JPS6125499A - 放射性標識に結合させた核酸プロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸混成方法は、特定遺伝子の検出と単離のために広く
用いられている。今日まで、放射性標識付けした核酸プ
ローブは、もつとも感度の高い検出系を構成している。

放射性標識付けの方法は、切れ目翻訳方法、５′−ヒド
ロキシ残基を燐酸化するためのキナーゼの使用及び末端
トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の使用を包含する。オリ
ゴヌクレオチドに対しては、切れ目翻訳方法は適用不可
能であり巨つＴｔＬＴの使用（Ｉ識付けのためＫ）は分
子の不均一な分布を与える可能性がある。その上、制限
分層に対しては、キナーゼ媒介反応は、存在する５′−
燐酸エステル基のアルカリ性ホスファターゼによる除去
後罠のみ作用する。これらの方法は何れも、この技術分
野の熟練者のみが実施することができる。上記のすべて
の反応ののちに、なお、酵素及び未反応の放射性出発物
質からの標識付けしたプローブの困難な精製と分離が必
要である。

かくして、本発明の目的は、非酵素的な作字的方法によ
る、オリゴヌクレオチド及び一本舗又は二本鎖ＤＮＡ又
けＲＮＡの標識付けのため方法を提供することＫある。

この目的及びその他の目的並びに利点は、本発明に従っ
て、プローブとして働らくべき核酸を、３′又は５′末
端において、第一アルキルアミン残基を有するヌクレオ
チドを形成するように修飾することによって、達成する
ことができる。次いで第一アミンを放射性分子と化学的
に反応させる。この反応は下記の形式のものとすること
ができる：＊ 一〜ＮＢ−ＣＭ、Ｒ ノ＜Ｎｉｌ。

ＮＨＮＨ−たんばく質　　またけ 〜〜〜〜ＮＨＮＨＲ この目的のために発明された新規化合物は−ＮＢ３、−
５Ｈ，−Ｈｙ　Ｔ’有する末端ネクレオチドヲ伴すう核
酸を包含する。これらは概念的に図面に示されている。

ここで図面を参照しながら詳細に説明すると、第１図に
おいて、１本舗又け２本鎖の核酸プローブを酵素的に、
２種の塩基のどちらがを含むりメネクレオシド三りん酸
残基に結合させる。塩基が右に示すような８−へキシル
アミノＡ又は５−アリルアミノＵである場合は、その生
成物は直接に放射性＃識付けするための準備が整ってい
る。

第１図の左に示すような他の塩基においては、生成物に
過よう素酸塩酸化を施して、シスーソオールを分離させ
て２つのアルデヒド基を生成させ、次いでそれをシッフ
の塩基縮合におけるようにソアミン又はポリアミンと縮
合させ、その後に水素化はう素ナトリウムによるシップ
塩基官能の還元によって相当する飽和したアミンを形成
させる。

アルデヒド基をアミノアルキルチオアルコールのアミノ
基と縮合させる場合は、その結果として一５Ｒ基を有す
るプローブが生じる。

上方の第２α図においては、遊離ＮＨ，基を有する第１
図の生成物を、酸化したα−Ｓ″Ｐ−標識ＡＴＰと反応
させてシッフ塩基を生じさせ、それを水素化はう素還元
してｌｔＰ標識生成物を与える。

下方の第２ｈ図においては、第１図の生成物を直接ｒｃ
コルトンハンター試薬と反応させて、放射性１１ｊ７残
基番有するアミドを形成させる。

一方ヌクレオシド三りん酸は、たとえばゾリン又＃′ｉ
２リミソン環上に、Ｅｌ又けＳＨ基を有することができ
る。

第５α図において、出発物質をＨｇ又け５１１残基を有
するヌクレオシド主りん酸と反応させる。

Ｈｇ又はＳＨ基は、たとえばチオ−ＩＴＰ又は水銀化Ｕ
ＰＴあるいＦｉｃｒｐなどのようなヌクレオシド三りん
酸を用いることＫよって提供することができ、且つ最終
的な結合は−ｓ−ｎｇ又は−５−５−によるものとする
ことができる。他のことわりがない限りは、ヌクレオチ
ドは酵素の作用によって（ＮＡ）プローブの一端に結合
させるものとする。このようなヌクレオチドは、その複
素環上に修飾した構造（修飾−８勺を有することができ
る。すなわち、プリン又はビリソン環はＳＨ又はＨｇ基
を有している。第５ｂ図においては、生成物を、たとえ
ば２−３１Ｓ−メルカゾトエタノールのような放射性試
薬と反応させて放射性標識生成物を生じさせる。

（ＮＡ）プローブの一端に酸素によって結合させたヌク
レオチドが、たとえばエテノＡＴＰ又はＣＴＰのような
三りん酸化物である場合は、それは螢光性であって、直
接に読みとることができる標識となる。

本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これ
らの実施例中で部数はすべて他のことわりがない限りは
重量による。

実施例　１ 公知のトリエステル方法〔デンベツクら、ジャーナル　
オプ　アメリカン　ケミカル　ンサエテイー、１０５．
７０６（１９８１；〕によってＨＢ１９’Ａ又ＦｉＨＢ
１９ＳＣコナーら、プロシーデインダス　オプ　ナショ
ナル　アカデミ−オツ　サイエンス、ＵＳ、８０．２　
ｙ　ｓ　（１９８３））を調製した。４０＃ｆのオリゴ
ヌクレオチドを１００１１ｊのＴｔＴ緩衝液（カコソル
酸カリウム２００ｍＭ（ｐＨ７，２）：塩化マグネシウ
ム５ｒＩＬＭ；ノチオトレイトールα２ｍＭ）中に溶解
する。

この溶液に対して、１０〃ノの１ｍＭＡＴＰを加える。

この混合物を３７℃で５分間放置する。次いで、４００
単位の末端デオキシヌクレチジルトランスフエラーゼδ
Ｔ）を加える（ＴｔｔＴはＰＬビオケミカルズから購入
した）。反応混合物を３７℃で４５〜６０分間温電した
のち、ＥＤＴＡ（最終濃度１ｏｔａｉの添加によって反
応を停止させ、次いで溶液を６０℃に加温する。次いで
溶液のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムの添加によって１２
〜１３に上げる。次いで全溶液を６０℃で１時間加熱す
る。この手頃は一つを除くすべての末端りメヌクレオチ
ド残基を除去する。次いで溶液を塩酸によってｐＨ９と
したのち、１０単位の細菌性アルカリホスファターゼを
加える。その混合物を５７℃で１０時間温装したのち、
ＨＣＬＫよってｐＨ７に中和する。次いで溶液を水によ
って約ＩＩＩＩ／（１０倍の稀釈；に稀釈する。これは
溶液のイオン強度を低下させる。次いで混合物を、あら
かじめＴＥ（トリ、ＸＩ　Ｑｓ＆、ＥＤＴＡｌｍＭ；塩
酸によってｐ　Ｈ７，２Ｋ調節）で平衡化して＠るＤＥ
ＡＥセルロースカラム上に加える。次イでカラムをＩＱ
ＱｍＡｆのＮａＣＬを含有するＴＥ緩衝液で洗浄する。

末端リボヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオ誉ド
を、６００ｍＭのＮａＣＬを含有するＴＥＫよって溶出
する。次いでセファデックス６１０カラム上で核酸試料
を部分的に脱塩する。核酸を含む溶液の最終容量は約５
００ｔｔｌである。この溶液に対して酢酸（１Ｍ）を加
えてｐＨを５に調節したのち、新しく調製した過よう素
酸ナトリウムの溶液（ｐＨ５、酢酸ナトリウム緩衝剤）
を１ｍＭの最終濃度となるまで加える。酸化を２５℃で
３０分継続する。次いで溶液のｐＨを水酸化ナトリウム
によってａ５に上げたのち、１０分の１の容量の１０ｍ
Ｍヘキサメチレン　ノアミン又はスペルミン水溶液（可
溶化のためＫｐＨを７〜８に調節）を加える。反応混合
物を２５℃で６０分温装し、生成するシック塩基を、１
０キの水素化はう素ナトリウムを５段階で加えることに
よって還元する。各段階の間に１５分の間隔を置く。

除たんばくのためにフェノール抽出とエタノール沈殿を
用いることを除けば、ＤＮＡＫ対しても同様な手順を行
なう。ＤＮＡを修飾する場合にはＤＥＡＥカラムを使用
しない。使用する段階を要約すると次のとおりである： ｅＬＴ オリゴヌクレチド　ＡＴＰ　　　オリゴヌクレオチド−
Ａ−Ａ−Ａオリゴヌクレオチド−（、’／／、−ＮＨ，
−−＾ＮＢ。

ＤＮＡを用いる場合は、段階５及び４の代りに１フエノ
ール抽出とエタノール沈殿を用いる。

実施例　２ 実施例１におけると同様な核酸試料をｒｒｔｒｇ）衝継
液中に取る。この溶液に対して、１０μノの１ｒＩＬＭ
へキシルアミノＡＴＰを加える。次いで実施例１と同様
にしてＴｔｔＴ反応を行なう。その反応ののちに１試料
を１Ｍ水酸化ナトリウムによって６０℃において３０分
間処理する。ＤＮＡに対しては、混合物を７エノールと
共に振とうし、フェノール相を除き、エタノールを加え
たのち混合物をドライアイス上で冷却することによって
、フェノール抽出とエタノール沈殿を行なう。オリゴヌ
クレオチドに対しては、実施例１におけると同様１／Ｃ
ＤＥＡＥカラムを用いる。同様な手順に従かうことによ
って、残基を適切な位置でヌクレオチド塩基に共有結合
させるととＫより、−ＮＭ、基含有ヌクレオチドをＤＮ
Ａ又はオリゴヌクレオチドて結合させることができる。

兆施例　３ １）ＮＡ＃″ｌｉベンゼンによって影響を受けないから
、実施例１の生成物の水溶液（１ｏｏＩｉａの０．１Ｍ
はう酸塩緩衝液中で１０〜１００μ？、ｐＨＢＩをベン
ゼン溶液として供給される１ｍｃｉのメルトンハンター
試薬と混合し、その混合物を０℃で１５分間振とうする
。この反応け０〜５０℃の間の温度と７〜９ＳのＰＨに
おいて進行する。比較的高いｐＨと比較的高い温度にお
いては、試薬の寿命が短かく且つ試薬は比較的迅速に水
と反応し、そのために収率が１０〜１５％に低下するお
それがある。反応後に、全混合物をセファデックス０２
５カラム中を通過させ、排除した放射性画分を、混成の
ために集める。

実施例　４ ｍａｐ標識ＡＴＰ　（α−りん酸残基において〕を１０
０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）緩衝液（濃度１ｍＭ
ｊ中に溶解し、過よう素酸ナトリウム（最終濃度２ｍＡ
ｆｌを添加する仁とＫよって常法に従かい過よう素す）
　ＩＪウムで酸化する。反応後に１水酸化ナトリウム溶
液を用いて溶液のｐＨを８Ｋｙ４節する。

次いで生成物を第一アミン含有末端に関して等モル濃度
で同一緩衝液中の実施例１又＃−ｔ２の生成物と混合し
且つ反応を２０℃で６０分間行なう。

生成物を実施例１と同様にして水素仕はう素ナトリウム
溶液を用いて還元したのち、セファデックス０１０カラ
ム上で精製して、空隙容量忙相当する画分のみを集める
。

実施例　５ ＥＰ８４１０７２４ａ１ｃ＋検出ｆローフ”ヲ＋ｔｓ　
／又＃′１Ｍｆｆ１ＰＫよって実施例３及び４における
ようにして標識付けし、次いで血液試料からのＤＮＡと
混成したのち、前記のようＫして検定する。

実施例　６ 標識付けした修飾オリゴヌクレオチドによる混成 Ｈβ１９Ａ′とＨ１９Ｓ（実施例１）から調製した修飾
オリゴヌクレオチドを実施例４におけるようにしてｘｔ
ｐで標識付けする。標識付けした修飾オリゴヌクレオチ
ドをコーナーら〔プロシーディング　オプ　アカデミ−
オプ　サイエンス、ＵＳｌ　８０．２７８〜２８２（１
９８３））の方法に従って血液ＤＮＡと混成させる。仁
の変性オリゴヌクレオチドの使用によって標識付は手順
が改善される。本発明の標識付は方法は酵素を必要とせ
ず巨つ効率が著るしく向上する（５０〜９０％）。

上記の詳細な説明及び実施例は例証のためのものであっ
て本発明を限定するものではなく、本発明の精神と範囲
内のその他の実施態様は、この分野の熟練者Ｋｉｉ自明
であることを了解すべきである。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は本発明による修飾した核酸ｆａ　−プの合
成と標識付けの概念的な流れ図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、−Ｓ−Ｓ−、−Ｈｇ−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−又は▲数
   式、化学式、表等があります▼結合によつて放射性標識
   に結合させた核酸部分を包含するプローブ。 ２、結合が−ＣＯ−ＮＨ−又は▲数式、化学式、表等が
   あります▼結合であり且つ核酸の複素環式環によつて保
   持されている特許請求の範囲第１項記載のプローブ。 ３、結合が核酸の末端リボース残基によつて保持されて
   いる特許請求の範囲第１項記載のプローブ。 ４、放射性標識がりん酸ヌクレオシド上に存在する特許
   請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプローブ。 ５、放射性標識がボルトン−ハンター試薬の基上に存在
   する特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプロ
   ーブ。 ６、脂肪族第一アミノ基を保持する核酸部分を包含する
   核酸材料。 ７、第一アミノ基が核酸の複素環式環によつて保持され
   ている特許請求の範囲第６項記載の核酸材料。 ８、第一アミノ基が核酸の末端リボース残基によつて保
   持されている特許請求の範囲第６項記載の核酸材料。 ９、−Ｈｇは−ＳＨ基あるいはアミノアルキル部分を保
   持する三りん酸ヌクレオシドを酵素の作用によつて核酸
   に結合させ且つその生成物を放射性物質に結合させるこ
   とを特徴とする、複素環式環が保持する−Ｓ−Ｓ−、−
   Ｈｇ−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−又は▲数式、化学式、表等が
   あります▼結合によつて放射性標識に結合させた核酸部
   分を包含するプローブの製造方法。 １０、末端にリボース環を保持する核酸に過よう素酸塩
   酸化を施してシス−ジオールを分離し、２つのアルデヒ
   ド基を形成させ、然るのちジアミン、ポリアミン又はア
   ミノアルキルチオアルコールと縮合させ、場合によつて
   はその後に水素化ほう素ナトリウムによるシツフ塩基官
   能基の還元を行ない、該縮合の生成物は−ＮＨ＿２又は
   −ＳＨ部分を保持するプローブであつて放射性物質に結
   合されていることを特徴とする、末端リボース残基が保
   持する−Ｓ−Ｓ−、−Ｈｇ−Ｓ−、−ＣＯＮＨ−又は▲
   数式、化学式、表等があります▼結合によつて放射性標
   識に結合させた核酸部分を包含するプローブの製造方法
   。