JPS61109797A - 標識化ヌクレオチドおよび標識化ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明な核象塩基として一般式ＣＩ） （式中、Ｘ”　ｌ　Ｘ”およびＸ＄はそれぞれ炭素原子
または窒素原子’ｌ　Ｙおよび２はそれぞれ水素原子、
水酸基またはアミノ基金、Ｆは螢光標識化合物を表わす
。） で示される標識化されたプリン塩基アナログ（ただし、
７−デアザプリンを除＜）ｔ−Ｖする標識化リーヌクレ
オチドまたは標識化デオキシリ−ヌクレオチド（以下、
標識化ヌクレオチドと総称する）、および前記の標識化
り〆ヌクレオチドまたは標識化デオキシリメヌクレオチ
ドをそれぞれ１個以上含有する標識化／　ＩＪ　！Ｊ　
／ヌクレオチドまたは標識化ポリデオキシリ−ヌクレオ
チド（以下、標識化ポリスクレオチドと総称する）に関
するものであシ、本発明によって得られる特定の塩基配
列を有する標識化ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の同
定および抽出に使用され、遺伝子工学、臨床診断および
食品等の分野で巾広く利用され得るものである〇（発明
の雪景） 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、Ｍ用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列ｔＶする
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。

例えば臨床診断の分野においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間は
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間を
要するなどの欠点を有する。

これに対して、遺伝子を検出することで疾患の診断を行
なうポリヌクレオチド矢は、検査時間は一般に数時間を
要するが、検出感度はかシでなく特異性も非常に高く、
また誤差がきわめて小さいという利点金有し、感染症の
みならず免疫学的方法では検出できない潜在性ウィルス
も検出可能であるため、これに適したポリヌクレオチド
の開発が要望されている。

（従来の技術） ／　ＩＪヌクレオチドを用い、交雑法によって標的遺伝
子を検出するときは、ポリヌクレオチドを標識化する必
要がある。標識化は放射性同位元素を用いる方法と光標
識化法に大別される。

現在放射性同位元素５Ｐを用いる方法が最も利用されて
お）、特開昭５８−１７０４９６号公報には人’ｒｐ（
ｒ−”ｐ）とキナーゼでポリヌクレオチドのダー末端基
に５Ｐで標識したリン酸基を導入し、”Ｐから放射され
るβ線でフィルムを感光させ、その黒斑点によって標的
遺伝子の存在を検出する方法が開示されている。放射性
同位元素による標識化は感度の点で優れている反面、使
用に際して■取少扱い上熟練が必要である。

■法規上の規制が厳しく、特別の１設および測定機器が
必要であり、またその限定された場所でしか取シ扱兄な
い、Ｏ！！康上の問題がある。

■使用後の廃棄物の処理に問題がある。■半減期に合わ
せて予約購入するので莢膜の期日がそれにより制約され
る。などの難点がある。これに対して放射性同位元素を
用いない標識化法として光標識化法が提案され、＊門昭
５８−２３７９５号公報および特開昭５８−４００９９
号公報には化学発光、生体発光、螢光を利用する方法が
開示されている。しかし光標識化法としては、チミジン
あるいはクリジンアナログとしてその〇−５位にアミド
結合を介してピオチンを付したジ−０−トリホスフエー
トｔ−酵素的二ツクトランスレーションの手法でポリヌ
クレオチドに組み込んで標識化し、標的遺伝子を検出す
る方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　人ｃａｄ＠ｍｙ　　ｏｆ　　Ｓａｌ＠ｎｃ＠
ｏｆｔｈ＠Ｕｎｉｔ＠ｄ　８ｔａｔ＠ｏｆ　Ａｍ＠ｒｉ
ｅａ　、第８０巻、第４０４５頁（１９８３年）〕が実
用化されているのみであるＯ （発明が解決しようとする問題点） 光標識法によ１１ヌクレオチドを標識する際、ポリヌク
レオチドが標的遺伝子とハイブリットする性質を損うこ
とのないよう標識化合物を導入する必要がある。しかし
、核酸塩基部全光標識化する場合、ピリミジン系塩基で
は０−５位に標識化合物を導入することが可能であるが
、プリン系塩基では立体化学的に標識化合物の導入が可
能なのは０−８位とＮ−７位のみであム０しかし、Ｃ−
８位に標識化合物を導入すると、塩基と糖がＢｙｌｌを
配座をとるために二重ら線が右巻きである場合はハイブ
リッド能を失い、またＮ−７位に導入する場合は窒素が
四級となり、糖と塩基部のグリコシド結合が切れる、い
わゆる脱プリン反応が生起しやすくなるために、プリン
基塩基金光標識化することはきわめて困難である。従っ
て核酸塩基部の光標識化は♂リミジン系塩基の場合にの
み有効であり、ポリヌクレオチドの塩基配列がプリン系
塩基のみの場合は光標識化ができ難いという不都合を生
ずる。

また、放射性同位元素で標識したポリヌクレオチドに比
して光標識化ポリヌクレオチドは一般的に検出感度が低
く、従ってより多量の標的遺伝子を必要とし、遺伝子工
学の研究および迅。

連さを要求される臨床検査には実用上問題が残っており
、検出感度をよ〕高めるために、より感度の高い標識化
合物を検討するとともに標識個所を増やす必要がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、光標識化され九−リヌクレオチドの検出
感度を向上させるとともに、核酸塩基部特にプリン系塩
基を光標識化することにつき検討を重ねた結果、一般式
〔！〕 （式中、ｘ”、ｘ”、ｘ”、ｙ、ｚ＞ヨびｒは前記と同
一の意味を表わす。） で示される０−７位を螢光標識化され九プリン塩基アナ
ログ（ただし、７−デアザプリンを除く）を核酸塩基と
して有するヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを用い
ることによシ、所期の目的を達成することを見い出し、
本発明を完成したものである。

本発明の標識化ヌクレオチドおよび標識化ポリヌクレオ
チドは、核酸塩基としてプリン系塩基に代えて一般式（
１） （式中、人は直結または炭化水素鎖を介して結合する官
能基を、Ｘ”　、　Ｘ”　、　Ｘ”　、　Ｙおよび２は
前記と同一の意味を表わチ０） で示される０−７位に官能基をもつプリン塩基アナログ
を有するヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの官能基
と共有結合性螢光標識化合物を反応させることによシ、
プリン塩基アナログのＯ−７位を螢光標識化するもので
ある。共有結合性螢光標識化合物と反応させる官能基と
しては、チオール基、アミノ基およびカルゼニル基が通
常用いられ、炭化水素鎖を介してまたは直接にプリン塩
基アナログのＯ−７位に結合している。これらの官能基
はポリスクレオチド合成の際に副反応をおこすことが考
えられるので、保護基により保護することが望ましく、
保護基としては最終脱保護工程で除去されるものであれ
ばよい。また、共有結合性螢光標識化合物は、前記官能
基と特異的な共有結合性をもつ螢光標識化合物であれば
すべて使用することができ、ダンシぶアジリジン、５−
ヨードアセトアミドフルオレセイン、１−プロそパイマ
ン、Ｎ−Ｃｐ−（２−ベンズイミダゾリル）フェニルコ
マレイミド、４−プロ七メチル、７−メドキシクマリン
、ダンシルヒト２ジン、フルオレセイン−５−チオセミ
カル／々シトなどが例示されるが、これらに限定される
４のではない。

本発明におけるプリン塩基アナログ、たとえば式〔厘〕 で示される４−アミノ−３（２−アミノエチル）−ビラ
ゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンはＴｈ・Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍ＊ｒｌｃａｎ　Ｏｈ＠ｍ１ａａｌ
　８ｏｃｉｓｔｙ　＊　帛８１巻、第２４５６頁（１９
５９年）に記載されている如く、マロノニトリルとヒト
２ジンを出発原料として合成されうるものであり、この
式（１）−で示される化合物に７−ゾオキシリゼヌクレ
オシドトランスフエラーゼとチミジンを作用させること
によシ式（ｆｆ） で示される１−／−］）−］デオキシリーシルーが好収
率で得られる。なお、この１−β−Ｄ−デオキシリーシ
ル一体は、’１’ｈ＊　Ｊｏｔｌｒｎａｌ　　ｏｆＯｒ
ｇａｎｌ＊　Ｃｈａｍｉｓｔｒｙ　、第３９巻、第３６
５４頁（１９７４年）に記載の合成法によっても式（１
）で示される化合物よ）３導される。このようにして得
られた１−β−Ｄ−デオ中シリゼシル一体のアミノ基お
よび５′−水酸基をそれぞれ保護基により保護したのち
、デオキシアデノシンの代ゎりに用いてトリエステル法
あるいはホスファイトトリエステル法にょシポリヌクレ
オチドとする。

このｔｌか、酵素法によるポリヌクレオチドの製法とし
て、無水リン酸トリメチル中で１−β−Ｄ−デオキシリ
２シル一体とオキシ塩化リン上作用させて、式（Ｖ） で示されるダーモノホスフエートとしたのち、Ｏｈ＠ｍ
１ｍｅｈ＠Ｂ＠ｒｉｅｈｔ＊　ｒ第９４巻、第１６１２
頁（１９８１年）ｉたはＴｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ｔｈ＠Ａｍｅｒ１ｅａｎＯｈ＠ｍ１ｅａｌ　８ｏａｉ＠
ｔｙ　、第６４９頁（１９６１年）に記載されている方
法によル式〔■〕 で示されるダートリホス７エートとし、これをデオキシ
アデノシントリホスフェートの代わりに用いてニックト
ランスレーションを行ないポリヌクレオチドとすること
もできる。

このようにして得られたポリヌクレオチドの水溶液に、
螢光標識化合物たとえばダンジルクロッイドのアセトン
溶液を滴下することによりポリヌクレオチドは容易に螢
光標識化する。この螢光標識化ポリヌクレオチドの分離
精製は高速液体クロマドグ２フイーを用いることによ）
速かに完了する。

（発明の効果） ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのプリン系塩基に
代えてプリン塩基アナログとすることによ〕、従来♂リ
ミジン系塩基には有効であるがプリン系塩基には十分に
適用できなかった光・標識化が全核酸塩基について可能
となり、検出感度が向上するとともに、ポリヌクレオチ
ドの塩基組成の制約も解決するものである。

（実施例） 実施例１ ■　４−アミノ−３−（２−アミノエチル）−一２ゾロ
（３，４−ｄ）ピリミジンの合成 マロノニトリル３３１とヒドラジン１１．５１１をエタ
ノール９０ｍｊに添加し、８時間還流後に反応液を濃縮
し、−夜放置して得た沈殿物を熱水に溶解、活性炭処理
して白色針状晶の３−シアノメチル−４−シアノ−５−
アミノピラゾール６、　ＯＮ　’に得た。次にこれにホ
ルムアミド２１を加え、２００〜２１０　Ｃで４時間加
熱後に反応液ｔ−２Ｎ水酸化す）　１７ウム水溶液に溶
かし、活性炭処理後、塩酸でｐＨをｌＩｉ！１．シ、−
夜放置して生成した沈殿物ｔ−瀘別、乾燥して粉末状の
４−アミノ−３−シアノメチルピラゾロ（ａ、＋−ｄ〕
ピリミジン４．７１　’ｆｔ−得た。更に、これｔ″２
２ネーニツケル−７）触媒３Ｉとともに、アンモニア飽
和のエタノールに懸濁させ、オートクレーブ中で水素圧
１３０ｉ圧以上に保ちながら１１０Ｃで４時間反応する
。反応終了後、触媒を濾別し、溶媒を留去した残渣をＩ
Ｎ水酸化す）　１７ウム水溶液に溶解、塩酸でｐＨｆ：
　Ｈ整復、−夜装置して生成した沈殿物を濾別、乾燥し
て粉末状の４−アミノ−３−（２−７オノエチル）−ピ
ラゾロ（３，４−ａ）ピリミジン３．４１１ｔ−得た。

■　４−アミノ−３−（２−アミノエチル）−１−β−
Ｄ−デオキシリ１ｇシルピラゾロＣ３，４−ｄ〕ピリミ
ジンの合成 よく乾燥した４−アミノ−３−（２−アミノエチル）−
ピラゾロ（３，４−ｄ〕ピリミジン１０．９に無水酢＠
５０―と無水ピリジン５０１ｊを加え、４０分間還流後
室温まで冷却し、溶媒を減圧留去したのちメタノールに
溶解、再び減圧留去して得た残渣に氷水３０．９を加え
て生成した沈殿物ｔ−ａ別し、４００１ｊの熱水に溶解
、活性炭処理後冷却して粗結晶を得た。この粗結晶を水
酸化す）　ＩＪクム水溶液に溶解、活性炭処理、酢酸に
よるｐＩＩ調整ののち一夜放置して生成した沈殿物ｔ−
ｇ別、乾燥して４−アセトアミノ−３−（２−アセトア
ミノエチル）−ピラゾロ（３，４−ｄ）ピリミジンの結
晶８．２　ＩＩｆ：得た。

次に、これを無水シアン化カリウム２．８１と無水ニト
ロメタン２００１１Ｅｊとともに加熱し１更に３．５ジ
ー０−アセチル−β−Ｄ−デオキシリゼシルクロツイド
１３１１ｔ−加え、還流下に２時間反応する。反応終了
後、溶媒を留去して得た残液を酢酸エチル３００１１ｊ
に溶解し、これを洗浄、脱水処理ののち濃縮し、シリカ
ゲルカラムによシ分離する。目的物を含む７ラクシヨン
を集め、溶媒を留去し、残渣をアンモニア飽和のメタノ
ールに溶解、３時間室温で放置後、溶媒を留去、乾固し
て得た残渣を少量の熱水に溶解し、これを酢酸エチル中
へ滴下して生成した粉末を濾別、乾燥して、粉末状の４
−アミノ−３−（２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−デ
オキシリｉシルピ２ゾロ（ａ、＋−ａ）ピリミジンＯＨ
Ｎ　　　　Ｏ 理論値（至）：４９．０　　６．１　　２＆６　　１６
．３実測値（４）：４＆９　　　！Ｌ９　　２＆９　　
１＆４■　ポリデオキシリｉヌクレオチドの合成蛋白質
核阪酵素・第２５巻、第２２７頁（１９８０年）記載の
方法によシ、４−アミノ−３−（２−アミノエチル）−
１−β−Ｄ−デオキシリゼシルぜ２ゾロ〔３，４−ｄ）
ピリミジンのアミノ基をベンゾイル化し、次いでデオキ
シリメース５′−位をジメト午シトリチル化、３′−位
をリン酸化して式〔■〕 で示される七ツマ−を合成した。次に、別途既知の方法
により合成したトリマーブロック−０−Ｔ （式中、０およびＴはトリマーブロックを形成する単位
ヌクレオチドをその塩基残基により表示し九もので、塩
基残基が０はシトシン、Ｔはチミンｔ−我わす。） と式〔電〕で示される七ツマ−との縮合ｔ”　、Ｎｕｃ
ｌｏｌａ人ｃｕｄｓ　Ｒｅｉ鶴ｒｅｈ、第８巻、第５４
７３頁（１９８１年）記載の方法によ１１返し行ない、
塩基配列がＡ′−ｏ−ａ−ｒ−Ａ′−ｏ−ｏ−ｒ−Ａ′
−ｏ−ｏ−Ｔ−ｒ（式中、Ｘ、０およびＴはポリヌクレ
オチドを形成する単位ヌクレオチドをその塩基残基によ
り表示したもので、塩基残基がＡＩは４−アミノ−３−
（２−アミノエテル）−ピラゾロ（ａ、＋−ａ）ピリミ
ジンを、０およびＴは前記と同一の意味を表わす。） である？リゾオキシリ２ヌクレオチド（ｓ　ｏｆ２！：
体）ｔ−合成した。

■　ポリデオキシリＩヌクレオチドの螢光標識化このポ
リデオキシリＩヌクレオチド（１０量体）１００Ｄ　（
２６０ｍｍ）’ｉｏ、５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈｓ、ｏ）ａ、ｓ−およびアセトニトリル１．　（ｌ　
ｍｌに溶解し、よく振とうしながらダンジルクロライド
のア七トン溶液（２０１ｎＩｌ／１００ＪＩｊ）ｌＯＩ
Ｌｌを滴下する。滴下倹約１０分攪拌したのち、反応液
を減圧濃縮し、逆相のカラムクロマトにより螢光標識さ
れたポリデオキシリゼヌクレオチドｔ−精製する。こＯ
ｇｔ光標識化ポリデオ中シリ〆ヌクレオチドは、２５０
！ｌ！！ｌ付近の光で励起し、５３０〜５４０　ｎｍの
強い螢光を測定し喪。

手続補正書働創 昭和６０年３月Ｓ日 昭和５９年特許願第２３１８４７号 ２、　発明の名称 標識化ヌクレオチドおよび標識化 ポリヌクレオチド ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都中央区京橋２丁目１７番４号 有機合成薬品工業株式会社 代表者　玉　重　雅　雄 ４、代理人 ６、　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （Ｌ）明細書第６頁第７〜８行のｒ　（Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ・・・（中略）・＝ｏｆ　ＡｍｅｒｉｃａＪの
記載を「〔プロシーディングズ　オブ　ナショナル　ア
カデミーオブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッドオ
ブ　アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔ
ｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｅｉｅｎｃｅ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｏｆ　Ａ＋＊ｅ
ｒｉｃａ　）」と補正する。

（２）同書第１０頁下から第５〜４行のｒＴｈｅＪｏｕ
ｒｎａｌ−（中略）−５ｏｃｉｅｔｙ　Ｊの記載を「ザ
ジャーナル　オブ　ザ　アメリカン　ケミカル　ソサイ
エティ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍ
ｅ−ｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　
）」と補正する。

（３）同書第１１頁下から１０〜９行のｒＴｈｅ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ・・・（中略）・・・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
Ｊの記載を「ザ　ジャーナル　オブ　オーガニック　ケ
ミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａ
ｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　」と補正する。

（４）同書第１２頁第６〜７行のｒ　Ｃｈｅｍｉｓｃｈ
ｅ　−（中略）・・・５ｏｃｉｅｔｙ　Ｊの記載を「ケ
ミッシェ　ベリヒテ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｂｅｒｉｃ
ｈｔ、ｅ）　、第９４巻。

第１６１２頁（１９６１年）またはザ　ジャーナル　オ
ブザ　アメリカン　ケミカル　ソサイエティ−（Ｔｈｅ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　
ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）　４１と補正する。

（５）同書第１８頁第８〜９行のｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＪの記載を「ヌクレイツク　
アシッドリサーチ（ＮｕｃＬｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）」と補正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸塩基として一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｘ＾１、Ｘ＾２およびＸ＾３はそれぞれ炭素原
   子または窒素原子を、ＹおよびＺはそ れぞれ水素原子、水酸基またはアミノ基 を、Ｆは螢光標識化合物を表わす。） で示される標識化されたプリン塩基アナログ（ただし、
   ７−デアザプリンを除く）を有することを特徴とする標
   識化リボヌクレオチドまたは標識化デオキシリボヌクレ
   オチド。 ２、核酸塩基として一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｘ＾１、Ｘ＾２およびＸ＾３はそれぞれ炭素原
   子または窒素原子を、ＹおよびＺはそ れぞれ水素原子、水酸基またはアミノ基 を、Ｆは螢光標識化合物を表わす。） で示される標識化されたプリン塩基アナログ（ただし、
   ７−デアザプリンを除く）を有する標識化リボヌクレオ
   チドまたは標識化デオキシリボヌクレオチドをそれぞれ
   １個以上含有することを特徴とする標識化ポリリボヌク
   レオチドまたは標識化ポリデオキシリボヌクレオチド。