によりｖ４展される。

ｒＧ末端プローブＤＮＡの調製 この操作はＲｏｙｃｈｏｕｄｖｙ氏他のｒＮｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＪ第１ｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈＪ１９７６年）記載の方法に従い行われる６ＤＮ
ＡＰＩ（またはＤＮＡｐＨ）　Ｉ　ＤＯμＦ　（３’−
末端２゜４ＸＩ　Ｏ−８％ル／＋ｄ）オヨびグアノシン
５′−トリホスヘート（ＧＴｐ）　１．５　Ｘ１０−６
モル／−をトリス−ＨＣＬ　５０　ｍＭ　、　　ジチオ
トレイトール０．１　ｍＭおよび塩化コパル）１ｍＭを
含有する１４０ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７，６）
　２５０μを量中で１　Ｘ　１０＋５単位／−のターミ
ナルデオキシリボヌクレオチドトランスフエラー七と３
７℃で４時間恒温培養する。核酸はｌＸ１５５１のセフ
ァデックスＧ−２５カラムで戸遇し蒸留水で溶離するこ
とにより単離される。〔６Ｈ〕−標識され九ＧＴＰとの
比較反応を行うことにより反応を分析すると付加された
グアノシンリボヌクレオチド残基の数が示される。これ
はＤＮＡ　Ｐ　ｎを用いて同様の方法で行うこともでき
る。

実施例　Ｉ 触媒としてのＨＲＰ、アポルミネサ−としてのＤＡＤＣ
ＡＦＩ　、変換基としての（ＯＨ″″）セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼのりゼヌクレオチド末端ポリデオキシ
リボヌクレオチドへの接合 ＤＮＡ　ＰＩ−ｒＧ　（ま九はＤＮＡ　ＰＩＩ−ｒＧ　
）末端ＤＮＡ１００μ？（３’−末端６０６ｎ　モル／
ｗｔｌ　）　ｔ−メタ過沃素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４
）　（Ｌ　１　ｍ　モル／　ｄ中２２℃で５０分間恒温
培養する。セイヨウワサビペルオキシダーゼｔ−６α６
ｎモル／−の濃度となるまで加え、接散濃度はここで３
１−末端２０２ｎモ〜包に調整されそしてこの混合物ｔ
−２５℃で２時間恒温培養する。水素化硼素ナトリウム
（ＮａＢＨ４）を最終濃度０．３７５μモル／ｗＬｔと
なるまで添加し、最終的な核酸濃度＆Ｘ３′−末端１５
１ｎモル／ゼであり、そして反応混合物音４℃で３時間
恒温培養する。この混合物ｋ　１００ｍＭ　ＮａＣｔｔ
含有する１０ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ１４）で４℃で透析
する。得られる混合物全セファデックスＧ−１，００を
含有する匡７×５０ｃＩＬのカラム上同じ緩衝液で溶離
することにより分離する。生成物ＤＮＡ　ＰＩ−ＨＲＰ
接合体をジアセチルジクロロフルオレシンに対する分析
により確認されるように〔６Ｈ〕−活性およびペルオキ
シダーゼ活性を含有する２　６０　ｎｍで吸収する７ラ
クシヨンにおいて同定される。

２’、　７’　−−、＃ロワー５−アミノフルオレシン
ゾアセテート（以下ＤＡＤＣＡＦ　Ｉと略記する）３−
一末端接合体の調製 ＤＡＤＣＡＦ　Ｉアポフルオロクロームの合成はＧ。

５ｔｅｉｎｂａｃｈ氏のｒ　Ａｃｔａ　Ｈｌｓｔｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ第４９巻第１９〜３４頁（１９７４年）記載
の操作にエリなされる。４−ニトロフタル酸１００ｆお
工び４−クロロレゾルシノール１００ｆｔ−混合しそし
て１８０℃で４時間融解させる。冷却後仁の混合物を微
細に粉砕しそして沸騰１１６Ｎ　）（ＣＬ　２００１中
に懸濁させる。不溶の粗製２１．７／−ジクロロ−５−
ニトロ−フルオレシンをプフナーロートで濾過し、沸騰
水５ＩＩで洗いそして１００℃で乾燥する。粗製物質１
００ｆｔ無水酢酸２５０を中に溶解させそして２時間還
流させる。純粋す２’、　７’−ジクロロ−５−ニトロ
フルオレシンジアセテートは４℃に冷却すると結晶化す
る。この化合物をプ７ナーロートで一過しそして室温で
真空乾燥することに工り回収する。

２’、　７’−シクロロー５−ニトロフルオレシンジア
セテートの還元はＲ，Ｂｒａｎｄｔ氏他のｒ　Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ第１１巻第
６〜９頁（１９６５年）記載の操作により行われる。２
／、　７／−ジクロロ−５−ニトロフルオレシン　ジア
セテート５ｔ（ｌｏ０９４モ＃）ｔ−氷酢酸１，７４モ
＃が添加され次沸騰エタノール１９５Ｍ中に溶解させる
。亜鉛末２ｔずつ５回加えそしてこの混合物全１０分間
攪拌する。さらに５ｆの亜鉛末全卵えそしてこの混合物
をさらに１０分間攪拌する。亜鉛’ｋＦ去しそして得ら
れる２’、　７’−ジクロロ−５−アミノフルオレシン
　ジアセテート（ＤＡＤＣＡＦＩ）　ｋクロロホルムか
ら沈澱させ続いて真空濾過しそして乾燥することにＬつ
回収する。化合物の構造を工ＮＭＲ１ＩＲお工びνＳ分
析にＬつ立証される。

ＤＮＡ　ｆ　Ｏ−プ１−ｒＧ　（ま几はＤＮＡ　ＰＩＥ
−ｒＧ　）　１００μ？（３′−末端６０６０モル／ｄ
）ｔ−メタ過沃累駿ナトリウム０．１ミリモル／１中２
２℃で３０分間恒温培養する。重炭酸ナトリウム−炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）　ｋ　（Ｌ　１　ミ！
Ｊモル／ａの濃度となるまで加える。ＤＡＤＣＡＪ’Ｉ
勿２０．２μモル／ｄの濃度となるまで加える（ここで
ＤＮＡ濃度は３′−末１１２０２ｎモル／ゴである）。

水素化硼素ナトリウムを濃度３７５μモル／―となるま
で加え、ＤＮＡの最終濃度は３′−末端１５１ｎモル／
ｄである。この混合物を４℃で３時間恒温培養する。得
られる混合物はセファデックスＧ−１００のカラムで炉
遇し、１００ｍＭのＮａＣ２ｔ−含有すル１０ｍＭ　Ｋ
ＰＯ４（ｐＨ７，４）　ｔ”用いて溶離することにより
精製する。接合物は２６０　ｎｍでの分析および初めに
アポフルオロクロームをαＯ１Ｎ　ＮａＯＨ中テ処理す
ることに・エワ活性化し、中和しそしてＨＲＰお工びＨ
２Ｏ２ｔ−加えそして５２０ｎｍでの螢光放射の発生を
監視することによる螢光分析により立証される。

ＨＲＰ　５’−Ｐ　−ＤＮＡ　グローブの調製５’−Ｐ
　−ＤＮＡ　Ｐｌ　（ま友はＩＩ　）１００μｒ　（３
′−末端２．４Ｘ１０　　モル／ｄ　）　ｆｆｉ　Ｉ　
Ｘ　１０　　モル／威のモルホリンスルホンｉ！！（以
下ＭＥＳと略記する）（ｐ）１５．ｏ）中の１×１０　
モル／−の１−エチル−（５，５’−ジメチルアｉ）ｆ
四ピル）カルゼジイミド（以下ＥＤＡＣと略記する）と
１時間恒温培養する。最終濃度Ｉ　Ｘ　１０−’モル／
就の重炭酸ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，５）中３×１０　モル／１の最終濃度となるまでＩ（
ＲＰ　ｋ添加し、最終的なりＮＡ濃度は３′−末端３　
Ｘ　１０−９モル／紅である。この混合物′ｌ！：２２
℃で１２時間恒温培養せしめる。２　Ｘ　５０ｃｍセフ
ァデックスＣ）−１００のカラムでクロマトグラフィー
し、１００＋ｎＭのＮａＣ２ｆ含有する１　０　ｍＭ　
ＫＰＯ４（ｐＨ７，４）で溶離することにエリ精製全行
う。

ＤＡＤＣＡＦＩ　５’　−Ｐ　−ＤＮＡグローブの調製
５’−Ｐ　−ＤＮＡ　Ｐｌ　（ま７１１　ＩＩ　）　１
００μｒ　（５’−末端２．４×１０−８モル／ｌｌｌ
１）紮１ｘ１０−５モル／成のＭＥＳ緩衝液（声ａｏ）
中のＩ　Ｘ　１０−’モル／ＭのＥＤＡＣと１時間恒温
培養する。最終濃度ｌＸ１Ｏ−’モル／ゼの重炭酸ナト
リウム−炭酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９，５）中３
×１０　モル／―の最終濃度と々るまでＤＡＤＣＡＦＩ
　ｉ添加し、最終的なりＮＡ濃度は６′−末端６×１０
　モル／１である。この混合物を２２℃で１２時間恒温
培養せしめる。２Ｘ５０ｃｍセファデックスＧ−１００
のカラムでクロマトグラフィーし、１００ｍＭのＮａＣ
Ｌを含有する１０１１１Ｍ　ＫＰＯ４（ｐＨ７，４）で
溶離することに工り精梨金行う。

Ｍ１！ｉ　ｍｐ８　　ＤＮＡの検出 ＤＡ、ＤＣＡＰＩ接合した！ロープ■ま友はｌ　ＤＮＡ
の活性化はそのプローブをＣＬＯＩＮＮａＯＨ中２２℃
で３０分間恒温培養することにより達成される。

次に１０　ｍＭ　ＫＰＯ４（ＰＨ７，−０）中に希釈す
ることに工り一を中和する。

ＤＮＡプローブＩ−ｒＧ−ＨＲＰ　５４　ｌｉｔおよび
ＤＮＡグローブ５’−Ｐ　−ＤＡＤＣＡＦＩ　５４／ｊ
ｒｉ　１００ｍＭのＮａＣＬを含有する１　０ｍＭ　Ｋ
ＰＯａ　（ｐｉ−１７，０）　１００ｐＬ中Ｍ１３ｒｎ
ｐ　８　ＤＮＡ　（０，１ｌｉｔ　〜１．０　ｐｒ　）
と２２℃で１時間恒温培養する。５．Ｉ　Ｘｌ　０　　
Ｍ　Ｈ２Ｏ２２μを全添加することによりＨ２Ｏ２ｋ　
１　ｘ　１０　　Ｍの濃度まで加える。

試料を渦巻かせそして２２℃で１時間恒温培養せしめる
。Ｍｌ　３　ｍｐ　８　ＤＮＡの存在は試料ｔミクロキ
ュベツト中５００　ｎｍで励起しそして生ずる５２０ｎ
ｍでの発光を観察することに工り立証される。

同様にして、ＤＮＡプローブ■がｒＧ−ＤＡＤＣＡＦＩ
でありそしてＤＮＡプローブ■が５’−Ｐ　−）ＩＲＰ
であるシステムを使用でｔＡ７１２１．。

実施例　■ 触媒としてＩＩ（ＲＰ、アポルミネサ−としてチラミン
、変換基として（ＯＨ−） プローｆ　ＤＮＡに接合し九チラミンの調製ＤＮＡグロ
ーブ１−ｒＧ（またはＤＮＡ　ＰＩＩ−ｒＧ　）　１０
０μ？（３′−末端６０６ｎモル／１ｊ）ｉメタ過沃素
酸ナトリウム［１１℃モルＺｒｊＬｔ中２２℃で３０分
間恒温培養する。重炭酸ナトリウム−炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐｉ−１９，５）　’ｌ：　０．１　ｍ　％ルミ
ｍｌとなるまで加える。

チラミン’に２０．２μモル／−となるまで加える（Ｄ
ＮＡ濃度はここで３′−末端２０２ｎモル／祷である）
。

水素化硼素ナトリウムを濃度６７５μモル／ｗＬｔとな
るまで添加し、最終的なりＮＡ濃度は６１−末端１５１
ｎモル／ｗＬｌである。混合物を４℃で３時間恒温培養
しそしてセファデックスＧ−１００のカラム上１００ｍ
ＭのＮａＣＡ　ｆ含有する１０ｍＭ　ｘｐｏ４（ｐＨ７
，４）で溶離することにより精製する。

５’−Ｐ　−ｆローフＤＮＡに結合し次チラミンの調製 ５’−Ｐ　−ＤＮＡ　ＰＩ　（ま；ＩＸＩＩ　）　１０
０μ？　（３’−末端２．４Ｘ　１０−８モル／ＩＬｔ
）　ｋ　Ｉ　Ｘ　１０−５モル／ｍノＭＥｓ緩衝Ｈ（ｐ
Ｈ５，Ｄ）中ｔＤ　Ｉ　Ｘ　１０−’　−ｅ　ｙｖ／ｒ
ｔｔｌ　ｔＤ　ＥＤＡＣ、！：１時間恒温培養する。最
終濃度Ｉ　Ｘ　１０＝モ〜旬の重炭酸ナトリウム−炭酸
ナトリウム緩衝１（ｐＨ９，５）中３×１０　モル／ｄ
の最終濃度となるまでチラミン全添加し、最終的なりＮ
Ａ濃度を工６′−末端６×１０　モル／１である。この
反応混合物ヲ２２℃で１２時間恒温培養せしめる。２×
５０αセファデックスＧ−ｊｏｏのカラムでクロマトグ
ラフィーし、１００ｍＭのＮａＣｔｆ含有する１　０　
ｍＭ　ＫＰＯ４（４７，４）で溶離することに二り精製
を行う。

Ｍｌ３　ｍｐ８　ＤＮＡの検出 ＤＮＡグローブＩ　−ｒＧ−ＨＲＰ　５４　ｔｔ？お工
びＤＮＡグローブＩ−５’−Ｐ−チラミン５４μＳ’ｔ
”１００ｍＭのＮａＣｔｆ含有するＩ　Ｃ１ｍＭ　ＫＰ
Ｏ４（ＰＨ７，０）　１００ｔｔＬ中Ｍ１３ｍｐ８ＤＮ
Ａ・（Ｑ、１μｔ〜１．０ｐｔ）と２２℃で１時間恒温
培養する。５、Ｉ　Ｘｌ　０−’Ｍ　Ｈ２Ｏ２２μｔを
添加することに工りＨ２Ｏ２’（Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍの
濃度まで加えそしてチラミン’に３ｔ３Ｘ１０＝Ｍとな
るまで加える。試料を渦巻かせそして２２℃で１時間恒
温培養する。Ｍｌ３　ｍｐ８　ＤＮＡの存在は試料金ミ
クロキュベツト中５００　ｎｍで励起しセして５２０　
ｎｍでの発光全観察することに二り立証される。

実施例　■ 触媒としてＨＲＰ、アポルミネサ−としてルミノール、
変換基として（Ｏ）（−） プローブＤＮＡ−ｒＧに接合し九ルミノールの調製ＤＮ
Ａプローブ１−ｒＧ（ま７’ｊ　ｋｌ　ＤＮＡ　ｐＨ−
ｒＣ）　）１００μ？（３′−末端６０６ｎモル／ｄ）
全メタ過沃素酸ナトリウム０．１ｎモル／プ中２２℃で
３０分間恒温培養する。重炭酸ナトリウム−炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９，５）ｉｏ、１ｍモル／ａとなるま
で加える。

ルミノー＃’ｊ（２０，２μモル／ゴとなるまで加える
（　ＤＮＡ濃度はここで３′−末端２０２ｎモｙ　／ｍ
ｌでおる）。水素化硼素ナトリウム全濃度３７５μモル
／ｄとなるまで添加し、最終的なりＮＡ濃度は３′−末
端１５１ｎモル／−である。この混合物音４℃で５時間
恒温培養しそしてセファデックスＧ−１００のカラム上
１００ｍＭのＮａＣｔｋ含有する１０ｍＭ　ＫＰＯ４（
ＰＨ７，４）で溶離することに：り精製する。

５／−Ｐ−グローブＤＮＡに結合し九ルミノールの調製 ５／　−Ｐ　−ＤＮＡ　ＰＩ　（またはＩｆ）１００μ
ｔ（６′−末端２．４Ｘ１０＝モル／属）全Ｉ　Ｘ　１
０−５モル／ｄのＭｇ８緩衝液ＣｐＨａｏ　）中のＩ　
Ｘ　１０　　モＡ／　／ｍｌのＦＤＡＣと１時間恒温培
養する。最終濃度ｌＸ１０−’モル／１の重炭酸ナトリ
ウム−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中３×１０
　モル／―の最終濃度となるまでルミノールを添加し、
最終的なりＮＡ濃度ハ３′−末端６×１０　モル／Ｍで
ある。この反応混合物ｔｌ−２２℃で１２時間恒温培養
する。２×５０ｃＩｒＬセフアデツクスＧ−１００のカ
ラムでクロマトグラフィーし、１００　ｍＭのＮａＣｔ
金含有する１０ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７，４）で溶離す
ることにより精製を行う。

Ｍｌ　５　ｍｐ　８　ＤＮＡの検出はハイブリッド形成
が４３０　ｎｍで放射される光ａｔ−監視することによ
り検出される以外は前出の実施例と同じ方法で行われる
。

実施例　■ 触媒としてのＦｅ　−ＥＤＴＡ　、アポルミネサ−とし
てのＤＡＤＣＡＰＩ　、変換基としての（ＯＢ−）Ｆｅ
　−ＥＤＴＡ−ＤＮＡプローブの調製トリエチル　エチ
レンジアミンテトラアセテートはＲ，Ｗ、　Ｈａｙ氏他
のｒ　Ｊ　、　Ｃｈｅｍ、　Ｂｏａ、　Ｊ　Ｄａｌｔｏ
ｎ　Ｔｒａｎｓ。

第１３４８〜１３５１頁（１９７５年）記載の操作によ
り調製される。モノアミノプロピル誘導体はＲ・Ｈｅｒ
ｔｚｂｅｒｇ氏他のｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ
第２３巻第３９５４〜３９４５頁（１９８４年）記載の
操作にエリ調製される。トリエチル　エチレンジアミン
テトラアセテート１００岬（０，２７ｍモル）全乾燥・
ジメチルホルムアミド２．５ｄ中力／Ｌ／ケニルノイミ
ダゾール４８１１１Ｐ（［１２９ｍモル）と２２℃で６
０分間混合し九、１．６−ジアミンプロパン２．６ｄ（
３１ミリモル）？加えそしてこの溶ｆｉｔ２２℃で２４
時間攪拌する。生成物全精製しそしてトリエステル保護
基ｔ−標準的操作にエリ除去する。

５’　−Ｐ　−Ｆｅ　−ＥＤＴＡの調製５’−Ｐ　−Ｄ
ＮＡグローブ１００μ？（６′−末端２．４Ｘ　１Ｑ　
　モに／ｒｔｔｌ　）　ｆ　１ＸＩ　Ｑ　　モル／ｒＩ
ＬｔのＭＥＳ中１Ｘ　１０”−’モル／ＷＬｔのＥＤＡ
Ｃと１時間恒温培養する。

ＫＤＴＡ−プロピルアミン２．５Ｗ’を添加して濃度１
ｘ１０　　モル／ｒｔ＋ｌの重炭酸ナトリウム−炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）中２．４Ｘ１０−’モル
／耐の濃度が得られ、最終的なりＮＡ濃度は３′−末端
３×１０−９モル／−である。この混合物を２２℃で１
２時間恒温培養する。２ｘｓｏｃｍセファデソクスＧ−
１００のカラムでクロマトグラフィーし、１００ｍＭの
ＮａＣｔｆ含有する１ｏ　ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７，４
）で溶離することにより精ａｔ行う。

Ｍ１３　ｍｐ　８　ＤＮＡの検出は前記の↓うにして任
意の適当なプローブ組み合せ１例えばＤＮＡプローブＩ
−ｒＧ−ＥＤＴＡ−Ｆｅ：ＤＮＡ７”＋：ｉ−プｌｌ−
５’−Ｐ　−ＤＡＤＣＡＦｒ、を几はＤＮＡ　ｆロープ
Ｉ−ｒＧ＝ＤＡＤＣＡＦＩ　：　ＤＮＡプローブＩｆ　
−ＥＤＴＡ−Ｆｅ　ｆ用いて行われる。

特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
中アンドやコンパニー　　　゛ 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 （Ｙ＿１−−−−Ｙ＿ｎ） を有するポリヌクレオチドプローブ、ここで上式中Ｙ＿
   １〜Ｙ＿ｎは標的ポリヌクレオチド被分析物の一本鎖領
   域と実質上相補性であるポリヌクレオチド配列を集合し
   て形成する同一であるかまたは異なるヌクレオチド部分
   である、但しヌクレオチド部分Ｙ＿１〜Ｙ＿ｎの少くと
   も１個がそれに結合されたアポルミネサーを有するヌク
   レオチドからなるものとする。 ２）アポルミネサーはそれがＯＨ＾−基と反応した場合
   にルミネサーに変換される組成物である前記特許請求の
   範囲第１項記載のプローブ。 ３）アポルミネサーが活性化されたジアセチルジクロロ
   フルオレシン、ホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフェニ
   ル酢酸、チロシン、ルミノールおよびｐ−ヒドロキシ−
   プロプリオン酸から選択されるものである前記特許請求
   の範囲第２項記載のプローブ。 ４）生理学的試料中の標的ポリヌクレオチド被分析物の
   存在を検出するにあたり、 （ａ）試料をハイブリッド形成条件下に、結合された触
   媒を有する第１のプローブおよび結合されたアポルミネ
   サーを有する第２のプローブ（両プローブは被分析物の
   実質上相互に排除し合う一本鎖領域と実質上相補性であ
   る）と、両プローブが被分析物とハイブリッド形成する
   に際し触媒およびアポルミネサーが相互に充分に近接し
   て位置しておりその結果触媒が基質から変換基を放出せ
   しめてそれが次にアポルミネサーをルミネサーに変換す
   るような様式で接触させ、 （ｂ）アポルミネサーをルミネサーに変換しうる変換基
   に触媒により変換されうる触媒用基質を加え、 （ｃ）試料をルミネサーの吸収スペクトルの範囲内の入
   射光線で照射し、そして （ｄ）ルミネサーにより放射される光線を測定する、 ことからなる方法。 ５）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第２項に定義
   されたとおりのものである前記特許請求の範囲第４項記
   載の方法。 ６）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第３項に定義
   されたとおりのものである前記特許請求の範囲第５項記
   載の方法。 ７）触媒が基質からＯＨ＾−基を放出させうる組成物で
   ある前記特許請求の範囲第４項記載の方法。 ８）触媒がセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ヘマチン
   、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（III）複合物およびミクロペルオキ
   シダーゼから選択され、そして基質が分子状酸素、過酸
   化水素、ＭｅＯＯＨ、ＥｔＯＯＨ、第三ブチルヒドロペ
   ルオキシド、リノレン酸ヒドロペルオキシド、コレステ
   ロール５−ヒドロペルオキシドおよびクメンヒドロペル
   オキシドから選択される前記特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第２項に定義
   されたとおりでありそして触媒が前記特許請求の範囲第
   ７項に定義されたとおりである前記特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 １０）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第３項に定
   義されたとおりであり、そして触媒および基質が前記特
   許請求の範囲第８項に定義されたとおりである前記特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 １１）生理学的試料中の標的ポリヌクレオチド被分析物
   の存在を検出するための診断用具キットであつて、かつ
   そのキッドが （ａ）結合された触媒を有しそして被分析物の第１の一
   本鎖領域と実質上相補性である第１のポリヌクレオチド
   プローブ、および （ｂ）第２の１本鎖領域は第１の領域と実質上相互に排
   除されているがしかし充分に近接しているので第１およ
   び第２のポリヌクレオチドプローブが被分析物とハイブ
   リッド形成するに際し、触媒およびアポルミネサーが相
   互に充分に近接しておりその結果触媒が基質に作用して
   変換基を放出せしめ、これがアポルミネサーをルミネサ
   ーへに変換する様式となつているところの、結合された
   アポルミネサーを有しそして被分析物の第２の１本鎖領
   域と実質上相補性である第２のポリヌクレオチドプロー
   ブ、 を包含することからなるキット。 １２）アポルミネサーをルミネサーに変換しうる変換基
   に触媒により変換されうる触媒用基質をさらに包含する
   ことからなる前記特許請求の範囲第１１項記載のキット
   。 １３）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第２項に定
   義されたとおりであり、触媒が前記特許請求の範囲第７
   項に定義されたとおりである前記特許請求の範囲第１１
   項記載のキット。 １４）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第３項に定
   義されたとおりであり、そして触媒が前記特許請求の範
   囲第８項に定義されたとおりである前記特許請求の範囲
   第１３項記載のキット。 １５）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第２項に定
   義されたとおりであり、そして触媒が前記特許請求の範
   囲第７項に定義されたとおりである前記特許請求の範囲
   第１２項記載のキット。 １６）アポルミネサーが前記特許請求の範囲第３項に定
   義されたとおりであり、そして触媒が前記特許請求の範
   囲第８項に定義されたとおりである前記特許請求の範囲
   第１５項記載のキット。