JPS6051120A - 単純ヘルペスサブユニットワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は単純ヘルペスサブユニットワクチンに関する。

さらに詳しくは、単純ヘルペスウイルスエ型および２型
に共通に存在する糖蛋白であるｙＡおよびｙＢ（両者は
分子量は異なるが、免疫学的には全く同一である。以下
ｊｉｌＡ、Ｂと略称する）を有効成分とする単純ヘルペ
スウィルス１型および２型の両感染度の予防のための単
純ヘルペスサブユニットワクチンを提供するものでアル
。

発明の技術的背景と産業上の利用分野 ウィルスによる主な感染症の殆んどが、ワクチンによる
予防接種によってコントロールが可能となったが、ヘル
ペス属ウィルスによる感染症の予防対策は、残された大
きな課題である。初感染の場合は一般に重篤な例が多く
、とくに先進国においては単純ヘルペスウィルス（以下
Ｈ５Ｖと略称する）に対する免疫抗体の保有率が低下し
てきており、今後問題化するのは必至である。すでに一
方では、−４ｆの性病として、あるいは新生児ヘルペス
感染症として問題化している国もある。

ＨＳ　Ｖには１型と２型の２種類があり、１型は人体の
主に口唇部に、２型は主に性器部に感染するとされてい
る。

我が国においても、１型・２型のいずれもかなり浸潤し
ていることが知られており、今後、重要なウィルス感染
症として、防圧対策に取り組む必要がある。

ウィルスによる感染症の予防には、通常ワクチンの投与
が最も効果的である。しかしながら、本ウィルス感染症
の場合、ＨＳ　Ｖの性質として注目される発癌性と潜伏
感染の問題は、ワクチン開発の障害となっている。すな
わち、通常考えられる弱毒ウィルス株を作出して生ワク
チンとする方法や、ウィルスを不活剤の添加・加熱処理
等によって不活化しワクチンとする方法では、ＩＩ　Ｓ
　Ｖの場合は当該ＩＩ　Ｓ　Ｖの感染性が消失したかど
うかを確実に証明することは困難であり、万一感染性を
有するＵ　Ｓ　Ｖが残存していた場合、人体に重大な障
害が引き起こされる可能性を考慮しなければならない。

もしこのようなワクチンを接種した後、ｌｌ５Ｖによる
発症がすぐには見られなくとも、潜伏感染を惹起してい
る懸念を否定してしまう訳にはいかない。すなわち、単
純ヘルペスワクチンにおいては、安全性の証明がきわめ
て難しいのである。

又、別の見地からのべれば、単純ヘルペスのように致死
率の低い感染症では、とくに副反応をなくすために、ワ
クチンは高度に精製されたものであることが望ましい。

従って、一般的にとりあげられるような生ワクチンや不
活化ワクチンは実用には供し難い。

従来技術 以上のような背景に基づいて、接種されたワクチンに起
因するＨ　Ｓ　Ｖ感染の恐れのなし）ワクチンを開発す
るために、種々の検討がなされつつある。

その中で実用化可能性の糸口を示唆するものとして、単
純ヘルペスのサブユニットワクチンに関スる報告がいく
つかなされている。

ＨＳ　Ｖ粒子の表面部分であるウィルスエンベロープお
よびＨＳ　Ｖを培養する際の感染培養細胞の細胞膜上に
は、ＨＳ　Ｖ特異糖蛋白が発現し、この糖蛋白に対する
抗体がＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖによる感染症の防御抗体になり得
るのではないかと、Ｇ）ろし）ろ考えられており、たと
えばウィルスエンベロープ成分を、ワクチン材料として
用いることが試みられてしする。

５ｋｉｎｎｅｒら［Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、１６６＋１１９〜１３２（１９７８）］
＋ｔ、ＨＳ　Ｖ　−１型感染幼若ハムスター腎細胞（Ｂ
ＨＫ−２１）を超音波処理シテ細胞ヲ破壊シタ後、Ｎｏ
ｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０＝シエル化学製）を
１　ｖ　／　ｖφ加えて可溶イし処理し、次にホルマリ
ンを加えて７２時間・４℃で不活化処理を行った後に、
２０　Ｗ　／　ｖφ蔗糖液を用いてクツシ、ヨン超遠心
分離にかけ、そのフラクションの一部をワクチン材料と
して用いることを試みた。

Ｋｕ　Ｌ　ｉ　ｎｏｖａら（Ａｒｃｂ　、Ｖｉｒｏｌ　
、　、　６１　、１４１〜１４７　（１９７９）〕は、
ＨＳ　Ｖ　−１型感染ヒト胎児肺細胞を浮遊液にＮｏｎ
１ｄｅｔ　Ｐ−４Ｑをｏ、ｓｖ／ｖ％加えて可溶化処理
し、その溶解物から細胞の核物質やウィルスのヌクレオ
カプシドを各々遠心分離除去し、上清をワクチン材料と
して供試した。

７、ｗｃｃｒｉ＋１にら［Ｉｎ［ｅｃｔ、Ｉｍｎｕｎ、
　＋　３１＋　２６７〜２７５（１９８１〕〕は、ｒｔ
ｓ’ｖ−１型感染ウサギ初代腎細胞をＴｒｉＬｏｎ　Ｘ
−１００をｌ　ｖ　／　ｖ　％含むトリス−Ｅｌ）　Ｔ
　Ａバッファーで可溶化処理した後、細胞の核物質を低
速遠心により分離し、さらに高分子物質を超遠心分離に
より除去した上清をレンズ豆レクチン結合セファロース
４Ｂアフィニティーカラムに通し、吸着成分をα−メチ
ルマンノシドとり゛ルーコースを含む溶離液で溶出し、
ワクチン材料とした。

Ｂｅｒｔｌａｎｄら〔米国特許第４，３１７，８１１号
（１９８２〕〕　は、ＨＳ　Ｖ−１型感染ニワトリ胎児
繊維芽細胞を４モルの尿素を含有するリン酸バッファー
による可溶化処理にかけ、連続超遠心分離により細胞成
分を分離し、」−清中のウィルス成分を超音波処理およ
び６０℃・３時間加熱処理して不活化した後、デオキシ
リボヌクレアーゼによる酵素処理でウィルスＤＮＡを分
解し１次にセファロース６Ｂ−ＣＪによるゲル濾過クロ
マトグラフィーにかけてデオキシリボヌクレアーゼを除
去したものを、ウィルスエンベロープ成分としてワクチ
ン材料に用いた。

さらに、別の試みとしてＫｌｅｉｎら［：Ａｒｃｈ、Ｖ
ｉｒｏｌ、。

６８．７３〜８０（１９８１）〕は、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　
−１型感染アフリカミドリザル腎細胞の培養上清を蔗糖
密度勾配連続超遠心分離にかけ、ウィルス粒子を精製取
得し、このウィルス浮遊液にＴｒ　ｉ　Ｌ　ｏｎ　Ｘ−
Ｉ　ＱＱ　をＩＶ／Ｖ％加えて可溶化処理してウィルス
粒子を破壊した後、蔗糖密度勾配超遠心分離によりＨＳ
■のヌクレオカプシド部分とウィルスエンベロープ部分
を分離し、後者をワクチン材料とした。

１（ｉＬｃｅｓら［Ｉｎ　ｆｅｃ　ｔ　、Ｉｍｍｕｎ、
　、　１６　＋　９５５Ｈ６０（１９７７）］は、］■
ｌ５ｖ−１型感染ヒト咽がん」二皮細胞をホモジナイザ
ーで破壊し、遠心分離にかけ、ウィルス粒子浮遊上清を
ホルマリンで不活化処理し、このウィルス粒子浮遊液に
ドデシル硫酸ナトリウムおよびＮ−ラウロイルサルコシ
ンナトリウム塩をｌ　ｗ　／　ｖ％加えて可溶化処理を
行なった。次に塩化セシウムを用いた超遠心分離でヌク
レオカプシドを除去した上清を集め、さらにデオキシリ
ボヌクレアーゼで酵素処理し、■ＩＳＶ由来の核酸を含
まないウィルスエンベロープ成分を得、これをワクチン
材料に供試した。

Ｃ：ａｐｐｃｌ　ら［Ａｒｃｌｌ、Ｖｉｒｏｌ、、ｆ３
ｓ＋１５−２３（１９８０）］は、ＬＩ　Ｓ　Ｖ−１型
感染ニワトリ胎児繊維芽細胞を超音波処理および凍結・
融解のくり返し操作により破壊し、低速遠心分離および
超遠心分離によりウィルス粒子を粗精製し、さらに蔗糖
密度超遠心分離を２回くり返して精製ウィルス粒子を得
、これＩＣ１ｖ　／　ｖ　％　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４
０による可溶化処理を加えた後、蔗糖液クッション超遠
心分離にかケウィルスエンベロープ成分を集め、ワクチ
ン材料とすることを試みた。

以上はいずれもＨＳ　Ｖ　−１型についての報告である
が、２型についてはＨｉ　１１　ｅｍａｎら（ｌＴｈｅ
Ｈｕ−ｍａｎ　！−１ｅｒｐｅｓ　Ｖｉ　ｒｕｓｅｓ　
、５０３〜５　Ｑ　９　、ｂｙ　Ｎａｈｒｎｉ−ａｓ、
Ａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ、（１９８１）〕はＨＳ　Ｖ　−２型感染ニワト
リ胎児繊維芽細胞をＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で可溶化
処理し、次にデオキシリボヌクレアーゼで酵素処理した
ものをレクチンアフイニテイクロマトグラフイーおよび
セファロースゲル濾過処理により、ウィルスエンベロー
プ部分を集め、これをアルミニウムゲル処理してサブユ
ニットワクチンとした。

いずれの報告もワクチン材料としてウィルスエンベロー
プ部分を部分精製したものであり、免疫原性を高めるた
め水酸化アルミニウムゲル処理が行なわれている。そし
て、マウスなどの動物実験により、ウィルスエンベロー
プ部分の有効性が確かめられているが、これらのワクチ
ン材料の分取・精製工程は煩雑である上に、精製度が不
充分であり、培養細胞成分の混入はさけられない。

前述したようにＨＳ　Ｖに対するワクチンは、いかなる
副作用をも避けるために、高度に精製されたものである
ことが要件である。これまでに報告されているワクチン
標品は、その技術内容を検討すれば、感染細胞あるいは
ウィルス粒子から抽出したものであっても、いずれも宿
主由来のおよそ分子量１００，０００　前後の蛋白をか
なり含んでいることが思料される。すなわちこれらの公
知技術によるワクチン標品は、とくにワクチンとしての
安全性の面から人体用のＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖサブユニットワ
クチンとして受け入れ難い問題点を含んでいることが明
らかである。

発明の目的 ｉｆ　Ｓ　Ｖに対するサブユニットワクチンとして用い
られるワクチン材料は、ＨＳ　Ｖ−１型および２型の両
者に対してひとしく抗原性を有しているものであれば、
もつとも好ましく、この抗原性も単にこれらウィルスに
対する中和抗体の産生能のみでは不充分であって、完全
にＨＳ　Ｖ感染を防御するにたるものでなくてはならな
い。またすでに述べた様にワクチンとして製品化する場
合には、安全性と有効性がすぐれ、ワクチン製剤として
の保存安定性を充分に具備したものであることが肝要で
ある。これらの要件を勘衾ずれば、Ｉ（Ｓ　Ｖに対する
ワクチンは、まずワクチン材料としては、成分的に特定
しうる一定の精製標品であることが望ましく、かつＨＳ
　−Ｖ　−１型および２型双方に対して効能を有するワ
クチンで１６Ｓこと、）（、実用上からも所望されるの
である。

ＨＳ　Ｖ　−１型および２型は血清学的に差を有するだ
けでなく、い（つかの生物学的性状にも相違がみられる
。しかし、ＤＮＡのレベルでは約５０係が相同であり、
蛋白のレベルでもかなりの交差がみられ、その他さらに
共通の抗原を有することが論ぜられている。ＨＳ　Ｖの
感染防御抗原がウィルスエンベロープ部分に存在するこ
とは前述したとおりであるが、その中でとくに糖蛋白が
注目されツツある。１９７９年ｃｒ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　）ｈｒｂｏｒＷｏｒｋｓｌｘｏｐ（Ｔｂｅ　
Ｈｕｍａｎ　ｔｌｅｒｐｅｓ　Ｖｉ　ｒｕｓｅｓ　、　
５　Ｑ　３５０９（１９８１，）、ｅｄ、ｌ）Ｙ　Ｎａ
ｈｍｉａｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｅｌ　５ｃｖｊｃｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）で、５ｐｅ
ａｒらの提案により、ｔｔ　ｓ　ｖエンベロープ成分と
しての糖蛋白に関する知見をもとに、種々の呼称を付さ
れていた糖蛋白が、ｇＣ（分子量１３０，０００）、ｇ
ＡとｇＢ（９０，０００〜１１５，０００）、！Ｅ　Ｃ
６０，０００〜８０，０００）、！　Ｄ　（５８，００
０）と分類され、命名された。

各フラクションの含量はｇＡ、Ｔ３が最も多く、ｇｃ、
ｊ；＋１）がこれに次ぎ、ｇＥが最も少い。ｇＣｌｆ　
Ｅは中和抗体を産生ずるが、■型と２型で相直し、ｇ　
Ｉ）は１型、２型共通の中和抗体を産生ずると云われて
いる。さらにｇＣは感染防御能を与えることが報告され
ている。

Ｅｂｃｒｌｃ［Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３６　＋　６６５〜
６７５　（１９８０））はｇＡと！７１１を調製用電気
泳動で分取し、さらにハイドロキシアパタイトカラムで
精製標品を得、それぞれに対する抗血清を作成した。ｇ
Ａに対する抗血清はｇＢと、ｆＢに対する抗血清はｇＡ
とそれぞれ反応することから、ｇＡとｆｌＢは同一の８
蛋白であって、分子量の相違はグリコシレージョンの程
度によるものとした。さらに、ｇＡ、Ｂは１型・２型間
で共通の中和抗体を産生ずるという報告もみられる。

本発明者らはこれらの知見を検討し、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖの
エンベロープ糖蛋白の中でもつとも含量が多く、血糖学
的に共通で、さらに１型、２型間で共通の中和抗体を生
ずるという事実からとくにｇＡ、Ｂに着目し、研究を重
ね、本発明を完成した。

すなわち、本発明者らはＨＳ　Ｖのエンベロープを構成
するサブユニットである糖蛋白のうち、Ｈｓｖ−１型・
２型に共通の糖蛋白であるｊ；ｌＡ、ＢがＩ−Ｉ　Ｓ　
Ｖ両型の感染を防御するに足りる充分な免疫効果を発揮
することを発見し、さらにこのｇＡ・Ｂをきわめて簡単
に単離・精製する手段を見出し、本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明は、ＨＳ　Ｖ−１型・２型に対するサ
ブユニットワクチンを提供するもので、本発明の技術に
よってはじめて従来からの懸案が解決され、安全で有効
かつ安定な単純ヘルペスサブユニットワクチン製剤が完
成されたのである。

本発明は、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　（以下とくに記載しないか
ぎり、ＩｆＳ　Ｖ　−１型および２型を意味する）感染
培養細胞もしくはその培養細胞から部分精製された１１
　Ｓ　Ｖ粒子、あるいはｔＩ　Ｓ　Ｖ特異サブユニット
［蛋白含有体から、界面活性剤によって可溶化して得ら
れるＩｆ　Ｓ　Ｖ特異サブユニット糖蛋白溶解液を、界
面活性剤の存在下で単クローン抗体をリガンドとするア
フィニティークロマトグラフィーにかけることにｊ：っ
て得られる、高度に精製された、ｌｌ５Ｖに共通な糖蛋
白であるｇＡ、Ｂを有効成分とする、単純ヘルペスサブ
ユニットワクチンおよびその製造方法を提供する。

本発明において用いられる■−Ｉ　Ｓ　Ｖ特異ザブユニ
ット糖蛋白含有体としては、ＨＳ　Ｖ粒子のほか、公知
の方法によりＨＳ　Ｖを感染せしめて培養した動物細胞
を用いることができる。

すなわち、Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖに感染した細胞中には、ＨＳ
Ｖが増殖し存在するほか、細胞膜上にＨＳ　Ｖ特異サブ
ユニット糖蛋白が発現しており、これらはいずれも本発
明におけるワクチンの原材料となり将る。

また、遺伝子組み換え技術を利用したＨ　Ｓ　Ｖｊ７Ａ
、Ｂを産生する組み換え培養体を利用することもできる
。

ＨＳ　Ｖの宿主域は広く、自然宿主は人であるが、サル
、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、
発育鶏卵などに感染増殖する。動物細胞としてはこのよ
うにＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖに感受性を有する動物由来のものが
、広く使用しうる。例えば、幼若／％ムスター腎細胞（
Ｂ　Ｉ−Ｉ　Ｋ　−２１）、アフリカミドリザル腎細胞
（Ｖｅｒｏ）、ヒト胎児肝細胞（ＨＥ　Ｌ）、ヒト咽頭
ガン上皮細胞（Ｈｅｐ−２）、ウサギ初代腎細胞（Ｐ　
ＲＫ　）、ニワｌ−ＩＪ胎児繊維芽細胞などを挙げるこ
とができる。

ｇＡ−Ｂの取得にさいし、要すれば、出発材料の処理法
として、ＨＳ　Ｖ感染培養細胞の培養上清、あるいは培
養細胞をホモジナイザーや超音波処理等の適当な手段で
破砕して得られるＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ含有体から遠心分離な
どの方法により細胞片などの粗大不溶物を除去し、Ｉ−
Ｉ　Ｓ　Ｖ粒子を取得精製した浮溶液を用いることもで
きる。

可溶化処理に用いられる界面活性剤は、ドデシル硫酸ナ
トリウム・デオキシコール酸ナトリウム等のアニオン系
界面活性剤あるいはＴｒｉＬｏｎ、Ｎｏｎ１ｄｃｔ、］
”Ｗｅｅｎなどの非イオン系界面活性剤の中から選ばれ
るが、好ましくは非イオン系界面活性剤の添加量は通常
０．１〜１０　Ｖ／Ｖ％であり、好ましくは０．５〜２
．Ｏｖ　／　ｖ％である。

可溶化処理は、ＨＳ　Ｖ粒子あるいはＩＩ　Ｓ　Ｖ特異
サブユニット糖蛋白含有体の浮遊液に所要量の界面活性
剤を加えて０℃〜２５℃で、２４時間静置もしくは撹拌
することによって容易達成される。

この処理工程によって、可溶化抽出された糖蛋白は、界
面活性剤か存在しない条１’ｌ二下では再結合するので
、ｔｔ　ｓ　ｖ糖蛋白ｇＡ−Ｂに対する単クローン抗体
をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーに
かけて、各種の糖蛋白の中から目的とするｇＡ−Ｂを分
離取得するにあたっては、アニオン系界面活性剤又は非
イオン系界面活性剤が好ましくは０．０１〜Ｑ−ｌ　ｖ
　／　ｖ％存在している条件下で、実施するとよい。

レクチン等をリガンドとするアフィニティクロマトグラ
フイーでは、レクチンに対し糖蛋白は細胞由来のものも
含めてすべて吸着されるので、ｇＡ、Ｂの精製度はさほ
ど向上するものではない。

これに反し、９Ａ、Ｂ単りローン抗体によるものでは、
特異性の高い結合が得られるので、きわめて高い精製度
を達成することができる。

単クローン抗体をリガンドとするアフィニティークロマ
トグラフィーを用いて、ｇＡ−Ｂを精製する方法として
は、００１〜Ｑ、　ｌ　ｖ　／　ｖ　％のアニオン界面
活性剤あるいは非イオン界面活性剤を含む中性伺近の緩
衝液、例えばＭ／１００リン酸緩衝１ｆｆｌ（ｐＨ７，
２〕で平衡化したアフィニティーゲルにｇＡ、Ｂを含有
する可溶化処理液を通液しｇＡ・Ｉ３を吸着させる。次
にゲルを上記緩衝液で洗った後、０，０１〜Ｑ、　ｌ　
ｖ　／　ｖ　％の非イオン界面活性剤を含む、たとえば
３Ｍチオシアン酸カリウム水溶液、３Ｍチオシアン酸ナ
トリウム水溶液、５Ｍ塩化マグネシウム水溶液、６Ｍ尿
素水溶液等の溶出液を通液し、ｐＡ−Ｂを溶出させ、こ
れを０．０１〜０．１ｖ／ｖ％の非イオン界面活性剤を
含有する中性伺近の緩衝液、例えば、Ｍ／１．　ＯＱ　
＋）ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　、あるいはトリス塩酸
緩衝液（＋）１１７．４）等に透析することによりＩ！
Ａ、Ｂ精製標品含有液を得ることができる。

かくしてイＩＩられたｊ７Ａ−Ｂは次のような理化学的
性状を有する。

凍結乾燥標品はおおむね白色で不定形粉末である。非イ
オン性界面活性剤であるＴ”ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を
０．０５　ｖ／ｖチ含有するＭ７１００　Ｐ　Ｂ　Ｓ　
（ｐＨ７，２）に対する溶解性は約１０％である。この
水溶液を６０℃・６０分間加熱しても、抗原性は消失し
ない。

ローリ−・フォリン反応によりペプタイドとしての青色
の呈色反応を示し、加水分解後ニンヒドリン反応でα−
アミノ酸としての紫青色の呈色反応を示す。

分子量はＳ　ｌ）　Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により約９０，０００であり、セルロファインＧＣ−
７００によるゲル濾過分析では約９５，０００であった
。

次に、常法により加水分解して、アミノ酸自動分析装置
を用いてｐＡ−Ｂのアミノ酸の組成を調べた。構成アミ
ノ酸の種類および９Ａ、Ｂを１分子として算出したアミ
ノ酸残基数は次のとおりであった。すなわち、リジンＣ
４０）　、ヒスチジンＣ２０）　、アルギニンＣ５１）
　、アスパラギン酸（８６人スレオニン（５５）　、セ
リン（５５）　、グルタミン酸（９１）　、グリシンＣ
７３）　、アラニン（７９）　、システィン〔１〕、バ
リン（６０）　、メチオニン（１７）、インロイシン（
４０）　、ロイシン（６６）、チロシン（３３）　、フ
ェニルアラニン（４０）の結果が得られた。なおトリプ
トファンはこの方法では測定し得なかった。

本発明の方法により調製された９、Ａ、ＢはＳＯＳポリ
アクリルアミド電気泳動で分析した結果においても、ま
た免疫電気泳動分析を行った所見においても、不純物の
存在がすべて否定された。

一般ｌとワクチンはワクチン投与後の抗体産生を高める
ため、免疫アジュバントとしてたとえばアルミニウムゲ
ルを加えて製剤化されることが多い。

アルミニウムゲル添加ワクチンの製剤化にあたっては、
精製ｐＡ、Ｂは中性伺近の適当な緩衛液あるいは生理食
塩水中で蛋白濃度としてＱ、　ｌ　ｗ　／　ｖ係以下、
好ましくは０．０２Ｗ／ｖ％以下に調整される。ｇＡ、
、Ｂのアルミニウムゲルへの吸着は、アルミニウムゲル
をｇＡ、１３に対して３−１０倍量用いて行なう。

この吸着操作は、ｇＡ−Ｂ含有液にアルミニウムゲル含
有液を混合するととて達成できるし、ｑ　Ａ　−Ｂ含有
液に塩化アルミニウム含有液の所定量を加え、この混合
液に適当な濃度の水酸化ナトリウム水溶液を加えて、水
酸化アルミニウムゲルを生成させると同時にｇＡ、Ｂを
吸着させることでも達成できる。この場合水酸化ナトリ
ウム水溶液に替えてリン酸三ナトリウム水溶液を用いる
ことによって、リン酸アルミニウムゲルにｇＡ、Ｂを吸
着させることもできる。上記ｇＡ、Ｂを吸着したアルミ
ニウムゲル懸濁、液にチメロサールなどの防腐剤を００
０５〜ＯＩＷ／ｖ％程度添加して、アルミニウムゲル添
加ワクチンとする。

なお、上記ｇＡ、Ｂを吸着したアルミニウム懸濁液に安
定化剤および所望により防腐剤を添加して凍結乾燥する
ことができる。

用いられる安定化剤としては、アミノ酸類および糖類の
一方または好ましくは双方が含まれ、ざらに好ましくは
これに膠質材を併用する。これらの種類および添加濃度
はとくに限定されるものではなく、通常の乾燥ワクチン
製剤に使用される範囲のものであれば倒れでもよい。ア
ルミニウムゲル、安定化剤を添加した精製ｇＡ、Ｂ含有
液は、所要量のｇＡ、Ｂを含むように小分容器に分注す
る。この分注液は急速凍結乾燥または緩速凍結乾燥し、
凍結乾燥製剤とする。凍結乾燥の条件としては、例えば
−５０℃、常圧にて予備凍結を６時間行ない、次に圧力
を０．０４　Ｔｏｒｒ　に下げ、＋５℃設定温度にて１
５分間１次乾燥を行う。次に＋３０℃設定温度＋Ｃで、
圧力０．　ＯＯ５Ｔｏｒｒで８時間２次乾燥を行う。

かくして提供された製剤は、力価の低下がなく、きわめ
てその保存性がよく、使用時の溶解性が速やかですぐれ
た単純ヘルペスサブユニットワクチンの凍結乾燥製剤で
ある。

つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

参考例 雫クローン抗体の調製： １１ＳＶ−１型１（０５株の感染Ｖｅｔｏ細胞を感染後
２４時時間区採取し、１　％　Ｔｒｒｔｏｎ　Ｘ−１０
０を含むＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐｉ（７，２〜７．４〕で４℃
１時間可溶化処理し、ｉｏｏ、ｏｏｏ　ｃで１時間超遠
心後　上清を分取し、粗製糖蛋白画分を得た。この０．
１　、／　（蛋白ｆｔｆ　ｉ　ｏ　ｏ　り／　ｍｔ、　
）をＢａｌ　ｂ／Ｃ７ｆｙ　ス（４週令ｐ後肢掌皮内に
接種し免疫を行なった。免疫１ケ月後マウスのＩＪ’４
Ｌを摘出し、細切してＥａｇｌｅ　ＭＥＮ培地を加えて
免疫肺細胞浮遊液を得た。次に１×１０８個の免疫肺細
胞と別に用意した１×１０７個のＰ３Ｕｌ細胞をシャー
レに入れポリエチレングリコール４０００を用いて３７
°０５分間融合し、ＨＡＴ培地でバイプリドーマを選択
した［ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｄ、
ｂｙ　Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｃｔ　ａｌ　、２ｎｄ、　Ｅｄ
＋Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　３
６３〜４１９　（１９８１）］。

この中からさらに酵素抗体法を用いてｇＡ、Ｂに対する
抗体産生ハイブリドーマを選択し、これを２．６，１０
．１４−テトラメチルペンタデカ７（Ａｌｄｒ−ｉｃｈ
　Ｃｈｅｍｉｃ２ＬＩ　Ｃｏ、）で処理したＢａ１ｂ／
Ｃ雌マウス（４週令〕の腹腔に移植した。移植後７〜１
４日目に腹水を採取しｇＡ、Ｂに対する単クローン抗体
（ＩｇＧ量１０”ｉｉ’／ｉ）を得た。

実施例１ （１）単クローン抗体結合カラムの調製：単クローン抗
体を含む上記腹水に４℃において５０％硫酸アンモニウ
ムを加え、Ｉ、７Ｇ画分を沈殿させ、カップリングバッ
ファー（０，０５モルＮａ２Ｉ−ＩＣＯ３，０，１５モ
ルＮａＣ，ｇ　、　ｐＩ−（８，２）　ニ溶解した。

同バッファーに対して４℃、２４時間透析したＬ　ＣＮ
］３ｒ活性化セファローズ４Ｂ（ファルマシア製）に５
ｍ２／−の濃度で結合させ、抗体カラムとした。

（２）抗体結合カラムによるｇＡ、Ｂの精製：ＨＳ　Ｖ
−１型ＫＯ５株感染Ｖｅｒｏ細胞を感染後２４時時間区
採取し、１　％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ　Ｘ−１００を含む
Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｉ’ｌｌ　７．２〜７．４）で可溶化し
、抗体カラムに流した。カラムを０，０５％ＴｒｉＬｏ
ｎ　Ｘ−１００ヲ含むＰ　Ｉｓ　Ｓ　（１）ＩＩ　７，
２〜７．４〕で洗った後、３モルＫ　Ｓ　ＣＮで吸着し
たｇＡ、Ｂを溶出し、００５ｖ　／　ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００を含むＰＢ　Ｓ　（ｐＩ−１７，２〜７．
４〕に対して透析し限外許過して濃縮した。

以上の操作はいずれも４℃にて行なった。

１′青製した９Ａ−ＢをＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動にて分析すると、９０Ｉ（付近にｇＡ−Ｂのメイン
バンドがみられ、４５Ｉ（付近にも数本のバンド力＜ｙ
２められた。そこて、蛋白をニトロセルロース紙にブロ
ッティングし、単クローン抗体および抗ＩＩ　Ｂ　Ｖウ
サギ血清とそれぞれ反応させたところ、９０１（のバン
ドはもとより４５にのいずれも両抗体と反応した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で認められた４
５１（のバンドは、プロッティングの結果よりＰｅｒｅ
ｉｒａら［Ｐｒｏ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ７８：５２０２（１９８１）’：ｌが報告している
ように、Ｖｅｒｏ細胞由来の酵素により分解されたｐＡ
、Ｂの分解産物と思われる。

実施例２ 精製ｇＡ、Ｂによるワクチンの調製： 単離精製したｇＡ、ＢのＰＢＳ（ｐＩ（７，２〜７゜４
　＋　ｏ、　０５　ｖ／ｖ％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−ＩＱ
Ｑを含む〕溶液（蛋白量３０μｇ／−月こ、ｇＡ、Ｂ蛋
白量に対して８重量倍の水酸化アルミニウムに相当する
塩化アルミニウムの水溶液を加えて混合した。この液に
１規定Ｎａ０Ｉ−Ｉを加えてｐＩ−Ｉ６．７に調整し、
水酸化アルミニウムゲルの生成と同時にｇＡ、Ｂを吸着
させた。次にｇＡ、Ｂ吸着アルミニウムゲルを遠心沈降
機により上清を分離し、沈降部分をＰＢＳ（ＰＨ７，２
〜７．４）に再浮遊して、ｇＡ、Ｂ量を３０Ｉｇ／−の
濃度になるよう調整し、アルミニウムゲル処理ワクチン
標品を得た。さらに防腐剤としてチメロザールを（１０
１ｗ／ｖチ添加し、２　ｍｌバイアルに１　ｍｌ宛に小
分密栓し保存した。このものは放置すれば白色雲紫状の
沈降物を生じ、上清は無色透明であった。軽い振とうに
より容易に均一な白色懸濁液となった。

実施例３ 精製ｇＡ、Ｂによる凍結乾燥ワクチンの調製：上記実施
例２で得た。９Ａ、Ｂ吸着アルミニウムゲルの沈降部分
をラクトースｌＱｗ／ｖ％、　ｌ−グルタミン酸１ナト
リウム（１４ｗ／ｖ％　、アルギニｙ　（１４ｗ／ｖ％
、　ゼラチン０．８　Ｗ／Ｖ　％、　チメロサール０．
００５　ｗ／ｖ％　の−濃度で含有する生理食塩液溶液
（ｒ）ＩＩ７．２〜７，４）に再浮遊して、ｇＡ−Ｂ量
を３０Ｉｇ／ｍ！、の濃度になるよう調整し、凍結乾燥
ワクチン原液とした。２ｒｎ１．バイアルに１ｍｌ宛小
分し、−５０℃、常圧にて６時間子Ｏｊｈ凍結後、圧力
を０．０４　Ｔｏｒｒに下げ、５℃にて１５分間１次乾
燥し、ついて３０℃にて圧力０．０５　Ｔｏｒｒで８時
間２次乾燥して凍結乾燥品を得た。

実験例 精製ｇＡ、ＩＪこよるワクチンの安全性および免疫原性
： （ｌｌＢａｌｂ／Ｃ雌マウス（４週令）１０匹の後肢掌
皮内に、実施例２で調製したワクチンを０１−（ｇＡ、
Ｂ蛋白量３μｇ〕接、踵した。初回免疫後２週間目およ
び３週間目に、アルミニウムゲル未処理のワクチンをそ
れぞれ同量宛接種し追加免疫を行なった。なお、対照マ
ウス１０匹にはＰＢＳ　（ＰＨ７，２〜７．４〕を同様
に接種した。この間、すべての供試マウスは体重の減少
はみられず、元気・食飲その他いずれも異常は認められ
なかった。

最終免疫終了後、１週目にＨ５Ｖ−１型林田株（臨床分
離強毒株、　ＬＤ５ｏ’１０３　Ｐ　Ｆ　Ｕ以下）をＩ
　Ｘ　１’０８　Ｐ　Ｆ　Ｕｌｏ、１　ｍ７！宛腹腔内
へ接種した。その結果は図に例示したとおりである。す
なわち対照群では３日目から死亡するものがみられ、累
計死亡率は９０優に達した。これに対し、免疫群では攻
撃後２ケ月目においてもなお死亡するものはみられなか
った。

（２）実施例２で調製したワクチンをＤと同様にして実
験を行ないｎａｌｂ／Ｃ雌マウス（４週令）　１０匹に
免疫した。免疫群、対照群ともに全く異常はみられず、
さらに最終免疫終了後１週間目に、１−Ｉ　Ｓ　Ｖ　−
２型ｙｓ−４株（臨床分離強Ｍ株、　Ｌｌ−）５゜１０
ＰＦＵ以下）をＩ　Ｘ　１　（］８Ｐ　Ｆ　Ｕ　／　（
１１ｍｌ宛腹腔内へ注射した。

その結果、対照群では累計死亡率は８０チに達したが、
免疫群では攻撃後２ケ月目においても死自するものはみ
られなかった。

（３）実施例３て調製した凍結乾燥ワクチンを（１）と
同様にして実験を行ない、Ｂａｌ＋）／ＣＣママウス４
週令）に免疫した。免疫群、対照群ともに全く異常はみ
られず、最終免疫終了後１週間目にＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ−２
型林田株をｌＸ１０８　ＰＦＵ／Ｑ、１＋ｙ＋／宛腹腔
内へ接種した。

その結果、免疫群では攻撃後２ケ月目においても死亡す
るものはみられなかった。対照群の素側死亡率は９０φ
であった。

（４）実施例２および３で調製された本発明製剤につい
て、生物学的製剤基準（厚生省監修、昭和５４年７月）
の一般試験法に準じモルモットを用ｐｓで異常毒性否定
試験を実施したところ、何ら異常を認めなかった。

【図面の簡単な説明】

添付の図面は実施例２て調製された単純ヘルペスサブユ
ニットワクチンの免疫効果を示したものであり、ワクチ
ン接種後の経過日数とマウスの生存率の関係を示すグラ
フである。図中、−はワクチン投Ｊｊによる免疫群、と
は対照群を示す。 情許出願人　財団法人化学及血清療法研究所代ν１　人
　弁理士青白　葆はか１名 手続補正書（酊０ 昭和５８年１０月　３１」 ■事件の表示 昭和５８年特許願第　１．５９６４１　号２発明の名称 単純ヘルペスサブユニットワクチン ；３補正をする者 事件との関係　特許出願人 【に所　（出本県熊本市清水町人窪６６８番地４代理人 ５捕ｉ）ミ命令の１１ｆ・１　自発

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）単純ヘルペスウィルス１型および２型に共通する
   構成成分である糖蛋白ｇＡ−ｇＢを有効成分とする単純
   ヘルペスサブユニットワクチン。
2. （２）糖蛋白ｇＡ、ｇＢが単純ヘルペスウィルス１型お
   よび２型粒子もしくはそれらの感染細胞から得られる前
   記第（１）項記載のワクチン。
3. （３）糖蛋白！Ａ　９Ｂが糖蛋白ｇＡ−ｇＢに対する単
   クローン抗体をリガンドとするアフィニティークロマト
   グラフィーを用いて精製されたものである前記第（１）
   項記載のワクチン。
4. （４）　アルミニウムゲルを添加する前記第（１）項記
   載のワクチン。
5. （５）凍結乾燥する前記第（４）項記載のワクチン。 ＋６）　単純ヘルペスウィルス１型および２型感染防御
   のための前記第（１）項記載のワクチン。 ＋７１　単純ヘルペスウィルス１型または２型粒子もし
   くはそれらの感染細胞のウィルスエンペロアブ成分を界
   面活性剤で可溶化処理し、こレヲ単純ヘルペスウィルス
   ｍｍ白９に一！Ｈに対する単クローン抗体をリガンドと
   するアフィニティークロマトグラフィーにかけて糖蛋白
   ｆｌＡ、ｆＢの精製標品を得、次にこれをアルミニウム
   ゲルに吸着させ、糖低白ｇＡ・ｇＢ吸着アルミニウムゲ
   ル浮遊液とするＩｙ、純ヘルペスサブユニットワクチン
   の製法。