JPH0427998B2

JPH0427998B2 -

Info

Publication number: JPH0427998B2
Application number: JP57169481A
Authority: JP
Inventors: Kunooru Yozusefu; Nagii Yanosu; Karasuzu Fuba; Kunooru Beruta
Original assignee: RIHITAA GEDEON BEGIESUZECHI GIARU AARU TEII
Current assignee: RIHITAA GEDEON BEGIESUZECHI GIARU AARU TEII
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1982-09-28
Publication date: 1992-05-13
Also published as: DK429082A; JPS58135816A; US4430264A; DE3280277D1; EP0075925B1; AU551250B2; ATE59556T1; EP0075925A2; HU183590B; EP0075925A3; AU8877482A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒトおよび／または動物血清から食欲
調整物質を製造する方法に関する。

ハンガリー特許第178703号により、ヒトおよ
び／または動物血清ら単離される食欲中枢に特異
的に作用する食欲調整物質は公知である。

この特許明細書によれば、ヒトおよび／または
動物血清を50000までの分子量を通過させる膜フ
イルターで濾過し、この濾液をゲル上（除去容
量、Ｍ＝50000以下）クロマトグラフイーに付す。
これを0.1〜1.0％食塩溶液で溶出すると中性の溶
液が得られる。この溶出液を分画し、生物活性な
分画を蒸発させ、残留物を必要量の水に溶解し、
この溶液を前述の方法でゲルクロマトグラフイー
に付し、水で分画溶出し、生物学的活性を示す分
画を蒸発させる。この方法により、加水分解する
とアミノ酸と糖に分解し（アミノ酸60％、糖10
％）、糖タンパク質と考えられる生成物が分離さ
れる。この糖タンパク質は、中枢神経系に対して
興奮作用も抑制作用も示さないが、食欲中枢に特
異的に作用する食欲調整物質である。

上記特許についてさらに研究した結果、この特
許に記載の方法で得られる分画は、本発明を構成
する新規方法によつてさらに分画できることを発
見した。この方法によれば、従来の方法で分離さ
れた分画よりも３〜４倍強力な生成物を得ること
ができる。この新しい生成物の化学的組成は公知
の分画の組成と明らかに異なる。この生成物は生
理学的に均一で、化学的に純粋な、一定の組成を
もつ物質とみなすことができる。

上述の従来法で分離される活性物質のタンパク
またはペプチド成分は、そのかなりの部分が化学
的に結合していないあるいは単に弱い結合型とし
て存在し、サチエチン（Satietin）作用に関して
は不活性な成分で、適当なタンパク沈殿方法によ
つて実際の作用物質から分離できるものであるこ
とが明らかになつた。こののちに残留する低分子
の、ペプチド性またはその他の夾雑物質は、さら
に精製操作に付し、一部は電気泳動で、一部は親
和性クロマトグラフイーによつて完全に除去でき
る。この方法で、純粋な、化学的に均一なサチエ
チン活性物質が得られる。

本発明によれば、従来法で製造される分画の活
性を数倍も増強させ、食欲中枢に特異的に作用す
る、化学的に均一で組成に関して適切に定義でき
る食欲調整物質、すなわち純粋なサチエチンが得
られる。

ヒトおよび／または哺乳動物から得た血清を
50000までの分子量を透過させる膜フイルターで
濾過する。濾液を部分蒸発させ、得られた濃縮液
の不溶性部分を適当に遠心分離して除去する。液
相に０〜10℃でトリクロル酢酸を５〜25ｇ／Ｖ％
好ましくは10〜12ｇ／Ｖ％（重量／容量％）にな
るまで加える。沈殿したタンパク質を適当な超遠
心によつて除去する。得られた溶液を除去容量Ｍ
＝4000のゲル上クロマトグラフイーに付し（除去
容量、除去限界；そのゲルは有孔の合成樹脂粒子
から構成されている。分子量4000以下の物質はこ
の孔部に侵入し、緩和な洗浄操作ではそこに留ま
り、一方分子量4000以上の物質は粒子の表面にあ
つて、直ちに洗い落されてしまう）。このゲルを
0.5〜1.0％食塩溶液またはPH6.0〜7.0の緩衝液で
溶出する。生物学的に活性な分画を凍結下に濃縮
し、新たに3000ダルトンの除去限界のゲルを用い
てクロマトグラフイーを行う。この方法で得られ
た生成物を必要に応じて電気泳動で精製し、精製
物質を親和性クロマトグラフイーで分離する。

本発明の最初の精製工程における膜濾過（限外
濾過）は、たとえば、Amicon UM−10（登録商
標名）膜またはSartorius（登録商標名）膜を用
い、適当な条件下たとえば３気圧で絶えず撹拌し
ながら行う。得られた濾液を真空蒸留して濃縮
し、不溶性部分を遠心分離で除去する。得られ
る、白濁しているが沈殿はない溶液を０〜10℃に
冷却し、トリクロル酢酸を濃度５〜25ｇ／Ｖ％好
ましくは10ｇ／Ｖ％になるまで加えた。沈殿を生
じた溶液を０〜５℃に少なくとも１時間好ましく
は一夜放置し、ついで沈殿したタンパク質を同温
度で超遠心して除去すると、澄明な、鮮やかな黄
色の溶液が得られる。トリクロル酢酸処理によ
り、アルブミンを含めた高分子量の血清タンパク
質が除去される。高分子のサチエチン性を有する
炭水化物成分は少量のタンパク成分を含むが沈殿
せず溶液に残る。すなわち、このタンパク成分は
サチエチンの炭水化物部分に結合した、化学的結
合の形で存在するものと考えられる。

次の精製工程は除去限界少なくともＭ＝4000の
ゲルによる製造ゲルクロマトグラフイーである。
Sephadex Ｇ−15またはSephadex Ｇ−25（いず
れも登録商標名）を充填したカラムを使用するの
が好ましい。溶出液としてはPH6.6の0.1M酢酸ア
ンモニウム緩衝液を適当な条件下に使用する。こ
の緩衝液によればサチエチン活性をもつが分画が
効果的に分離できることが実験的に明らかにされ
た。しかもこの緩衝液は蒸発させることができる
ので、塩を含まない生成物が得られる点で実際上
有利である。このほか0.9％生理的食塩水または
PH6.0〜7.0の範囲の各種リン酸緩衝液を使用する
こともできる。活性分画はゲルカラムの除去容量
近くにあるように思われる（目的物質の分配係数
Kdが０である場合の除去容量V₀でゲルカラムか
ら排除される）。これは目的物分子はゲルの孔部
内径より大きく、したがつてゲルの内部には侵入
できないことを意味する。ゲルから排除され、溶
出液とともに溶出分画に現れる。これはカラムの
体積の３分の１に相当する。Sephadex Ｇ−15は
記載の方法では1500以上の分子量をもつ分子の通
過を抑えることができる。これより小さい分子量
をもつ血清由来の物質はゲルの内部に侵入し、溶
出が遅れる（この場合Kdは０より大きい）。限外
濾過で捕集された低分子物質および塩の量はサチ
エチン量に比べて著しく多く、この精製工程での
精製工率は大きさの順序にかかつている。タンパ
ク質の沈殿に使用したトリクロル酢酸は低分子化
合物としてゲルカラム中に残る。カラム容量の３
分の１に相当する溶出領域（除去領域）は塩や酸
を含まない活性物質が包含される。この分画を集
め、凍結下に濃縮する。その後の精製工程も同様
にゲルクロマトグラフイーであるが、除去容量
3000ダルトン以下のゲルを使用する。Bio−Gel
Ｐ−２（登録商標名）と蒸留水の使用が適当であ
る。この精製工程では、まだ生成物中に夾雑する
塩および低分子成分（たとえばペプチド破片）を
除去する。この工程でもサチエチン活性を有する
分画はゲルに捕えられず、カラム容量の３分の１
に相当する溶出容量に現われる。この分画を集め
て凍結乾燥すると、作用物質は取扱いの容易な淡
黄色粉末として得られる。ヒト血清１（限外濾
過液2/3に相当）から８〜10mgの凍結乾燥生成
物が得られる。この方法で製造された粗サチエチ
ンは標準と考えることができ、このまま食欲調整
の目的に実用できる純度を有する。この物質のサ
チエチン活性は25〜50S.E.／mgである。

生成物のサチエチン活性は確立された生物学的
方法で測定できる。サチエチン単位（S.E.）は、
96時間絶食させた体重200〜240ｇの雌CFYラツ
トの脳室内に適用した場合、標準飼料の１日目の
摂食量が平均24.04±0.76ｇから10ｇに低下する
作用量を意味する。

上述の粗サチエチンは動物血清（ウシ、ウマ、
ウサギ、ラツト等）からも同様に得られる。生成
物の収率、作用強度は動物の種類によつて異な
る。たとえばウシ血清からはヒトの場合と同じ活
性を有する生成物がヒトの場合よりやや高収率
に、10〜13mg／得られる。食欲中枢に特異的、
選択的に現れる作用の特徴は動物の種類によつて
変化することなく同一である。

上述の方法で得られた活性25〜50S・Ｅの粗サ
チエチンについて、ポリアクリルアミド上ナトリ
ウムドデシル硫酸（SDS）を用いるゲル電気泳動
またはポリアクリルアミドゲル上勾配電気泳動法
によつて測定した分子量は50000〜70000である。
この生成物は塩を夾雑せず、またアルブミンを事
実上含まず、タンパク成分は少なく（５〜25％）、
炭水化物成分は60〜90％である。凍結乾燥状態で
淡黄色の粉末である。この生成物の炭化水素成分
の主要構成成分はフコース、マンノース、カラク
トースおよびグルコースである。

加水分解生成物には常にかなりの量のグルコサ
ミンが検出できる。ポリアクリアミド上ナトリウ
ムドデシル硫酸で行つたゲル電気泳動と分析的等
電点電気泳動法では、タンパク染色によつて識別
できる線条４〜６がみられる（構成成分または統
合）。この生成物PH6.2または1.6の緩衝液にとり、
さらに荷電圧電気泳動を行うと混合物であること
がわかる。生成学的に活性な主成分は原点または
わずかにその陰極側に動く。電気泳動終了後、活
性物質をニンヒドリンまたは過ヨード酸で検出で
きるが、この物質が糖タンパク質であることは同
様に確認できる。

上述の方法で得られた粗サチエチンは電気泳動
により、また実験室的には濾紙電気泳動でさらに
精製できる。PH6.2の緩衝液中で行つた電気泳動
による分離では約75％の収率で、原点に残る
（Rf＝0.1）主生成物が得られる。一方２種のタン
パクないしは糖タンパクの性質をもつ夾雑物を陽
極の方向に動く。この方法で高い活性（60〜
100S.E.／mg）を示し、ニンヒドリン、過ヨウ素
酸に陽性な主生成物が完全に分離できる。

この方法で得られた物質はきわめて純度が高
い。これまで試みた実験（ゲルクロマトグラフイ
ー、ポリアクリルアミドゲル上勾配電気泳動）に
よればこの物質は均質であることを示している。
糖タンパク質としての性質を示すこの物質の活性
は約100S.E.／mgである。しかしながら組成およ
び活性にはわずかに変動があつて、なおこの物質
が完全には均一でないと考えられる。サチエチン
活性物質の精製に関するその後の研究から、上述
の方法で分離し電気泳動で精製した物質は最近開
発された親和性クロマトグラフイー（たとえば
D.M.Swallow，L.Evans，D.A.Hopkinson：
Nature269：261〜262，1977）によつてさらに精
製できることが明らかになつた。

親和性クロマトグラフイーでは、分離を目的と
する物質には存在するが夾雑物質にはない基に選
択的に結合できる物質を吸着剤として使用する。
糖タンパクであるサチエチンには、糖タンパクの
グルコピラノース基に特異的に結合する吸着剤を
使用する。この基に特異性を有する公知の吸着剤
としては“Con−Ａ−Sepharose”（登録商標名）
と呼ばれる吸着ゲルがとくに有利である。このゲ
ルはシアノブロミドで活性化されたSepharose4B
（登録商標名）にConcavalin Ａ（登録商標名）を
結合したものであり、特定の条件下にα−マンノ
ピラノシルおよびα−Ｄ−グルコピラノシル基を
含む分子に結合するが、この基のない夾雑物質
（タンパク質、ペプチド）はこのゲルに結合しな
い。この結合しない物質は初期の溶出液、すなわ
ちカラム容量の３分の１に相当する溶出液中に現
れる。ゲルに結合した糖タンパク物質は結合の様
式によつて、すなわち物質の化学的性質に応じて
分離され、とくにゲルに結合する物質の場合は勾
配溶出が用いられる。

親和性クロマトグラフイーを実施するにあたつ
てはあらかじめ分画化によつて精製した物質を中
性の出発緩衝液に溶解する。出発緩衝液としては
0.02モルのトリス塩酸塩（２−アミノ−２−ヒド
ロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸
塩）溶液を使用し、これに0.5〜1.0モル／の食
塩および好ましくは少量の（数ミリモルの）カル
シウムおよびマグネシウムイオンを含む緩衝液が
有利である。吸着剤とタンパク性夾雑物の間の非
特異的タンパク結合を低下させるためには、食塩
の濃度を高くする。出発緩衝液溶解した物質は、
吸着剤（好ましくはCon−Ａ−Sepharose）を充
填したカラムに適用する。カラムはあらかじめ、
たとえばカラム容量の10倍の緩衝液を通して、出
発緩衝液で平衡化する。

出発物質をカラムに適用したのち、濃度勾配
（α−メチルマンノシドの緩衝液中濃度が上つて
いく）のある溶出液で溶出する。溶出液は出発緩
衝液と、α−メチルマンノシドを含むほかは同一
とすることが好ましい。濃度0.5モル／のα−
メチルマンノシド溶液をたえず緩衝液に適加し、
常に撹拌を続ける方法が有用である。この方法で
直線性の勾配が得られる。溶出液はα−メチルマ
ンノシドの含量のみが変わつて、イオン濃度やPH
値は溶出の間を通じて変化しない。この過程を
254および280nmの波長を用いて光度計で追跡す
ると第２図に示すような溶出曲線が得られる。カ
ラムを素通りした最初のピーク１で示される分画
に夾雑物と考えられる。一方、カラムに結合する
糖タンパク質は保持時間が長く、ほぼ対称のピー
ク２として、α−メチルマンノシドの濃度が上が
ると溶出する。相当する分画を合する。この方法
で得られた物質は緩衝液成分の塩、α−メチルマ
ンノシドおよび高分子物質から分離された低分子
フラグメンを含むので、これから純粋な目的物質
を上述のゲルクロマトグラフイーによつて分離し
なければならない。この場合は、除去容量3000ダ
ルトン以下のゲル、好ましくはBio−Gel Ｐ−２
を使用する。溶出は脱イオン水による。生成物中
に含有される塩やその他の低分子量夾雑物は分子
径が小さいので、ゲルの内部に侵入し、保持され
る。純粋な、塩を含まないサチエチンはゲルの表
面にあつて、洗浄されてカラム容量の３分の１に
相当する最初の溶出液中に現れる。純粋なイオン
を含まない水の中の、作用物質分画を集め、凍結
乾燥する。この方法で完全に純粋、均一な作用物
質、サチエチンが白色粉末として得られる。

活性物質サチエチンのヒトまたは動物血清から
の製造および精製の全工程、中間生成物および収
量を第１図のフローシートに示した。このフロー
シートから明らかなように血清１から約1.5mg
の凍結乾燥サチエチンが得られ、その生物活性は
約100S.E.／mgである。

本発明によつて分離された精製サチエチンの分
子量はSDSを用いたゲル電気泳動によつて60000
ないし70000と確認された。PH値５〜７または７
〜９のアムホリン〔Amfolin（Pharmacia LKB
社、Bromma，Swedenの登録商標名）、この物
質は等電点電気泳動（IEF）によるタンパク質の
分離に使用されるキヤリアーとして両性の挙動を
示す〕およびポリアクリルアミドゲルを用いて等
電点電気泳動を行うと、等電点PI＝7.0〜7.1であ
る。生成物の酸加水分解物を分析した結果から、
次の組成を示す。

タンパク質 15％炭水化物 75％グルコサミン４％水５％アミノ酸成分およびアンモニアの分析：Asp1.21
％，Thr0.66％，Ser0.71％，Glu1.87％，
Pro0.45％，Gly0.42％，Ala1.58％，Cys0.13
％，Val0.55％，Met0.12％，Ile0.26％，
Leu0.90％，Tyr0.31％，Phe0.44％，NH₃0.24
％，Lys3.79％，His0.15％，Arg0.49％，糖成分：フコース19％、マンノース21％、ガラク
トース11％、グルコース24％分析値は凍結乾燥物についてのものである。凍
結乾燥状態の変化により水分含量は変動する。

ナトリウムドデシル硫酸で行つたポリアクリル
アミド−ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル
上勾配電気泳動および等電点電気泳動の結果は、
この物質が化学的に均一であることを示してい
る。

次に本発明の方法を以下の実施例によつてさら
に詳細に説明する。

例 (a) 3000mlのヒト血清をたえず撹拌しながらら３
〜４気圧においてAmicon UM−10膜フイルタ
ーによつて濾過する。得られた限外濾液（約
2000ml）を真空中で60mlまで蒸発させる。沈殿
を生じた濃縮液を9000ｇで30分間遠心分離す
る。上澄液を分離し、撹拌、冷却下に55％トリ
クロル酢酸12mlを滴加する。混合物を５〜10℃
に１時間放置する。沈殿したタンパク質を加速
30000で、５℃において超遠心して除去する。
得られた液体は完全に澄明である。この液体を
Sephadex Ｇ−15を充填したカラム（5.90cm）
に適用し、0.1モル酢酸アンモニウム緩衝液
（PH6.6）で溶出するクロマトグラフイーに付
す。500〜600mlの分画を集め、凍結乾燥する。
凍結乾燥残留物を水10mlに溶解し、Bio−Gel
Ｐ−２のカラム（2.5×90cm）に適用する。カ
ラムを蒸留水で溶出し、130〜180mlの分画を集
め、凍結乾燥する。この方法で、塩を含まない
粗サチエチン25〜30mgが淡黄色の粉末として得
られる。

(b) 上記方法で得られた粗生成物30mgを蒸留水に
５mg／mlの濃度に溶解する。この溶液を幅２
cm、長さ30cmに、Whatman3M（登録商標名）
電気泳動濾紙上に滴加する。この濾紙を乾燥
し、PH6.2（ピリジン10V％、酢酸0.5V％）の緩
衝液に均一に浸す。水平位置、電圧20V／cmで
４時間電気泳動を行う。次に濾紙を乾燥し、１
cmの帯に、ニンヒドリンまたは過ヨウ素酸−シ
ツフ試薬で発色させると、分離した成分の位置
がわかる。相当する濾紙の部分を切断して、蒸
留水で活性物質を抽出する。凍結乾燥すると活
性50〜100S.E.／mgの活性物質20〜23mgが得ら
れる。

(c) 電気泳動で精製した生成物20mgを出発緩衝液
（PH7.0、組成：トリス塩酸煙0.02モル／、
NaCl0.5モル／、塩化カルシウム0.01モル／
、塩化マンガン0.01モル／）４mlにとり、
Con−Ａ−Sepharose充填カラム（φ1.7cm、
＝37cm）に適用する。溶出は出発緩衝液100ml
で開始する。同じ組成の緩衝液100mlをたえず
撹拌しながら、これに0.5モル／のα−メチ
ルマンノシドを適加する。α−メチルマンノシ
ドの濃度は０から0.5モル／で直線的に徐々
に変化する。この過程を紫外線モニター（波長
254nm）で連続的に追跡する。各2.5mlの分画
をとる。所望の生成物を含む分画（75ml〜100
ml）を集め、凍結乾燥して容量10mlにする。

濃縮液から塩およびその他の低分子夾雑物を
除くために、Bio−Gel Ｐ−２充填カラム（φ
＝2.5cm、＝90cm）に適用し、蒸留水で溶出
する。140〜180mlの分画を集め、凍結乾燥す
る。純白色の、塩を含まない、均一の生成物が
得られる。このサチエチンの活性は100S.E.／
mgである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の一態様を示すフローシ
ートであり、第２図は本発明の粗生成物をCon
Ａ−Sepharoseカラムによる親和性クロマトグラ
フイーに付した場合の溶出液を紫外部吸収でモニ
ターして得られた溶出曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の物性： (i) SDSを用いるゲル電気泳動によつて測定し
て、60000〜70000の分子量； (ii) PH５〜７またはPH７〜９のアムホリンおよび
ポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳
動によつて測定して、7.0〜7.1の等電点PI； (iii) 凍結乾燥生成物の酸加水分解後の組成：タンパク質 15％炭水化物 75％グルコサミン４％水５％アミノ酸成分およびアンモニアの分析値： Asp1.21％，Thr0.66％，Ser0.71％， Glu1.87％，Pro0.45％，Gly0.42％， Ala1.58％，Cys0.13％，Val0.55％， Met0.12％，Ile0.26％，Leu0.90％， Tyr0.31％，Phe0.44％，NH₃0.24％， Lys3.79％，His0.15％，Arg0.49％，および糖成分の分析値：フコース19％、マンノース
21％、ガラクトース11％、グルコース24％、を有する特異的に食欲中枢に作用する食欲調整物
質を製造する方法において、ヒトおよび／または
動物血清を分子量50000までを通過させる膜フイ
ルターに通して濾過し、濾液を部分蒸発させ、得
られた濃縮液から不溶性部分を遠心分離によつて
除去し、ついで液相に０〜10℃でトリクロル酢酸
をその濃度が５〜25W／Ｖ％になるように添加
し、沈殿したタンパク質を遠心分離によつて除去
し、得られた溶液を除去容量4000ダルトン以下の
ゲル上で、0.5〜1.0％食塩溶液またはPH6.0〜7.0
のリン酸緩衝液を溶出液としてクロマトグラフイ
ーに付し、この生物活性分画を凍結乾燥により濃
縮し、この物質をあらためて除去容量3000ダルト
ン以下のゲル上で、クロマトグラフイーに付し、
水で溶出し、活性分画を凍結乾燥し、得られた粗
生成物をPH6.0〜6.5において電気泳動によつて精
製し、原点から主生成物を溶離し、グルコピラノ
ースおよび／またはマンノピラノース基に特異的
な親和性を示す吸着剤を用いる親和性クロマトグ
ラフイーに付すことを特徴とする上記食欲調整物
質の製造方法。２ヒトおよび／または動物血清を分子量50000
までを通過させる膜フイルターに通して濾過し、
濾液を部分蒸発させ、得られた濃縮液から不溶性
部分を遠心分離によつて除去し、ついで液相に０
〜10℃でトリクロル酢酸をその濃度が５〜25W／
Ｖ％になるように添加し、沈殿したタンパク質を
遠心分離によつて除去し、得られた溶液を除去容
量4000ダルトン以下のゲル上で、0.5〜1.0％食塩
溶液またはPH6.0〜7.0のリン酸緩衝液を溶出液と
してクロマトグラフイーに付し、この生物活性分
画を凍結乾燥により濃縮し、この物質をあらため
て除去容量3000ダルトン以下のゲル上で、クロマ
トグラフイーに付し、水で溶出し、活性分画を凍
結乾燥し、得られた生成物をPH6.0〜6.5において
電気泳動によつて精製し、原点から主生成物を溶
離し、グルコピラノースおよび／またはマンノピ
ラノース基に特異的な親和性を示す吸着剤を用い
る親和性クロマトグラフイーに付すことによつて
得ることができ、かつまた、下記の物性： (i) SDSを用いるゲル電気泳動によつて測定し
て、60000〜70000の分子量； (ii) PH５〜７またはPH７〜９のアムホリンおよび
ポリアクリルアミドゲルを用いる等電点電気泳
動によつて測定して、7.0〜7.1の等電点PI； (iii) 凍結乾燥生成物の酸加水分解後の組成：タンパク質 15％炭水化物 75％グルコサミン４％水５％アミノ酸成分およびアンモニアの分析値： Asp1.21％，Thr0.66％，Ser0.71％， Glu1.87％，Pro0.45％，Gly0.42％， Ala1.58％，Cys0.13％，Val0.55％， Met0.12％，Ile0.26％，Leu0.90％， Tyr0.31％，Phe0.44％，NH₃0.24％， Lys3.79％，His0.15％，Arg0.49％，および糖成分の分析値：フコース19％、マンノース
21％、ガラクトース11％、グルコース24％、を有することを特徴とする、食欲調整物質。