JPS5913732A - 血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な血栓溶解剤に関する。

血栓症は、外科手術、分べん、外傷あるいは伝染性疾病
等におし・て血管内に血液の結塊を形成されることによ
ってひき起こされることが多く、この危険を取り除くべ
く種々の試みがなされている。ヘパリン、クマリン誘導
体等の抗凝血剤の投与はその１例である一０他の例は、
血栓溶解剤の使用である。血栓溶解剤は、血栓症におい
て生成した血塊を溶解によって血管から移動させる機能
を有するものである。

血塊は、酵素トロンビンの作用によってフィブリノゲン
から形成されたフィブリンで構成されている。一方、正
常な血液はプラスミノーゲンを含有しており、このプラ
スミノーゲンがプラスミンに作用するとフィブリンを溶
解してそれを酵素作用によって分解するものである。循
環する血液は、血管内に血塊が生ずると直ちにこれを劣
化させて取除くために必要なすべての含有物を含んでは
いるが、実際には、身体の自己血栓溶解の潜在能力は、
このような目的を充分満足させることは難しい。これは
、血中のプラスミノーゲン・アクチベータの濃度が不充
分であることに起因している。したがって、体外から血
栓溶解剤を投与することが血栓症の有力今日、尿又は培
養腎細胞から分離されたプラスミノーゲン・アクチベー
タであるウロキナーゼ、ストレプトコソキから採られる
プラスミノーゲン・アクチベータてあろストレプトキナ
ーゼながら、ウロキナーゼもストレプトキナーゼも血液
から採った正常のプラスミノーゲ／・アクチベータとは
異なるものであり、とくに、これらはフィブリンに対し
て特異的な親和性をもっていないので、血栓症の治療に
おけろウロキナーゼ及びストレプトキナーゼの使用結果
は、すべての点で必ずしも十分満足できるものではない
。所望の効果を得るためには比較的多量の投与を必要と
するが、大量投与は、フィブリノーゲン溶解ある（・は
内出血等の危険な副作用を招く原因となる。したがって
、比較的大規模に製造でき、かつ、副作用の少ない高い
血栓＠解活性を有する薬剤の開発が強く要望されている
。

本発明者等は、血液から採った正常のプラスミノーゲン
・アクチベータと強い関係をもち、かつ、血栓症の治療
におし・て効果の大きい血栓溶解活性を有するプラスミ
ノーゲン・アクチベータを探索した結果、ヒトの腎臓又
は血管等の組織から新規なプラスミノーゲン・アクチベ
ータを分離精製することに成功し、この物質及びその製
造方法についてすでに提案した。先の４是案に係る新規
なプラスミノーゲン・アクチベータは、ヒト腎臓あるい
はヒト血管等から分離精製される組織プラスミノーゲン
・アクチベータである。ｌ（ｗａａｎら（　Ｆｅｄ．　
Ｐｒｏｃ．　２４，　３８７（　１９６５）　）もヒト
腎臓維続プラスミノーゲン・アクチベータの研究を行な
っているが、Ｋｕｃ　ｉ　ｎｓ　ｋ　ｉら、Ｂｅｒｎｉ
ｋら、Ｂａｒｌｏｗら、Ａ．ｓｔｅｄらあるいはＬｅｗ
＋ｓのその後の研究により、このようなヒト腎臓組織の
培養により得られるプラスミノーゲン・アクチベータは
ウロキナーゼと免疫学的及び物理化学的に同一であるこ
とが明らかにされており、ウロキナーゼの副作用が知ら
れつつある今日、ヒト腎賊等の組織からプラスミノーゲ
ン・アクチベータを分離精製し、これを血栓溶解剤とす
る勇気を喪失させた。しかるに、本発明者美は、驚くー
＼きことに、ヒト腎臓やヒト血管から、ウロキナーゼと
全く性質を異にする組織プラスミノーゲン・アクチベー
タの分離精製に成功するとともに、この新規なアクチベ
ータについてあらゆる観点から検討を進める中で、強力
な血栓溶解効力を見（・出し、本発明を完成するに至っ
たものである。

本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・
アクチベータは、次の特徴を有する。

（１）　　ナトリウムトテンルサルフェ−１・−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により、１本のタン白質バ
ンドを示し、みかけの分子量が約５５、Ｃ１００±ｉ．
　ｏ　ｏ　ｏであること。

（２）　　還元剤の存在によってもみかけの分子量は変
化しないこと。

（３）　　等電点電気泳蛎法による主バンドのｐ■が７
〜９の範囲にあること。

（４）抗ウロキナーゼＩｇＧ−セファロース親和性クロ
マトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を有す
ること。

（５）　　次のグループＡの物質に加水分解活性を示し
、グループＢの物質に活性を示さなし・性質を有するこ
、と。

グループＡ：Ｉｆ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル↑ 、、ｌ、　　１７７ンーＲ−ニトロアニリドジヒドロク
ロライド及び！−Ｉ−Ｄ−イソロイシルーし一プロリル
−Ｌ−アルギン−に−二トロアニリドジヒドロクロライ
ド。

グループＢ　：　Ｂｏｃ　−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド、
カルボベンゾキシ−し−フェニルアラニル−Ｌ−アルギ
ニン−４−１ｆルクマリル−７−アミド、Ｌ−プロリル
−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−メチル
クマリル−７−アミド、グルタリルグリシル−Ｌ−アル
ギニン−４−メチルクマリル−７−アミド。

本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン拳
アクチベータは、以上のような特徴的性質を有し、当該
アクチベータは、フィブリン−セファロ−ヌカラムに実
質的に全て吸着され、かつ、２Ｍ　Ｎ１．−Ｉ、ＳＣＮ
により溶出され、また組織あるいは血管から１乃至２Ｍ
のＮＩ（４５ＣＮ（ｐＨ７，４）で抽出あるいはかん流
され、０．１％のトリトンＸ−１００等の存在下で精製
されるものてあって、ｐ　Ｈ７，４の緩衝液中４°Ｃで
２週間後も安定なものである。

本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・
アクチベータは、例えば、次のようにして製造される。

ヒト腎臓又はヒト血管から常法によりアンモニラムチオ
シアイ・−トの存在下で抽出し、次いで酸性にして沈澱
物を得、これを再び緩衝液で抽出して抽出液を得、次（
・で該抽出液をイオン交換体を保持するカラム、Ｌ−ア
ルギニンあるいはアルギニン誘導体を担体に結合したカ
ラム、時 血球凝集素を担体に結合したカラム、分子＼能を有する
担体を保持するカラムから選ばれるカラム又はこれらを
組み合せた複数のカラムに通じて精製するごとにより得
ることができろ。

本発明に係る血栓溶解剤は、以下に示す実施例により自
ずと明らかであるが、成分たるプラスミノーゲン・アク
チベータは正常細胞由来であることが特記されなければ
ならない。悪性しゅよう細胞由来のプラスミノーゲン・
アクチベータも血栓溶解活性があることが知られている
が、ヒトに投与する医薬としての性格−に、長期にある
いは大量に投与する場合のあらゆる危険性を考虜するな
らば、本発明に係る血栓溶解剤の一安全性がその由来に
おいてずでに確保されている。更に、ウロキナーゼとは
異なり、本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノ
ーゲン・アクチベータは、血液から採った正常のプラス
ミノーゲンーアクチベータと同様な、フィブリンに対す
る特異な親和性を有しているので、血栓症の治療に十分
満足しうる結果を与える。

加えて内出血あるいはアナフィラキシ−・ショック等副
作用もなく、本発明に係る血栓溶解剤は、極めて有効な
治療薬である。

本発明に係る血栓溶解剤は、適当な用量で患者に投与し
てよく、そして副作用が少なし・か又はない潜在力及び
有効血栓溶解力をもつ。したがって、本発明の血栓溶解
剤は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、動脈閉塞
、体外循環及び動脈静脈閉鎖の場合に遭遇するような異
なった血管床の急性及び慢性の血栓閉塞を治療するのに
用いられる。

以下本発明の血栓溶解剤を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１　本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノー
ゲン・アクチベータの分離 精製 ヒト腎臓のアセトンによる脱脂粉末１００１ｉ’に、ｐ
Ｉ（７，４の０．０２ＭトリスＨＣＩで緩衝させた２Ｍ
のチオシアン酸アンモニウム５００ｉｌ！を加え、４℃
にて１０時間攪拌した。遠心分離（ｘ１３，０ＯＯＰ、
６０分間）により抽出液と沈澱物とに分けた。

抽出液をｌＮＨＣｌにてｐＨ３，０に調整し、沈澱物を
遠心分離（ｘ　１ｓ、ｏｏｏ　ｙ、３０分）により回収
した。この沈澱物をさらに５００−の１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　
ｉ”　Ａ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０　ＫＩＵ／ｒＩＬ
ｅアプロチニン、５ｍＭイブシロンアミノカプロノ酸、
００１％’］、”ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　８０を含むｐＩ−１
７，４の００１モルリン酸すＩ・リウム緩衝液（緩衝ｏ
、Ａ）に溶解した。次に、この緩衝液に１００ｍ７！の
フィブリン澱物を１００ｍＺの緩衝液Ａに再懸濁し、４
Ｘ１０ｏｎのカラムに充てん後、５００−の緩衝液Ａで
洗浄した。次いで、０．４　Ｍのアルギニンを含んだ緩
衝液Ａでプラスミノーゲン・アクチベータを溶出した。

溶出液は１０ｍ１ずつフラクションした。その結果を第
１図及び第１表に示す。

この精製法は約８５％以上の高℃・回収率を示し、本発
明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲンφアクチベ
ータのもつ強力なフィブリンとの親和性を利用したもの
である。

第１表 実施例２　本発明の血栓溶解剤とウロキナーゼとの血栓
溶解作用の比較 本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・アク
チベータとウロキナーゼとの血栓溶解作用をチャンドラ
・ループ法によって比較した。健康なボランティアの男
子より得た人血液を用（・て実験を行なった。正確に５
ｍｌの血液を採取し、６１％のクエン酸ノーダを０５−
加えて凝血を防ぎ、さらに１２５Ｉでラベルしたフィブ
リノーゲン５０μｔを加えた。

よ（混合した後、１５−ずつ分取し、長さ２８ｍ内径Ｃ
Ｊ、５６ｃｍのタイボンチューブに入れ、２０ｍＭの塩
化カルシウムを加えた後、チューブの両端を連結して環
状とした。この環状循環チューブを１７ｒｐｒ′ｒｒで
回転する２６度の勾配をも一つターン・テーブルに固定
した。室温（２４−２５℃）で１時間あるいは２４時間
血栓形成を行なった後チーーブを開き１０μｔのザンプ
ルを採り、ラジオアイソトープを測定した。

その後プラスミノーゲン・アクチベータを加え、チュー
ブの両端を閉じてターン・テーブルで再び回転した。所
定時間後に１０１Ｌｔの血液ザンプルを採り、ア・イソ
トープを測定した。

アクチベータの活性は、血栓より溶解してくる１２５丁
の血液中の量で表わした。

加えた１２５■−フィブリノーゲンは、約９５〜９８％
の効率で血栓のポリマーに穫り込まれていたが、１時間
後と２４時間後では、クロスリンクの程度に差があり、
部分的にクロスリンクした（Ｐａｒｔｉａｌ　　ｃｒｏ
ｓｓ　　Ｉ　１ｎｋｅｄ＝　Ｐ　Ｘ　Ｌ　）ものと、は
ぼ完全に（Ｔｏｔａｌｌｙｃｒｏｓｓ　Ｉ　１ｎｋｅｄ
　＝　Ｔ　Ｘ　Ｌ　）クロスリンクし７たものが得られ
た。第２図はｐ　Ｘ　Ｌに対する本発明の血栓溶解剤の
成分たるプラスミノーゲン・アクチベータとウロキナー
ゼのドース量による溶解の状態を示したものである。第
２図において、（ａ）はアクチベータの場合を示し、（
１））はウロキナーゼの場合を示しており、本発明に係
る血栓溶解剤のプラスミノーゲン・アクチベータがウロ
キナーゼに比較して非常に効率のよ（・溶解を起こすこ
とを示して℃・る。

反応１０時間後に（ｌ〕）の系に（ａ）と同量の本発明
に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲジン・アク
チベータを加えると、はぼ完全な溶解が誘発された（第
２図（Ｃ））。第２図において各点は６つの実験値の平
均値を示しており、アクチベータの濃度をｌＸＩＤ”Ｍ
とした場合、本発明の成分たるアクチベータはＰＸＬを
２０時間後にはほぼ完全に溶解し２て℃・るが、ウロキ
ナーゼは、その約４０％を溶出しているにすぎない。そ
こでこの系に１０時間後さらに本発明の゛アクチベータ
を追加するとほぼ完全な１２５■の放出が起っており当
該アクチベータか強い血栓溶解作用を有することを示し
ている。

また完全にクロスリンクした血栓を使用した実験ではウ
ロキナーゼは３５％の溶Ｗ（を２０時間後に示したにす
ぎないが、本発明の血栓溶＋ｖｇ剤の成分たるプラスミ
ノーゲン・アクチベータでは９０％の溶解を示した。一
方、コントロールとして全くアクチベータを注入しない
場合は１２５■の放出は全く検出されず血栓の溶解がア
クチベータに依存していることを示している。

実施例ろ　各種動物血栓に対する本発明に係る血栓溶解
剤の作用 実施例２と同様な方法で各種＠物より採血を行）；（Ｃ
・１時間後にクロスリンクした血栓（１）　Ｘ　Ｌ　）
をその動物の血しょう中で本発明の血栓溶解剤の成分た
るプラスミノーゲン・アクチベータを働かせその溶解作
用を調べた。

各々の実験でアクチベータの濃度を２　ｏ　Ｉ　ＵＡｎ
Ｉ！。

とし反応開始後１０時間までその溶解状態な１２５■の
クロットからの放出によって測定した。この系でもバッ
クグランドはほとんどアクチベータを注入しない時と同
様で１０時間後もわずか２〜６％が検出されるにすぎな
かった。これとは対照的にヒトの系では、はぼ９６％が
溶解された。ヒト及び各種動物にすし・て溶解度を測定
した結果を第３図に示す。

第６図において、（ａ）はヒト、（ｂ）はサル、（ｃｌ
はラビット、（ｄ）はイヌ、（ｅ）はラットの場合をそ
れぞれ示している。第３図に示されるように、動物によ
って溶解の程度は異なって（・るが、サルの場合はヒト
と同様によく働いているが、ラットの場合は溶解作用は
よくない。本発明に係る血栓溶解剤はヒトあるいはサル
に特異的な酵素であることがこれによって示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノー
ゲン・アクチペータを実施例１に示す方法によって溶出
したときの溶出曲線である。 第２図は、本発明の血栓溶解剤とウロキナーゼとの血栓
溶解作用を比較した図であって、（ａ）は本発明の血栓
溶解剤、（１））はウロキナーゼ、（Ｃ）はウロキナー
ゼに１０時間後本発明の血栓溶解剤を加えた場合をそれ
ぞれ示す。 第３図はヒト及び各種動物の血栓に対する本発明の血栓
溶解剤の血栓溶解効果を示す図である。第３図において
、（ａ）はヒト、（＋））はサル、（ｃ）はラビット、
（ｄ）はイヌ、、（ｅ）はラットの場合をそれぞれ示す
。 特許出願人 三井東圧化学株式会社 手　　続　　補　　正　　書 昭和５７年８月２４日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１２２９８１号 ２、発明の名称 血栓溶解剤 ３、補正をする者 ４・補正の対象 明細書 手　　続　　補　　正　　書 昭和５８年７月７日 特許庁長官　若　杉　相　夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第　１２２９８１　　号２、発明の名
称 血栓溶解剤 ３６補正をする者 明細卦の１特許請求の範囲」および「発明の詳細な説明
」の欄 ５、補正の内容 （１）　　明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂ｊ
Ｅする。 （２）　　明細書の６直１３〜１４行の［により、１本
のタン白質バンドを示し、１とあるを［による主要なタ
ン白質バンドの１と訂正する。 （３）　　同１０頁４行の「溶解力をもつ。」とあるあ
とに次の文を加入する。 ［すなわち、本発明に係る血栓溶解剤は、通常用いられ
るこの種の薬剤と同様に適用することが出来るが、例え
ば本発明のプラスミノーゲンアクヂベータを５多ヒト而
精アルブミンを含む生理食塩水中に溶解し、１回の射出
による投与量はウロキナーゼ換算値としてｉｏ　、ｏｏ
ｏ国際単位（約１００μｇ）とすることが好ましい。」 （４）　　同１１頁２〜３行の「１ｍへ４ＥＤＴＡ　、
　Ｊとあるを削除する。 （５）　　同１１頁３〜４行の「１０ＫＩＵ／−アプロ
チニン」とあるを削除する。 （６）　　同１１頁１４行のｌ−１０ｒｎ１．Ｊとある
’Ｎ２．５ｍ１Ｊと訂正する。 （７）　　同１１頁１６行の［８５％以ト１とあるを［
３０チＪと訂正する。 （８）　　同１２頁の第１表のタ゛ン白量の爛の「８４
１とあるを［−２６Ｊと訂正する。 （９）　　同１２頁の第１表の総括性の欄の「９５１と
あるを「６５」と訂正する。 （１０）同１２頁の第１表の総括性の瀾の「８ｏ」とあ
るを［３２］と訂正する。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 １−別　紙１ 特許請求の範囲 １、　次の特徴を有するプラスミノーゲン・アクチベー
タを成分とする血栓溶解剤。 （１）すトリウムドデシルサルフェート−ポリアン白質
バンドのみかけの分子量が約５５．０００±１．０００
であること。 （２）、Ｉ！元削の存在によってもみかけの分子量は変
化しないことっ （３）等電点電気泳動法による主バンドのｐＩが７〜９
の範囲にあること。 （４）　　抗つロキナーゼＩｇＧ−セファロース親和性
クロマトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を
有すること。 （５）次のグループＡの物質に加水分解活性を示し、グ
ループＢの物質に活性を示さない性質を有すること。 グループＡ：ｆｌ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リ
シン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライド及びｌ（
−Ｄ−イソロイシル＝ｌ）−プロリル−Ｌ−アルギン−
ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライド。 グループ１３　：　Ｂｏｃ−Ｌ−バリル−１ノープロリ
ル−し−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド
、カルボベンゾキシ−１ノーフェニルアラニル−し−ア
ルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド、Ｌ−プロ
リル−ｒノーフェニルアラニル−Ｌ−アルギニン−４−
メーｆ−ルクマリル−７−アミド、グルタリルグリ／ル
ーム−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　次の特徴を有するプラスミノーゲン・アクチベー
   タを成分とする血栓溶解剤。 （１）　　ナトリウムドデシルザルフェート−ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動法により、１本のタン白質バン
   ドを示し、みかけの分子量が約５５，０００±１．００
   ０であること。 （２）　　還元剤の存在によってもみかけの分子量は変
   化しないこと。 （３）　　等電点電気泳動法による主バンドのｐ■が７
   〜９の範囲にあること。 （４）抗つロキナーゼＩｇＧ−セファロース親和性クロ
   マトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を有す
   ること。 （５）　　次のグループへの物質に加水分解活性を示し
   、グループＢの物質に活性を示さない性質を有すること
   。 グループＡ：Ｈ−Ｄ−バリル−し一ロイシ／Ｌ、−ＬＩ
   Ｊシン−夫−ニトロアニリドジヒドロクロライド及びＩ
   −Ｉ　−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリルーＬ−アルギ
   ンーＸ−ニトロアニリドジヒドロクロライド。 グループＢ：Ｂｏｃ−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−
   アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド、カルボ
   ベンゾキシ−Ｌ−フェニルアラニル−し−アルギニン−
   ４−メチルクマリル−７−アミド、Ｌ−プロリル−Ｌ−
   フェニルアラニル−Ｌ−フルギニンー４−メチルクマリ
   ル−７−アミド、グルタリルグリシル−Ｌ−アルギニ７
   −４−メチルクマリル−７−アミド。