JPS5913197B2 - 胆汁酸の測定法 - Google Patents
胆汁酸の測定法Info
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- JPS5913197B2 JPS5913197B2 JP5157577A JP5157577A JPS5913197B2 JP S5913197 B2 JPS5913197 B2 JP S5913197B2 JP 5157577 A JP5157577 A JP 5157577A JP 5157577 A JP5157577 A JP 5157577A JP S5913197 B2 JPS5913197 B2 JP S5913197B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は胆汁酸の測定法に関する。
さらに詳しくは、本発明は胆汁酸を含む試料を酸性にし
て処理し、ついで３α一 ・・イドロキシステロイド・
デハイドロゲナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す）、ジア
ホラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下ＮＡＤと略す）、テトラゾリウム塩および塩基あるい
は緩衝剤を加え、試料をアルカリ性にし、生成する色素
化合物を吸光分析法により測定することを特徴とする胆
汁酸の測定法に関ｃ する。従来、胆汁酸の測定法とし
ては、ガスクロマトグラフィーや酵素を使用して行なう
方法が知られている。
て処理し、ついで３α一 ・・イドロキシステロイド・
デハイドロゲナーゼ（以下３α−ＨＳＤと略す）、ジア
ホラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以
下ＮＡＤと略す）、テトラゾリウム塩および塩基あるい
は緩衝剤を加え、試料をアルカリ性にし、生成する色素
化合物を吸光分析法により測定することを特徴とする胆
汁酸の測定法に関ｃ する。従来、胆汁酸の測定法とし
ては、ガスクロマトグラフィーや酵素を使用して行なう
方法が知られている。
以下に、酵素を使用する方法について詳述する。
０ 例えば、血清中の胆汁酸をアンパーライトＸＡＤ−
２を詰めたカラムで分離し、溶出液を蒸発乾固後、メタ
ノールで抽出する。
２を詰めたカラムで分離し、溶出液を蒸発乾固後、メタ
ノールで抽出する。
このメタノール抽出液に３α−ＨＳＤ’を添加し、この
時、生成するコレステノンを螢光物質（例えばヒドラジ
ン・・イド１５ レート）と反応させた後、螢光分析に
より定量する方法が知られている〔第２２回日本臨床病
理学会総会抄録９１頁（１９７５）〕。しかしながら、
該方法を用いて血清中の胆汁酸を定量する場合には血清
がｌｍｌ以上必要でありかつ蒸発乾固、抽出９０という
煩雑な操作が必要である等の欠点がある。更に、上記諸
欠点を改良した螢光分析法による胆汁酸の測定法が知ら
れている。〔臨床化学、第４巻、第３、４合併号、３１
２〜３１８頁（１９７６）〕この改良方法によれば、血
清０．２ゴをまず高温２５処理（例えば６７℃、２０分
間）する。冷却後、この液に３α−ＨＳＤジアホラーゼ
、ＮＡＤおよびレザズリンをＯ、ＩＭ−トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ９、Ｏ）に溶解した液を加える。そして該混合
液を室温処理（例えば２０℃、４０分間）したのち、３
０その処理液を螢光波長５８０ｎｍで測定する方法であ
る。しかしながら、この改阜方法においても胆汁酸の回
収率はたかだか９０％程度にすぎず、かつ胆汁酸を測定
する為に螢光物質を使用しているため、試料中の不純物
や用いる試薬により測定３５上の妨害をうけやすく測定
値のバラツキも大きい。又、螢光分析器という複雑な機
器をも必要としている。本発明者らは、胆汁酸の回収率
を上げて分析精度もよくかつ測定用の螢光物質も必要と
せす、簡卑な機器を使用して胆汁酸の分析を行なうこと
を目的として種々検討した結果、胆汁酸を含有する生体
成分を酸性にして処理し、ついで３α−ＨＳ仄ジアホラ
ーゼ、ＮＡＤｌテトラゾリウム塩および塩基あるいは緩
衝剤を加えアルカリ性にし、生成する色素化合物を可視
部吸光分析法によジ測定するという胆汁酸の回収率の高
いかつ分析精度の良い方法を見出し本発明を完成した。
時、生成するコレステノンを螢光物質（例えばヒドラジ
ン・・イド１５ レート）と反応させた後、螢光分析に
より定量する方法が知られている〔第２２回日本臨床病
理学会総会抄録９１頁（１９７５）〕。しかしながら、
該方法を用いて血清中の胆汁酸を定量する場合には血清
がｌｍｌ以上必要でありかつ蒸発乾固、抽出９０という
煩雑な操作が必要である等の欠点がある。更に、上記諸
欠点を改良した螢光分析法による胆汁酸の測定法が知ら
れている。〔臨床化学、第４巻、第３、４合併号、３１
２〜３１８頁（１９７６）〕この改良方法によれば、血
清０．２ゴをまず高温２５処理（例えば６７℃、２０分
間）する。冷却後、この液に３α−ＨＳＤジアホラーゼ
、ＮＡＤおよびレザズリンをＯ、ＩＭ−トリス塩酸緩衝
液（ｐＨ９、Ｏ）に溶解した液を加える。そして該混合
液を室温処理（例えば２０℃、４０分間）したのち、３
０その処理液を螢光波長５８０ｎｍで測定する方法であ
る。しかしながら、この改阜方法においても胆汁酸の回
収率はたかだか９０％程度にすぎず、かつ胆汁酸を測定
する為に螢光物質を使用しているため、試料中の不純物
や用いる試薬により測定３５上の妨害をうけやすく測定
値のバラツキも大きい。又、螢光分析器という複雑な機
器をも必要としている。本発明者らは、胆汁酸の回収率
を上げて分析精度もよくかつ測定用の螢光物質も必要と
せす、簡卑な機器を使用して胆汁酸の分析を行なうこと
を目的として種々検討した結果、胆汁酸を含有する生体
成分を酸性にして処理し、ついで３α−ＨＳ仄ジアホラ
ーゼ、ＮＡＤｌテトラゾリウム塩および塩基あるいは緩
衝剤を加えアルカリ性にし、生成する色素化合物を可視
部吸光分析法によジ測定するという胆汁酸の回収率の高
いかつ分析精度の良い方法を見出し本発明を完成した。
以｝、本発明を詳細に説明する。
まず本発明の原理について述べる。
胆汁酸とＮＡＤとが、３α−ＨＳＤの存在下に反応する
ことによＶ）３−ケトステロイドと還元型ＮＡＤ（以下
ＮＡＤＨ２と略す）とが生成する。
ことによＶ）３−ケトステロイドと還元型ＮＡＤ（以下
ＮＡＤＨ２と略す）とが生成する。
ついで、この生成したＮＡＤＨ２とテトラゾリウム塩が
ジアホラーゼの存在下に反応することによりＮＡＤと色
素化合物とが生成する。胆汁酸１モルに対し１モルある
いは１／２モル生成するこの色素化合物の可視部（波長
４００−ニ６００ｎｍ）での吸光度を測定することによ
り対応する生体成分中の胆汁酸を定量することができる
。
ジアホラーゼの存在下に反応することによりＮＡＤと色
素化合物とが生成する。胆汁酸１モルに対し１モルある
いは１／２モル生成するこの色素化合物の可視部（波長
４００−ニ６００ｎｍ）での吸光度を測定することによ
り対応する生体成分中の胆汁酸を定量することができる
。
尚、胆汁酸とＮＡＤとの反応の際に、血中酵素（例えば
ラクチック・デハイドロゲナーゼ、マレ[■■・・イド
ロゲナーゼ等）がこの反応の妨害酵素となるので、これ
らの血中酵素を何んらかの処理によシ失活させておく必
要がある。
ラクチック・デハイドロゲナーゼ、マレ[■■・・イド
ロゲナーゼ等）がこの反応の妨害酵素となるので、これ
らの血中酵素を何んらかの処理によシ失活させておく必
要がある。
本発明においては、酸性で而中酵素を失活させるか、失
活した血中酵５素を、さらに酵素（例えば酸性プロテア
ーゼ、ペプチダーゼ等）で分解させる。本発明方法によ
ると、生体成分を酸性（ＰＨＯ．ｌ〜６．０）にし、熱
処理（温度２０〜４５℃、時間１〜３０分間）する。
活した血中酵５素を、さらに酵素（例えば酸性プロテア
ーゼ、ペプチダーゼ等）で分解させる。本発明方法によ
ると、生体成分を酸性（ＰＨＯ．ｌ〜６．０）にし、熱
処理（温度２０〜４５℃、時間１〜３０分間）する。
この処理により、生体成分５中の血中酵素は失活する。
さらに望ましくはこの処理時に、酸性で有効な酵素（例
えば酸性プロテアーゼ、ペプチダーゼ等を加えることに
より１生体成分中の失活した血中酵素をさらに分解させ
ておくことがよい。 ４
上記熱処理された液に例えばジアホラーゼＮＡＤ、テト
ラゾリウム塩、界面活性剤および緩衝剤から成る発色試
薬液を加え、さらに熱処理（温度２０〜５０℃、時間１
〜３０分間）する。
さらに望ましくはこの処理時に、酸性で有効な酵素（例
えば酸性プロテアーゼ、ペプチダーゼ等を加えることに
より１生体成分中の失活した血中酵素をさらに分解させ
ておくことがよい。 ４
上記熱処理された液に例えばジアホラーゼＮＡＤ、テト
ラゾリウム塩、界面活性剤および緩衝剤から成る発色試
薬液を加え、さらに熱処理（温度２０〜５０℃、時間１
〜３０分間）する。
この場合、固体の発色試薬に上記熱処理された液を加え
て溶解し、さらに熱処理してもよい。ついで、この混合
液に３α−ＨＳＤを加えたのちＰＨをアルカリ性（ＰＨ
７．５〜１２．５）に調整する。無論、３α−ＨＳＤを
含有するアルカリ溶液を用いてもよい。その後、この液
の吸光度を波長４００〜６００ｎｍで測定する。生体成
分中の胆汁酸の量は発色剤の分子吸光係数あるいは検量
線を用いて算出することができる。又、本発明において
発色試薬液に３α−ＨＳＤを一緒に混合して使用しても
よい。
て溶解し、さらに熱処理してもよい。ついで、この混合
液に３α−ＨＳＤを加えたのちＰＨをアルカリ性（ＰＨ
７．５〜１２．５）に調整する。無論、３α−ＨＳＤを
含有するアルカリ溶液を用いてもよい。その後、この液
の吸光度を波長４００〜６００ｎｍで測定する。生体成
分中の胆汁酸の量は発色剤の分子吸光係数あるいは検量
線を用いて算出することができる。又、本発明において
発色試薬液に３α−ＨＳＤを一緒に混合して使用しても
よい。
本発明で対象となる胆汁酸を含有する生体成分としては
例えば血清、尿、胆汁等が挙げられる。
例えば血清、尿、胆汁等が挙げられる。
もちろん対象となる試料としては胆汁酸を含むものであ
ればいずれでもよい。定量に際して用いられる生体成分
量としては、血情、尿で０．０１〜１ｍ１１胆汁で０．
００１〜０．１ｍ１の範囲が好ましい。
ればいずれでもよい。定量に際して用いられる生体成分
量としては、血情、尿で０．０１〜１ｍ１１胆汁で０．
００１〜０．１ｍ１の範囲が好ましい。
生体成分を酸性にする為に使用される酸としては、例え
ば塩酸、硫酸等の鉱酸あるいはクエン酸、リンゴ酸等の
有機酸等が挙げられる。
ば塩酸、硫酸等の鉱酸あるいはクエン酸、リンゴ酸等の
有機酸等が挙げられる。
発色試薬液に用いられるテトラゾリウム塩（発色剤）と
しては、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ
−ニトロフエニル）−５−フエニル一２Ｈ１テトラゾリ
ウム・クロライド（以下ＩＮＴと略する）、３，３５−
（３，３５−ジメトキシ−４，４しビフエニレン）−ビ
ス〔２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル一２Ｈ
ｅテトラゾリウム・クロライド〕（以下ＮＴＢと略す）
等が挙げられる。
しては、例えば３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ
−ニトロフエニル）−５−フエニル一２Ｈ１テトラゾリ
ウム・クロライド（以下ＩＮＴと略する）、３，３５−
（３，３５−ジメトキシ−４，４しビフエニレン）−ビ
ス〔２−（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル一２Ｈ
ｅテトラゾリウム・クロライド〕（以下ＮＴＢと略す）
等が挙げられる。
発色試薬液に用いられる界面活性剤としては例えばトリ
トンＸ−１００（ロームアンドハウス社製）等が挙げら
れる。
トンＸ−１００（ロームアンドハウス社製）等が挙げら
れる。
発色試薬液に用いられる緩衝液としては、例えばホウ酸
緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
又、この発色試薬液を構成する各成分の濃度は次の通シ
である。ジアホラーゼの濃度としては０．１１Ｕ〜１０
万ＩＵ／ｔの範囲が好ましい。
である。ジアホラーゼの濃度としては０．１１Ｕ〜１０
万ＩＵ／ｔの範囲が好ましい。
ＮＡＤの濃度としては０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲が好
ましい。
ましい。
テトラゾリウム塩の濃度としては０．１ｎ１Ｍ〜５０ｍ
Ｍの範囲が好ましい。
Ｍの範囲が好ましい。
界面活性剤の濃度としては０．００１〜５％の範囲が好
ましい。
ましい。
３α−ＨＳＤの濃度としては、反応完丁時間により適宜
選択できるが例えば０．０００１１Ｕ〜１００１ｕ／ｔ
の範囲が好ましい。
選択できるが例えば０．０００１１Ｕ〜１００１ｕ／ｔ
の範囲が好ましい。
測定液をアルカリ性にする塩基としては例えば苛性ソー
ダ、苛性カリ等が挙げられる。
ダ、苛性カリ等が挙げられる。
以下本発明の実施例を示す。
実施例 １
１試薬
発色試薬液：０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）中に
次の４成分を下記の割合で含む。
次の４成分を下記の割合で含む。
ジアホラーゼ（ウオーシントン・バイオケミカル社製、
３０１Ｕ／ワ） ０．００５５％＠／ｖ）ＮＡＤ（協
和醗酵社製） ０．３２％（ｗ／ｖ）ＩＮＴ（シグマ
社製） ０．０２６％（ｗ／ｖ）トリトンＸ（商品
名、ローム・ア，ンド・ハウス社製） ０．１％
（ｗ／ｖ）２操作 肝硬変患者の血晴０．２ｍ１ずつ採取し、被験液とし、
それぞれに０．１Ｎ−ＨＣｔＯ．２ｍｌと蒸留水０．３
ｍ１を加えて３ｒＣで１０分間加温する。
３０１Ｕ／ワ） ０．００５５％＠／ｖ）ＮＡＤ（協
和醗酵社製） ０．３２％（ｗ／ｖ）ＩＮＴ（シグマ
社製） ０．０２６％（ｗ／ｖ）トリトンＸ（商品
名、ローム・ア，ンド・ハウス社製） ０．１％
（ｗ／ｖ）２操作 肝硬変患者の血晴０．２ｍ１ずつ採取し、被験液とし、
それぞれに０．１Ｎ−ＨＣｔＯ．２ｍｌと蒸留水０．３
ｍ１を加えて３ｒＣで１０分間加温する。
次いで、これら処理済被験液に上記発色試薬液２．０ｍ
１を加えたのち、一方には０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ
９．Ｏ）に溶解した３α−ＨＳＤ（協和醗酵社製，０．
９８４１Ｕ／Ｍ９）〔０．１％（蹄４）〕０．３ｍ１を
加えて検体とし、又、一方には蒸留水０．３ｍ１を加え
ブランクとする。ついで３７℃で１５分間加渦したのち
ブランクを対照として５００ｎｍでの吸光度を測定し、
０．３５２を得た。血清中の胆汁酸の濃度は上記の吸光
度と発色剤１ＮＴの５００ｎｍにおける分子吸光係数（
１．５×１０４）より算出され３５２μＭであつた。
１を加えたのち、一方には０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ
９．Ｏ）に溶解した３α−ＨＳＤ（協和醗酵社製，０．
９８４１Ｕ／Ｍ９）〔０．１％（蹄４）〕０．３ｍ１を
加えて検体とし、又、一方には蒸留水０．３ｍ１を加え
ブランクとする。ついで３７℃で１５分間加渦したのち
ブランクを対照として５００ｎｍでの吸光度を測定し、
０．３５２を得た。血清中の胆汁酸の濃度は上記の吸光
度と発色剤１ＮＴの５００ｎｍにおける分子吸光係数（
１．５×１０４）より算出され３５２μＭであつた。
実施例 ２
実施例１において肝硬変患者の血清０．２ｍ１の代わり
に同じ肝硬変患者の血清１０ｍ１に標準物質のグリココ
ール酸（Ｃ２６Ｈ４３ＮＯ６・１．５Ｈｅ０ツＭ７二４
９３）０．４９３η（濃度１００μＭ）を加えたものか
ら検体およびブランクとしてそれぞれ０．２ｍ１ずつ採
取した他は実施例１の操作と同様の操作を行ない吸光度
として０．４４７の値を得た。
に同じ肝硬変患者の血清１０ｍ１に標準物質のグリココ
ール酸（Ｃ２６Ｈ４３ＮＯ６・１．５Ｈｅ０ツＭ７二４
９３）０．４９３η（濃度１００μＭ）を加えたものか
ら検体およびブランクとしてそれぞれ０．２ｍ１ずつ採
取した他は実施例１の操作と同様の操作を行ない吸光度
として０．４４７の値を得た。
したがつてグリココール酸による吸光度の上昇分は検体
に一定の標品を添加した時の吸光度（本実施例によつて
得られた値）と検体に標品未添加の時の吸光度（実施例
１によつて得られた値）とΩ差（即ち０．４４７−０．
３５２）より０．０９５として算出された。したがつて
検出されたグルココール酸の濃度は９５μＭである。よ
つてグリココール酸の回収率は次の様になる。グリココ
ール酸の回収率 実施例 ３ １試薬 発色試薬液：０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）中に
次の５成分を下記の割合で含む。
に一定の標品を添加した時の吸光度（本実施例によつて
得られた値）と検体に標品未添加の時の吸光度（実施例
１によつて得られた値）とΩ差（即ち０．４４７−０．
３５２）より０．０９５として算出された。したがつて
検出されたグルココール酸の濃度は９５μＭである。よ
つてグリココール酸の回収率は次の様になる。グリココ
ール酸の回収率 実施例 ３ １試薬 発色試薬液：０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）中に
次の５成分を下記の割合で含む。
ジアホラーゼ（ウオーシントン・バイオケミカル社製，
３０１し〜）０．００５５％（ｗ／ｖ） ＮＴＢ（シグマ社製） ０．０２６％（ｗ／ｖ）ＮＡ
Ｄ（？和醗酵社製） ０．３２％（ｗ／ｖ）３α−ＨＳ
Ｄ（？和醗酵社製、０．９８４１し〜）０．１％（ｗ／
ｖ）トリトンＸ（商品名、ローム・アンド・ハウス社製
） ０．１％（ｗ／ｖ）２操作 肝硬変患者の血清０．２ｍ１を採取し、被験液として、
これにペプシン（ウオーシントン・バイオケミカル社製
，２５００１ＵＡ）０．１％（ｗ／ｖ）を含有する０．
０１Ｎ−ＨＣｔＯ．８ｍｌを加え、３７℃で１０分間加
温した。
３０１し〜）０．００５５％（ｗ／ｖ） ＮＴＢ（シグマ社製） ０．０２６％（ｗ／ｖ）ＮＡ
Ｄ（？和醗酵社製） ０．３２％（ｗ／ｖ）３α−ＨＳ
Ｄ（？和醗酵社製、０．９８４１し〜）０．１％（ｗ／
ｖ）トリトンＸ（商品名、ローム・アンド・ハウス社製
） ０．１％（ｗ／ｖ）２操作 肝硬変患者の血清０．２ｍ１を採取し、被験液として、
これにペプシン（ウオーシントン・バイオケミカル社製
，２５００１ＵＡ）０．１％（ｗ／ｖ）を含有する０．
０１Ｎ−ＨＣｔＯ．８ｍｌを加え、３７℃で１０分間加
温した。
ついで、この混合液に上記発色試薬液２ｍ１を加え、さ
らに３７℃で１５分間加温した。肝硬変患者の血清の代
わりに蒸留水０．２ｍ１をとｖ、以下検体と同様に処理
したものをプランクとした。この反応液のブランクを対
照にした５５０ｎｍでの吸光度は０．２３０であつた。
血清中の胆汁酸の量は得られた吸光度および発色剤ＮＴ
Ｂの５５０ｎｍでの分子吸光係数（３．６４×１０４）
とから算出され、１９０１ｔＭであつた。実施例 ４ 実施例３において肝硬変患者の血清０．２ＷＬ１の代わ
りに同じ肝硬変患者の血清１０−に標準物質のグリココ
ール酸（Ｃ２６Ｈｌ３ＮＯ６・１．５Ｈ２０，Ｍｗ＝４
９３）０．４９３η（濃度１００μＭ）を加えたものか
ら検体およびブランクとしてそれぞれ０．２ｍ１ずつ採
取した他は実施例３の操作と同様の操作を行ない吸光度
として０．３４８の値を得た。
らに３７℃で１５分間加温した。肝硬変患者の血清の代
わりに蒸留水０．２ｍ１をとｖ、以下検体と同様に処理
したものをプランクとした。この反応液のブランクを対
照にした５５０ｎｍでの吸光度は０．２３０であつた。
血清中の胆汁酸の量は得られた吸光度および発色剤ＮＴ
Ｂの５５０ｎｍでの分子吸光係数（３．６４×１０４）
とから算出され、１９０１ｔＭであつた。実施例 ４ 実施例３において肝硬変患者の血清０．２ＷＬ１の代わ
りに同じ肝硬変患者の血清１０−に標準物質のグリココ
ール酸（Ｃ２６Ｈｌ３ＮＯ６・１．５Ｈ２０，Ｍｗ＝４
９３）０．４９３η（濃度１００μＭ）を加えたものか
ら検体およびブランクとしてそれぞれ０．２ｍ１ずつ採
取した他は実施例３の操作と同様の操作を行ない吸光度
として０．３４８の値を得た。
したがつてグリココール酸による吸光度の上昇分は検体
に一定の標品を添加した時の吸光度（本実施例によつて
得られた値）と検体に標品未添加の時の吸光度（実施例
３によつて得られた値）との差（即ち、０．３４８−０
．２３０）より０．１１８として算出された。したがつ
て、検出されたグリココール酸の濃度は９７１ｔＭであ
る。よつてグリココール酸の回収率は次の様になる。グ
リココール酸の回収率 実施例 ５ 発色試薬液（実施例１において用いられたのと同じもの
）２ｍ１１０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）０．５
ｗＬ１および３α−ＨＳＤ（０．９８４１Ｕ／Ｒｆｌｇ
）０．１％（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍホウ酸緩衝液
（ＰＨ９．Ｏ）０．３ｍ１を混合し、３７℃で１０分間
加温した。
に一定の標品を添加した時の吸光度（本実施例によつて
得られた値）と検体に標品未添加の時の吸光度（実施例
３によつて得られた値）との差（即ち、０．３４８−０
．２３０）より０．１１８として算出された。したがつ
て、検出されたグリココール酸の濃度は９７１ｔＭであ
る。よつてグリココール酸の回収率は次の様になる。グ
リココール酸の回収率 実施例 ５ 発色試薬液（実施例１において用いられたのと同じもの
）２ｍ１１０．１Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）０．５
ｗＬ１および３α−ＨＳＤ（０．９８４１Ｕ／Ｒｆｌｇ
）０．１％（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍホウ酸緩衝液
（ＰＨ９．Ｏ）０．３ｍ１を混合し、３７℃で１０分間
加温した。
その後、この液に標準物質のソジウム・デオキシコレー
ト（２３３．４μＭ）（以下ＳＤと略す）、キノデオキ
シコレート（２１１．４μＭ）（以下ＣＤＣと略す）、
グリココール酸（２０９．１μＭ）（以下ＧＣＡと略す
）およびソジウム・タウロコレート（１９６．３μＭ）
（以下ＳＴＣと略す）の各溶液を０．２ｍ１ずつ加え、
それぞれ３７℃で５分間加温した各液の５００ｎｍでの
吸光度（測定値および理論値）および回収率は次の通り
である。実施例 ６ 健常成人男子の尿７ａを酢酸でＰＨ５とし、これにβ−
グルクロニダーゼ（ベーリンガ一・マンハイム社製，３
１Ｕ／η）０．２５１Ｕを加え５０℃で１５時間加温し
た。
ト（２３３．４μＭ）（以下ＳＤと略す）、キノデオキ
シコレート（２１１．４μＭ）（以下ＣＤＣと略す）、
グリココール酸（２０９．１μＭ）（以下ＧＣＡと略す
）およびソジウム・タウロコレート（１９６．３μＭ）
（以下ＳＴＣと略す）の各溶液を０．２ｍ１ずつ加え、
それぞれ３７℃で５分間加温した各液の５００ｎｍでの
吸光度（測定値および理論値）および回収率は次の通り
である。実施例 ６ 健常成人男子の尿７ａを酢酸でＰＨ５とし、これにβ−
グルクロニダーゼ（ベーリンガ一・マンハイム社製，３
１Ｕ／η）０．２５１Ｕを加え５０℃で１５時間加温し
た。
この液を水で１０ｍ１に希釈し、その０．２ｍ１を採取
し、以下実施例３と同様に行ない５５０ｎｍでの吸光度
を測定した。その値は０．０４５であり、これから尿中
の胆汁酸の量は５３μＭと算出された。実施例 ７
測定値の再現性試験 実施例３において肝硬変患者の血清０．２ｄの代わりに
他の肝硬変患者の血清０．２ＴｆＬ１．ずつ１０検体を
用いた他は実施例３と同様に行ない、下記の１０回の測
定値を得た。
し、以下実施例３と同様に行ない５５０ｎｍでの吸光度
を測定した。その値は０．０４５であり、これから尿中
の胆汁酸の量は５３μＭと算出された。実施例 ７
測定値の再現性試験 実施例３において肝硬変患者の血清０．２ｄの代わりに
他の肝硬変患者の血清０．２ＴｆＬ１．ずつ１０検体を
用いた他は実施例３と同様に行ない、下記の１０回の測
定値を得た。
上記の値から平均値、標準偏差および変動係数は次の通
りである。
りである。
平均値（マ） ：７５．２μＭ
標準偏差（ＳＤ）：１．０３２
変動係数（Ｃ）：１．３％
参考例 １
本発明法と螢光法によつて得られた胆汁酸の測定値の相
関を調べた。
関を調べた。
各種血清１０検体を用い、実施例３と同様に実験を行な
つた。
つた。
螢光法の測定は大管らの文献によつた。
〔臨床化学・第４巻・第３・４合併号、３１２〜 ３１
８頁（１９７６）〕上記の表から、本発明法（ｙ）と蛍
光法（ｘ）との相関係数および回帰直線は次の様になる
。
８頁（１９７６）〕上記の表から、本発明法（ｙ）と蛍
光法（ｘ）との相関係数および回帰直線は次の様になる
。
相関係数：０．９９
回帰直線：ｙ＝１．０１ｘ−０．３５
Claims (1)
- １ 胆汁酸を含有する試料を酸性とし、熱処理した後、
胆汁酸とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
ＮＡＤという）とを３α−ハイドロキシステロイド・デ
ハイドロゲナーゼと反応せしめ３−ケトステロイド及び
還元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨという）を生成せしめ、生
成したＮＡＤＨとテトラゾリウム塩とをジアホラーゼの
存在下に反応せしめて色素化合物を生成せしめ、該色素
に基ずく反応液の可視部における吸光度を測定すること
を特徴とする胆汁酸の測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5157577A JPS5913197B2 (ja) | 1977-05-04 | 1977-05-04 | 胆汁酸の測定法 |
| DE19782818327 DE2818327A1 (de) | 1977-05-04 | 1978-04-26 | Verfahren zur quantitativen bestimmung des gesamten gallensaeuregehalts einer analysenprobe |
| FR7812431A FR2389892A1 (en) | 1977-05-04 | 1978-04-26 | Colorimetric assay of total bile acid content - of blood, urine or bile, by reducing tetrazolium salt to formazan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5157577A JPS5913197B2 (ja) | 1977-05-04 | 1977-05-04 | 胆汁酸の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53136893A JPS53136893A (en) | 1978-11-29 |
| JPS5913197B2 true JPS5913197B2 (ja) | 1984-03-28 |
Family
ID=12890739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5157577A Expired JPS5913197B2 (ja) | 1977-05-04 | 1977-05-04 | 胆汁酸の測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5913197B2 (ja) |
| DE (1) | DE2818327A1 (ja) |
| FR (1) | FR2389892A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56144096A (en) * | 1980-04-09 | 1981-11-10 | Nyegaard & Co As | Diagnosis method and reagent system thereof |
| CA1163907A (en) * | 1980-04-09 | 1984-03-20 | Manabu Yamanaka | Method for the estimation of hydroxysteroids and reagent system therefor |
| JPS5754598A (en) * | 1980-09-16 | 1982-04-01 | Sugiura Mamoru | Measurement of bile acid, measuring reagent, and measuring reagent kit |
| DE3236388A1 (de) * | 1982-10-01 | 1984-04-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur selektiven herstellung reduzierter sauerstoffspezies und hierfuer geeignete reagentien |
| WO2002027012A1 (fr) * | 2000-09-28 | 2002-04-04 | Arkray, Inc. | Procede de production de produits de degradation de proteines |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2053897A5 (en) * | 1969-07-09 | 1971-04-16 | American Hospital Supply Corp | Dehydrogenase activity determination with - dyeing composition |
-
1977
- 1977-05-04 JP JP5157577A patent/JPS5913197B2/ja not_active Expired
-
1978
- 1978-04-26 DE DE19782818327 patent/DE2818327A1/de not_active Withdrawn
- 1978-04-26 FR FR7812431A patent/FR2389892A1/fr not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2818327A1 (de) | 1978-11-16 |
| FR2389892A1 (en) | 1978-12-01 |
| JPS53136893A (en) | 1978-11-29 |
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