JPS6237957B2 - - Google Patents
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Description
体液、特に血清のコレステロール濃度分析にお
いて、最初の段階はコレステロールエステルを加
水分解してコレステロールを遊離することであ
る。 コレステロールエステル加水分解の慣用方法に
は、強塩基（KOH、NaOH等）が用いられるか
又は使用が簡単かつ選択的であるのでヒドロラー
ゼ酵素（即ちコレステロールエステラーゼ）が用
いられる。腐食性物質の取り扱いは不便であるか
又は不望である場合がありそして以下の先行技術
文献に関連して記載するように、酵素的方法は遊
離の（蛋白質へ結合していない）コレステロール
エステルの加水分解に有用でありうるのが、蛋白
質結合コレステロールエステルを処理するのに用
いる時酵素的方法は有効でないか又は長時間を要
する。エステル―蛋白質結合は明きらかにエステ
ラーゼの作用を阻害するので、酵素をエステルに
作用させる前に蛋白質―エステルコンプレツクス
を破壊する何らかの手段が必要である。 グツドヒユー等による米国特許第3869349号
（1975年３月４日公告）には、コレステロールエ
ステラーゼ活性を示すリパーゼ調製物とプロテア
ーゼとを含む組成物の使用に関する記載がある。
この特許には、界面活性剤がプロテアーゼの換わ
りとなりうるということに関しいかなる記載もな
い。 ビユーコロ等による米国特許第3703591号に
は、リパーゼとプロテアーゼとを組み合せて用い
て、血清（即ち蛋白質結合）トリグリセリドの加
水分解を行うことについて記載されている。しか
しながら界面活性剤を、コレステロールエステル
の加水分解においてプロテアーゼと共にか又はそ
の代替物として使用することに関するいかなる記
載もない。 ストーク等による米国特許第3759793号には、
ビユーコロにより提唱されたリパーゼと明きらか
に等しい、リゾプスアリザス（Phizopus
arrhizus）からのリパーゼを用いた血清トリグリ
セライドの加水分解について記載されている。し
かしながらこの場合はプロテアーゼを必要としな
い。この明きらかな変則の理由は明確でない。し
かしながら同一譲受け人の英国特許第1395126号
において見られるようにストーク等の加水分解方
法は非常に遅いことに注目されたい。この英国特
許には、前記リゾプスアリザスリパーゼを用いた
トリグリセリド加水分解の改良方法が記載されて
おり、この方法はトリグリセリドとリパーゼを、
カルボキシルエステラーゼ及びアルカリ金属硫酸
アルキル又はアルカリ土類金属硫酸アルキル（ア
ルキル基の炭素数10ないし15）の存在下において
緩衡液中で接触させる工程を含む。好ましい硫酸
アルキルはナトリウムドデシルスルフエートであ
る。しかしながらカルボキシルエステラーゼの不
存在下で、界面活性剤のみを用いることにより、
トリグリセリドのヒドロラーゼ活性が強められる
ことについてのいかなる記載もない。 「ヘレニウス、アリ及びシモンズ、カイによる
Biochemistry第10巻第13号1971年」には、人間
の血漿を高濃度の天然及び合成の界面活性剤で処
理する工程を含む、人間の血漿の低濃度リポ蛋白
質からすべての主な脂質を除去する方法が記載さ
れている。脂質除去は、人間の血漿の低濃度リポ
蛋白質の脂質を含まぬ蛋白質部分を特徴づける目
的で適用される。この文献には、迅速かつ正確な
加水分解法及び安定な分析組成物を提供すること
により血清のコレステロール含量の分析を簡単に
するであろう有用な分析手段が界面活性剤とリパ
ーゼとの組み合せにより得られるであろうことに
ついていかなる記載もない。 米国特許第3689364号（1972年９月５日公告）
には、リパーゼの基質として“遊離の”トリグリ
セリド乳剤を用いた、血清のような体液中に含ま
れるリパーゼの分析について記載されている。
“遊離”のトリグリセリド（即ち蛋白質へ結合し
ていないトリグリセリド）である基質乳剤を安定
化する胆汁塩は、同時に分析下のリパーゼ（それ
が膵臓リパーゼである場合に）に促進効果を及ぼ
す。この促進効果は明きらかに、基質乳剤である
遊離のトリグリセリド上のリパーゼの加水分解活
性の増大をもたらす。この特許には、前記胆汁塩
は血清において見られるように、それが蛋白質へ
結合したリパーゼと接触する場合にリパーゼ調製
物に何らかの作用を及ぼすことについていかなる
記載もない。詳しくは前記リパーゼが蛋白質結合
コレステロールエステルを加水分解しうるという
ことについていかなる記載もない。 コマツによる米国特許第3898130号、1975年８
月５日公告には、微生物リパーゼ（特にカンジタ
（Candida）リパーゼ（Sic））、膵臓リパーゼ並び
にナトリウムタウロデオキシコレート、タウロコ
レート、タウロチエノデオキシコレート及びタウ
ロデヒドロコレートから成る群から胆汁塩の混合
物を有する組成物とトリグリセリドとを接触させ
る工程を含むトリグリセリド加水分解法が記載さ
れている。微生物リパーゼ酵素及び膵臓リパーゼ
酵素は加水分解組成物の必須成分である。 ドイツ国公開公報第2522432号（1975年12月４
日刊行）には、シユードマナスフルオレスセンス
（Pseudomonas fluorescens）からのコレステロ
ールエステラーゼを用いたコレステロールエステ
ルを加水分解する為の酵素的方法が記載されてい
る。しかしながらこれには、蛋白質結合コレステ
ロールエステルの加水分解を行うのに界面活性剤
を用いる事又はその必要性に関するいかなる記載
もない。 フランス国特許第2223696号及び米国特許第
3925164号（1975年12月９日公告）には、界面活
性剤の存在下でカンジダルーゴサ（Candida
rugosa）、リゾプス又はアスペルギルスからの酵
素調製物によりコレステロールエステルを加水分
解することによる血清の総コレステロール分析が
記載されている。唯一の提唱界面活性剤はヒドロ
キシポリエトキシドデカンである。以下の例で示
すように、そのような界面活性剤は、コレステロ
ールエステルヒドロラーゼ活性を阻害する場合が
あるのでこの明細書に記載されている物質程有効
でない。 ドイツ国公開公報第2509156号（1975年９月23
日刊行）にはコレステロールエステル加水分解剤
として、コレステロールエステラーゼ及び／没食
子酸又はその塩を用いる総コレステロール分析の
酵素的方法が記載されている。コレステロールエ
ステラーゼはノカルジアレストリクタス
（Nocardia restrictus）から採取したＥ
（3.1.1.13）として同定されている。この文献には
この明細書記載の合成界面活性剤がコレステロー
ルエステラーゼの有用な促進剤であるといういか
なる記載もない。 ベルギー国特許第811728号は、(1)コレステロー
ルエステル加水分解活性を有する化学系とコレス
テロールオキシダーゼ活性を有する化学系との混
合物と(2)過酸化水素又はΔ４―コレステン―３―
オンの測定手段とを含む、生物学的流体試料中の
総コレステロール測定用試験組成物に関する。遊
離のコレステロールは水溶液のような流体にほん
のわずかしか溶けないので、流体試験中に存在す
る実質的にすべての遊離のコレステロールを可溶
化しうる界面活性剤をこの試験組成物に含めるこ
とが好ましいとこの明細書に記載されている。し
かしながらこの明細書には更に、コレステロール
エステルヒドロラーゼは胆汁からの酵素助因子を
必要とし、しかもコレステロールエステルヒドロ
ラーゼ及び胆汁からのその助因子がそれ故前記組
成物に含まれる場合は界面活性剤の使用は望まし
くないと言つている。 更に本発明の実施に必要な特殊なタイプの界面
活性剤に関する開示はこのベルギー国特許のどこ
にもみあたらない。 コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を有
するリパーゼ調製物と、その酵素活性を阻害しな
いオキシエチレン単位が約20未満のポリオキシエ
チレン鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシ
エタノールとの混合物を蛋白質結合コレステロー
ルエステルと接触させることにより、蛋白質結合
コレステロールエステルを約10分未満（好ましく
は約５分で）のオーダーの比較的短時間で加水分
解しうることが見い出された。 この明細書に記載の方法及び組成物によりコレ
ステロールエステル加水分解薬剤として先行技術
方法により可能であつたよりもずつと広範囲の酵
素調製物の使用が可能になる。かくして安価な物
質を用いて先行技術の方法及び物質を用いた場合
に少くとも等しいかそれ以上である反応完了まで
の反応時間及び反応完了時の状態を実現すること
が出来る。 前述のごとく、遊離のコレステロールエステル
の加水分解を触媒する酵素調製物がある。しかし
ながらそのような物質を用いても、血清中で見ら
れるような蛋白質へ結合したコレステロールエス
テルの加水分解は非常に低速でか又は不完全な様
式でしか触媒されない。これは明きらかに、酵素
の通常の様式での加水分解触媒機能を阻害する蛋
白質―脂質コンプレツクスの影響である。先行技
術では促進剤（即ち蛋白質結合コレステロールエ
ステルがリパーゼによつて加水分解されうる速度
を増大させる薬剤）と呼ばれることのあるものの
使用が提唱されている。そのような薬剤が作用す
る機構は解明されていないけれども、それらによ
つてある様式でエステル―蛋白質コンプレツクス
が破壊されてエステルが遊離し、慣用手段による
加水分解に供することが理論づけられている。た
とえばプロテアーゼ酵素がこの目的に適うものと
して提唱された。 本発明者等は、ある界面活性剤は促進剤であり
そしてそれらをプロテアーゼの代替物として用い
て、（蛋白質結合コレステロールエステルの加水
分解剤として）通常、蛋白質結合コレステロール
エステルの加水分解を触媒不可能であるか又はで
きたとしても非常に不望の低速でしか行えない酵
素調製物を有用なものとできることを見い出し
た。その上プロテアーゼは、ベルギー国特許第
801742号記載のような、被検物検出用の多層要素
に用いられるゼラチンのような蛋白質含有バイン
ダを分解する傾向があるので、この明細書に記載
の組成物は前記のような要素に特に有用である。 従つて本発明の新規な加水分解組成物は、コレ
ステロールエステラーゼ活性を示す酵素調製物
と、促進剤としてその酵素活性を阻害しないオキ
シエチレン単位が約20未満のポリオキシエチレン
鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシエタノ
ールとの混合物とを含む。 この明細書に記載の方法及び組成物に潜在的に
有用な酵素調製物は遊離の（蛋白質に結合してい
ない）コレステロールエステルヒドロラーゼ活性
を示すものである。そのような活性を示すリパー
ゼ調製物は特に好ましい。 酵素、詳しくはリパーゼ調製物のコレステロー
ルエステルヒドロラーゼ（エステラーゼ）活性を
測定するに有用なスクリーニング方法は、一定量
の酵素調製物をPH7.0の標準コレステリルリノリ
エート溶液へ添加し、37℃においてN2雰囲気下
で２時間培養しそしてJ.Vonhoeffmyv及びR.
Friedによる「Z.Klin.Chem.U.Klin.Biochem.
８、134（1970）」に記載のヒドロキシルアミン法
により溶液中に残つたエステル量を測定する工程
を含む。この方法により、スクリーニング操作に
おいて約25mg/dlを越えるコレステロールを放出
するコレステロールエステラーゼ活性を示す調製
物が、本発明の実施における有用な候補と考える
べきである。 コレステロールエステル加水分解に有用な酵素
調製物を植物源又は動物源から採取できるが、本
発明者等は、未精製か又は精製したカンジダルー
ゴサ、クロモバクテリウムビイスコサム
（Chromobacterium viscosum）、パラリポリテイ
クム（Paralipolyticum）変種からのような微生
物源からの調製物を好む。その他の有用な酵素調
製物及びそれを製造する方法は以下の米国特許に
記載されている。グランデルによる第2888385
号、1959年５月26日公告；メルサー等による第
3168448号、1965年２月２日公告；ヤマダ等によ
る第3189529号、1965年６月15日公告；フクモト
等による第3262863号、1966年７月26日公告；及
びマウベルナイ等による第3513073号、1970年５
月19日公告。 好ましい市販の酵素調製物には、インジアナ州
エルクハールトのマイルス研究所から得られる小
麦胚種リパーゼ、ウイルソン研究所から得られる
リパーゼ3000（膵臓酵素）、シグ又研究所から得
られるステアプシン（膵臓リパーゼ）及びエンザ
イムデイベロツプ社から得られるリパーゼＭ（カ
ンジダル―ゴザから採取）がある。 ある界面活性剤は、ある酵素調製物のコレステ
ロールエステラーゼ活性を阻害する。従つて、こ
の明細書に記載のごとく使用する界面活性剤と酵
素調製物とを組み合せる試みを行う前に、組成物
の二つの構成分である界面活性及び酵素調製物に
関し、この界面活性剤が酵素調製物を阻害しない
かを測定する。そのような測定は好ましくは以下
に記載の試験により行う。この試験に首尾よく適
合する界面活性剤と酵素調製物との混合物をこの
明細書において両立性混合物と呼びそしてその各
構成分は互いに両立性であると呼ぶ。 本発明の加水分解組成物は以下の比較例２で用
いる試験により特徴づけられる。測定すべき本発
明の界面活性剤を正常人血清へ添加する。本発明
の酵素調製物試料を添加しそしてこの混合物を約
10分間37℃で培養する。次いでこの溶液0.1mlを
水で1.9mlまで希釈しそして10分間騰沸浴中に入
れた。コレステロールを以下に記載の周知のコレ
ステロールオキシダーゼ系により総体積1.2mlに
おいて定量する。同様の対照試験を酵素調製物の
み（界面活性剤なし）を用いて同時に行う。前記
試験を行う場合、酵素調製物以外のすべての混合
物成分を含むブランクを行うのが非常に望まし
く、その結果、コレステロール又はその他の血清
成分によるであろう反応はさし引くことができ
る。好ましい組成物は、10分未満の時間に有効コ
レステロールエステルの少くとも70％を加水分解
する組成物であり、そして非常に好ましい組成物
は実質的に完全に加水分解を行う、即ち約10分未
満の時間で入取可能なコレステロールエステルの
少くとも約90％を加水分解する組成物である。 この型の試験から、フエノキシポリエトキシエ
タノールが非常にすぐれた促進剤であることが見
い出された。商品名トライトンＸ―114、100、
102及びトライトンｎ―101でロームアンドハース
社により市販されている物質が特に好ましい。好
ましいアルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ルはオキシエチレン単位が約20未満のポリオキシ
エチレン鎖を含む。以下の例で示すように、前記
規定のアルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ル以外の同様な物質によつてはこの明細書に記載
の改善された加水分解は提供されない。アルキル
基の炭素数が８又は９である前記物質が非常に好
ましい。以下の例で示すように、前記先行技術の
界面活性剤は、測定下の酵素調製物と結合する
時、許容可能な程高い解離を示さない。このよう
な界面活性剤にはフランス国特許第2223696号及
び米国特許第3925164号記載のヒドロポリキシエ
トキシドデカンがある（有用な加水分解組成物を
表に示す）。 この明細書記載の方法に従つた加水分解に有用
な両立性混合物中の酵素調製物及び界面活性剤の
濃度は、たとえば、酵素調製物の純度、酵素調製
物の活性度、結合コレステロールエステルの性
質、使用する特定の界面活性剤等のような因子に
依存して大いに変化しうる。しかしながら一般
に、分析溶液の約0.25ないし約10重量％の界面活
性剤濃度が有用であり、そして約0.5ないし５重
量％の界面活性剤濃度が最適結果を与えることが
見い出された。酵素調製物濃度の有用な範囲も同
様に変化するが、市販調製物を用いる場合総分析
溶液の約10ないし80mg/mlの濃度が、非常に有用
であることが見い出された。そのような組成物の
最適化は当然当業者の問題である。 この明細書に記載の型の加水分解組成物を、先
行技術に記載の一層若しくは多層吸収剤又はその
他の分析要素（たとえば試験紙）に組み入れるこ
とが出来るし、しかも蛋白質結合コレステロール
エステルの検出又は測定に、前記要素においてこ
の明細書記載の組成物及び方法を用いることは本
発明の範囲内であることは明きらかであろう。 一つの好ましい態様に従つて、この明細書記載
の加水分解組成物を、たとえばベルギー国特許第
801742号及び米国特許第3992158号に記載の型の
多層分析要素の一又はそれ以上の層中に組み入れ
る。前記要素は液体の所定の被検物の存在を分析
することを目的としそしてそれらには好ましくは
非繊維性の拡散層が含まれる。この拡散層によ
り、適用試料中の分析活性成分の、試薬層に対す
る見掛上の均一濃度が生成される。前記試薬層に
は、検出可能な生成物又は検出可能な変化を生成
する、被検物の存在下で相互作用のある少くとも
ある物質が含まれる。これらの層は使用条件下で
流体接触する。 この明細書において分析要素の層間の流体接触
を参照することにより、流体が液体であつても気
体であつてもそのような要素の拡散層と試薬層と
の間の重なり領域を通過する能力が意味される。 別の言い方では流体接触とは、流体の成分が流
体接触している層間を通過する能力を意味する。
流体接触している層は接触可能であるけれども、
それらは間にはさまれている層によつて分離する
こともできる。しかしながら相互に流体接触して
いる拡散層と試薬層との間に物理的にはさまれて
いる。要素中の層は流体接触している拡散層と試
薬層との間の流体の通過を妨げない。 層間の流体接触は、流体通過の為にもともと接
触しているか又は有効に接触している層を有する
要素を製造することにより可能ならしめることが
できる。亦た、最初接触しておらずそして更にた
とえば米国特許第3511608号に記載のようなさし
込み又は弾性のある吸収性物質、又は米国特許第
3917453号及び第3933594号記載のような変形性支
持体を用いることによつて、離れて位置させるこ
とが可能な層を有する要素を製造することも適当
であろう。要素が最初接触していない層を有する
場合、圧縮力を適用するか又は別のやり方で要素
の層をその使用時に流体接触させて分析結果を得
ることが必要であることが理解されよう。 そのような要素の非常に好ましい態様に従つ
て、この明細書の記載の加水分解組成物を拡散層
中へ組み入れそしてコレステロール検出用の過酸
化水素に感受性のある指示組成物及びコレステロ
ールオキシダーゼのような検出系を試薬層に含め
る。 標準操作及び例に関する以下の記載により更に
本発明の有用な範囲が示される。 標準操作 総血清コレステロールの定量 コレステロールを先ず加水分解してコレステロ
ールを遊離する。総体積８ml中に含まれる培養混
合物は、コレステロールオキシダーゼ（N.コレ
ステロリウム）2.4単位、４―アミノアンチピレ
ン・HCl0.768mg、1.7―ジヒドロキシナフタリン
0.256mg、パーオキシダーゼ0.22mg（プロプロガ
リン単位125／mg）、未精製リパーゼ調製物6.4mg
及びブロテアーゼ0.48mg（B.サブチルス（シグマ
社タイプV11））又はオクチルフエノキシポリエ
トキシエタノール（トライトンＸ―100）160mgで
ある。培養混合物を37℃で５分間平衡化しそして
人間の血清20μを添加することにより反応を開
始した。10分後に490nmにおける吸収を測定し
た。ブランクには血清以外のすべての成分が含ま
れていた。血清基質のかわりにフアームコ
（Fermco）試験水性コレステロール標準（イリノ
イ州シカゴのフアームコ研究所により得られる）
を用いることによつて作製した標準曲線から総コ
レステロールが得られた。 参照方法はリーベルマン―バーチヤード法であ
りこれは、ハウクのフジオロジカルケミストリ
ー、B.L.オサー（Oser）（編集者）、第14版、マ
ツクグロウ―ヒル―ヒルブツク社、ニユーヨー
ク、1964（1965）に記載されている。この方法に
は定量前のコレステロール及びコレステロールエ
ステルの抽出工程が含まれる。 例 １ 界面活性剤アルキルフエノキシポリエトキシエ
タノールの存在下における血清コレステロール
エステルの酵素触媒加水分解 人間の血清（20μ）を緩衝試薬（37℃におい
て平衡）８mlを添加した。この試薬には酵素調製
物とプロテアーゼ又は酵素調製物と界面活性剤が
含まれておりコレステロールエステルの加水分解
を引き起こした。10分後に490nmにおける吸収を
測定し、前述のごとく総血清コレステロールを求
めた。 血清コレステロールをコレステロールオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ系を用いて定量した。こ
の系では先ずコレステロールエステルが加水分解
されてコレステロールを遊離し、次いでこれは酸
化されてコレスタンになり同時にH2O2を生成す
る。次いでH2O2はパーオキシダーゼ反応により
染料生成に関与し、染料を生成するプロテアーゼ
が培養混合物へ添加される場合、未精製リパーゼ
調製物により血清コレステロールエステルの加水
分解が触媒される。表のデータにより、Ｓ−１
（エトキシ単位約10を有し親水性―親油性バラン
ス（HLB）13.5のオクチルフエノキシポリエトキ
シエタノール）の存在下でコレステロールエステ
ルの完全な加水分解が見られることが示される。
この界面活性剤は有効にプロテアーゼ代わりとな
ることが出来かくして(1)コレステロール検出系の
蛋白質成分の不望の加水分解か又は(2)この系の不
望のPH変化をおこしうる外生の蛋白質（プロテア
ーゼ）の必要性を排除した。加水分解系としてＳ
―１とリパーゼ調製物とを用いた血清コレステロ
ールの定量により得られた結果は対照方法による
結果と非常によく適合した。（表参照）。
いて、最初の段階はコレステロールエステルを加
水分解してコレステロールを遊離することであ
る。 コレステロールエステル加水分解の慣用方法に
は、強塩基（KOH、NaOH等）が用いられるか
又は使用が簡単かつ選択的であるのでヒドロラー
ゼ酵素（即ちコレステロールエステラーゼ）が用
いられる。腐食性物質の取り扱いは不便であるか
又は不望である場合がありそして以下の先行技術
文献に関連して記載するように、酵素的方法は遊
離の（蛋白質へ結合していない）コレステロール
エステルの加水分解に有用でありうるのが、蛋白
質結合コレステロールエステルを処理するのに用
いる時酵素的方法は有効でないか又は長時間を要
する。エステル―蛋白質結合は明きらかにエステ
ラーゼの作用を阻害するので、酵素をエステルに
作用させる前に蛋白質―エステルコンプレツクス
を破壊する何らかの手段が必要である。 グツドヒユー等による米国特許第3869349号
（1975年３月４日公告）には、コレステロールエ
ステラーゼ活性を示すリパーゼ調製物とプロテア
ーゼとを含む組成物の使用に関する記載がある。
この特許には、界面活性剤がプロテアーゼの換わ
りとなりうるということに関しいかなる記載もな
い。 ビユーコロ等による米国特許第3703591号に
は、リパーゼとプロテアーゼとを組み合せて用い
て、血清（即ち蛋白質結合）トリグリセリドの加
水分解を行うことについて記載されている。しか
しながら界面活性剤を、コレステロールエステル
の加水分解においてプロテアーゼと共にか又はそ
の代替物として使用することに関するいかなる記
載もない。 ストーク等による米国特許第3759793号には、
ビユーコロにより提唱されたリパーゼと明きらか
に等しい、リゾプスアリザス（Phizopus
arrhizus）からのリパーゼを用いた血清トリグリ
セライドの加水分解について記載されている。し
かしながらこの場合はプロテアーゼを必要としな
い。この明きらかな変則の理由は明確でない。し
かしながら同一譲受け人の英国特許第1395126号
において見られるようにストーク等の加水分解方
法は非常に遅いことに注目されたい。この英国特
許には、前記リゾプスアリザスリパーゼを用いた
トリグリセリド加水分解の改良方法が記載されて
おり、この方法はトリグリセリドとリパーゼを、
カルボキシルエステラーゼ及びアルカリ金属硫酸
アルキル又はアルカリ土類金属硫酸アルキル（ア
ルキル基の炭素数10ないし15）の存在下において
緩衡液中で接触させる工程を含む。好ましい硫酸
アルキルはナトリウムドデシルスルフエートであ
る。しかしながらカルボキシルエステラーゼの不
存在下で、界面活性剤のみを用いることにより、
トリグリセリドのヒドロラーゼ活性が強められる
ことについてのいかなる記載もない。 「ヘレニウス、アリ及びシモンズ、カイによる
Biochemistry第10巻第13号1971年」には、人間
の血漿を高濃度の天然及び合成の界面活性剤で処
理する工程を含む、人間の血漿の低濃度リポ蛋白
質からすべての主な脂質を除去する方法が記載さ
れている。脂質除去は、人間の血漿の低濃度リポ
蛋白質の脂質を含まぬ蛋白質部分を特徴づける目
的で適用される。この文献には、迅速かつ正確な
加水分解法及び安定な分析組成物を提供すること
により血清のコレステロール含量の分析を簡単に
するであろう有用な分析手段が界面活性剤とリパ
ーゼとの組み合せにより得られるであろうことに
ついていかなる記載もない。 米国特許第3689364号（1972年９月５日公告）
には、リパーゼの基質として“遊離の”トリグリ
セリド乳剤を用いた、血清のような体液中に含ま
れるリパーゼの分析について記載されている。
“遊離”のトリグリセリド（即ち蛋白質へ結合し
ていないトリグリセリド）である基質乳剤を安定
化する胆汁塩は、同時に分析下のリパーゼ（それ
が膵臓リパーゼである場合に）に促進効果を及ぼ
す。この促進効果は明きらかに、基質乳剤である
遊離のトリグリセリド上のリパーゼの加水分解活
性の増大をもたらす。この特許には、前記胆汁塩
は血清において見られるように、それが蛋白質へ
結合したリパーゼと接触する場合にリパーゼ調製
物に何らかの作用を及ぼすことについていかなる
記載もない。詳しくは前記リパーゼが蛋白質結合
コレステロールエステルを加水分解しうるという
ことについていかなる記載もない。 コマツによる米国特許第3898130号、1975年８
月５日公告には、微生物リパーゼ（特にカンジタ
（Candida）リパーゼ（Sic））、膵臓リパーゼ並び
にナトリウムタウロデオキシコレート、タウロコ
レート、タウロチエノデオキシコレート及びタウ
ロデヒドロコレートから成る群から胆汁塩の混合
物を有する組成物とトリグリセリドとを接触させ
る工程を含むトリグリセリド加水分解法が記載さ
れている。微生物リパーゼ酵素及び膵臓リパーゼ
酵素は加水分解組成物の必須成分である。 ドイツ国公開公報第2522432号（1975年12月４
日刊行）には、シユードマナスフルオレスセンス
（Pseudomonas fluorescens）からのコレステロ
ールエステラーゼを用いたコレステロールエステ
ルを加水分解する為の酵素的方法が記載されてい
る。しかしながらこれには、蛋白質結合コレステ
ロールエステルの加水分解を行うのに界面活性剤
を用いる事又はその必要性に関するいかなる記載
もない。 フランス国特許第2223696号及び米国特許第
3925164号（1975年12月９日公告）には、界面活
性剤の存在下でカンジダルーゴサ（Candida
rugosa）、リゾプス又はアスペルギルスからの酵
素調製物によりコレステロールエステルを加水分
解することによる血清の総コレステロール分析が
記載されている。唯一の提唱界面活性剤はヒドロ
キシポリエトキシドデカンである。以下の例で示
すように、そのような界面活性剤は、コレステロ
ールエステルヒドロラーゼ活性を阻害する場合が
あるのでこの明細書に記載されている物質程有効
でない。 ドイツ国公開公報第2509156号（1975年９月23
日刊行）にはコレステロールエステル加水分解剤
として、コレステロールエステラーゼ及び／没食
子酸又はその塩を用いる総コレステロール分析の
酵素的方法が記載されている。コレステロールエ
ステラーゼはノカルジアレストリクタス
（Nocardia restrictus）から採取したＥ
（3.1.1.13）として同定されている。この文献には
この明細書記載の合成界面活性剤がコレステロー
ルエステラーゼの有用な促進剤であるといういか
なる記載もない。 ベルギー国特許第811728号は、(1)コレステロー
ルエステル加水分解活性を有する化学系とコレス
テロールオキシダーゼ活性を有する化学系との混
合物と(2)過酸化水素又はΔ４―コレステン―３―
オンの測定手段とを含む、生物学的流体試料中の
総コレステロール測定用試験組成物に関する。遊
離のコレステロールは水溶液のような流体にほん
のわずかしか溶けないので、流体試験中に存在す
る実質的にすべての遊離のコレステロールを可溶
化しうる界面活性剤をこの試験組成物に含めるこ
とが好ましいとこの明細書に記載されている。し
かしながらこの明細書には更に、コレステロール
エステルヒドロラーゼは胆汁からの酵素助因子を
必要とし、しかもコレステロールエステルヒドロ
ラーゼ及び胆汁からのその助因子がそれ故前記組
成物に含まれる場合は界面活性剤の使用は望まし
くないと言つている。 更に本発明の実施に必要な特殊なタイプの界面
活性剤に関する開示はこのベルギー国特許のどこ
にもみあたらない。 コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を有
するリパーゼ調製物と、その酵素活性を阻害しな
いオキシエチレン単位が約20未満のポリオキシエ
チレン鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシ
エタノールとの混合物を蛋白質結合コレステロー
ルエステルと接触させることにより、蛋白質結合
コレステロールエステルを約10分未満（好ましく
は約５分で）のオーダーの比較的短時間で加水分
解しうることが見い出された。 この明細書に記載の方法及び組成物によりコレ
ステロールエステル加水分解薬剤として先行技術
方法により可能であつたよりもずつと広範囲の酵
素調製物の使用が可能になる。かくして安価な物
質を用いて先行技術の方法及び物質を用いた場合
に少くとも等しいかそれ以上である反応完了まで
の反応時間及び反応完了時の状態を実現すること
が出来る。 前述のごとく、遊離のコレステロールエステル
の加水分解を触媒する酵素調製物がある。しかし
ながらそのような物質を用いても、血清中で見ら
れるような蛋白質へ結合したコレステロールエス
テルの加水分解は非常に低速でか又は不完全な様
式でしか触媒されない。これは明きらかに、酵素
の通常の様式での加水分解触媒機能を阻害する蛋
白質―脂質コンプレツクスの影響である。先行技
術では促進剤（即ち蛋白質結合コレステロールエ
ステルがリパーゼによつて加水分解されうる速度
を増大させる薬剤）と呼ばれることのあるものの
使用が提唱されている。そのような薬剤が作用す
る機構は解明されていないけれども、それらによ
つてある様式でエステル―蛋白質コンプレツクス
が破壊されてエステルが遊離し、慣用手段による
加水分解に供することが理論づけられている。た
とえばプロテアーゼ酵素がこの目的に適うものと
して提唱された。 本発明者等は、ある界面活性剤は促進剤であり
そしてそれらをプロテアーゼの代替物として用い
て、（蛋白質結合コレステロールエステルの加水
分解剤として）通常、蛋白質結合コレステロール
エステルの加水分解を触媒不可能であるか又はで
きたとしても非常に不望の低速でしか行えない酵
素調製物を有用なものとできることを見い出し
た。その上プロテアーゼは、ベルギー国特許第
801742号記載のような、被検物検出用の多層要素
に用いられるゼラチンのような蛋白質含有バイン
ダを分解する傾向があるので、この明細書に記載
の組成物は前記のような要素に特に有用である。 従つて本発明の新規な加水分解組成物は、コレ
ステロールエステラーゼ活性を示す酵素調製物
と、促進剤としてその酵素活性を阻害しないオキ
シエチレン単位が約20未満のポリオキシエチレン
鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシエタノ
ールとの混合物とを含む。 この明細書に記載の方法及び組成物に潜在的に
有用な酵素調製物は遊離の（蛋白質に結合してい
ない）コレステロールエステルヒドロラーゼ活性
を示すものである。そのような活性を示すリパー
ゼ調製物は特に好ましい。 酵素、詳しくはリパーゼ調製物のコレステロー
ルエステルヒドロラーゼ（エステラーゼ）活性を
測定するに有用なスクリーニング方法は、一定量
の酵素調製物をPH7.0の標準コレステリルリノリ
エート溶液へ添加し、37℃においてN2雰囲気下
で２時間培養しそしてJ.Vonhoeffmyv及びR.
Friedによる「Z.Klin.Chem.U.Klin.Biochem.
８、134（1970）」に記載のヒドロキシルアミン法
により溶液中に残つたエステル量を測定する工程
を含む。この方法により、スクリーニング操作に
おいて約25mg/dlを越えるコレステロールを放出
するコレステロールエステラーゼ活性を示す調製
物が、本発明の実施における有用な候補と考える
べきである。 コレステロールエステル加水分解に有用な酵素
調製物を植物源又は動物源から採取できるが、本
発明者等は、未精製か又は精製したカンジダルー
ゴサ、クロモバクテリウムビイスコサム
（Chromobacterium viscosum）、パラリポリテイ
クム（Paralipolyticum）変種からのような微生
物源からの調製物を好む。その他の有用な酵素調
製物及びそれを製造する方法は以下の米国特許に
記載されている。グランデルによる第2888385
号、1959年５月26日公告；メルサー等による第
3168448号、1965年２月２日公告；ヤマダ等によ
る第3189529号、1965年６月15日公告；フクモト
等による第3262863号、1966年７月26日公告；及
びマウベルナイ等による第3513073号、1970年５
月19日公告。 好ましい市販の酵素調製物には、インジアナ州
エルクハールトのマイルス研究所から得られる小
麦胚種リパーゼ、ウイルソン研究所から得られる
リパーゼ3000（膵臓酵素）、シグ又研究所から得
られるステアプシン（膵臓リパーゼ）及びエンザ
イムデイベロツプ社から得られるリパーゼＭ（カ
ンジダル―ゴザから採取）がある。 ある界面活性剤は、ある酵素調製物のコレステ
ロールエステラーゼ活性を阻害する。従つて、こ
の明細書に記載のごとく使用する界面活性剤と酵
素調製物とを組み合せる試みを行う前に、組成物
の二つの構成分である界面活性及び酵素調製物に
関し、この界面活性剤が酵素調製物を阻害しない
かを測定する。そのような測定は好ましくは以下
に記載の試験により行う。この試験に首尾よく適
合する界面活性剤と酵素調製物との混合物をこの
明細書において両立性混合物と呼びそしてその各
構成分は互いに両立性であると呼ぶ。 本発明の加水分解組成物は以下の比較例２で用
いる試験により特徴づけられる。測定すべき本発
明の界面活性剤を正常人血清へ添加する。本発明
の酵素調製物試料を添加しそしてこの混合物を約
10分間37℃で培養する。次いでこの溶液0.1mlを
水で1.9mlまで希釈しそして10分間騰沸浴中に入
れた。コレステロールを以下に記載の周知のコレ
ステロールオキシダーゼ系により総体積1.2mlに
おいて定量する。同様の対照試験を酵素調製物の
み（界面活性剤なし）を用いて同時に行う。前記
試験を行う場合、酵素調製物以外のすべての混合
物成分を含むブランクを行うのが非常に望まし
く、その結果、コレステロール又はその他の血清
成分によるであろう反応はさし引くことができ
る。好ましい組成物は、10分未満の時間に有効コ
レステロールエステルの少くとも70％を加水分解
する組成物であり、そして非常に好ましい組成物
は実質的に完全に加水分解を行う、即ち約10分未
満の時間で入取可能なコレステロールエステルの
少くとも約90％を加水分解する組成物である。 この型の試験から、フエノキシポリエトキシエ
タノールが非常にすぐれた促進剤であることが見
い出された。商品名トライトンＸ―114、100、
102及びトライトンｎ―101でロームアンドハース
社により市販されている物質が特に好ましい。好
ましいアルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ルはオキシエチレン単位が約20未満のポリオキシ
エチレン鎖を含む。以下の例で示すように、前記
規定のアルキルフエノキシポリエトキシエタノー
ル以外の同様な物質によつてはこの明細書に記載
の改善された加水分解は提供されない。アルキル
基の炭素数が８又は９である前記物質が非常に好
ましい。以下の例で示すように、前記先行技術の
界面活性剤は、測定下の酵素調製物と結合する
時、許容可能な程高い解離を示さない。このよう
な界面活性剤にはフランス国特許第2223696号及
び米国特許第3925164号記載のヒドロポリキシエ
トキシドデカンがある（有用な加水分解組成物を
表に示す）。 この明細書記載の方法に従つた加水分解に有用
な両立性混合物中の酵素調製物及び界面活性剤の
濃度は、たとえば、酵素調製物の純度、酵素調製
物の活性度、結合コレステロールエステルの性
質、使用する特定の界面活性剤等のような因子に
依存して大いに変化しうる。しかしながら一般
に、分析溶液の約0.25ないし約10重量％の界面活
性剤濃度が有用であり、そして約0.5ないし５重
量％の界面活性剤濃度が最適結果を与えることが
見い出された。酵素調製物濃度の有用な範囲も同
様に変化するが、市販調製物を用いる場合総分析
溶液の約10ないし80mg/mlの濃度が、非常に有用
であることが見い出された。そのような組成物の
最適化は当然当業者の問題である。 この明細書に記載の型の加水分解組成物を、先
行技術に記載の一層若しくは多層吸収剤又はその
他の分析要素（たとえば試験紙）に組み入れるこ
とが出来るし、しかも蛋白質結合コレステロール
エステルの検出又は測定に、前記要素においてこ
の明細書記載の組成物及び方法を用いることは本
発明の範囲内であることは明きらかであろう。 一つの好ましい態様に従つて、この明細書記載
の加水分解組成物を、たとえばベルギー国特許第
801742号及び米国特許第3992158号に記載の型の
多層分析要素の一又はそれ以上の層中に組み入れ
る。前記要素は液体の所定の被検物の存在を分析
することを目的としそしてそれらには好ましくは
非繊維性の拡散層が含まれる。この拡散層によ
り、適用試料中の分析活性成分の、試薬層に対す
る見掛上の均一濃度が生成される。前記試薬層に
は、検出可能な生成物又は検出可能な変化を生成
する、被検物の存在下で相互作用のある少くとも
ある物質が含まれる。これらの層は使用条件下で
流体接触する。 この明細書において分析要素の層間の流体接触
を参照することにより、流体が液体であつても気
体であつてもそのような要素の拡散層と試薬層と
の間の重なり領域を通過する能力が意味される。 別の言い方では流体接触とは、流体の成分が流
体接触している層間を通過する能力を意味する。
流体接触している層は接触可能であるけれども、
それらは間にはさまれている層によつて分離する
こともできる。しかしながら相互に流体接触して
いる拡散層と試薬層との間に物理的にはさまれて
いる。要素中の層は流体接触している拡散層と試
薬層との間の流体の通過を妨げない。 層間の流体接触は、流体通過の為にもともと接
触しているか又は有効に接触している層を有する
要素を製造することにより可能ならしめることが
できる。亦た、最初接触しておらずそして更にた
とえば米国特許第3511608号に記載のようなさし
込み又は弾性のある吸収性物質、又は米国特許第
3917453号及び第3933594号記載のような変形性支
持体を用いることによつて、離れて位置させるこ
とが可能な層を有する要素を製造することも適当
であろう。要素が最初接触していない層を有する
場合、圧縮力を適用するか又は別のやり方で要素
の層をその使用時に流体接触させて分析結果を得
ることが必要であることが理解されよう。 そのような要素の非常に好ましい態様に従つ
て、この明細書の記載の加水分解組成物を拡散層
中へ組み入れそしてコレステロール検出用の過酸
化水素に感受性のある指示組成物及びコレステロ
ールオキシダーゼのような検出系を試薬層に含め
る。 標準操作及び例に関する以下の記載により更に
本発明の有用な範囲が示される。 標準操作 総血清コレステロールの定量 コレステロールを先ず加水分解してコレステロ
ールを遊離する。総体積８ml中に含まれる培養混
合物は、コレステロールオキシダーゼ（N.コレ
ステロリウム）2.4単位、４―アミノアンチピレ
ン・HCl0.768mg、1.7―ジヒドロキシナフタリン
0.256mg、パーオキシダーゼ0.22mg（プロプロガ
リン単位125／mg）、未精製リパーゼ調製物6.4mg
及びブロテアーゼ0.48mg（B.サブチルス（シグマ
社タイプV11））又はオクチルフエノキシポリエ
トキシエタノール（トライトンＸ―100）160mgで
ある。培養混合物を37℃で５分間平衡化しそして
人間の血清20μを添加することにより反応を開
始した。10分後に490nmにおける吸収を測定し
た。ブランクには血清以外のすべての成分が含ま
れていた。血清基質のかわりにフアームコ
（Fermco）試験水性コレステロール標準（イリノ
イ州シカゴのフアームコ研究所により得られる）
を用いることによつて作製した標準曲線から総コ
レステロールが得られた。 参照方法はリーベルマン―バーチヤード法であ
りこれは、ハウクのフジオロジカルケミストリ
ー、B.L.オサー（Oser）（編集者）、第14版、マ
ツクグロウ―ヒル―ヒルブツク社、ニユーヨー
ク、1964（1965）に記載されている。この方法に
は定量前のコレステロール及びコレステロールエ
ステルの抽出工程が含まれる。 例 １ 界面活性剤アルキルフエノキシポリエトキシエ
タノールの存在下における血清コレステロール
エステルの酵素触媒加水分解 人間の血清（20μ）を緩衝試薬（37℃におい
て平衡）８mlを添加した。この試薬には酵素調製
物とプロテアーゼ又は酵素調製物と界面活性剤が
含まれておりコレステロールエステルの加水分解
を引き起こした。10分後に490nmにおける吸収を
測定し、前述のごとく総血清コレステロールを求
めた。 血清コレステロールをコレステロールオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ系を用いて定量した。こ
の系では先ずコレステロールエステルが加水分解
されてコレステロールを遊離し、次いでこれは酸
化されてコレスタンになり同時にH2O2を生成す
る。次いでH2O2はパーオキシダーゼ反応により
染料生成に関与し、染料を生成するプロテアーゼ
が培養混合物へ添加される場合、未精製リパーゼ
調製物により血清コレステロールエステルの加水
分解が触媒される。表のデータにより、Ｓ−１
（エトキシ単位約10を有し親水性―親油性バラン
ス（HLB）13.5のオクチルフエノキシポリエトキ
シエタノール）の存在下でコレステロールエステ
ルの完全な加水分解が見られることが示される。
この界面活性剤は有効にプロテアーゼ代わりとな
ることが出来かくして(1)コレステロール検出系の
蛋白質成分の不望の加水分解か又は(2)この系の不
望のPH変化をおこしうる外生の蛋白質（プロテア
ーゼ）の必要性を排除した。加水分解系としてＳ
―１とリパーゼ調製物とを用いた血清コレステロ
ールの定量により得られた結果は対照方法による
結果と非常によく適合した。（表参照）。
【表】
Ｓ―１濃度が２％の場合に完全な加水分解が得
られ、この界面活性剤は、４％もの濃度において
有害効果をもたらさなかつた。最終色濃度は10分
後に測定したけれども、反応は37℃においてたつ
た５分の短時間で本質的に完了した。 比較例 １ 約20を越えるポリオキシエチレン鎖を有するア
ルキルフエノキシポリエトキシエタノールを用い
て前記例１に記載の試験を反復することにより、
この界面活性剤が酵素のコレステロールエステラ
ーゼ活性を何らかの形で阻害することを示す結果
が得られた。 比較例 ２ (a)カンジダールゴサからのコレステロールエス
テラーゼとフランス国特許第2223696号に記載の
界面活性剤及び(b)前記コレステロールエステラー
ゼとこの明細書に記載の代表的な界面活性剤との
直接的比較試験を行つた。 培養混合物を調製した。（総体積0.6ml） 0.5ml 正常な人間の血清 20mg コレステロールエステラーゼ（カンジダ
ルーゴサからの市販の調製物であるリ
パーＭ） ５マイクロモル リン酸カリウム緩衡液（PH
7.0） 10mg 促進剤 反応を37℃で10分間進行させ、次いでその0.1
mlを1.9mlの水へ添加しそして10分間沸騰水中に
入れた。次いで水性コレステロール標準を用いコ
レステロールオキシダーゼ―パーオキシダーゼ系
によりコレステロールを定量し標準曲線を作製し
た。これらの試験結果と次の表に示す。
られ、この界面活性剤は、４％もの濃度において
有害効果をもたらさなかつた。最終色濃度は10分
後に測定したけれども、反応は37℃においてたつ
た５分の短時間で本質的に完了した。 比較例 １ 約20を越えるポリオキシエチレン鎖を有するア
ルキルフエノキシポリエトキシエタノールを用い
て前記例１に記載の試験を反復することにより、
この界面活性剤が酵素のコレステロールエステラ
ーゼ活性を何らかの形で阻害することを示す結果
が得られた。 比較例 ２ (a)カンジダールゴサからのコレステロールエス
テラーゼとフランス国特許第2223696号に記載の
界面活性剤及び(b)前記コレステロールエステラー
ゼとこの明細書に記載の代表的な界面活性剤との
直接的比較試験を行つた。 培養混合物を調製した。（総体積0.6ml） 0.5ml 正常な人間の血清 20mg コレステロールエステラーゼ（カンジダ
ルーゴサからの市販の調製物であるリ
パーＭ） ５マイクロモル リン酸カリウム緩衡液（PH
7.0） 10mg 促進剤 反応を37℃で10分間進行させ、次いでその0.1
mlを1.9mlの水へ添加しそして10分間沸騰水中に
入れた。次いで水性コレステロール標準を用いコ
レステロールオキシダーゼ―パーオキシダーゼ系
によりコレステロールを定量し標準曲線を作製し
た。これらの試験結果と次の表に示す。
【表】
【表】
前表から、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル（即ちフランス国特許第2223696号のドデカン
材）は、本発明に従つた促進剤として有用でない
ことは明きらかである。
ル（即ちフランス国特許第2223696号のドデカン
材）は、本発明に従つた促進剤として有用でない
ことは明きらかである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を
有する酵素調製物と、その酵素活性を阻害しない
オキシエチレン単位が約20未満のポリオキシエチ
レン鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシエ
タノールとの混合物を水性媒質中で蛋白質結合コ
レステロールエステルと接触させることを特徴と
する蛋白質結合コレステロールエステルの加水分
解法。 ２ コレステロールエステルヒドロラーゼ活性を
有する酵素調製物と、その酵素活性を阻害しない
オキシエチレン単位が約20未満のポリオキシエチ
レン鎖を含むアルキルフエノキシポリエトキシエ
タノールとの混合物を特徴とする蛋白質結合コレ
ステロールエステル加水分解用組成物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76516877A | 1977-02-03 | 1977-02-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5396378A JPS5396378A (en) | 1978-08-23 |
| JPS6237957B2 true JPS6237957B2 (ja) | 1987-08-14 |
Family
ID=25072829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP995878A Granted JPS5396378A (en) | 1977-02-03 | 1978-02-02 | Hydrolysis of cholesterol binding protein |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5396378A (ja) |
| BE (1) | BE863657A (ja) |
| CA (1) | CA1104041A (ja) |
| DE (1) | DE2804356C2 (ja) |
| FR (1) | FR2379815A1 (ja) |
| GB (1) | GB1592632A (ja) |
| SE (2) | SE468093B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0416388Y2 (ja) * | 1987-03-07 | 1992-04-13 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3208253A1 (de) * | 1982-03-08 | 1983-09-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen bestimmung des cholesterins der ldl-fraktion im serum |
| IT1177513B (it) * | 1984-01-27 | 1987-08-26 | Menarini Sas | Reattivo liquido pronto per l'uso per la determinazione del contenuto di glucosio nel sangue |
| GB2154735B (en) * | 1984-01-27 | 1987-07-15 | Menarini Sas | Reagent for determining blood glucose content |
| EP0218083A1 (en) * | 1985-09-03 | 1987-04-15 | Abbott Laboratories | Stabilized cholesterol reagent and method for determining total cholesterol using the reagent |
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| JPS5027593A (ja) * | 1974-03-28 | 1975-03-20 | ||
| JPS50137193A (ja) * | 1974-03-25 | 1975-10-31 | ||
| JPS526593A (en) * | 1975-07-03 | 1977-01-19 | Nagase Sangyo Kk | Method of measuring cholesterol with use of cholesterol esterase |
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| DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
| US4164448A (en) * | 1973-12-07 | 1979-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Activation of cholesterol oxidase for cholesterol assay |
| DE2361169C3 (de) * | 1973-12-07 | 1978-09-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Aktivierung von von Detengensspuren befreiter Cholesterinoxydase |
| GB1479994A (en) * | 1974-03-04 | 1977-07-13 | Abbott Lab | Single reagent for the enzymatic determination of cholesterol and method therefor |
-
1978
- 1978-01-09 CA CA294,608A patent/CA1104041A/en not_active Expired
- 1978-02-02 DE DE2804356A patent/DE2804356C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1978-02-02 GB GB4302/78A patent/GB1592632A/en not_active Expired
- 1978-02-02 SE SE7801248A patent/SE468093B/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-02-02 JP JP995878A patent/JPS5396378A/ja active Granted
- 1978-02-03 FR FR7803002A patent/FR2379815A1/fr active Granted
- 1978-02-03 BE BE184909A patent/BE863657A/xx not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-06-10 SE SE8303292A patent/SE462047B/sv not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS4844480A (ja) * | 1971-09-22 | 1973-06-26 | ||
| JPS50137193A (ja) * | 1974-03-25 | 1975-10-31 | ||
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| JPH0416388Y2 (ja) * | 1987-03-07 | 1992-04-13 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE468093B (sv) | 1992-11-02 |
| FR2379815A1 (fr) | 1978-09-01 |
| SE8303292L (sv) | 1983-06-10 |
| JPS5396378A (en) | 1978-08-23 |
| CA1104041A (en) | 1981-06-30 |
| FR2379815B1 (ja) | 1982-01-08 |
| GB1592632A (en) | 1981-07-08 |
| SE8303292D0 (sv) | 1983-06-10 |
| BE863657A (fr) | 1978-08-03 |
| DE2804356A1 (de) | 1978-08-10 |
| SE462047B (sv) | 1990-04-30 |
| SE7801248L (sv) | 1978-08-04 |
| DE2804356C2 (de) | 1995-07-13 |
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