JPS6030680A - リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 - Google Patents
リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法Info
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- JPS6030680A JPS6030680A JP13991983A JP13991983A JPS6030680A JP S6030680 A JPS6030680 A JP S6030680A JP 13991983 A JP13991983 A JP 13991983A JP 13991983 A JP13991983 A JP 13991983A JP S6030680 A JPS6030680 A JP S6030680A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、リパーゼにエステラーゼを付加する方法に関
する。更に詳しくは、シュードモナス属の産生ずるリパ
ーゼと非イオン界面活性剤を混合しリパーゼと非イオン
界面活性剤を結合せしめ、リパーゼ活性はそのまま保持
しつつ、新たにエステラーゼ活性を生ぜせしめることを
特徴とするリパーゼにエステラーゼを付加する方法に関
する。
する。更に詳しくは、シュードモナス属の産生ずるリパ
ーゼと非イオン界面活性剤を混合しリパーゼと非イオン
界面活性剤を結合せしめ、リパーゼ活性はそのまま保持
しつつ、新たにエステラーゼ活性を生ぜせしめることを
特徴とするリパーゼにエステラーゼを付加する方法に関
する。
ダニエル（Ｄｅｓｎｕｅｌ ｌｅ ）らはバイオチミカ
・工ト・）＜イオフィジ力・アクタ（Ｂ）ｏｃｈｒｒａ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
・工ト・）＜イオフィジ力・アクタ（Ｂ）ｏｃｈｒｒａ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ）第２３巻、２６４頁（１９５７年）において
リパーゼ及びエステラーゼの二つの酵素の酪酸メチルに
対する基質濃度依存性を比較した。その結果、リパーゼ
は水に溶けていない基質と水との界面で作用し、エステ
ラーゼは水に溶解した状態の基質に作用すると定義した
。即ちリパーゼは基質の飽和点以上で活性が出現するの
に対し、エステラーゼはその前後では急激な活性変化は
みられない。それ以後この定義がほぼ一般に受け入れら
れており、本願発明のリパーゼ及びエステラーゼの区別
もこの定義に従うものである。
リパーゼ及びエステラーゼの二つの酵素の酪酸メチルに
対する基質濃度依存性を比較した。その結果、リパーゼ
は水に溶けていない基質と水との界面で作用し、エステ
ラーゼは水に溶解した状態の基質に作用すると定義した
。即ちリパーゼは基質の飽和点以上で活性が出現するの
に対し、エステラーゼはその前後では急激な活性変化は
みられない。それ以後この定義がほぼ一般に受け入れら
れており、本願発明のリパーゼ及びエステラーゼの区別
もこの定義に従うものである。
近年、病気を診断する技術の発達力゛（著しく、シュー
ドモナス属菌の産生ずるリパーゼが、血清中のトリグリ
セリド定量用試薬として臨床検査においてさかんに用い
られている。しかしながら生体内の脂質の定量にはトリ
グリセリドの定量のみならず、モノ、ジグリセリド或い
はその抽水溶性エステル結合を有する脂質の定量も必要
であり、リパーゼのみならずエステラーゼをも同時に合
せ持つ酵素が存在するとすれば非富に有益となり得るも
のである。
ドモナス属菌の産生ずるリパーゼが、血清中のトリグリ
セリド定量用試薬として臨床検査においてさかんに用い
られている。しかしながら生体内の脂質の定量にはトリ
グリセリドの定量のみならず、モノ、ジグリセリド或い
はその抽水溶性エステル結合を有する脂質の定量も必要
であり、リパーゼのみならずエステラーゼをも同時に合
せ持つ酵素が存在するとすれば非富に有益となり得るも
のである。
本発明者らは、シュードモナス属細菌の産生ずるリパー
ゼについて研究中、たまたま本リパーゼに親水基として
ポリオキシエチレン基、親油基としてアルキル基を有す
る非イオン界面活性剤の水溶液を添加することにより、
リパーゼ活性はそのまま保持しつつ、新たにエステラー
ゼ活性を生ぜせしめることを見い出した。これまでシュ
ードモナス属菌の産生ずるリパーゼがコレステロールエ
ステラーゼ活性を同時に有する旨の報告（昭和４９年度
日本薬学大会講演要旨集第４６頁）はあるが、しかしリ
パーゼ活性とエステラーゼ活性を同時に持つ複合酵素の
報告がないことを知り本発明を完成したものである。
ゼについて研究中、たまたま本リパーゼに親水基として
ポリオキシエチレン基、親油基としてアルキル基を有す
る非イオン界面活性剤の水溶液を添加することにより、
リパーゼ活性はそのまま保持しつつ、新たにエステラー
ゼ活性を生ぜせしめることを見い出した。これまでシュ
ードモナス属菌の産生ずるリパーゼがコレステロールエ
ステラーゼ活性を同時に有する旨の報告（昭和４９年度
日本薬学大会講演要旨集第４６頁）はあるが、しかしリ
パーゼ活性とエステラーゼ活性を同時に持つ複合酵素の
報告がないことを知り本発明を完成したものである。
本発明において使用するリパーゼは、シュードモナス・
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒ−ｅｓｃｅｎｓ） ＩＡＭ １０５７の産生ずるリパ
ーゼ（リボプロティンリパーゼ作用もある。）であり、
この酵素の諸性質については、バイオチミカ・エト・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｂｌｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ）第４８８巻、３５３〜３５８頁（’１９
７７年）、同誌第４８９巻、２６２〜２６８頁（１９７
７年）及び特開昭５３−１０４７９２号に記載されてい
る。しかしながらこれら文献記載のリパーゼはＳＤＳ電
気泳動、ゲル濾過では一応単一のタンパクであるが、デ
ィスク電気泳動的にはまだ微小蛋白が存在し、本発明者
らは調整用ディスク電気泳動によりこの微小蛋白（リパ
ーゼ活性を有する）の除去を行い、完全に単一なリパー
ゼとし、本願ではこのものを使用した。しかしながらこ
の精製品のみならず、各精製段階から得られるリパーゼ
標品の使用はむろん、培養液から得られる粗酵素溶液そ
のものをも使用ｂｉ供し得る。
フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒ−ｅｓｃｅｎｓ） ＩＡＭ １０５７の産生ずるリパ
ーゼ（リボプロティンリパーゼ作用もある。）であり、
この酵素の諸性質については、バイオチミカ・エト・バ
イオフィジカ・アクタ（Ｂｌｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ）第４８８巻、３５３〜３５８頁（’１９
７７年）、同誌第４８９巻、２６２〜２６８頁（１９７
７年）及び特開昭５３−１０４７９２号に記載されてい
る。しかしながらこれら文献記載のリパーゼはＳＤＳ電
気泳動、ゲル濾過では一応単一のタンパクであるが、デ
ィスク電気泳動的にはまだ微小蛋白が存在し、本発明者
らは調整用ディスク電気泳動によりこの微小蛋白（リパ
ーゼ活性を有する）の除去を行い、完全に単一なリパー
ゼとし、本願ではこのものを使用した。しかしながらこ
の精製品のみならず、各精製段階から得られるリパーゼ
標品の使用はむろん、培養液から得られる粗酵素溶液そ
のものをも使用ｂｉ供し得る。
尚、シュードモナス属菌の産生ずるリパーゼ以外の他の
リパーゼ、例えばブタ膵臓リパーゼ（生化学工業社製品
）、キャンシタ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃ
ｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ）のリパーゼ（シグマ社製品）
、ムコール・リポリティヵ（Ｍｕｃｏｒ １ｙｐｏｌ。
リパーゼ、例えばブタ膵臓リパーゼ（生化学工業社製品
）、キャンシタ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃ
ｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ）のリパーゼ（シグマ社製品）
、ムコール・リポリティヵ（Ｍｕｃｏｒ １ｙｐｏｌ。
１ｔｉｃａ ） （オリエンタル酵母社製品）、ヒトミ
ルクリポタンパクリパーゼ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ
ａｌ。
ルクリポタンパクリパーゼ（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ
ａｌ。
Ｂｉｏｃｈ’ｉｍ、Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、＾ｃｔａ第６２
０巻３０８〜３１Ｂ頁（１９８０年）記載の方法によっ
て製造した。）には酪酸メチル分解活性に対して本願の
非イオン界面活性剤の添加効果は全くな（、本願発明の
効果はシュードモナス属菌の産生ずるリパーゼに特異的
であることがわかった。
０巻３０８〜３１Ｂ頁（１９８０年）記載の方法によっ
て製造した。）には酪酸メチル分解活性に対して本願の
非イオン界面活性剤の添加効果は全くな（、本願発明の
効果はシュードモナス属菌の産生ずるリパーゼに特異的
であることがわかった。
一方リパーゼに添加する非イオン界面活性剤としては、
親水基としてポリオキシエチレン重合体を、親油基とし
゛Ｃアル羊ル基を有するものがあげられ、具体的にその
構造式及び化学名をあげればＣ，ｎＨ２，０（Ｃ１１２
ＣＩ２０ ）７ Ｈ：ポリオキシエチレン（７）デシル
エーテル；Ｃ１２１Ｈ２５０（ｃＨ２ｃＨ２ｏ）ｎＨ：
ポリオキシエチレンドデシルエーテル（ｎ＝２３のもの
をＢｒ１ｊ３５と称する。）；Ｃ１３Ｈ２７゜（ＣＨ２
ＣＨ２０）１ｏＨ：ポリオキシエチレン（１０） Ｉ−
リゾシルエーテル；Ｃ１４Ｈ２，０（ＣＨ２Ｃ１１２０
）、１Ｈ：ポリオキシエチレン（１１）テトラデシルエ
ーテル；Ｃ，６Ｈ３３’Ｏ（ＣＨ２Ｃ１１２０）ｎ’Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎ＝１０
のものをＢｒ１ｊ５６、ｎ＝２０のものをＢｒ１３５８
とそれぞれ称する。）；ＣＡＢ Ｈ３７０（Ｃ１１２Ｃ
Ｈ２０）ｎ Ｈ’ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル（ｎ＝１０のものをＢｒ１ｊ７６と称する。） ；
Ｃ−＋８ Ｈ２Ｓ ０ （ＣＨ２Ｃ１＋２０ ）ｎ Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）オレイルエーテル（ｎ＝１
０のものをＢｒ１ｊ９６、ｎ＝２９のものをＢｒ１ｊ９
８と称する。）；ポリオキシエチレン（１７）セチルー
ヌテアリルエーテル等がある。
親水基としてポリオキシエチレン重合体を、親油基とし
゛Ｃアル羊ル基を有するものがあげられ、具体的にその
構造式及び化学名をあげればＣ，ｎＨ２，０（Ｃ１１２
ＣＩ２０ ）７ Ｈ：ポリオキシエチレン（７）デシル
エーテル；Ｃ１２１Ｈ２５０（ｃＨ２ｃＨ２ｏ）ｎＨ：
ポリオキシエチレンドデシルエーテル（ｎ＝２３のもの
をＢｒ１ｊ３５と称する。）；Ｃ１３Ｈ２７゜（ＣＨ２
ＣＨ２０）１ｏＨ：ポリオキシエチレン（１０） Ｉ−
リゾシルエーテル；Ｃ１４Ｈ２，０（ＣＨ２Ｃ１１２０
）、１Ｈ：ポリオキシエチレン（１１）テトラデシルエ
ーテル；Ｃ，６Ｈ３３’Ｏ（ＣＨ２Ｃ１１２０）ｎ’Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）セチルエーテル（ｎ＝１０
のものをＢｒ１ｊ５６、ｎ＝２０のものをＢｒ１３５８
とそれぞれ称する。）；ＣＡＢ Ｈ３７０（Ｃ１１２Ｃ
Ｈ２０）ｎ Ｈ’ポリオキシエチレンステアリルエーテ
ル（ｎ＝１０のものをＢｒ１ｊ７６と称する。） ；
Ｃ−＋８ Ｈ２Ｓ ０ （ＣＨ２Ｃ１＋２０ ）ｎ Ｈ
：ポリオキシエチレン（ｎ）オレイルエーテル（ｎ＝１
０のものをＢｒ１ｊ９６、ｎ＝２９のものをＢｒ１ｊ９
８と称する。）；ポリオキシエチレン（１７）セチルー
ヌテアリルエーテル等がある。
非イオン界面活性剤の添加量としては、通電は酵素１分
子に結合する非イオン界面活性剤の分子の割合（以下Ｂ
ｒ１ｊとリパ一ゼの結合比又はＢ ／ ｅと称する。）
が５〜１００、好ましくは２０〜４０で、本結合体のエ
ステラーゼ活性が最大となるので、１、．５Ｘ １０−
３μｍｏｌｅのリパーゼを用いに場合７．５×１０−３
〜１．５Ｘ １０” ／Ｊ ｍｏｌｅ程度が望ましい。
子に結合する非イオン界面活性剤の分子の割合（以下Ｂ
ｒ１ｊとリパ一ゼの結合比又はＢ ／ ｅと称する。）
が５〜１００、好ましくは２０〜４０で、本結合体のエ
ステラーゼ活性が最大となるので、１、．５Ｘ １０−
３μｍｏｌｅのリパーゼを用いに場合７．５×１０−３
〜１．５Ｘ １０” ／Ｊ ｍｏｌｅ程度が望ましい。
しかしながら反応系の食塩濃度を上げたり、基質として
用いる酪酸メチルの濃度を高めることによって、或いは
酵素量を少なくすることによって非イオン界面活性剤の
添加量をより低くすることができる。
用いる酪酸メチルの濃度を高めることによって、或いは
酵素量を少なくすることによって非イオン界面活性剤の
添加量をより低くすることができる。
尚、リパーゼと非イオン界面活性剤の結合は単なる混合
によって生じ添加の順序即ちリパーゼ、非イオン界面活
性剤のいずれが先に添加され他のものが後に加えられた
としても同様な効果を生じる。
によって生じ添加の順序即ちリパーゼ、非イオン界面活
性剤のいずれが先に添加され他のものが後に加えられた
としても同様な効果を生じる。
以下に非イオン界面活性剤の１つ、即ちポリオキシエチ
レン（ｎ）セチルエーテルのｎが２０であるＢｒ１３５
８ （花王アトラス社製品）とシュードモナス属菌のリ
パーゼとを用い本発明を更に具体的に説明する。
レン（ｎ）セチルエーテルのｎが２０であるＢｒ１３５
８ （花王アトラス社製品）とシュードモナス属菌のリ
パーゼとを用い本発明を更に具体的に説明する。
１．５Ｘ １０−３μｍｏｌｅのシュードモナス属リパ
ーゼを含む溶液１００ｍに７．５Ｘ １Ｏ−２ｐ ｍｏ
ｌｅのＢｒ１ｊ５８を含む水溶液１００度を混合するこ
とによってリパーゼとＢｒ１ｊＳ８の結合が生じる。こ
のものをセファデックスＧ−２００ゲル濾過による分子
量を推定した結果、約６５．０００〜８０，０００であ
り、ちとのりバーゼの分子量が３３，０００であること
からリパーゼ１分子あたり３０〜４０個のＢｒ１３５８
が結合していることがわかった。このＢｒ１ｊ５８とシ
ュードモナス属リパーゼの結合はきわめて強固なもので
あり、そのことは水溶液中にシュードモナス属リパーゼ
を添加するだけでごく短時間で活性型になることから予
測されるが、またジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡＥ
と称する。）セルロースカラムクロマトグラフィー、フ
ォータナライズドアミノエチル（以下ＱＡＥと称する。
ーゼを含む溶液１００ｍに７．５Ｘ １Ｏ−２ｐ ｍｏ
ｌｅのＢｒ１ｊ５８を含む水溶液１００度を混合するこ
とによってリパーゼとＢｒ１ｊＳ８の結合が生じる。こ
のものをセファデックスＧ−２００ゲル濾過による分子
量を推定した結果、約６５．０００〜８０，０００であ
り、ちとのりバーゼの分子量が３３，０００であること
からリパーゼ１分子あたり３０〜４０個のＢｒ１３５８
が結合していることがわかった。このＢｒ１ｊ５８とシ
ュードモナス属リパーゼの結合はきわめて強固なもので
あり、そのことは水溶液中にシュードモナス属リパーゼ
を添加するだけでごく短時間で活性型になることから予
測されるが、またジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡＥ
と称する。）セルロースカラムクロマトグラフィー、フ
ォータナライズドアミノエチル（以下ＱＡＥと称する。
）セファデックスＡ−５０に非吸着となり、ディスク電
気泳動でも泳動されなくなり、ショ糖濃度を段階的に積
層させたカラムでの電気泳動では非イオン性のＢｒ１ｊ
５Ｂもリパーゼと共に泳動されることからも証明されう
る。
気泳動でも泳動されなくなり、ショ糖濃度を段階的に積
層させたカラムでの電気泳動では非イオン性のＢｒ１ｊ
５Ｂもリパーゼと共に泳動されることからも証明されう
る。
この結合体からなる反応系に基質の酪酸メチルを添加す
ると即座に活性化が起った。そして添加時の基質濃度依
存性を開べたところ活性化は基質が水溶性の時のみ高く
、そのパターンはダニエルの提言した所謂エステラーゼ
型を示しており（第１図に示す）、更に酪酸メチルにか
え、トリブチリン、コハク酸メチル、α−ナフチルアセ
テートなどの他の水溶性基質に対しても活性化が起って
いるので本結合体はエステラーゼ活性を明らかに獲得し
たといいうるものであった。
ると即座に活性化が起った。そして添加時の基質濃度依
存性を開べたところ活性化は基質が水溶性の時のみ高く
、そのパターンはダニエルの提言した所謂エステラーゼ
型を示しており（第１図に示す）、更に酪酸メチルにか
え、トリブチリン、コハク酸メチル、α−ナフチルアセ
テートなどの他の水溶性基質に対しても活性化が起って
いるので本結合体はエステラーゼ活性を明らかに獲得し
たといいうるものであった。
一方、この結合体は５ｍＭのトリオレインを基質にした
場合には活性に変化を生じながった。これはリパーゼ活
性に対しては変化がないことを意味する。更に又、８０
ｍＭ酪酸メチル分解活性に対するＢｒ１ｊ５８の効果は
Ｂ ／ ｅの分子比に相関していた。
場合には活性に変化を生じながった。これはリパーゼ活
性に対しては変化がないことを意味する。更に又、８０
ｍＭ酪酸メチル分解活性に対するＢｒ１ｊ５８の効果は
Ｂ ／ ｅの分子比に相関していた。
即ち、リパーゼを１／２に減らした場合、１／２のＢｒ
１ｊ５８で最大活性を示し、その活性化のパターンはほ
ぼ同様であった（第２図に示す。）。これはリパーゼと
３ｒｉｊ５８が直接インターラクションしている証拠の
一つと考えられる。
１ｊ５８で最大活性を示し、その活性化のパターンはほ
ぼ同様であった（第２図に示す。）。これはリパーゼと
３ｒｉｊ５８が直接インターラクションしている証拠の
一つと考えられる。
リパーゼとＢｒ１３５Ｂの結合物の酪酸メチルに対する
活性化は、当然のことながら他のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルでも同様な効果が得られた。又、ポリオ
キシエチレンｐ−ノニルフェニルエーテルのエマルゲン
９０３（花王石けん社製品）、第２級直鎮アルコールエ
トキシレートのアデカトール５０８０、アデカトールＳ
０１０５、アデカトールＳ ０１３５ （いずれも旭
電化社製品）などでも２０〜３０％の効果がみられた。
活性化は、当然のことながら他のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルでも同様な効果が得られた。又、ポリオ
キシエチレンｐ−ノニルフェニルエーテルのエマルゲン
９０３（花王石けん社製品）、第２級直鎮アルコールエ
トキシレートのアデカトール５０８０、アデカトールＳ
０１０５、アデカトールＳ ０１３５ （いずれも旭
電化社製品）などでも２０〜３０％の効果がみられた。
Ｂｒ１ｊ３５は約４５％の相対活性を示した。トリトン
メ−１００、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、プルし１ニツクＦ
５８、エマルゲン８１０、工マルゲンＰＩ ２０５、ア
デカトールＮＰ １１０では活性化効果は得られなかっ
た。又酢酸、パルミチン酸、オレイン酸などの脂肪酸ナ
トリウム塩も活性に影響を与えなかった。
メ−１００、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナ
トリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、プルし１ニツクＦ
５８、エマルゲン８１０、工マルゲンＰＩ ２０５、ア
デカトールＮＰ １１０では活性化効果は得られなかっ
た。又酢酸、パルミチン酸、オレイン酸などの脂肪酸ナ
トリウム塩も活性に影響を与えなかった。
以上で明らかなように、シュードモナス属リパーゼと非
イオン界面活性好ましくはポリオキシエチレンアルキル
エーテルを構造式に持つものを混合することによりリパ
ーゼ活性はそのまま保持しかつ新たにエステラーゼ活性
を有する本発明の目的の複合酵素が得られることがわか
る。次にＢｒ１ｊ５８添加前後のシュードモナス属リパ
ーゼの性質を比較した結果を表−１に示す。
イオン界面活性好ましくはポリオキシエチレンアルキル
エーテルを構造式に持つものを混合することによりリパ
ーゼ活性はそのまま保持しかつ新たにエステラーゼ活性
を有する本発明の目的の複合酵素が得られることがわか
る。次にＢｒ１ｊ５８添加前後のシュードモナス属リパ
ーゼの性質を比較した結果を表−１に示す。
（以°下余白）
表−１
次に本発明において使用したエステラーゼ及びリパーゼ
活性測定法について述べる。
活性測定法について述べる。
エステラーゼ活性：
基質（８０ｍＭ酪酸メチルなど）を０．１Ｍ ＮａＣ１
を含む０．５％アラビアゴムに入れ１０ｍβにフィルア
ンプし共栓をして３０秒間強く振り溶解させたのち３７
℃でｐＨ８，０に調整後スタラーで攪拌し、Ｎ２ガス気
流下で５０μｇの酵素を加え、０．００２Ｎな、いしＯ
，ｌＮＮａ０１１で滴定しながら５分間反応させた。尚
、ｐＨ調整したＢｒ１３５８の０．０８４％水溶液１０
０度を酵素添加直前に添加した。力価は１分間に１マイ
クロモルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１単位とした。
を含む０．５％アラビアゴムに入れ１０ｍβにフィルア
ンプし共栓をして３０秒間強く振り溶解させたのち３７
℃でｐＨ８，０に調整後スタラーで攪拌し、Ｎ２ガス気
流下で５０μｇの酵素を加え、０．００２Ｎな、いしＯ
，ｌＮＮａ０１１で滴定しながら５分間反応させた。尚
、ｐＨ調整したＢｒ１３５８の０．０８４％水溶液１０
０度を酵素添加直前に添加した。力価は１分間に１マイ
クロモルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１単位とした。
リパーゼ活性：
均一なエマルジョンを作成した５ｍＭトリオレインを２
％牛血清アルブミンを含む同上の反応系に入れ、上記の
方法に準じて活性を測定した。
％牛血清アルブミンを含む同上の反応系に入れ、上記の
方法に準じて活性を測定した。
以下に本発明の実施例について記載する。
実施例１
シュードモナス属リパーゼ（リパーゼ活性２５００Ｕ／
■、エステラーゼ活性２．８ｕ ／■、天野製薬社製品
） １．５ｘｌＯ−３μｍｏｌｅを含む溶液１００−と
、Ｂｒ１ｊ５８ （花王アトラス社製品）の７．５Ｘ
１Ｏ−２Ｉ ｍ。
■、エステラーゼ活性２．８ｕ ／■、天野製薬社製品
） １．５ｘｌＯ−３μｍｏｌｅを含む溶液１００−と
、Ｂｒ１ｊ５８ （花王アトラス社製品）の７．５Ｘ
１Ｏ−２Ｉ ｍ。
ｌｅを含む水溶液１００ｇを室温下混合し、リパーゼと
Ｂｒ１ｊ５Ｂを結合せしめたところ、このものはエステ
ラーゼ活性として２０ｕ／■（７倍上昇）を有していた
（ ８０ｍＭ酪酸メチルを基質とした場合）。又リパー
ゼ活性は２５００ｕ／ｍｇであった。
Ｂｒ１ｊ５Ｂを結合せしめたところ、このものはエステ
ラーゼ活性として２０ｕ／■（７倍上昇）を有していた
（ ８０ｍＭ酪酸メチルを基質とした場合）。又リパー
ゼ活性は２５００ｕ／ｍｇであった。
実施例２〜１３
実施例１と同様のシュードモナス属リパーゼ１．５Ｘ
１０’ ｐ ｍｏｌｅを含む各溶液１００ｄに各種界面
活性剤の８０μｇを含む水溶液各１ｏｏｐ１！をそれぞ
れ混合し、リパーゼと各種界面活性剤を結合せしめ該結
合物の酪酸メチル分解活性を測定した。その結果を表−
２に示す。
１０’ ｐ ｍｏｌｅを含む各溶液１００ｄに各種界面
活性剤の８０μｇを含む水溶液各１ｏｏｐ１！をそれぞ
れ混合し、リパーゼと各種界面活性剤を結合せしめ該結
合物の酪酸メチル分解活性を測定した。その結果を表−
２に示す。
（以下余白）
表−２
尚、表−２中のＰＯＥはポリオキシエチレン基の略であ
り、相対活性はＢｒ１ｊ５８を１００としたときのエス
テラーゼ相対活性である。
り、相対活性はＢｒ１ｊ５８を１００としたときのエス
テラーゼ相対活性である。
実施例１４
５％ＮａＣ１及び実施例１と同様のシュードモナス属リ
パーゼ２．ＯＸ １Ｏ−３ｐ ｍｏｌｅを含む水溶液１
００４にＢｒ１ｊ５８０．５Ｘ １０−２＃ ｍｏｌｅ
を含む水溶液１００ｇを加え混合し、リパーゼとＢｒ１
ｊ５８を結合せしめた。
パーゼ２．ＯＸ １Ｏ−３ｐ ｍｏｌｅを含む水溶液１
００４にＢｒ１ｊ５８０．５Ｘ １０−２＃ ｍｏｌｅ
を含む水溶液１００ｇを加え混合し、リパーゼとＢｒ１
ｊ５８を結合せしめた。
４０ｍＭ酪酸メチルを基質として結合物のエステラーゼ
活性を測定したところ０．ＩＭ ＮａＣ１を含む系では
２８ｕ／ｗであったが、２ Ｍ ＮａＣ１存在下でば２
０ｕ／■であった。
活性を測定したところ０．ＩＭ ＮａＣ１を含む系では
２８ｕ／ｗであったが、２ Ｍ ＮａＣ１存在下でば２
０ｕ／■であった。
実施例１５〜２０
シュードモナス属リパーゼ１．５Ｘ１０−３μｍｏｌｅ
の各 １００ｐ１にＢｒ１ｊ５Ｂの １．５Ｘ １０″
２〜９ Ｘ １０μｍｏｌｅの各濃度を含む水溶波谷１
００越ずつを加え、それぞれのＢｒ１ｊ５８とリパーゼ
の結合比（Ｂ／ｅで示す）からなる結合物を形成せしめ
、基質踊酸メチルを用いてエステラーゼ活性とリパーゼ
とＢｒ１ｊ５８の結合比との関係をみた。その結果を表
−３に示す。
の各 １００ｐ１にＢｒ１ｊ５Ｂの １．５Ｘ １０″
２〜９ Ｘ １０μｍｏｌｅの各濃度を含む水溶波谷１
００越ずつを加え、それぞれのＢｒ１ｊ５８とリパーゼ
の結合比（Ｂ／ｅで示す）からなる結合物を形成せしめ
、基質踊酸メチルを用いてエステラーゼ活性とリパーゼ
とＢｒ１ｊ５８の結合比との関係をみた。その結果を表
−３に示す。
（以下余白）
表−３
実施例２１
実施例１と同様のシュードモナス属すパーゼ品１．５Ｘ
１Ｏ−３ｐ ｍｏｌｅを含む水溶液にｌｌｒ ｉ ｊ
５Ｂの３．７５Ｘ１０’ ｐ ｍｏｌｅ〜７．５Ｘ
１０’μｍｏｌｅを含む水溶液１００ｇを加え混合し、
リパーゼとＢｒ１ｊ５８を結合せしめたのち４０〜１２
０ｍＭの酢酸メチルを加えて基質の各濃度におけるリパ
ーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比（Ｂ／ｅ）とエステラーゼ
活性との関係をみたところ第２図の通りであった。
１Ｏ−３ｐ ｍｏｌｅを含む水溶液にｌｌｒ ｉ ｊ
５Ｂの３．７５Ｘ１０’ ｐ ｍｏｌｅ〜７．５Ｘ
１０’μｍｏｌｅを含む水溶液１００ｇを加え混合し、
リパーゼとＢｒ１ｊ５８を結合せしめたのち４０〜１２
０ｍＭの酢酸メチルを加えて基質の各濃度におけるリパ
ーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比（Ｂ／ｅ）とエステラーゼ
活性との関係をみたところ第２図の通りであった。
実施例２２
実施例１と同様にしてシュードモナス属リバーゼとＢｒ
１ｊ５Ｂ （花王アトラス社製品）を混合し、結合せし
め、このもののエステラーゼ活性を基質として０．５ｍ
Ｍ）リブチリンを用いて測定したところＢｒ１ｊ混合前
のエステラーゼ活性が３４０ｕ ／■であったものが混
合後２１２０ｕ／ｍｇに上昇した。尚リパーゼ活性は２
５００ｕ ／■であった。
１ｊ５Ｂ （花王アトラス社製品）を混合し、結合せし
め、このもののエステラーゼ活性を基質として０．５ｍ
Ｍ）リブチリンを用いて測定したところＢｒ１ｊ混合前
のエステラーゼ活性が３４０ｕ ／■であったものが混
合後２１２０ｕ／ｍｇに上昇した。尚リパーゼ活性は２
５００ｕ ／■であった。
第１図はシュードモナス属リパーゼのＢｒ１３５Ｂ存在
、非存在下における酪酸メチル濃度依存性をみ 、＝肩 たものであり、第２図は各濃度におけるシュード ＼モ
ナス属リパーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステツー
ｌゼ活性との関係をみたものであり、第３図は各酪 −
酸メチル濃度におけるシュードモナス属リパーゼ 帳と
Ｂｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステラーゼ活性との関係を
癩みたものである。 謳 姻 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 酪酸メチル濃度（ｍＭ） 第２図 Ｂ／ｅ （ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 第３図 Ｂ／ｅ （ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 手続補正書（自発） 昭和５９年５月λど日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１３９９１９号 ２、発明の名称 リパーゼにエステラーゼ活性を付加する方法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号発明の詳細
な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第１５頁〜第１６頁の表−２を下記の表と
（２）明細書第１６頁下から第４行〜第３行に「相対活
性は・・・エステラーゼ相対活性である。」とあるを「
活性比率とは、界面活性剤無添加のエステラーゼ活性を
１としたとき、各種界面活性剤を添加した場合のそれぞ
れのエステラーゼ活性の示す値である。」と補正する。 （３）明細書第１８真下から第９行の’ Ｂｒ１ｊ５Ｂ
の」とあるを’ Ｂｒ１ｊ５８」と補正する。 （４）明細書第１８頁下から第８行〜第７行の「含む水
溶液１００１１Ｆを」とあるを削除する。 （５）明細書第１８真下から第６行の「酢酸メチル」と
あるを「酪酸メチルｊと補正する。 （６）明細書第１８頁下から第２行〜第１９頁第６行の
実施例２２を下記の文に入れかえる。 ｒ実施例２２ 実施例１と同様のシュードモナス属すパーゼ品１．５Ｘ
１０−３μｍｏｌｅあるいば７．６Ｘ １０−６μｍｏ
ｌｅを含む水溶液にＢｒ１ｊ５Ｂの４．５Ｘ １０＝
μｍｏｌｅあるいは２．２８Ｘ １０−４ ＃ ｍｏｌ
ｅを加え混合し、リパーゼとＢｒ１３５８を結合せしめ
たのち、種々の水溶性の基質あるいは不溶性の基質の活
性を測定したところ表−４に示、すように水溶性の基質
のみ活性が上昇した。 なお基質は０．５％アラビアゴムを含む０．１Ｍ食塩溶
液に溶解あるいは乳化した。 （以下余白）
、非存在下における酪酸メチル濃度依存性をみ 、＝肩 たものであり、第２図は各濃度におけるシュード ＼モ
ナス属リパーゼとＢｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステツー
ｌゼ活性との関係をみたものであり、第３図は各酪 −
酸メチル濃度におけるシュードモナス属リパーゼ 帳と
Ｂｒ１ｊ５Ｂの結合比とエステラーゼ活性との関係を
癩みたものである。 謳 姻 特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 酪酸メチル濃度（ｍＭ） 第２図 Ｂ／ｅ （ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 第３図 Ｂ／ｅ （ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ） 手続補正書（自発） 昭和５９年５月λど日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１３９９１９号 ２、発明の名称 リパーゼにエステラーゼ活性を付加する方法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号発明の詳細
な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第１５頁〜第１６頁の表−２を下記の表と
（２）明細書第１６頁下から第４行〜第３行に「相対活
性は・・・エステラーゼ相対活性である。」とあるを「
活性比率とは、界面活性剤無添加のエステラーゼ活性を
１としたとき、各種界面活性剤を添加した場合のそれぞ
れのエステラーゼ活性の示す値である。」と補正する。 （３）明細書第１８真下から第９行の’ Ｂｒ１ｊ５Ｂ
の」とあるを’ Ｂｒ１ｊ５８」と補正する。 （４）明細書第１８頁下から第８行〜第７行の「含む水
溶液１００１１Ｆを」とあるを削除する。 （５）明細書第１８真下から第６行の「酢酸メチル」と
あるを「酪酸メチルｊと補正する。 （６）明細書第１８頁下から第２行〜第１９頁第６行の
実施例２２を下記の文に入れかえる。 ｒ実施例２２ 実施例１と同様のシュードモナス属すパーゼ品１．５Ｘ
１０−３μｍｏｌｅあるいば７．６Ｘ １０−６μｍｏ
ｌｅを含む水溶液にＢｒ１ｊ５Ｂの４．５Ｘ １０＝
μｍｏｌｅあるいは２．２８Ｘ １０−４ ＃ ｍｏｌ
ｅを加え混合し、リパーゼとＢｒ１３５８を結合せしめ
たのち、種々の水溶性の基質あるいは不溶性の基質の活
性を測定したところ表−４に示、すように水溶性の基質
のみ活性が上昇した。 なお基質は０．５％アラビアゴムを含む０．１Ｍ食塩溶
液に溶解あるいは乳化した。 （以下余白）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シュードモナス属菌の産生ずるリパーゼと非イオン
界面活性剤を混合し、リパーゼと非イオン界面活性剤を
結合せしめ、リパーゼ活性はそのまま保持し、かつエス
テラーゼ作用を生ぜしめることを特徴とするリパーゼに
エステラーゼ活性を付加する方法。 ２ 非イオン界面活性剤が親水基としてポリオキシエチ
レン重合体を持ち、親油基としてアルキル基を持つとこ
ろの特許請求の範囲第１項記載のリパーゼにエステラー
ゼ活性を付加する方法。 ３ 親水基としてポリオキシエチレン重合体を持ち、親
油基としてアルキル基を持つ非イオン界面活性剤がポリ
オキシエチレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンド
デシルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテ
ル、ポリオキシエチレンテトラデシルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
、ポリオキシエチレンセチル−ステアリルエーテルのい
ずれかである特許請求の範囲第１項又は第２項記載のリ
パーゼエステラーゼ活性を付加する方法。 ４ リパーゼと非イオン界面活性剤の結合がリパーゼ１
分子あたり非イオン界面活性剤分子１０以上からなって
いるところの特許請求の範囲第１項記載のリパーゼにエ
ステラーゼ活性を付加する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13991983A JPS6030680A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13991983A JPS6030680A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6030680A true JPS6030680A (ja) | 1985-02-16 |
Family
ID=15256703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13991983A Pending JPS6030680A (ja) | 1983-07-30 | 1983-07-30 | リパ−ゼにエステラ−ゼ活性を付加する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6030680A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6222599A (ja) * | 1985-07-24 | 1987-01-30 | Toyo Jozo Co Ltd | 光学活性カルボン酸の製造法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5031088A (ja) * | 1973-05-25 | 1975-03-27 | ||
| JPS55159794A (en) * | 1979-02-22 | 1980-12-12 | Millipore Corp | Hydrolysis of glyceride by enzyme |
| JPS58175488A (ja) * | 1982-01-07 | 1983-10-14 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | シユ−ドモナス属菌からのコレステリンエステラ−ゼの水溶液の安定化法 |
-
1983
- 1983-07-30 JP JP13991983A patent/JPS6030680A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5031088A (ja) * | 1973-05-25 | 1975-03-27 | ||
| JPS55159794A (en) * | 1979-02-22 | 1980-12-12 | Millipore Corp | Hydrolysis of glyceride by enzyme |
| JPS58175488A (ja) * | 1982-01-07 | 1983-10-14 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | シユ−ドモナス属菌からのコレステリンエステラ−ゼの水溶液の安定化法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6222599A (ja) * | 1985-07-24 | 1987-01-30 | Toyo Jozo Co Ltd | 光学活性カルボン酸の製造法 |
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