JPS6019719A - 抗腫瘍活性を有する蛋白質 - Google Patents
抗腫瘍活性を有する蛋白質Info
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- JPS6019719A JPS6019719A JP58127779A JP12777983A JPS6019719A JP S6019719 A JPS6019719 A JP S6019719A JP 58127779 A JP58127779 A JP 58127779A JP 12777983 A JP12777983 A JP 12777983A JP S6019719 A JPS6019719 A JP S6019719A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗腫瘍活性を有する新規生理活性物質に関す
るものである。
るものである。
本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ ）で採用された略記
法により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければ５体を示すものとする。
ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ ）で採用された略記
法により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければ５体を示すものとする。
Ａｌａ ：アラ二ン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｇｉｎ ：グルタミン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ｇｌｙ ニゲリシン
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｌｙｓ ：リジン
Ｐｒｏ ニブロリン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｖａｌ：バリン
網内系賦活化作用を有する種々の物質、例えば、各種ダ
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗肺瘍細
胞能カなどの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばＣａｒｓｗｅＨらは、ＣＤ Ｉ ５ｗ
１ｓｓ マウスにＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ
−Ｇｕｄｒｉｎ （ＢＣＧ）’ｉ投与し、その２週間後
にエンドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの
血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有すること−
およびＭｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａで担癌させ；ｌ’
ｔ（ＢＡＬＢ／ｃＸＣ５７ＢＬ／６）Ｆｌ マ’ｙ ス
（Ｄｉ瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、ＴＮ
Ｆ （Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｔｏｒ ）と
名づけた（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ７２巻（屋９ ） ３６６６〜３６７ｏ頁（
１９７５年）〕。
ラム陽性菌やエンドトキシンにより誘導され、抗肺瘍細
胞能カなどの生理活性を有する物質の存在は多数報告さ
れている。例えばＣａｒｓｗｅＨらは、ＣＤ Ｉ ５ｗ
１ｓｓ マウスにＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ
−Ｇｕｄｒｉｎ （ＢＣＧ）’ｉ投与し、その２週間後
にエンドトキシンを静脈内注射して得られる該マウスの
血清が、培養し細胞に対して殺細胞作用を有すること−
およびＭｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａで担癌させ；ｌ’
ｔ（ＢＡＬＢ／ｃＸＣ５７ＢＬ／６）Ｆｌ マ’ｙ ス
（Ｄｉ瘍を出血性壊死に至らしめる現象を見出し、ＴＮ
Ｆ （Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｔｏｒ ）と
名づけた（ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ７２巻（屋９ ） ３６６６〜３６７ｏ頁（
１９７５年）〕。
その後、Ｒｕｆｆら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、 １２５
巻（Ａ４）１６７１〜１６７７頁（１９８０年）〕およ
びＭａ ｔ ｔｈｅｗｓら［Ｂｒ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
４２巻４１６〜４２２頁（１９８０年）〕は、前記Ｃ
ａｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製したウサギ血清か
らＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２
０００倍および約１０００倍精製されたもの全書ている
。しかし、いずれの場合にも精製されたものに関しては
動物実験において抗腫瘍効果を確認していない。
巻（Ａ４）１６７１〜１６７７頁（１９８０年）〕およ
びＭａ ｔ ｔｈｅｗｓら［Ｂｒ、Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ
４２巻４１６〜４２２頁（１９８０年）〕は、前記Ｃ
ａｒｓｗｅｌｌらの方法に準じて調製したウサギ血清か
らＴＮＦの精製を試みて、それぞれ原血清に比べて約２
０００倍および約１０００倍精製されたもの全書ている
。しかし、いずれの場合にも精製されたものに関しては
動物実験において抗腫瘍効果を確認していない。
特開昭５７−１４０７２５号は、網内系賦活化作用を有
する物質の１種または２種以上全哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与］〜、次いでグラム隘性菌
由来のエンドトキシン全注射することＫよって、または
哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系
にグラム隘性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
って誘発される、制癌作用全有する蛋白性生理活性物質
を単離精製した、と開示している。史に、その物質の分
子量は、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で４ｄ ３９，０００±５，０００、等
電点はｐＨ３，９±０．６（等電点電気泳動法）である
、と開示している。
する物質の１種または２種以上全哺乳動物（マウス、ウ
サギ、モルモット等）に投与］〜、次いでグラム隘性菌
由来のエンドトキシン全注射することＫよって、または
哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む組織培養系
にグラム隘性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
って誘発される、制癌作用全有する蛋白性生理活性物質
を単離精製した、と開示している。史に、その物質の分
子量は、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で４ｄ ３９，０００±５，０００、等
電点はｐＨ３，９±０．６（等電点電気泳動法）である
、と開示している。
上記物質の制癌作用は極めて優れたものであるが、それ
全単離精製するためＫは、粗製溶液を煩雑な精製工程に
付さなければならないうえ、その活性回収率が低い、と
いう欠点を有する。
全単離精製するためＫは、粗製溶液を煩雑な精製工程に
付さなければならないうえ、その活性回収率が低い、と
いう欠点を有する。
本発明者らは、本明細書中に記載の方法によシ調製した
ウサギ血清から上記物質を収率良く得る精製法について
鋭意研究を続けていたが、その過程で、特開昭５７−１
４０７２５号の精製法とは異なる精製性全採用すること
により、意外にも上記物質とは異なる、優れた抗腫瘍活
性を有する新規蛋白質が収率良く（すなわち全工程を通
じての回収率が約５０〜７０チ）得られることを見いだ
し、更に研究を続けた結果、本発明を完成するに至った
。
ウサギ血清から上記物質を収率良く得る精製法について
鋭意研究を続けていたが、その過程で、特開昭５７−１
４０７２５号の精製法とは異なる精製性全採用すること
により、意外にも上記物質とは異なる、優れた抗腫瘍活
性を有する新規蛋白質が収率良く（すなわち全工程を通
じての回収率が約５０〜７０チ）得られることを見いだ
し、更に研究を続けた結果、本発明を完成するに至った
。
本発明は、アミノ末端よりＳｅｒ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａｌ −Ｖａｌ −
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＸＩ−Ｌｅｕ −−−
−−−（但し、式中Ｘ１は１個のアミノ酸残基金示す。
ｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ −Ｖａｌ −Ｖａｌ −
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＸＩ−Ｌｅｕ −−−
−−−（但し、式中Ｘ１は１個のアミノ酸残基金示す。
）で表わされるアミノ酸配列構造金有するポリペプチド
のサブユニットからなる構造を有し、かつ下記特性を有
する蛋白−５＝ 質に関するものである。
のサブユニットからなる構造を有し、かつ下記特性を有
する蛋白−５＝ 質に関するものである。
ａ）分子量 ４０，０００±５，０００（ゲルｐ適法）
１７．５００±２，０００ （５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動法） ｂ）等電点 ５．０±０．３（等電点電気泳動法）Ｃ）
実験例３に記載のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活
性が５ Ｘ １０６〜Ｉ Ｘ １０？単位／η蛋白質 更に、本発明の物質は、実験例４に記載のＭｅｔｈＡ
ＳａｒＣＯｍａ担癌Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスを
用いる生物評価において、１匹当り３，０００〜５，０
００単位を静脈内に投与した場合の活性が（＋）以上で
ある。また、セルロースアセテート膜を用いる電気泳動
ではα−グロブリン領域に泳動され、各種レクチンカラ
ム（Ｃｏｎ Ａ−セファロース（ファルマシア社製）、
ＲＣＡ−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）、ＷＧ
Ａ−セファロース６ＭＢ （ファルマシアａ［）、ＵＥ
Ａ−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）、ＬＰＡ−
ゲル（Ｅ、Ｙ。ラボラトリ社製）〕に吸着しない性状を
有している。
１７．５００±２，０００ （５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動法） ｂ）等電点 ５．０±０．３（等電点電気泳動法）Ｃ）
実験例３に記載のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活
性が５ Ｘ １０６〜Ｉ Ｘ １０？単位／η蛋白質 更に、本発明の物質は、実験例４に記載のＭｅｔｈＡ
ＳａｒＣＯｍａ担癌Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ系マウスを
用いる生物評価において、１匹当り３，０００〜５，０
００単位を静脈内に投与した場合の活性が（＋）以上で
ある。また、セルロースアセテート膜を用いる電気泳動
ではα−グロブリン領域に泳動され、各種レクチンカラ
ム（Ｃｏｎ Ａ−セファロース（ファルマシア社製）、
ＲＣＡ−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）、ＷＧ
Ａ−セファロース６ＭＢ （ファルマシアａ［）、ＵＥ
Ａ−Ｉ−ゲル（Ｅ、Ｙ、ラボラトリ−社製）、ＬＰＡ−
ゲル（Ｅ、Ｙ。ラボラトリ社製）〕に吸着しない性状を
有している。
６−
本発明の新規生理活性物質の物性は、以下に記載する実
験例１〜８の各方法によって測定したものである。
験例１〜８の各方法によって測定したものである。
実験例
旬分子量測定法
Ａ）セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製スウェ
ーデン）のカラム（１，５Ｘ １００Ｃｒｎ）を用い、
０．１Ｍ塩化ナトリウム／ ５０ ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ）（７，４）にてゲル濾過全行った。分子量測定用標
準蛋白質（ファルマシア社製、リボヌクレアーゼＡ１キ
モトリプシノーゲンＡ１オプアルブミン、アルドラーゼ
）を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−Ｍ細胞を用いた
活性評価により分子量の測定をした。本発明になる生理
活性物質は、オブアルブミンとキモトリプシノーゲンＡ
の中間に溶出し、分子量Ｆｉ４０，０００±５，０００
であった。
ーデン）のカラム（１，５Ｘ １００Ｃｒｎ）を用い、
０．１Ｍ塩化ナトリウム／ ５０ ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ）（７，４）にてゲル濾過全行った。分子量測定用標
準蛋白質（ファルマシア社製、リボヌクレアーゼＡ１キ
モトリプシノーゲンＡ１オプアルブミン、アルドラーゼ
）を用いて分子量検量線を作成し、Ｌ−Ｍ細胞を用いた
活性評価により分子量の測定をした。本発明になる生理
活性物質は、オブアルブミンとキモトリプシノーゲンＡ
の中間に溶出し、分子量Ｆｉ４０，０００±５，０００
であった。
Ｂ） Ｓｅｇｒｅｓ ｔらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２８−３巻５４−６５頁（１９
７２年）〕に従い、トリス／グリシン／５ｎｓ（ｐＨｓ
、３）でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルに１０μ２の
試料を付与し、電気泳動を行った。標準分子量キット（
ファルマシア社製）′ｆ：用いて分子量検量線を作成し
、Ｌ−Ｍ細胞での活性評価と、染色（クーマシー・ブリ
リアント・ブルーＲ−２５０）により分子量を決定した
。
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２８−３巻５４−６５頁（１９
７２年）〕に従い、トリス／グリシン／５ｎｓ（ｐＨｓ
、３）でＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルに１０μ２の
試料を付与し、電気泳動を行った。標準分子量キット（
ファルマシア社製）′ｆ：用いて分子量検量線を作成し
、Ｌ−Ｍ細胞での活性評価と、染色（クーマシー・ブリ
リアント・ブルーＲ−２５０）により分子量を決定した
。
本発明になる生理活性物質は、１７，５００±２，００
０の位置に、単一染色バンドと活性を示した。
０の位置に、単一染色バンドと活性を示した。
２）等電点測定法
アト−株式会社製の等電点電気泳動装置（５Ｊ−１０７
１ＥＣ型）を用い、ファルマライト（ファルマシア社Ｎ
＋ ｐＨ’〜６．５）とグリセロールヲ含む５チポリ
アクリルアミド平板ゲル（厚み１ｋｌＪ長さ’ Ｏ（：
ｍｓ 巾１０ｍ）を作成した。陽極側に０．０４ Ｍ、
ＤＬ−グルタミン酸、陰極側に０．２ Ｍ 。
１ＥＣ型）を用い、ファルマライト（ファルマシア社Ｎ
＋ ｐＨ’〜６．５）とグリセロールヲ含む５チポリ
アクリルアミド平板ゲル（厚み１ｋｌＪ長さ’ Ｏ（：
ｍｓ 巾１０ｍ）を作成した。陽極側に０．０４ Ｍ、
ＤＬ−グルタミン酸、陰極側に０．２ Ｍ 。
Ｌ−ヒスチジンを使用して、７０．ＯＶで５０分間の前
泳動を行った。続いて試料５０μＶを付与し、７００ｖ
で１時間、５００■で１６時間泳動を行った。泳動終了
後ゲル’ｉ２，５１ＲＩ巾で切出し、次いで各ゲル片ｉ
ｎ、１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，２） ０．２ ｍで抽出し、各抽出
液についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行った。本発
明になる生理活性物質の等電点け５．０±０．５であつ
ｆｃ。
泳動を行った。続いて試料５０μＶを付与し、７００ｖ
で１時間、５００■で１６時間泳動を行った。泳動終了
後ゲル’ｉ２，５１ＲＩ巾で切出し、次いで各ゲル片ｉ
ｎ、１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，２） ０．２ ｍで抽出し、各抽出
液についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行った。本発
明になる生理活性物質の等電点け５．０±０．５であつ
ｆｃ。
５） Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価
Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、Ｒｏｆｆ（Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ ２巻Ｊｐｉｃｋ編集、 Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２５５頁（１９８０年）
〕あるいは［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２６巻・コレク
ション、ＣＣＬｌ、２ ）ｉ殺す効果を測定するもので
ある。すなわち、順次培地で希釈した試料０．１ｄと１
０”コ／−の濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液０，１ｄｉ
９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボラ
トリ−社）に加えた。培地ｉｊ １ ｖ／ｖ ％のウシ
胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培
地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他
編集、朝倉書店、１９６７年に記載されている〕を用い
た。マイクロプレートｆｔ５％の炭酸ガスを含む空気中
、３７Ｃで４８時間培養した。培養終了後、グルタルア
ルデヒド２０μｔを加え細胞を固定した。固定後、 ９
− マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレ
ンブルー溶液ヲ０．１−加え、生き残った細胞を染色し
た。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残っ
たメチレンブルーｉ ０．３６ Ｎ塩酸溶液で抽出し、
その６６５ ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マ
ルチスキャン（フロー・ラボラ） ＩＪ−社）で測定し
た。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−
Ｍ細胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を１単位
／ ｍｅと定義し、試料を加えない対照の吸光度の５０
％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算
によってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単
位／ｄで表記する）とした。
ｏｋｉｎｅＲｅｐｏｒｔｓ ２巻Ｊｐｉｃｋ編集、 Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２５５頁（１９８０年）
〕あるいは［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２６巻・コレク
ション、ＣＣＬｌ、２ ）ｉ殺す効果を測定するもので
ある。すなわち、順次培地で希釈した試料０．１ｄと１
０”コ／−の濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液０，１ｄｉ
９６穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボラ
トリ−社）に加えた。培地ｉｊ １ ｖ／ｖ ％のウシ
胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培
地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他
編集、朝倉書店、１９６７年に記載されている〕を用い
た。マイクロプレートｆｔ５％の炭酸ガスを含む空気中
、３７Ｃで４８時間培養した。培養終了後、グルタルア
ルデヒド２０μｔを加え細胞を固定した。固定後、 ９
− マイクロプレートを洗浄、乾燥して、０．０５％メチレ
ンブルー溶液ヲ０．１−加え、生き残った細胞を染色し
た。余分なメチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残っ
たメチレンブルーｉ ０．３６ Ｎ塩酸溶液で抽出し、
その６６５ ｎｍにおける吸光度をタイターチック・マ
ルチスキャン（フロー・ラボラ） ＩＪ−社）で測定し
た。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。Ｌ−
Ｍ細胞の５０％を殺すために必要な生理活性量を１単位
／ ｍｅと定義し、試料を加えない対照の吸光度の５０
％の値に相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算
によってめ、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単
位／ｄで表記する）とした。
一方、蛋白質ｉは、Ｂｒａｎｆｏｒｄらの方法（Ａｎａ
ｌ。
ｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ７２巻２４８〜２５４頁（１９７６
年）〕により、クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ２
５０’ｉｉ用いる色素結合法から算出した。
年）〕により、クーマシー・ブリリアント・ブルーＧ２
５０’ｉｉ用いる色素結合法から算出した。
本発明になる生理活性物質の比活性４１．５ｘ１０ａ〜
Ｉ Ｘ １０？単位／９蛋白質であった。
Ｉ Ｘ １０？単位／９蛋白質であった。
４） Ｍｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａ担ｉマウス’ｌ用
いる活性評価−１０− Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマウスの腹部皮肉に２ Ｘ １
０５コのＭｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、
７日後移植した腫瘍の大きさが直径７〜８■となり、出
血性壊死がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウ
スを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、２１ｎ
Ｉ！の試料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り
壊死反応の判定を行った。
いる活性評価−１０− Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃマウスの腹部皮肉に２ Ｘ １
０５コのＭｅｔｈ Ａ ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植し、
７日後移植した腫瘍の大きさが直径７〜８■となり、出
血性壊死がなく良好な血行状態にある腫瘍を有するマウ
スを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、２１ｎ
Ｉ！の試料を注射し、２４時間後に次の判定基準に則り
壊死反応の判定を行った。
（−）：変化なし
く＋）：かすかな出血性壊死
（廿）：中程度の出血性壊死
（移植病表面の真中から５０−以上に
わたって壊死）
（＋ｌ＋） ：顯著な出血性壊死
（移植病の中央部が重度に壊死し、周
囲の癌組織がわずかに残った状態）
また、試料投与後２０日１に癌が完全に退縮したかどう
かを観察し完治率をめた。
かを観察し完治率をめた。
以上の方法によシ測定した本生理活性物質の活性を下表
に示す。
に示す。
５０００ ６ ２１ ３０ ２／６
１００００ ６ ０１２３ ３／６
２００００ ６ ００ １ ５ ６／６対照注理食塩水
） ６ ６０００ ０／６※完治率：完全に癌が退縮し
たマウス数／実験マウス数５）アミノ酸配列描造決定 本発明になる生理活性物質を用いて次の検討を行なった
。
） ６ ６０００ ０／６※完治率：完全に癌が退縮し
たマウス数／実験マウス数５）アミノ酸配列描造決定 本発明になる生理活性物質を用いて次の検討を行なった
。
試料調製用の厚み１龍、長さ１１ ｃｒｎ、 ｌ］ １
５ Ｃｍのポリアクリルアミド１５チを含む５ＤＳ−ポ
リアクリルアミド平板ゲル全作成１７り。作成法の詳細
は、アト−株式会社「スラブ型５ＤＳ−アクリルアミド
ゲル電気泳動」のパンフレットによった。装置はアト−
株式会社製５Ｊ−１０６０・ＳＤＨ型を用いた。
５ Ｃｍのポリアクリルアミド１５チを含む５ＤＳ−ポ
リアクリルアミド平板ゲル全作成１７り。作成法の詳細
は、アト−株式会社「スラブ型５ＤＳ−アクリルアミド
ゲル電気泳動」のパンフレットによった。装置はアト−
株式会社製５Ｊ−１０６０・ＳＤＨ型を用いた。
該平板ゲル１板当り、本発明になる生理活性物質を４０
０μＶ付与した。付与に際して前処理として、１％ＳＤ
Ｓ水溶液１００μｔと４０チシヨ糖水溶液５０μｔに４
００μＶの本生理活性物質會含む５００μｔの水溶液を
混合し、５０Ｃ３０分の熱処理を行なった。電気泳動は
１５０ｖ定電圧で、４時間３０分を要した。この操作を
５回くりかえして行なった。泳動後、外側の一部をクー
マシー・ブリリアント・ブルーＧ２５０で５分間染色を
行ない、脱色後明瞭に見えるバンド（単一染色バンド）
全中心に、２．５１１１１１間隔で５本に切出しを行な
った。次いで１チの重炭酸アンモニウム１．５ゴの中に
該ゲル片を浸漬して、４Ｃ２４時間抽出を行なった。抽
出後、パスツールピペットにて抽出液を取り出し、同液
で洗浄を行なって、各２．５ｄずつの抽出液全５スライ
ス分、取得した。得られた抽出液は、確認のためＬ−Ｍ
細胞を用いる活性評価を行なった。中心のバンドの部分
に活性が総て回収された。
０μＶ付与した。付与に際して前処理として、１％ＳＤ
Ｓ水溶液１００μｔと４０チシヨ糖水溶液５０μｔに４
００μＶの本生理活性物質會含む５００μｔの水溶液を
混合し、５０Ｃ３０分の熱処理を行なった。電気泳動は
１５０ｖ定電圧で、４時間３０分を要した。この操作を
５回くりかえして行なった。泳動後、外側の一部をクー
マシー・ブリリアント・ブルーＧ２５０で５分間染色を
行ない、脱色後明瞭に見えるバンド（単一染色バンド）
全中心に、２．５１１１１１間隔で５本に切出しを行な
った。次いで１チの重炭酸アンモニウム１．５ゴの中に
該ゲル片を浸漬して、４Ｃ２４時間抽出を行なった。抽
出後、パスツールピペットにて抽出液を取り出し、同液
で洗浄を行なって、各２．５ｄずつの抽出液全５スライ
ス分、取得した。得られた抽出液は、確認のためＬ−Ｍ
細胞を用いる活性評価を行なった。中心のバンドの部分
に活性が総て回収された。
合計５回の電気泳動を行ない、２ｒｎ９のチャージ試料
より１．６１ｎ９の抽出試料を得た。
より１．６１ｎ９の抽出試料を得た。
該抽出試料溶液をセファデックスＧ２５のカラム−１３
− （０，９Ｘ １０ ｃｒｒｌ）に付し、脱塩を行なった
。次いでトミー精工社製、遠心真空乾燥機コンセントレ
ータ−（ＥＣ−１０）を用いて、２５Ｃ，２時間１．５
０ Ｏｒｐｍで乾燥を行ない、アミノ酸配列用分析試料
とした。
− （０，９Ｘ １０ ｃｒｒｌ）に付し、脱塩を行なった
。次いでトミー精工社製、遠心真空乾燥機コンセントレ
ータ−（ＥＣ−１０）を用いて、２５Ｃ，２時間１．５
０ Ｏｒｐｍで乾燥を行ない、アミノ酸配列用分析試料
とした。
アプライドバイオシスムズ社製アミノ酸シークエンシン
グアナライザー（モデル４７０Ａ）ｋ用い、ＲｌＭ、
Ｈｅｗｉｃｋらの方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、 ＣＪｔｅｍ、
２５６巻７９９０−７９９７頁（１９８１年）〕に準
じて、Ｎ末端側より順次エドマン分解を行った。遊離し
てくルフェニルチオヒダントインーアミノ酸’ｋ、スペ
クトロフィジクス社製畠速液体クロマトグラフィー（Ｓ
Ｐ８１００）、使用カラムデュポン社製ゾルパックスＯ
ＤＳに付し、分析を行ない、常法に従ってアミノ酸決定
をした。その結呆、本発明になる生理活性物質のＮ末端
側からのアミノ酸配列は下記の通りであった。
グアナライザー（モデル４７０Ａ）ｋ用い、ＲｌＭ、
Ｈｅｗｉｃｋらの方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、 ＣＪｔｅｍ、
２５６巻７９９０−７９９７頁（１９８１年）〕に準
じて、Ｎ末端側より順次エドマン分解を行った。遊離し
てくルフェニルチオヒダントインーアミノ酸’ｋ、スペ
クトロフィジクス社製畠速液体クロマトグラフィー（Ｓ
Ｐ８１００）、使用カラムデュポン社製ゾルパックスＯ
ＤＳに付し、分析を行ない、常法に従ってアミノ酸決定
をした。その結呆、本発明になる生理活性物質のＮ末端
側からのアミノ酸配列は下記の通りであった。
５ｅｒ−Ａｌ ａ−８ｅｒ −Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。
−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。
−Ｌｅｕ−Ａｌａ −Ｈｉ ５−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｘ、 −Ｌｅｕ−：
Ｘｌはアミノ酸１残基。
ａ −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｘ、 −Ｌｅｕ−：
Ｘｌはアミノ酸１残基。
−１４−
６）レクチンカラムへの吸着性
市販の各種レクチン固定化樹＋＋ｉ’を市販セパコール
ミ二カラム（バイオランド社製）に充填し、１５０ｍＭ
の塩化ナトリウムを含む５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で充分に洗浄後、同緩衝液に溶解した１００μ
７の本発明に々る生理活性物質試料を付与し、次いで下
記に示す溶出液で溶出を行なった後、素通り画分と溶出
画分と’ｉＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価法にかけ測定し
た。総てのカラムにおいて、総ての活性が素通り画分に
回収さ７）電気泳動の易動度 セルロースアセテート膜トしてセパラックスＳ（富士写
真フィルム社製）を用い、ｐＨ８，６イオン強度０．０
６〜０．０７で泳動を行なった。泳動紹了後１龍巾で切
片を作成した。得られた切片を生理食塩水で抽出し、Ｌ
−Ｍ細胞での活性評価を行ない易動度をめた。同時に染
色用サンプルを泳動し、ポンソー３Ｒ（半井化学楽品株
式会社製）で染色を行なった。
ミ二カラム（バイオランド社製）に充填し、１５０ｍＭ
の塩化ナトリウムを含む５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）で充分に洗浄後、同緩衝液に溶解した１００μ
７の本発明に々る生理活性物質試料を付与し、次いで下
記に示す溶出液で溶出を行なった後、素通り画分と溶出
画分と’ｉＬ−Ｍ細胞を用いる活性評価法にかけ測定し
た。総てのカラムにおいて、総ての活性が素通り画分に
回収さ７）電気泳動の易動度 セルロースアセテート膜トしてセパラックスＳ（富士写
真フィルム社製）を用い、ｐＨ８，６イオン強度０．０
６〜０．０７で泳動を行なった。泳動紹了後１龍巾で切
片を作成した。得られた切片を生理食塩水で抽出し、Ｌ
−Ｍ細胞での活性評価を行ない易動度をめた。同時に染
色用サンプルを泳動し、ポンソー３Ｒ（半井化学楽品株
式会社製）で染色を行なった。
本発明の生理活性物質は、α−グロブリン領域に泳動さ
れ、単一の染色バンドの位置に活性を示した。
れ、単一の染色バンドの位置に活性を示した。
８）ジスルフィド結合の還元による影響ジスルフィド結
合還元剤としてジチオスレイトール（０，１ｍＭ、１ｍ
Ｍ）または２−メルカプトエタノール（０，１ｍＭ 、
１ ｍＭ ）を用い、本発明になる生理活性物質２０
μｆ ／ｄ−ｉ ０．１５ Ｍ塩化す） ＩＪウム／
５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中、２５Ｃで２
時間反応させた。反応後、Ｌ−Ｍ細胞を用いて残存活性
を測定し、ジスルフィド結合還元剤を用いなかった対照
の残存活性に対する比をめ、その結果全下表に示す。
合還元剤としてジチオスレイトール（０，１ｍＭ、１ｍ
Ｍ）または２−メルカプトエタノール（０，１ｍＭ 、
１ ｍＭ ）を用い、本発明になる生理活性物質２０
μｆ ／ｄ−ｉ ０．１５ Ｍ塩化す） ＩＪウム／
５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中、２５Ｃで２
時間反応させた。反応後、Ｌ−Ｍ細胞を用いて残存活性
を測定し、ジスルフィド結合還元剤を用いなかった対照
の残存活性に対する比をめ、その結果全下表に示す。
なお、これまでの説明で明らかなように、本発明になる
新規生理活性物質は、溶液中での分子量、すなわちゲル
濾過時の分子量が４０，０００±ｓ、ｏ ｏ ｏであ、
Ｑ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のサブユ
ニット解離状態での分子量が１７，５００±２，０００
である。
新規生理活性物質は、溶液中での分子量、すなわちゲル
濾過時の分子量が４０，０００±ｓ、ｏ ｏ ｏであ、
Ｑ、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のサブユ
ニット解離状態での分子量が１７，５００±２，０００
である。
しかも５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の抽
出サンプルをゲル濾過に付すと、活性画分が分子量４０
，０００±５，０００付近にあることから、本発明の生
理活性物質は、サブユニット構造を有する蛋白質と考え
られる。
出サンプルをゲル濾過に付すと、活性画分が分子量４０
，０００±５，０００付近にあることから、本発明の生
理活性物質は、サブユニット構造を有する蛋白質と考え
られる。
−１７−
次に本発明の新規生理活性物質を得る方法について説明
する。
する。
ウサギに網内系賦活化作用を有する物質の１種または２
種以上を静脈内または腹腔内に注射する。網内系賦活化
作用を有する物質としては、通常ダラム陽性菌、原生動
物または１孝母が用いられ、生菌状態、死菌状態（例え
ば熱処理やホルマリン処理後）又は菌体抽出成分として
投与される。ここでダラム陽性菌としては、例えばＰｒ
ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅａ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ）、Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏａｕｍ （
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕ
ｍ）のようなＰｒｏｐｌｏｎｉｂａｃｔｅｒｌａ 、Ｂ
ａｅｌｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇ訂ｒｉｎ（ＢＣ
Ｇ）、Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉ
ｓのようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ％Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ％Ｎｏｃａｒｄｉａ
ｇａｒｄｎｅｒｉのようなＮｏｃａｒｄｉａａが挙げら
れる。原生動物としては、例えばマラリア原虫、トキソ
プラズマが挙げられる。
種以上を静脈内または腹腔内に注射する。網内系賦活化
作用を有する物質としては、通常ダラム陽性菌、原生動
物または１孝母が用いられ、生菌状態、死菌状態（例え
ば熱処理やホルマリン処理後）又は菌体抽出成分として
投与される。ここでダラム陽性菌としては、例えばＰｒ
ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅａ（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ）、Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏａｕｍ （
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕ
ｍ）のようなＰｒｏｐｌｏｎｉｂａｃｔｅｒｌａ 、Ｂ
ａｅｌｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇ訂ｒｉｎ（ＢＣ
Ｇ）、Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉ
ｓのようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ％Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ％Ｎｏｃａｒｄｉａ
ｇａｒｄｎｅｒｉのようなＮｏｃａｒｄｉａａが挙げら
れる。原生動物としては、例えばマラリア原虫、トキソ
プラズマが挙げられる。
酵母の場合、通常Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｍ ｃｅｒ
ｅｖｉｇｉａｅなどから抽出したｚｙｍｏｓａｎが用い
られる。また、ビランコポリマーのような合成高分子化
合物を用い−１８− ることもできる。網内系賦活化作用を有する物質の投与
後７〜１４日後に、グラム陰性菌よシ得られたエンドト
キシン、例えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のリポポ
リサッカライドを該ウサギの静脈内に注射する。注射後
１．５〜２時間後に、抗腫瘍作用を有する生理活性物質
の粗製溶液（以下、単に粗製溶液と記す）を得る。す々
わち、該ウサギの体液（例えば腹水、リンパ液等）およ
び、または血清もしくは血漿を得る。または、該ウサギ
の肝臓、肝臓等の臓器を均一に破砕し、生理食増水で抽
出する。おるいは前もって、網内系賦活化作用を有する
物質の１種または２種以上を静脈内または腹腔内に注射
したウサギまたは正常ウサギのマクロファージ（例えば
肺胞マクロファージもしくは末梢血マクロファージ）を
含む組線培養系にエンドトキシンを加えると、上清中に
本発明の生理活性物質が遊離する。このようにして得ら
れた粗製溶液は、以下に述べる手段により精製され、本
発明の生理活性物質が得られる。
ｅｖｉｇｉａｅなどから抽出したｚｙｍｏｓａｎが用い
られる。また、ビランコポリマーのような合成高分子化
合物を用い−１８− ることもできる。網内系賦活化作用を有する物質の投与
後７〜１４日後に、グラム陰性菌よシ得られたエンドト
キシン、例えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のリポポ
リサッカライドを該ウサギの静脈内に注射する。注射後
１．５〜２時間後に、抗腫瘍作用を有する生理活性物質
の粗製溶液（以下、単に粗製溶液と記す）を得る。す々
わち、該ウサギの体液（例えば腹水、リンパ液等）およ
び、または血清もしくは血漿を得る。または、該ウサギ
の肝臓、肝臓等の臓器を均一に破砕し、生理食増水で抽
出する。おるいは前もって、網内系賦活化作用を有する
物質の１種または２種以上を静脈内または腹腔内に注射
したウサギまたは正常ウサギのマクロファージ（例えば
肺胞マクロファージもしくは末梢血マクロファージ）を
含む組線培養系にエンドトキシンを加えると、上清中に
本発明の生理活性物質が遊離する。このようにして得ら
れた粗製溶液は、以下に述べる手段により精製され、本
発明の生理活性物質が得られる。
本発明の生理活性物質を得るための好ましい精製法の骨
子は、粗製溶液、特に血清または血漿を次の工程に付す
ことである。
子は、粗製溶液、特に血清または血漿を次の工程に付す
ことである。
（１１和製溶液の前処雅
（２１地基性陰イオン交換体クロマトグラフィー（３）
刀ｎ熱処理 （４）ゲルＦ通 ｆ５１Ｚｎ”＋キレートアフイ二イティク口マトクラフ
ィ−（６１ゲル濾過 以下に、これらの工程の詳細を説明する。
刀ｎ熱処理 （４）ゲルＦ通 ｆ５１Ｚｎ”＋キレートアフイ二イティク口マトクラフ
ィ−（６１ゲル濾過 以下に、これらの工程の詳細を説明する。
なお、粗製溶液および溶出液中の蛋白質濃度および本生
理活性物質の濃度は、それぞわ前述の実験例３に記載の
蛋白質測定法および■、−Ｍ細胞を用いた活性評価で６
川定される。
理活性物質の濃度は、それぞわ前述の実験例３に記載の
蛋白質測定法および■、−Ｍ細胞を用いた活性評価で６
川定される。
精製工程１
粗製溶液をキレート剤と珪藻土粉末で処理した後、フィ
ルターで濾過する。キレート剤としてはエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム地が好ましい。珪藻土粉末として
は、例えばセライト、スーパーセルなどが挙げられる。
ルターで濾過する。キレート剤としてはエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム地が好ましい。珪藻土粉末として
は、例えばセライト、スーパーセルなどが挙げられる。
濾過操作は孔径０．２〜３μのフィルターの１種類また
は数棟類を組み合わせて行々われる。この工程での活性
の回収率は約９５〜１００％である。
は数棟類を組み合わせて行々われる。この工程での活性
の回収率は約９５〜１００％である。
精製工程２
前記工程で得られた濾過液と塩基性陰イオン交換体との
接触は、カラム法、バッチ法のいずれを用いてもよい。
接触は、カラム法、バッチ法のいずれを用いてもよい。
塩基性陰イオン交換体との接触に先立ち、濾過液を陰イ
オン交換体との接触時に用いる緩衝液に対して透析して
もよいし、または低塩濃度の緩衝液で希釈してもよい。
オン交換体との接触時に用いる緩衝液に対して透析して
もよいし、または低塩濃度の緩衝液で希釈してもよい。
本工程は、ｆｉｌＪ製溶液全溶液６．０〜８．０、塩濃
度０．２Ｍ以下の緩衝液を用い、塩基性陰イオン交換体
に接触させて本発明の生理活性物質を吸着させ、次いで
同緩衝液で該イオン交換体を洗浄して非吸着蛋白質を除
去した後、高塩濃度の緩衝液を用いて、本生理活性物質
を溶出させることにより行なわれる。
度０．２Ｍ以下の緩衝液を用い、塩基性陰イオン交換体
に接触させて本発明の生理活性物質を吸着させ、次いで
同緩衝液で該イオン交換体を洗浄して非吸着蛋白質を除
去した後、高塩濃度の緩衝液を用いて、本生理活性物質
を溶出させることにより行なわれる。
塩基性陰イオン交換体の具体例としては、ＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ％ＤＥＡＥ−セファセルＣ以上ファルマシア社製）
のようなジエチルアミノエチル基含有陰２１− イオン交換体が好ましい。ｔＪ衝液としては、例えば希
薄なトリス−塩酸緩衝液およびリン酸緩衝液が挙げられ
る。塩濃度を調節するために加える塩としては、増化ナ
トリウム、塩化カリウムが好ましい。
ファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ％ＤＥＡＥ−セファセルＣ以上ファルマシア社製）
のようなジエチルアミノエチル基含有陰２１− イオン交換体が好ましい。ｔＪ衝液としては、例えば希
薄なトリス−塩酸緩衝液およびリン酸緩衝液が挙げられ
る。塩濃度を調節するために加える塩としては、増化ナ
トリウム、塩化カリウムが好ましい。
なお、精製工程２の終了後、精製度が原面醒に比し６０
０倍以上に達していない場合は、精製工程２をくりかえ
して行なう。
０倍以上に達していない場合は、精製工程２をくりかえ
して行なう。
精製工程３
前記工程で得られた溶出液は、限外濾過、凍結乾燥また
は適当な大きさの堪基性陰イオン交換体カラムを用いて
濃縮した後、加熱処理を行なう。
は適当な大きさの堪基性陰イオン交換体カラムを用いて
濃縮した後、加熱処理を行なう。
加熱処理は通常６０〜７０Ｃで３０分〜２時間行なわれ
るが、６０Ｃで３０分間処理するのが好ましい。加熱処
理の際の緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液あ
るいはリン酸緩衝液などが挙げられ、そのｐＨは６．０
〜９．０である。精製工程１〜３を通しての精製度は６
００倍以上、活性の回収率は約７８〜１０ロチである。
るが、６０Ｃで３０分間処理するのが好ましい。加熱処
理の際の緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液あ
るいはリン酸緩衝液などが挙げられ、そのｐＨは６．０
〜９．０である。精製工程１〜３を通しての精製度は６
００倍以上、活性の回収率は約７８〜１０ロチである。
精製工程４
−２２−
本生理活性物質を含む溶出液は、限外濾過、凍結乾燥ま
たは適当力大きさの塩基性陰イオン交換体カラムを用い
て濃縮した後、分子量３０，０００〜７０，０００の物
質の分離に適した相体を用いるゲル濾過に付す。溶出液
としては緩衝液が用いられ、そのｐＨは通常６．０〜９
．０である。緩衝液中の塩濃度は１．０Ｍ以下である。
たは適当力大きさの塩基性陰イオン交換体カラムを用い
て濃縮した後、分子量３０，０００〜７０，０００の物
質の分離に適した相体を用いるゲル濾過に付す。溶出液
としては緩衝液が用いられ、そのｐＨは通常６．０〜９
．０である。緩衝液中の塩濃度は１．０Ｍ以下である。
ゲルＦＪ用担体の具体例としては、セファデックスＧ−
１５０、Ｇ−２００（ファルマシア社製）、セファクリ
ルＳ−２００（ファルマシア社製）、バイオゲルＰ−１
５０、Ｐ−２００（バイオランド社製）、トヨバールＨ
Ｗ−５５、Ｉ（Ｗ−６５（東洋ソーダ株式会社製）等が
挙げられる。
１５０、Ｇ−２００（ファルマシア社製）、セファクリ
ルＳ−２００（ファルマシア社製）、バイオゲルＰ−１
５０、Ｐ−２００（バイオランド社製）、トヨバールＨ
Ｗ−５５、Ｉ（Ｗ−６５（東洋ソーダ株式会社製）等が
挙げられる。
緩衝液および加えられる塩としては、精製工程２で挙げ
たものが同様に用いられる。ゲル濾過で得た本生理活性
物質含有画分を集め、限外濾過、凍結乾燥、堪基性陰イ
オンダ換体、小型カラム等で濃縮を行なうと、原血清も
しくは血漿に比べて約Ｉ Ｘ １０’〜４ Ｘ １０’
倍に精製された本生理活性物質の溶液が得られる。精製
工程１〜４を通しての油性の回収率は約７０〜９５％で
ある。
たものが同様に用いられる。ゲル濾過で得た本生理活性
物質含有画分を集め、限外濾過、凍結乾燥、堪基性陰イ
オンダ換体、小型カラム等で濃縮を行なうと、原血清も
しくは血漿に比べて約Ｉ Ｘ １０’〜４ Ｘ １０’
倍に精製された本生理活性物質の溶液が得られる。精製
工程１〜４を通しての油性の回収率は約７０〜９５％で
ある。
精製工程５
精製工程４で得られた溶液をＪ、Ｐｏｒａｔｈらの方法
（Ｎａｔｕｒｅ ２５８巻 ５９Ｂ頁（１９７５年）〕
に準じて調製したＺｎ２＋キレートセフ了ロースカラム
に付す。なお、イミノジ酢酸をカップリングしたセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）が市販されてい
るのでこれを用いてもよい。
（Ｎａｔｕｒｅ ２５８巻 ５９Ｂ頁（１９７５年）〕
に準じて調製したＺｎ２＋キレートセフ了ロースカラム
に付す。なお、イミノジ酢酸をカップリングしたセファ
ロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）が市販されてい
るのでこれを用いてもよい。
イミノジ酢酸をカップリングしたセファロースＣＬ−６
Ｂカラムに１１ｎ９／−の濃度の増化亜鉛を流し、ｚｎ
２＋をキレート吸着させる。続いて溶出に用いる緩衝液
を用いてカラムを洗浄した後、精製工程４で得られた溶
液をその１ま、もしくは濃縮した後付す。この工程で使
用する緩衝液およびその中で使用する塩濃度と種類は、
精製工程２で用いたものと同様のものが用いられる。こ
の操作でほとんどの夾雑蛋白質が？着され、本生理活性
物質は非吸着画分に溶出される。この溶出液のｆ１１製
度は原血清″！！たは原向漿に比べて約２ Ｘ １０’
〜７ Ｘ １０’倍であり、精製工程１〜５を通しての
活性回収率は約５６〜７６％である。
Ｂカラムに１１ｎ９／−の濃度の増化亜鉛を流し、ｚｎ
２＋をキレート吸着させる。続いて溶出に用いる緩衝液
を用いてカラムを洗浄した後、精製工程４で得られた溶
液をその１ま、もしくは濃縮した後付す。この工程で使
用する緩衝液およびその中で使用する塩濃度と種類は、
精製工程２で用いたものと同様のものが用いられる。こ
の操作でほとんどの夾雑蛋白質が？着され、本生理活性
物質は非吸着画分に溶出される。この溶出液のｆ１１製
度は原血清″！！たは原向漿に比べて約２ Ｘ １０’
〜７ Ｘ １０’倍であり、精製工程１〜５を通しての
活性回収率は約５６〜７６％である。
ｎ製工程６
精製工程５で得られた溶出液は、精製工程４と同様の押
体、緩衝液、塩を用いてゲル濾過に付す。
体、緩衝液、塩を用いてゲル濾過に付す。
但し、使用するカラムは、精製工程４で用いたものより
も小径かつ長尺のものを用いる。活性画分を集め、濃縮
、透析、濾過滅菌および必要に応じて凍結乾燥等を行々
い、本発明の新規生理活性物質を得る。精製工程１〜６
を通しての精製度は約４ Ｘ １０４〜１．５ Ｘ １
０！倍で、活性回収率は約５０〜７０％である。
も小径かつ長尺のものを用いる。活性画分を集め、濃縮
、透析、濾過滅菌および必要に応じて凍結乾燥等を行々
い、本発明の新規生理活性物質を得る。精製工程１〜６
を通しての精製度は約４ Ｘ １０４〜１．５ Ｘ １
０！倍で、活性回収率は約５０〜７０％である。
このようにして得られた本発明の生理活性物質は、各種
同系移植マウス癌およびヌードマウス移植ヒト癌に対し
て優れた制癌効果を示した。すｈわち、マウス由来の結
腸＃ＪＣｏｌｏｎ ２６を移植したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／
ｃ糸マウスあるいは悪性黒色腫Ｂ１／ｉを移植したＣ
５７ＢＬ／６系マウスおよび神経芽腫Ｎｅｕｒｏ２ａを
移植したＡ系マウスに、本発明の生理活性物質５，００
０〜１０，０００単位を１回ないし３回静脈内投与した
試験において、対照群（生２５− 理食塩水投与群）に比して有意々癌の増殖抑制と退縮が
認められた、また、ヒト由来の肺癌ｐｃ−１０、悪性黒
色腫ＨＭＶ−２あるいけ神経芽腫ＧＯＴＯを移植したＢ
Ａ Ｌ Ｂ ／ ｅ系ヌードマウスに、本発明の生理
活性物質１０，０００〜３０，０００単位を１回ないし
７回静脈内投与した試験において、対照群（生理食塩水
投与群）に比して有意々癌の増殖抑制と退縮が認められ
た。
同系移植マウス癌およびヌードマウス移植ヒト癌に対し
て優れた制癌効果を示した。すｈわち、マウス由来の結
腸＃ＪＣｏｌｏｎ ２６を移植したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／
ｃ糸マウスあるいは悪性黒色腫Ｂ１／ｉを移植したＣ
５７ＢＬ／６系マウスおよび神経芽腫Ｎｅｕｒｏ２ａを
移植したＡ系マウスに、本発明の生理活性物質５，００
０〜１０，０００単位を１回ないし３回静脈内投与した
試験において、対照群（生２５− 理食塩水投与群）に比して有意々癌の増殖抑制と退縮が
認められた、また、ヒト由来の肺癌ｐｃ−１０、悪性黒
色腫ＨＭＶ−２あるいけ神経芽腫ＧＯＴＯを移植したＢ
Ａ Ｌ Ｂ ／ ｅ系ヌードマウスに、本発明の生理
活性物質１０，０００〜３０，０００単位を１回ないし
７回静脈内投与した試験において、対照群（生理食塩水
投与群）に比して有意々癌の増殖抑制と退縮が認められ
た。
以上説明したように、本発明の生理活性物質は、粗製溶
液から約５０〜７０チという好収率で得られる。本物質
は極めて優れた抗１！Ｊｉ瘍効果を有し、その作用は種
特異性が少なく、シかも広範囲な効果を持ち、１１０え
て毒性がほとんど認められないことから、極めて有用な
抗腫瘍剤として期待できるものである。
液から約５０〜７０チという好収率で得られる。本物質
は極めて優れた抗１！Ｊｉ瘍効果を有し、その作用は種
特異性が少なく、シかも広範囲な効果を持ち、１１０え
て毒性がほとんど認められないことから、極めて有用な
抗腫瘍剤として期待できるものである。
以下に参考例および実施例を示し、本発明をより具体的
に述べるが、本発明は、この実施例に限定されるもので
はない。
に述べるが、本発明は、この実施例に限定されるもので
はない。
参考例
イミノジ酢酸固定化樹脂の調製
−２６−
市販のエポキシ活性化セファロースＣＬ−６Ｂ（ファル
マシア社製）１５２を蒸留水１００−に加え、２時間膨
潤させた。次いでガラスフィルター上で吸引濾過し、更
に蒸留水で充分洗浄した。
マシア社製）１５２を蒸留水１００−に加え、２時間膨
潤させた。次いでガラスフィルター上で吸引濾過し、更
に蒸留水で充分洗浄した。
充分に水切りを行なった後、６？のイミノジ酢酸ナトリ
ウムを含む３０ゴの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液中にゲル
を懸濁させ、ゆるやかに振とうしながら２４時間６５Ｃ
で反応した。反応終了後、ガラスフィルターを用いて反
応液を吸引濾過した後、蒸留水で充分に洗浄し、４５−
のイミノジ酢酸固定化樹脂を得た。
ウムを含む３０ゴの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液中にゲル
を懸濁させ、ゆるやかに振とうしながら２４時間６５Ｃ
で反応した。反応終了後、ガラスフィルターを用いて反
応液を吸引濾過した後、蒸留水で充分に洗浄し、４５−
のイミノジ酢酸固定化樹脂を得た。
樹脂は０．１５ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）中で保存し、これを実施例
の精製工程５で用い友。樹脂の再生は０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０５ Ｍエチレンジアミン４酢酸溶
液で行なった。
ン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）中で保存し、これを実施例
の精製工程５で用い友。樹脂の再生は０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０５ Ｍエチレンジアミン４酢酸溶
液で行なった。
実施例
雌ウサギ（体重２．５〜３．［］ｋｐ）にホルマリンに
て死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒ
ｖｕｍ、ウェルカム社、英国）５０ｍ９を耳静脈より注
射した。該ウサギに８日後再度１００μｔのエンドトキ
シン（大腸菌０２６：Ｂ６由来のりボボリサッヵライド
、ディフコ社製。
て死菌処理したＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒ
ｖｕｍ、ウェルカム社、英国）５０ｍ９を耳静脈より注
射した。該ウサギに８日後再度１００μｔのエンドトキ
シン（大腸菌０２６：Ｂ６由来のりボボリサッヵライド
、ディフコ社製。
米国）を耳静脈より注射し、２時間後に心臓より全採面
した。採取し、た血液に１００７当り１００単位のヘパ
リンナトリウムをカｎえた後、５．００Ｏｒｐｍで３０
分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶固型物を除
去した。４００羽のウサギより、３．０００単位／ゴの
力価を有する血漿２４ｔが得られた。
した。採取し、た血液に１００７当り１００単位のヘパ
リンナトリウムをカｎえた後、５．００Ｏｒｐｍで３０
分間冷却遠心操作を行ない、血球および不溶固型物を除
去した。４００羽のウサギより、３．０００単位／ゴの
力価を有する血漿２４ｔが得られた。
精製工程１
Ｕｌ 血漿２４ｔに２４２のエチレンジアミン４酉１゜
酸２ナトリウムおよび２４０１ｉ’のセライトを刃口え
１時間攪拌した後、孔径３μ、１μおよびｎ、２μのフ
ィルターで順次濾過した。
酸２ナトリウムおよび２４０１ｉ’のセライトを刃口え
１時間攪拌した後、孔径３μ、１μおよびｎ、２μのフ
ィルターで順次濾過した。
精製工程２
該濾過液２４ｔに１２１（Ｄｏ、０４ＭトＩＪスー塩酸
緩衝液（ｐ Ｈ７，８）を加えた後、０．１Ｍ塩化ナト
リウムを含む口、０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
８）で充分に平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（２７ｘ４５ｃｍ）
に徐々に付した。次いで７５１のカラム平衡化緩衝液（
０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−
塩酸緩衝液、 ｐ Ｈ７，８）で洗浄した後、０．１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−塩酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，８） ５０ ｔで洗浄後、０．１８Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，２）を用いて溶出を行なった。流速は５ｔ／ｈ
ｒとし、溶出液は８ｔずつ分画して活性画分を集めた。
緩衝液（ｐ Ｈ７，８）を加えた後、０．１Ｍ塩化ナト
リウムを含む口、０４Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
８）で充分に平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（２７ｘ４５ｃｍ）
に徐々に付した。次いで７５１のカラム平衡化緩衝液（
０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−
塩酸緩衝液、 ｐ Ｈ７，８）で洗浄した後、０．１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−塩酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，８） ５０ ｔで洗浄後、０．１８Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．０４Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，２）を用いて溶出を行なった。流速は５ｔ／ｈ
ｒとし、溶出液は８ｔずつ分画して活性画分を集めた。
該活性画分に同容量の０．０４ Ｍ ）リス−塩酸緩衝
液（ｐ Ｈ７，８）を刃口えて希釈した後ｓ ２ ｌ／
ｈ ｒの流速でＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂの
カラム（１０Ｘ１５０１りに付した。次いで０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，８）１ｔを用いて、流速２００ ｍ／ｈｒで
洗浄を行なった後、０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０４ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐａ７．２）ｓｚを
用いて、流速２００ｄ／ｈｒで溶出を行なった。溶出液
は２５０−ずつ分画して活性画分を集めた。この段階で
活性の回−２９− 収率は９０％、精製度は６６０倍であった。
液（ｐ Ｈ７，８）を刃口えて希釈した後ｓ ２ ｌ／
ｈ ｒの流速でＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂの
カラム（１０Ｘ１５０１りに付した。次いで０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０４ Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，８）１ｔを用いて、流速２００ ｍ／ｈｒで
洗浄を行なった後、０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０４ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（ｐａ７．２）ｓｚを
用いて、流速２００ｄ／ｈｒで溶出を行なった。溶出液
は２５０−ずつ分画して活性画分を集めた。この段階で
活性の回−２９− 収率は９０％、精製度は６６０倍であった。
精製工程３
次に該溶出液を容器に移し７０ｃの湯浴中に浸した後、
攪拌しながら該溶出液の温度を６０ｃになるまで加熱し
た。その後６０ｃの別の湯浴に移し、３０分間加熱処理
した後、速やかに４ｃに冷却した。加熱処理した溶液は
、限外濾過により濃縮した。ここまでのｆｉｌｌ製工程
での活性の回収率は８８％であった。
攪拌しながら該溶出液の温度を６０ｃになるまで加熱し
た。その後６０ｃの別の湯浴に移し、３０分間加熱処理
した後、速やかに４ｃに冷却した。加熱処理した溶液は
、限外濾過により濃縮した。ここまでのｆｉｌｌ製工程
での活性の回収率は８８％であった。
ｎ製工程４
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．００５ Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，４）で充分に平衡化したセファクリルＳ
〜２００（ファルマシア社製）のカラム（ｓｘ８ｏｍ）
に該濃縮液を付し、伺緩衝液にてゲル濾過溶出を行なっ
た。加速は４［１ｄ／ｈｒで４０１ｎｔずつ分画して活
性画分を採取し、活性画分を限外濾過により濃縮した。
衝液（ｐＨ７，４）で充分に平衡化したセファクリルＳ
〜２００（ファルマシア社製）のカラム（ｓｘ８ｏｍ）
に該濃縮液を付し、伺緩衝液にてゲル濾過溶出を行なっ
た。加速は４［１ｄ／ｈｒで４０１ｎｔずつ分画して活
性画分を採取し、活性画分を限外濾過により濃縮した。
精芽シ工程１〜４を通しての活性回収率は８２％、精製
度は２．ＯＸ １０４倍であった。
度は２．ＯＸ １０４倍であった。
精製工程５
−３０−
ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液全ｚ２＋キ
レートセフ了ロースカラムに付した。キレートセファロ
ース（イミノジ酢酸固定化樹脂）は参考例に記載の方法
で調製したものを用いた。す彦わち、参考例で得られた
イミノジ酢酸固定化樹脂を充填したカラム（１，６ｘ
２０Ｑ＠）に、１ｍＯ／１ｎＩ！の塩化亜鉛水溶液１２
〇−全流速２０ ｍｌ ／ ｈｒで流した。次いで０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐ Ｈ７，４）で充分に平衡化した後、前工程で得られ
た濃縮液を流速２０ ｖｌ／ ｈｒで付し、更に１２０
−の同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取した。活性は
この両分にほとんどが回収された。精製工程１〜５を通
しての活性回収率は６６％、精製度は５．ＯＸ １０’
倍であった。
レートセフ了ロースカラムに付した。キレートセファロ
ース（イミノジ酢酸固定化樹脂）は参考例に記載の方法
で調製したものを用いた。す彦わち、参考例で得られた
イミノジ酢酸固定化樹脂を充填したカラム（１，６ｘ
２０Ｑ＠）に、１ｍＯ／１ｎＩ！の塩化亜鉛水溶液１２
〇−全流速２０ ｍｌ ／ ｈｒで流した。次いで０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（
ｐ Ｈ７，４）で充分に平衡化した後、前工程で得られ
た濃縮液を流速２０ ｖｌ／ ｈｒで付し、更に１２０
−の同緩衝液で溶出した非吸着画分を採取した。活性は
この両分にほとんどが回収された。精製工程１〜５を通
しての活性回収率は６６％、精製度は５．ＯＸ １０’
倍であった。
精製工程６
前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、０．１５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ
７，４）で充分に平衡化したトヨバールＨＷ−５５（東
洋ソーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ９０−）に付し
た。同緩衝液にて流速４ ｖｌ／ ｈｒでゲル濾過溶出
を行ない、活性画分を採取した。全ｎ製工程を通しての
活性の回収率Ｆｉ６０％、精製度は７．５ Ｘ １０’
倍であった。このようにして得られた本生理活性物質の
比活性は６．ＯＸ １０６単位／ｍ９蛋白質であった。
化ナトリウムを含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ
７，４）で充分に平衡化したトヨバールＨＷ−５５（東
洋ソーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ９０−）に付し
た。同緩衝液にて流速４ ｖｌ／ ｈｒでゲル濾過溶出
を行ない、活性画分を採取した。全ｎ製工程を通しての
活性の回収率Ｆｉ６０％、精製度は７．５ Ｘ １０’
倍であった。このようにして得られた本生理活性物質の
比活性は６．ＯＸ １０６単位／ｍ９蛋白質であった。
Claims (2)
- （１） アミノ末端よりＳｅｒ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ −ｐｒｏ −Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ −Ｌｅｕ−Ｇｌ ｎ−Ｘ。 −Ｌｅｕ ・・・・・・・・・・・・ （但し、式中ＸＩは１個のアミノ酸残基金示す。）で表
わされるアミノ酸配列構造を有するポリペプチドのサブ
ユニットからなる構造を有し、かつ下記特性を有する蛋
白質。 ａ）分子量 ４０，０００±５，０００ （グル沢適法
）１７．５００±２，０００ （５ＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法） ｂ）等重点 ５．０±０．５（等電点電気泳動法）Ｃ）
本文定義のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活性が５
Ｘ１０”〜ｌＸ１０”単位／９蛋白質。 - （２）網内系賦活化作用を有する物質′（ｉｌ−１種ま
たは２種以上、ウサギに投与し、次いでグラム陰性菌由
来のエンドトキシンを注射することによって、またはウ
サギ由来のマクロファージを含む組織培養系にグラム陰
性菌由来のエンドトキシンを加えること罠よって誘発さ
れる特許請求の範囲第１項記載の蛋白質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58127779A JPS6019719A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
| US06/629,853 US4529594A (en) | 1983-07-15 | 1984-07-11 | Protein having antitumor activity |
| EP84304769A EP0132125B2 (en) | 1983-07-15 | 1984-07-12 | A protein having antitumor activity |
| DE8484304769T DE3462506D1 (en) | 1983-07-15 | 1984-07-12 | A protein having antitumor activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58127779A JPS6019719A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6019719A true JPS6019719A (ja) | 1985-01-31 |
| JPH0443080B2 JPH0443080B2 (ja) | 1992-07-15 |
Family
ID=14968472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58127779A Granted JPS6019719A (ja) | 1983-07-15 | 1983-07-15 | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4529594A (ja) |
| EP (1) | EP0132125B2 (ja) |
| JP (1) | JPS6019719A (ja) |
| DE (1) | DE3462506D1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4920196A (en) * | 1982-07-30 | 1990-04-24 | Genentech, Inc. | Human lymphotoxin |
| JPH0695939B2 (ja) * | 1983-12-02 | 1994-11-30 | 大日本製薬株式会社 | ウサギ癌壊死因子をコ−ドするクロ−ン化ｄνａ |
| US5248666A (en) * | 1984-03-23 | 1993-09-28 | Oncogen | Methods for inhibiting neoplastic cell proliferation using platelet factor 4 |
| US4879226A (en) * | 1984-04-06 | 1989-11-07 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel human physiologically active polypeptide |
| US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
| US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| US6686455B1 (en) | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
| WO1993013089A1 (en) * | 1985-01-25 | 1993-07-08 | Urban Frank J | Macrocyclic polyether carboxylic acids |
| US5011777A (en) * | 1985-01-25 | 1991-04-30 | Oncogen | Vectors encoding brain derivable polypeptide factors |
| US4714683A (en) * | 1985-01-25 | 1987-12-22 | Oncogen | Polypeptide tumor inhibitors and antibodies thereto |
| EP0216934A4 (en) * | 1985-03-04 | 1987-07-09 | Sawai Seiyaku Kk | NOVEL SUBSTANCE INDUCING TUMOR NECROSIC FACTOR FROM ACID RESISTANT BACTERIA. |
| CA1265446A (en) * | 1985-09-30 | 1990-02-06 | Masahiro Maki | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
| EP0249618A1 (en) * | 1985-12-05 | 1987-12-23 | Biogen N.V. | Combinations of tumor necrosis factors and antibiotics and methods for treating tumors |
| US4822605A (en) * | 1986-02-18 | 1989-04-18 | Exovir, Inc. | Compositions and methods employing the same for the treatment of viral and cancerous skin lesions and the like |
| RU2377253C2 (ru) * | 2002-12-02 | 2009-12-27 | Амген Фремонт,Инк. | Антитела, специфичные к фактору некроза опухолей, и их применение |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4076701A (en) * | 1975-07-29 | 1978-02-28 | Immunology Research Foundation, Inc. | Tumor complement fraction recovery method and product |
| EP0027514B1 (en) * | 1979-08-17 | 1983-08-31 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Antitumor substance and its production |
| US4309418A (en) * | 1980-03-25 | 1982-01-05 | Sloan-Kettering Research Institute For Cancer | Anti-tumor agent from human serum and process |
| DK366380A (da) * | 1980-08-28 | 1982-03-01 | Novo Industri As | Anvendelsen af grp og salte deraf |
| JPS57140725A (en) | 1981-12-28 | 1982-08-31 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance having carcinostatic action |
| US4447355A (en) * | 1982-04-07 | 1984-05-08 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for stabilizing a tumor necrosis factor and a stable aqueous solution or powder containing the same |
| US4390468A (en) * | 1982-08-04 | 1983-06-28 | Maruzen Oil Co., Ltd. | Preparation of antitumor agent from shellfish |
-
1983
- 1983-07-15 JP JP58127779A patent/JPS6019719A/ja active Granted
-
1984
- 1984-07-11 US US06/629,853 patent/US4529594A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-12 EP EP84304769A patent/EP0132125B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-12 DE DE8484304769T patent/DE3462506D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0132125B1 (en) | 1987-03-04 |
| EP0132125A3 (en) | 1985-11-13 |
| US4529594A (en) | 1985-07-16 |
| EP0132125B2 (en) | 1990-06-27 |
| JPH0443080B2 (ja) | 1992-07-15 |
| EP0132125A2 (en) | 1985-01-23 |
| DE3462506D1 (en) | 1987-04-09 |
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