JPS5820267B2 - アルコ−ルオキシダ−ゼおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規アルコール オキシダーゼζこ関する。

別の面では本発明は新規結晶アルコール オキシダーゼ
に関する。

他の面では新規アルコールオキシダーゼの製造および単
離方法に関する。

アルコール オキシダーゼはエタノールではないが、メ
タノール上に生育する各種微生物により産生されること
が既知である。

これらのアルコール オキシダーゼは反応 ＲＣＨ２０Ｈ＋０２ｔＲＣＨＯ＋Ｈ２Ｏ２（式中Ｒは水
素もしくは低級アルキルで、一般にＨ−、ＣＨ３−、Ｃ
Ｈ３ＣＨ２−およびＣＨ３（Ｃ）Ｉ２）２−の基から選
択する）を接触する。

アルコールオキシダーゼはアルデヒドおよび過酸化水素
の製造において、また融和性溶液から酸素を清掃もしく
は除去するために使用することができる。

適当な試験探査法と組み合せて、アルコール オキシダ
ーゼはアルコール濃度、特にメタノールおよびエタノー
ルのようなアルコールの濃度を決定するためＱこ使用す
ることができる。

従ってこのような酵素は生物学的流体、たとえば血液な
どのアルコールレベルの測定のような適用に有用である
。

これらの酵素のいくつかの用途は提案された用途に対し
商業的に妥当な量で純粋酵素を入手できないことによっ
て妨害される。

アルコール オキシダーゼの前記タイプで遭遇する問題
の１つは、多くの酵素と同様に比較的純粋な形で、たと
えば実質的にカフ−ラーゼ活性を欠く形で単離すること
が困難であることである。

硫酸アンモニウム、アルコールもしくはポリエチレング
リコールのような材料を使用する分別沈澱、もしくはイ
オン交換樹脂を使用するカラム クロマトグラフィもし
くはゲル分子篩媒体のような各種技術が純粋酵素を製造
するために利用された。

このような技術の使用Ｑこよる比較的純粋なアルコール
オキシダーゼの単離は困難で、材料および時間を浪費
し、商業酵素のコストの多くの原因となる。

比較的純粋のアルコール オキシダーゼの結果的高コス
トはこれら酵素の用途を限定するようになり、そして大
量の酵素を必要とする適用において酵素の潜在的使用を
阻止し、また新適用の探求を阻止する。

更に当業者の承知のように、温度およびｐＨに対する既
知先行アルコール オキシダーゼ酵素の安定性、特殊基
質に対する特異性、およびこれらの化合物および他のも
のによる阻止作用の受は易さ、また接触反応速度はこの
ような酵素がもつとも効率的で、且効果的であると認め
られる潜在的用途にも影響する。

本発明者らはその性質のいくつかで、特に透析のような
回収操作における結晶化の容易さという異常性で既知ア
ルコール オキシダーゼと異なる性質を示す新規アルコ
ール オキシダーゼを見出した。

新規アルコール オキシダーゼはピキア（ｐｉｃｈｉａ
）属の微生物および遺伝的ζこおよび／もしくは分類的
にピキアと密接に関連する微生物より成るメタノール−
資化性ピキア−タイプ微生物から得られる。

本発明の一面によれば、メタノール−資化性ピキア−タ
イプ微生物細胞の水性流体サスペンションが製造される
。

サスペンドした固形は均質物から除去され、可溶性アル
コール オキシダーゼとして新規アルコール オキシダ
ーゼを含む有用な酵素活性を有する粗製溶液が製造され
る。

その方法は更に、特に商業用途に望ましい結晶形の新規
アルコール オキシダーゼの製造を包含する。

結晶形は限外沖過方法、現在好ましくは、そして有利に
は透析により、もしくは他の分離方法により得ることが
できる。

透析は０．０５Ｍ〜約０．ＯＩＭの範囲のモルイオン強
度を有する回収範囲溶液のアルコール オキシダーゼの
結晶化に有効な細胞密度を有する水性流体を均質化して
製造した粗製溶液を、アルコール オキシダーゼに不透
過性であるが、たとえあるさしても透析媒体の水および
緩衝剤分子に透過性の膜を通して透析媒体に対して透析
し、膜の酵素側に回収範囲溶液を達成し、それによって
アルコール オキシダーゼを結晶化させ、そして生成結
晶アルコール オキシダーゼを透析媒体から分離するこ
とより成る。

本発明はまた新規単離アルコール オキシダーゼより成
る。

本発明は更に新規アルコール オキシダーゼを使用し選
択試料の短鎖アルコール濃度を定量することより成る。

本発明のアルコール オキシダーゼはピキア属および遺
伝的におよび／もしくは分類的にピキアに密接に関連し
好ましくはピキア属自体の酵母であり且炭素およびエネ
ルギー源としてメタノールを含む供給材料を利用するこ
とのできるピキア−タイプ酵母種により産生される。

このようなメタノールを資化するピキア酵母の特定例は
ピキア パストリス（Ｐ １ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ ）、ピキア ピヌス（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｎｕｓ）
、ピキア トレハロフイラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａ
ｌｏｆｈｉｌａ）およびピキア モリシアナ（Ｐｉｃｈ
ｉａ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎａ ）を含む。

ピキア パストリス種の適当な酵母の模範的２菌株はＵ
ｎｉｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ
ｆ Ａｇｒｉｃ−ｕｌｔｕｒｅ 、 Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ５ｅｒｖｉｃｅ 。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｏｆ Ｐｅｏｒｉａ
ｓ ｌ１ｌｉｎｏｉｓに寄託されＮＲＲＬ Ｙ−１１
４３０（微工研菌寄５６８２）およびＹ−１・１４３１
（微工研菌寄５’６８３）の数字指定を受けた。

本発明によれば、メタノール適応性ピキア−タイプ酵母
の選択種は炭素およびエネルギー源としてメタノールを
使用し好気水性醗酵条件下で培養される。

好ましくはメタノールは生育制限因子であるような条件
下で供給される。

メタノール制限条件は一定セットの醗酵培養条件に対し
最高生育割合を生ずるメタノールの最少濃度であるメタ
ノール濃度として本明細書で規定される。

好ましくは醗酵は高細胞密度条件、すなわち細胞密度は
醗酵液１１につき乾燥重量規準で１００Ｉもしくはそれ
より多い条件で行なわれる。

選択酵母はバッチもしくは連続的方法で酸素、メタノー
ルおよび同化性窒素源の存在で生育させる。

当業者（こ既知の各種タイプの醗酵方法および装置は利
用することができる。

たとえば、米国特許第３，９８２，９９８号明細書記載
のような起泡−タイプ醗酵容器もしくは他の適当な醗酵
容器は使用することができる。

酸素はそれ自体で、もしくは空気もしくは酸素。

補強空気の形で当業者に既知のよう（こ約０１〜１００
気圧のような圧力範囲で醗酵容器に供給することができ
る。

醗酵ζこ対する同化性窒素源は微生物の代謝利用に適す
る形の窒素を供する任意の有機もしくは無機窒素含有化
合物であることがで。

きる。

適当な有機窒素源は、たとえばたん白、アミノ酸、尿素
などを含む。

適当な無機窒素源はたとえばアンモニア、水酸化アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムなどを含む。

現在好ましい窒素源は有利性および利用性のためにアン
モニアおよび水酸化アンモニウムを含む。

水性微生物醗酵液のｐＨ範囲は約３〜７の範囲、更に好
ましく、そして通例は約３５〜５．５の範囲であるべき
である。

ｐＨ範囲に対する微生物の選択は成る程度まで使用培地
また特定微生物による。

従って当業者が容易に決定できる培地に変化を与えいく
らか変えることができる。

十分な水は使用微生物の特別の要求に対し供するように
、また水溶性栄養素のキャリア流体を供するようζこ醗
酵要素に維持される。

ミネラル、生育因子、ビタミンなどは使用菌株および選
択培養条件により変化する量で一般に添加され、当業者
に既知かもしくは当業者により容易に決定される。

代表的栄養培地は参考例で示す。

微生物の生育は醗酵容器の操作温度に敏感で、微生物の
各特定菌株は生育至適温度を有する。

模範的醗酵温度は約２０〜約６５°Ｃの範囲である。

選択温度は一般に使用微生物に依るであろう。

何故ならばどれもがいくらか異る温度／生育割合関係を
有するであろうからである。

醗酵圧は一般に約０．１〜約１００気圧、更に通例は約
１〜約３０気圧そして更に好ましくは約１〜約５気圧の
範囲内にある。

何故ならより高圧は水性培地（こ一層大きい溶解酸素レ
ベルおよび通例はより高い細胞生産性を生じるからであ
る。

新規アルコール オキシダーゼの単離では選択微生物の
細胞を含む水性サスペンションの流体が製造される。

水性流体は直接、もしくは好ましくは下記のようにｐＨ
調整後に使用することができる醗酵容器流出物であるこ
とができる。

別法では、懸濁微生物細胞は最初に醗酵培地からたとえ
ば遠心分離により、もしくは個々の細胞の大きさより小
さい孔径を有するフィルターによる沖過により分離し、
その後有利な量の水もしくは適当な水性緩衝液、たとえ
ば０．２ ＭのＫ Ｈ２Ｐ０４／Ｎａ２ＨＰ０４緩衝液
に再サスペンドすることができる。

水性サスペンション中の細胞密度は最少結晶化密度より
大きくなければならないことがわかった。

満足すべき結果は流体細胞密度が流体１１につき乾燥重
量規準で約７５．９より大きい場合に得られる。

満足すべき結果は流体として使用される場合の醗酵容器
流出物が水酸化アンモニウム、苛性ソーダなどの塩基の
添加により約７．５のようなｐＨに最初に調整される場
合得られることがわかった。

しかし、ｐＨは臨界的とは考えられない。

水性サスペンションのｐＨは均質化前に調整の必要がな
い。

しかし、約６〜９の範囲に広＜ｐＨを調整することは好
ましいと考えられる。

何故ならこの範囲では酵素は活性を有し且安定であるか
らである。

細胞含有流体は当業者に既知の適当な要素により均質化
される。

たとえばメタノール上に生育した酵母を含む醗酵容器流
出物は約７．５のｐＨに調整され、１００〜１２０ｇバ
イオマス（乾燥重量）／ｌのような高細胞密度濃度で、
ベルト コンビネーション＃３および流量２０〜３０ｍ
１／時間、５〜３０℃の連続運転で０．６１容器を用い
Ｄｙｎｏｍｉｌｌ Ｍｏｄｅｌ ＫＤＬを使用して均質
化した。

均質物固形は均質物から分離し、可溶性成分として新規
アルコール オキシダーゼを含む粗溶液を製造する。

たとえば均質物固形は遠心分離により除去し、細胞を含
まぬ上澄液を得る。

別法では固形は適当な孔径を有するフィルターにより沖
過して除去し、次いで所望の場合ｐＨを調整することが
できる。

所望の場合結晶アルコール オキシダーゼの回収のよう
なそれ以上の精製工程に対しては、ｐＨは５．７５〜６
．７５の範囲に、望むならたとえばｐＨ６，５を有する
ように調整するこきができる。

アルコール オキシダーゼを含む粗製溶液は有効な酵素
活性を有し、その形で有用な適用を見出す。

しかし、本発明のアルコール オキシダーゼは以下に示
すような特異性を有し、それは結晶アルコール オキシ
ダーゼの単離ζこよりもつとも良く理解される。

可溶性アルコール オキシダーゼを含む粗製溶液は硫酸
アンモニウムζこよる分別沈澱によるような一層濃厚な
固状形か、もしくはもつとも望ましく且好ましくは通例
の透析様式もしくは回収割合を増加させる限外沖過を適
用することによる透析条件下の処理で最高活性を示す有
力な結晶形で新規アルコール オキシダーゼ回収処理を
することができる。

透析では可溶性アルコール オキシダーゼを含む粗製溶
液はアルコール オキシダーゼζこ不透過性であるが、
水、緩衝剤および無機分子Ｏこ対し透過性の膜を通して
透析媒体に対して透析される。

粗製溶液は溶液が本明細書記載の回収範囲溶液条件に到
達する場合アルコール オキシダーゼの結晶化ζこ有効
な細胞密度を有する水性流体を均質化することにより製
造される。

満足すべき結晶化は有効細胞密度が水性流体１１につき
約７５ｇ（乾燥重量規準で）の場合Ｏこ観察された。

結晶化は結晶アルコール オキシダーゼの回収量は少な
いが、より低い有効細胞密度においてさえ起こることも
予期される。

経験的に決定できる最少細胞密度（最少結晶化密度）以
下では実質的に結晶アルコール オキシダーゼは回収さ
れない。

使用膜のタイプは臨界的であるとは考えられない。

任意の適当な膜を使用することができる。

たとえば商業的に入手できる酢酸セルロース透析チュー
ブは透析袋を形成させるのにもしくは別の風に使用する
ことができ、もしくは中空繊維透析小房を使用すること
ができる。

アルコール オキシダーゼ含有溶液は透析媒体たとえば
水もしくは緩衝溶液に対し透析され、０．０５Ｍ〜０．
０１Ｍイオン強度を回収範囲に有し、それによって膜の
酵素側に電気泳動的に均質な結晶オキシダーゼを沈澱さ
せる回収範囲溶液を達成させる。

透析媒体は透析中膜の酵素側の溶液のモルイオン強度が
少なくとも回収範囲部分を通過する任意の媒体であるこ
とができる。

たとえば、アルコール オキシダーゼを含む粗製溶液が
０．２ Ｍのモルイオン強度を有する場合、透析媒体は
適当容量の蒸溜水であることができる。

酵素が透析される流体の容量は膜の酵素側のイオン強度
が少なくとも回収範囲部分を通過する限り、臨界的であ
るとは考えられない。

透析中アルコール オキシダーゼ含有溶液のｐＨは適当
な緩衝システムの使用により約５．７５〜約７．６５の
範囲に維持すべきである。

適当な緩衝システムはたとえばＫＨ２ＰＯ４およびＮａ
２ＨＰＯ４より成る。

好ましくはｐＨ範囲は最高回収量の結晶アルコール オ
キシダーゼに対し約６．０〜約６．５である。

例で示すようにアルコール オキシダーゼの良好な結晶
化は広いｐＨ範囲で観察された。

狭い範囲は酵素の最少溶解度を達成する現在好ましいｐ
Ｈ範囲を表わす。

本発明のアルコール オキシダーゼは０．０２Ｍイオン
強度、ｐｉ−１６，０〜６．２５の溶液の条件下で最少
溶解度を有することがわかった。

従って至適結晶化はこれらの条件を得るように透析を企
画することにより達成される。

良好な結晶化は上記条件に適合する大量の緩衝液に対し
、酵素含有溶液の徹底的透析により達成することができ
る。

別法では透析システムは平衡で、もしくは透析出発後い
つかの時点で至適結晶化条件を達成するように設計する
ことができる。

たとえばｐＨ６，２５で０．２Ｍのイオン強度を有する
粗酵素溶液は９倍過剰の蒸溜水（粗酵素溶液容量に対し
）に対し透析することができる。

平衡では粗酵素溶液のイオン強度は０．０２Ｍであろう
し、結晶化が起こるであろう。

このような方法は比較的長時間を平衡化の発生に要する
不利がある。

他方において、粗酵素溶液がたとえば０．０５Ｍのモル
イオン強度を有する場合、平衡化させるための９倍過剰
の蒸溜水（粗酵素溶液の容量に対し）に対する透析は０
．００５Ｍイオン強度を有する溶液を生ずるであろう。

形成結晶は平衡イオン強度が回収範囲外にあるので再溶
解する傾向があるであろう。

しかし、結晶は比較的短時間の透析後に形成するであろ
う。

次に平衡システムおよび再溶解前に取り出し、回収する
ことができる。

この後者の透析方法は結晶アルコール オキシダーゼの
回収に要する時間が短かいので現在好ましい。

透析は約４〜約４０℃の範囲の温度で安全に行なうこと
ができる。

一般に１時間より長い、好ましくは１８時間もしくはそ
れより長い十分な時間で結晶化を生じさせねばならない
。

透析が終ると、アルコール オキシダーゼは結晶固形と
して透析袋に含まれる。

結晶アルコールオキシダーゼは固形結晶から透析袋の液
体をデカントすることなどにより透析媒体から容易に分
離することができる。

湿潤結晶は貯蔵するために所望のように更に処理するこ
とができる。

たとえば、結晶スラリーは凍結乾燥により凍結し乾燥粉
末を形成させることができ、もしくは水に、更に好まし
くはリン酸塩緩衝液に溶解することができる。

変性および酵素活性のロスに対し酵素溶液を安定化させ
る既知安定剤化合物、蔗糖もしくはグリセロールなどは
添加することができる。

約４〜４０℃の範囲の温度で酵素標品を貯蔵することが
好ましい。

更に好ましくは、酵素は約４〜２４℃の範囲の温度で貯
蔵される。

もつとも好ましくは約４℃で酵素を貯蔵することである
。

酵素はｐＨ７，５の０、１ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液中に
、微生物の発育を阻止する０、０２％アジ化ソーダと共
に４℃の保存する場合最少の活性ロスしか生じないこと
がわかった。

しかしアルコール オキシダーゼは酵素活性の有意なロ
スなしに凍結保存することもできる。

本発明によりピキア微生物からアルコール オキシダー
ゼの製造方法において、結晶固形は粗酵素溶液の透析中
に形成され、それ以上の精製工程は必要のないことがわ
かった。

新規結晶アルコール オキシダーゼは容易に製造され、
且比較的安価な、そうでなければ経済的に魅力がない、
アルコール オキシダーゼが適用のために入手できる。

ピキア アルコール オキシダーゼの特性ピキア−タイ
プ微生物から単離したアルコールオキシダーゼはピキア
パストリスから単離されたアルコール オキシダーゼ
により代表される。

「ピキア」アルコール オキシダーゼはソジウムドデシ
ルサルフエート（ＳＤＳ）ゲル電気泳動により判定され
たように均質である。

細胞の初めのカタラーゼ活性は、たとえあるとしても結
晶アルコール オキシダーゼと連合してほとんど残留し
ない。

アルコール オキシダーゼ酵素はＳＤＳゲル電気泳動に
より概算した時１サブユニツトにつき概算分子量７２，
０００の６個もしくはそれ以上のサブユニットより成り
、アルコール オキシダーゼの概算分子量が見積もられ
る。

酵素は酵素サブユニットにつき約ＩＦＡＤ（フラビン
アデニンジニュークレオチツド）部分より成る補酵素と
してＦＡＤを有するフラボたん白である。

メタノールに対する見かけのＭｉｃｈａｅｌｉｓ恒数Ｋ
ｍは約４ｍＭである。

電気泳動分析はピキア酵素の分子量はキャンシダ ボイ
ジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ ）から単
離したアルコール オキシダーゼのものより大きいこと
を示唆する。

ピキア酵素はアジ化ソーダと結合する度合で、およびｐ
Ｈ６，５の０．０２Ｍリン酸ソーダ溶液で結晶を形成す
る能力でハンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ）から単離したアルコール
オキシダーゼと異る。

ピキア酵素の特性は決定され表１に示す。

各種基質に対する反応性は１００％に等しくしたメタノ
ールにより標準化して示される。

表 １ 特 性 ピキア パストリス 分子量 ５００，０００（概算） 補酵素 ＦＡＤ サブユニット数 ６個もしくはそれ以上（概算）至適活
性 温度 （広く） ３５〜４５° ＋ （至適）４５゜ ｐＨ （広く） ６〜９ （至適）８．０ メタノールに対 するＫｍ（ｍＭ） ４ 阻止剤 ＨＣＨＯ ＞ ３０ ｍＭ ピキア アルコール オキシダーゼは他の報告されたア
ルコール オキシダーゼと多くの点で異る。

特にピキア パストリスからのアルコールオキシダーゼ
は低級アルコールおよびホルムアルデヒドに対して反応
性があるが、アセトアルデヒドもしくは有機酸に対して
反応性がない。

アセトアルデヒドおよび有機酸に対するこの反応性の欠
如は、たとえば血液のような有機流体のアルコール濃度
決定処理にピキア−由来のアルコール オキシダーゼを
使用する場合に明白な利益がある。

何故ならアルデヒドおよび有機酸材料による妨害が避け
られるからである。

本発明のアルコール オキシダーゼは次の反応ＲＣＨＯ
Ｈ＋０２→ＲＣＨＯ＋Ｈ２０□ （式中Ｒは水素もしくは低級アルキルで、一般にＨ−、
ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−およびＣＨ３（ＣＨ２）２−
より成る基から選択する）を接触する。

従って酵素はアルデヒドおよび過酸化水素の製造に、ま
た酸素の存在が望ましくない場合酵素融和性流体から酸
素を除去するために使用することができる。

更に反応の過程で酸素が消費され、アルデヒドおよび過
酸化水素が生産されるので、酵素は酵素活性と融和性の
条件で流体試料中の短鎖アルコールＲＣＨ２０Ｈの濃度
を決定するために使用することができる。

たとえば本酵素は醗酵方法におけるメタノールの濃度も
しくは血液のような体液中のエタノールの濃度のような
生物学的流体中の低級アルコール濃度を決定するために
使用することができる。

このようなアルコール濃度を決定する特に有利な方法は
ポーラログラフの溶解酸素電極の先端にアルコール オ
キシダーゼを固定することである。

いくつかのこのようなポーラログラフ溶解酸素電極が商
業的に入手でき、本アルコール オキシダーゼ酵素によ
る利用に適する。

たとえばＣ１ａｒｋもしくはＢｅｃｋｍａｎ溶解酸素電
極は使用することができる。

アルコール オキシダーゼは任意の適当な方法により電
極先端に固定化することができる。

たとえば酵素は適当な支持材料と混合してペーストを形
成させ、電極上に薄いフィルムとして濃度を決定すべき
化合物を透過するが酵素自体を透過しない膜により保持
される。

たとえばたとえば支持材料はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｙスエーデンからのポリサ
ッカライドイオン交換樹脂であるＤ Ｅ Ａ Ｅ ５
ｅｐｈａｄｅｘであることができる。

エタノール定量に対しては、適当な膜は酢酸セルロース
フィルムであり、そのフィルムを通してエタノールは満
足すべき移動性を有する。

勿論酵素は適当な電極膜に等価で結合することができ、
もしくは適当なポリマーフィルムに物理的に添加するこ
とができる。

酵素活性と融和性の条件はｐＨ約６〜約９および最高感
応性に対し好ましくはｐＨ約８．０の範囲の流体試料ｐ
Ｈおよび約２５〜４５℃、好ましくは有利には約２５℃
の範囲の流体試料温度を含む。

試料ｐＨは水酸化アンモニウム溶液もしくは稀塩酸溶液
により所要のように調整することができる。

好ましくは、分析すべき化合物の一連の既知濃度を使用
し検量線が作製され、そして流体試料中の化合物濃度は
当業者に既知のようにそこから決定される。

アルコール濃度を決定するために試料電極は試験すべき
調製流体試料中に浸漬される。

基質アルコールは膜を通して拡散し、酸素の存在下に反
応してアルデヒド生成物および過酸化水素を生成する。

反応は試料中の酸素濃度のｐＨ変化割合を観察すること
により追跡される。

接触反応は化学量論的であるので、アルコールＲＣＨ２
０ＨのｍＷは当業者に既知のように酸素濃度の変化割合
から決定することができる。

別法では、反応は生成した過酸化水素についてポーラロ
グラフで追跡することができる。

尚別の適用では反応は検流計で追跡することができる。

生物学的流体中のアルコール濃度の決定、たとえば血液
試料中のエタノール濃度の決定もしくは醗酵ブロス中の
短鎖アルコール濃度の決定に対するアルコール オキシ
ダーゼの使用は、本オキシダーゼがアルデヒドおよび有
機酸に比較的低反応性であるため特に有利であり、従っ
て血液のような生物学的流体に存在しうろこのような化
合物によりそう妨害を受けることはない。

本発明を更に例示するために次の例が供される。

参考例 次の醗酵はアルコール オキシダーゼを単離するための
流出液を供するために行なったいくつかの醗酵のうちの
代表である。

連続的好気醗酵方法において、それぞれ約４０；６０の
容量比のメタノールおよび水性ミネラル塩培地を、メタ
ノールが生育制限因子であるような割合で、酵母種ピキ
ア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０を接種した醗
酵容器に個々に供給した。

醗酵容器は約６１０７の液容量、ｐＨ１温度およびレベ
ルの自動調整器を有する１５００１の泡を満たした醗酵
容器であった。

攪拌は、２個の通例のパドル−タイプ タービン駆動に
より１０００γｐｍで行なった。

通気割合は１分当り醗酵容器内の醗酵液１１につき約４
容の空気（約３８ ｐｓｉｇおよび２５℃で）であった
。

無水アンモニアを醗酵混合物のｐＨを約３．５に維持す
るような割合で添加した。

水性ミネラル塩培地は１１の飲料水、１５．８６ｍ１７
５％Ｈ３ＰＯ４，９，５３９に２８０４．７．８ ｇＭ
ｇｓｏ４＋ ７ Ｈ２Ｏ，０，６ｇＣａＣ１２・２ Ｈ
２Ｏおよび２．６ｇ８５％ＫＯＨを混合して調製した。

微量ミネラル溶液＋ビオチンはメタノール１１につき１
０ＴｒＬｌの割合でメタノール流を経て別に供給した。

微量ミネラル溶液子ビオチンは７８０ＴＬｌの微量金属
溶液、２０ｍ１３の水、２００ＴＬｌのメタノールおよ
び０．０３２９のビオチンを混合して調製した。

微量金属溶液は１１の溶液に対し６５ ｇＦｅＳ０４・
７Ｈ２０、２０９Ｚｎ５Ｏ，” ７Ｈ２０、３，０，？
ＭｎＳＯ４”Ｈ２Ｏ、６，０ｇＣｕＳＯ，・５ Ｈ２Ｏ
、５，０ｍｌ濃Ｈ２ＳＯ４および１１溶液にするのに十
分なイオン除去水を混合して調製した。

水性ミネラル塩培地は１時間につき３１．ｉの割合で、
メタノールは１時間につき２１１の割合で供給した。

醗酵は約３０℃および約３８ ｐｓｉｇ圧で、１１．６
時間の保留時間で行なった。

分析目的のために、生成酵母細胞は遠心分離により醗酵
流出液（醗酵液）から分離し、水サスペンションで洗滌
し、再遠心分離し、一夜１００℃で乾燥し、秤量した。

乾燥規準で酵母細胞収量は代表的には供給メタノール１
００ｇにつき約４０．６ｇであった。

細胞密度は代表的には醗酵流出液１１につき約１２８．
４ｇの細胞であった。

醗酵液の全固形含量は代表的には細胞十溶解固形１１に
つき約１３４．７９であった。

一部の醗酵流出液は凍結し、貯蔵した。

例Ｉ、ＩＸおよびＸにおいてメタノールとの反応に対す
るアルコール オキシダーゼ活性は次の分析方法（方法
Ａ）により決定した。

染料−緩衝剤混合物は０．１ ｍｌの０−ジアニシジン
溶液（１重量％Ｏ−ジアニシジン水溶液）と１２ｍ１の
通気０．１ＭＩＪン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７，５）を混
合して調製した。

分析混合物は２．５ ｍｌの染料−緩衝剤混合物、５０
μｌのメタノール、１０μｌのパーオキシダーゼ溶液（
１ｍＩ？のワサビ パーオキシダーゼ−８ｉｇｍａｓタ
イプ■）および２５μｌｌのアルコール オキシダーゼ
溶液により調製した。

分析混合物は２５℃で４×１×１ｃＩｒＬキユーペツト
に維持し、４６０ｍｍよる吸収の増加を２〜４分間記録
した。

酵素活性は 活性（μモル／分／ｍ１）＝う企Ｘ１１．５（式中１１
．５はＨ２Ｏ２の既知試料で調製した標準カーブに基づ
く係数であり、△Ａは試験時間中の吸収の変化である）
により計算する。

例■および■においては別の分析方法（方法Ｂ）を使用
した。

ＭＢＴＨ貯蔵溶液を１００ｍ１の０．０５Ｍリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７，５）につき０．０４９のＭＢＴＨ（３−
メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン、Ｓ’
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｒｇｍａ Ｓ ｔ 、 Ｌｏｕｉｓ 、 Ｍ １ｓｓｏｕｒｉから
入手できる）により調製した。

塩化第二鉄貯蔵溶液は１００ｍ１の０．１ＮＨＣＩにつ
き０．２ｇの塩化第二鉄から調製した。

ＭＢ、ＴＨ浴溶液１ ｒｕ１部分を２５μｌのアルコー
ルに添加し、それらを混合した。

ｂ５μｌのアルコール オキシダーゼ溶液を添加し、混
合物は２５００１０分間インキュベートした。

塩化第二鉄溶液の４ｍｌ試料を混合物に添加し、生成混
合物は１時間所望温度に放置した。

６２５ ｎｍにおける染料吸収は１ｃＷＬの路長キュー
ペットを使用し比色計で記録した。

試料の活性は吸収ピークの高さとして記録する。

例Ｉ ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０の醗酵
を上記代表的方法Ｏこより行なった。

醗酵流出液部分を取り出し、水酸化アンモニウムでｐＨ
７，５に調整シ、ベルト コンビネーション＃３および
流速２０〜３０ｍＡ！１時間を使用する３０°Ｃでの連
続操作で０．６１容器を使用しＤｙｎｏ −Ｍ ｉｌｌ
Ｍｏｄｅｌ Ｋ Ｄ Ｌで均質化した。

ミルのビーズは直径０．３〜０．５ ｍｍを有する分離
ガラス ビーズとなった。

生成均質物は５°Ｃ１３０分間２０．ＯＯＯＸｇで遠心
分離し、細胞を含まない上澄を得た。

細胞を含まぬ上澄液の酵素活性（方法穴使用）は約３３
０Ｕ／ｍｌであった。

上澄液は将来使用のため凍結貯蔵した。

上澄液の６個の１３０ｍ１部分を酢酸セルロース透析袋
に入れ、５°Ｃで約８１の蒸溜水に対し透析した。

４日後、各袋の水性相をデカントした。袋中の残留固形
は２タイプの固形より成っていた。

薄い上部白色相は注意深く除き廃棄した。

底部固形は黄褐色で、アルコール オキシダーゼであっ
た。

アルコール オキシダーゼ部分は蒸溜水（固形容積の約
１０倍）に溶解し、方法穴による分析は９４Ｕ／ｍｌの
活性を示した。

アルコール オキシダーゼの比活性は１ｏ、４Ｕ／ｍ９
たん白であった。

固形アルコール オキシダーゼ試料はＳＤＳゲル電気泳
動により試験し、均質純粋酵素を示す単一バンドを観察
した。

既知分子量を有するたん白のものとの電気泳動移動性の
比較は約７２，０００のサブユニット分子量を示す。

本例の結果はピキア パストリスから純結晶アルコール
オキシダーゼの製造および単離に対する本発明方法を
証明する。

例■ 例Ｉ記載のように製造した凍結上澄部分を解凍し遠心分
離して溶液を清澄化した。

１ｒｒＬｌの清澄上澄液を含む６透析袋をイオン強度の
異るリン酸塩緩衝剤（すべてｐＨ７，５）を含む５００
ｍ１の水溶液に対し、−夜広くそれぞれを透析した。

それぞれ０．５Ｍ、０．１Ｍおよび０．０５Ｍでの透析
１，２および３において、沈澱は全く観察されなかった
。

沈澱の最高量は０．０２ＭＩＪン酸塩の透析４で観察さ
れた。

それぞれ０．０１および０．００５ＭＩＪン酸塩の透析
５および６は透析４より沈澱が少なかった。

しかし透析５および６では、早期に形成したいくらかの
沈澱が再溶解した。

これら試験の結果は透析中のアルコール オキシダーゼ
の沈澱が約０．０５Ｍ以下のリン酸塩緩衝剤レベルで生
ずることを証明する。

アルコールオキシダーゼは０．０２ＭＩＪン酸塩の最少
の溶解性と思われる。

約０．ＯＩＭおよびそれ以下の緩衝剤レベルで、最高沈
澱に必要な時間を超える透析は結晶固形の再溶解を生ず
ることができる。

例■ 分析方法Ｂを使用する一連の分析を異るｐＨ値を使用し
て行ない、各種レベルのｐＨでアルコールオキシダーゼ
（均質物から細胞を含まぬ上澄液として）の相対的活性
を決定した。

各分析溶液のｐＨはＨＣＩもしくはＮａＯＨを添加して
変えた。

各ｐＨζこおける相対的活性は６２５ｎｍにおける吸収
として表わす。

溶液のｐＨ６２５ｎｍにおける吸収 ４．１ ０．０６ ５．１ ０．１９ ６．１ ０．３３ ７．１ ０．３８ ８．１ ０．４１ ９．１ ０．３３ １０．３ ０．０９ これらの結果は至適ｐＨは約ｐＨ８で、作用範囲は約６
〜約９であることを示す。

例■ 分析方法Ｂを使用し別の一連の分析を異る分析温度を使
用して行ない、相対的活性に及ぼす分析温度の影響を決
定した。

ピキア パストリスからのアルコール オキシダーゼの
試料は０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝剤（ｐＨ７，５、、）
に溶解した。

試料は各種分析温度で分析し、相対的活性は６２５ｎｍ
における吸収として表わす。

分析温度℃、 ６２５ｎｍにおける吸収２７
０．４２ ３６ ０．５４ ４５ ０．６０ ５５ ０．２７ ６５ ０．０５ これらの結果はピキア パストリスからのアルコール
オキシダーゼ活性に対する至適温度は約４５℃で、作用
範囲は約３５〜約４５℃である。

例Ｖ 対照試験ではハンセヌラ ポリモルファからのアルコー
ル オキシダーゼを本発明方法により透析し、ピキア以
外の属の酵母からのアルコールオキシダーゼは本発明に
おけるように純粋結晶固形を形成しないことを証明した
。

連続的好気水性醗酵は酵母種ハンセヌラ ポリモルファ
（ＮＲＲＬＹ−１１１７０）を水性醗酵条件下にメタノ
ール上に生育させて行なった。

醗酵流出液部分は例１記載のように均質化し、遠心分離
した。

細胞を含まぬ上澄を０．２５’ｐ）（間隔で５．５〜７
．７５のｐ）ｌ値を使用する一連の透析で０．００５Ｍ
ＩＪン酸塩緩衝剤に対し０℃で透析した。

各透析では２０時間後透析袋中に全く沈澱は形成しなか
った。

ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０由来の
アルコール オキシダーゼ゛について同時に行なった一
連の比較透析では、結晶アルコールオキシダーゼの沈澱
が約５．７５〜約６．７５のｐＨ値で起った。

最大量の沈澱はｐＨ６，０〜６．２５で形成した。

これらの結果はハンセヌラ ポリモルファカラのアルコ
ール オキシダーゼはピキア パストリスのアルコール
オキシダーゼの結晶化に対し有効な条件下では透析中
に結晶しないことを示す。

結晶化挙動のこの差異は注目に値する。

急速且安価な純粋結晶酵素の回収方法であるからピキア
パストリスから得た本発明のアルコール オキシダーゼ
に対し重大な利益を証明する。

例■ ピキア パストリスから単離したアルコールオキシダー
ゼは試料のエタノール量を定量するのに使用する溶解酸
素電極の先端に固定した。

固形アルコール オキシダーゼおよびＤ ＥＡＥＳｅｐ
ｈａｄｅｘ （約１：１の重量比で）を混合し、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ溶解酸素探針の先端のテフロン膜に適用した。

酢酸セルロース透析膜はアルコール オキシダーゼ−Ｄ
Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ混合物を電極先端
に保持するために使用した。

電極は試料のアルコール濃度に比例するピークの高さと
して分析結果を与える相似型微分器に取りつけた。

電極は一連の標準エタノール溶液により検量した。

各場合に試料は２５°Ｃの３．３ ｍｌの０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ＰＨ７，５）を含む電極室に添加した。

ピークの高さ対アルコール濃度の検定カーブは約０．１
容量％アルコール（１０００ｐｐｍ）の最終濃度までア
ルコール オキシダーゼ電極の先端で一線に並んだ。

組みたてたアルコール オキシダーゼ電極は少なくとも
１ケ月間アルコールの定量に対し有効に作動した。

電極は急速応答（分析時間約１５秒）を示し、そして０
．２ｐｐｍ容量でエタノール濃度に感度があった。

例■ 例■記載のアルコール オキシダーゼ電極は各種基質に
対しアルコール オキシダーゼの相対的反応性を決定す
るために使用した。

各定量では１〜１０μｌの基質水溶液（１容量％）を電
極室内の３．３ ｍｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）に
添加し、ピークの高さを記録した。

結果は試料の大きさに対し補正し、１００に等しくした
メタノールにより標準化した相対的反応性について以下
にリストする。

相対的反応性 メタノール １００ エタノール ２７ １−プロパツール １０ １−ブタノール ５ ホルムアルテ゛ヒト ３０ ２−プロパツール、２−メチル−１−プロパツール、１
−ペンタノール、アセトアルデ゛ヒト、およびエチレン
グリコールは１より少ない相対的活性であった。

蟻酸ソーダ、シクロヘキサノール、および１，４−ブタ
ンジオールは実質的に不活性であった。

本例の結果は本発明のアルコール オキシダーゼ電極は
短鎖アルコールおよびホルムアルデヒドに対し非常に特
異的であることを示す。

本例で観察した酵素の反応性の差異および例■で観察し
た差異は、一部は本試験で使用した酢酸セルロース膜を
通過する基質分子の異る移動性によるものと信じられる
。

差異は一部はアルコール オキシダーゼ標品の純度の差
によるかもしれない。

例■ 一連の人の血清試料を無水エタノールの既知量と混合し
、そして一連の０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝液試料を既知
量の無水エタノールと混合した。

両シリーズにおいて、エタノールレベルは０，０．０１
゜０．０２ 、０．０５および０．１０容量％エタノー
ルであった。

各溶液から５０μｌ試料は例■記載のアルコール オキ
シダーゼ電極を使用して分析した。

ピークの高さ対エタノールレベルのプロットは直線およ
び両シリーズの試料に対しほとんど同じプロットを示し
た。

これらの結果は血清中の他の成分、たとえばアルデヒド
および有機酸はピキア−タイプ微生物からのアルコール
オキシダーゼを含むアルコール−感受性電極を使用す
るアルコール濃度定量を妨害しないことを示す。

例Ｖ ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０から透
析による純結晶固形として単離したアルコール オキシ
ダーゼを含む一連の試料を４０℃で２週間まで保持して
熱安定性を決定した。

アルコール オキシダーゼは２．２ηたん白／ｍｌの濃
度で０、５ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）に添
加した。

別のアルコール オキシダーゼ試料は５０容量％水＊＊
性グリセロールに溶解した。

別のアルコール オキシダーゼ試料は凍結乾燥した。

３試料は２週間の試験中時々方法Ａにより分析した。

結果は以下に要約する。

これら試験の結果は緩衝溶液中のアルコールオキシダー
ゼ活性は４０°Ｃで２週間後に実質的に未変化であった
ことを示す。

５０％グリセロール中のアルコール オキシダーゼ活性
は１週後未変化であったが、４０°Ｃ２週後にはその活
性のいくらかを失なった。

凍結乾燥固形は熱試験中その活性の大部分を失なった。

しかし凍結乾燥アルコール オキシダーゼは４℃ですぐ
れた安定性を有した。

例Ｘ 数種の温度でピキア パスｌ−ＩＪス由来のアルコール
オキシダーゼの溶液中の安定性を決定するために研究
を行なった。

ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０の好気
醗酵からの醗酵流出液を例Ｉ記載のように均質化し、遠
心分離した。

細胞を含まぬ上澄は硫酸アンモニウムにより分別沈澱さ
せた。

生成酵素は５０％純度より低いことをその酵素活性から
概算した。

このような一部精製アルコール オキシダーゼ（０，１
ｍ１）を０．０２重量％アジ化ソーダ（以下にアジ化ソ
ーダ溶液として引用する）を含む１０ｍ１蒸溜水試料に
、そして０．０２重量％アジ化ソーダを含む０．１ Ｍ
ＩＪン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）（以下にアジ化ソー
ダー緩衝溶液として引用する）の１０ｍ１試料に添加し
た。

溶液は方法人を使用し活性に対する間隔をおいた試料分
析により１ケ月間４゜２４．３０もしくは４０°Ｃに保
持した。

４℃に保持したアジ化ソーダおよびアジ化ソーダー緩衝
溶液は試験期間中活性のロスが全くなかった。

２４℃に保持したアジ化ソーダおよびアジ化ソーダー緩
衝溶液は試験データーの外挿法Ｏこより４０日間にその
活性（半減期）の約半分を失なうことが概算された。

３０℃ではアジ化ソーダー緩衝溶液は約３０日の半減期
を有したが、アジ化ソーダ溶液は約１０日の半減期であ
った。

４０°Ｃではアジ化ソーダー緩衝溶液は約１５日の半減
期で、一方アジ化ソーダ溶液は僅か約３日の半減期であ
った。

例Ｍ ピキア パストリスから例■記載のように均質化および
遠心分離して得た細胞を含まぬ凍結上澄試料を遠心分離
して清澄化し、塩酸でｐＨ６，５に調整した。

次に上澄液は５．５時間蒸溜水に対し透析した（上澄液
／水容量比１／１０）。

生成固形結晶アルコール オキシダーゼは固形酵素から
透析上澄をデカントして回収した。

細胞を含まぬ出発上澄のカタラーゼ活性は、Ｊ 、 Ｂ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ５１９５．１３３（１９５２）
記載のＲ，、Ｆ。

Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ １．Ｗ、 ５ｉｚｅｒの方法を
使用し６９７３Ｕ／ｍｌであったが、透析上澄のカタラ
ーゼ活性は６６９７ Ｕ／ｍｌであった。

従って細胞を含まぬ上澄の初めのカタラーゼ活性の９０
％以上が透析完了後の透析上澄に残留する。

例■ ピキア パストリスからのアルコール オキシダーゼの
各種基質に対する反応性は上記分析方法Ａを使用し決定
した。

上記例１記載と同じ醗酵方法でピキア パストリスＮＲ
ＲＬ Ｙ−１１４３０の好気醗酵からの醗酵流出液を均
質化し、遠心分離した。

細胞を含まぬ上澄は硫酸アンモニウムで分別沈澱させ、
一部精製したアルコール オキシダーゼを得た。

分析方法Ａはメタノールに代る適当な基質を使用した。

１００に等しくしたメタノールで標準化した相対的反応
性による結果は以下に表示する。

基 質 相対的反応性 メタノール １００エタノ
ール １００１−プロパツ
ール ７３２−プロパツール
４１−ブタノール
４５２−メチル−１−プロパツール
９１−ペンタノール ５これら
の結果はピキア パストリスからの一部精製アルコール
オキシダーゼは低級、直鎖、第一級アルコールに対し
反応性があることを示す。

例馴 本発明のアルコール オキシダーゼ精製方法による透析
中、純粋結晶アルコール オキシダーゼの形成に及ぼす
酵素濃度の影響を決定するために”試験を行なった。

ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０の好気
醗酵を１１につき約１５０．！９（乾燥重量）の細胞密
度で行なった。

醗酵流出液は均質化し、遠心分離して細胞を含まぬ上澄
を得た。

一連の試料は水で一連に稀釈して細胞を含まぬ上澄から
製造した。

試料（各２ｍ１）のうち５個は４〜５時間１００ｍ１の
０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）に対し透析し
た。

試料６は試料５の複製で、透析しなかった。

透析が完了すると、５透析袋中の液および未透析試料は
分析方法Ａにより酵素活性を分析した。

透析中沈澱を形成した場合、固形は液からデカントして
単離し、方法Ａによる分析のためにリン酸塩緩衝液２ｍ
ｌに溶解した。

結果は以下に示す。

有効細胞 透析前の 上澄の 沈澱の試
料 稀 釈 密度ｇ／１（ａ）活性ｕ７ｒｎ！
” 活性Ｕ／ｍ１（０）活性Ｕ／ｍｌ！”）１
未稀釈 １５０ ２００ ３５．
５ １６５．６２ ２Ｘ ７
５ １００ ５６．８ ４５．１
３ ４Ｘ ３７．５ ５０
５３．３ （ｅ）４ ８Ｘ
１８．７５ ２５ ２５．９
（ｅ）５ １６Ｘ ９．４
１１ １１．３ −（ｅ）６
１６ｘ（ｆ） ９．４ １０．１
− −（ａ）、！ｉ’（乾燥重量）／
ｌブロスの稀釈試料で表わす醗酵流出液の細胞密度。

（ｂ） 透析前の概算活性は透析中油性に全く変化が
ないと仮定する透析後の試料５の活性からおよび未透析
試料６の活性から計算する。

（Ｃ）透析後の透析袋中の液の活性。

（ｄ） 分析のために２ｍｌの０．５ Ｍ ＩＪン酸
塩緩衝液（ｐＨ７，５）に固形沈澱を溶解することによ
り決定する。

（ｅ） 透析中全く沈澱を形成しない。

（ｆ） この試料は透析しなかった。

それぞれ未稀釈上澄（１５０ｇ−乾燥／ｌ細胞密度）お
よび２倍稀釈（約７Ｆｌ−乾燥／ｌ細胞密度の有効細胞
密度を表わす）の試料１および２の透析中沈澱を形成し
た。

沈澱は高稀釈の試料では形成しなかった。

それは約３７．５．９（乾燥重量）／ｌブロスおよびそ
れ以下の有効細胞密度で醗酵からの醗酵流出液を表わす
。

これは約４０ｇ（乾燥重量）／ｌブロス以下の細胞密度
で醗酵からの醗酵流出液は結晶アルコール オキシダー
ゼの回収には適さないことを示唆する。

しかし、このような低細胞密度醗酵からの醗酵流出液は
限外渥過、塩もしくは溶媒沈澱などのような抜法を使用
して濃縮し、本透析方法によるアルコール オキシダー
ゼの単離に適する材料を供することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の反応 ＲＣＨＯＨ＋０″ＲＣＨＯ＋Ｈ２Ｏ２ ２２← （式中、Ｒは水素、メチル、エチルおよびプロピルから
   成る群から選ばれる）を触媒するピキア属のメタノール
   資化性微生物由来のアルコールオキシダーゼであって、
   この酵素は５°ＣでｐＨ５，７５〜６．７５の範囲で、
   ０．０２ＭＩＪン酸塩バッファー中透析下、電気泳動的
   に均質な結晶固体として水溶液から単離でき、上記水溶
   液は流体Ｉ！尚り少なくとも７５．９の有効細胞密度を
   有し、アルコールオキシダーゼはフラビンアデニンジヌ
   クレオチド補酵素、少なくとも６つのサブユニットを有
   し、アセトアルデヒド又は有機酸の存在下本質的に反応
   性なくそしてキャンジダボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａｂ
   ｏｉｄｉｎｉｉ ）由来のアルコールオキシダーゼ酵素
   より重い分子量を有するフラボタン白であることを特徴
   とする、上記アルコールオキシダーゼ。 ２ 濃厚である特許請求の範囲第１項記載のアルコール
   オキシダーゼ。 ３ 結晶である特許請求の範囲第１項記載のアルコール
   オキシダーゼ。 ４ ピキア−タイプの酵母はピキア属のものである特許
   請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項ζこ記載の
   アルコール オキシダーゼ。 ５ 酵母はピキア パストリスである特許請求の範囲第
   ４項記載のアルコール オキシダーゼ。 ６ アルコール オキシダーゼの製造方法において、メ
   タノール資化性ピキア−属微生物の細胞サスペンション
   を含む流体を製造し、その流体は流体の均質化後に０．
   ０５Ｍ〜約０．ＯＩＭの範囲のモルイオン強度を有する
   時にアルコールオキシダーゼの結晶化に有利な細胞密度
   を有し、細胞サスペンションを含むその流体を均質化し
   て均質物を製造し、それによって可溶性アルコール オ
   キシダーゼを含む溶液を製造し、こうして製造した均質
   物を、アルコール オキシダーゼには不透過性であるが
   たとえあるとしても、水および緩衝剤分子に透過性であ
   る膜を通して透析媒体に対して透析し、膜の酵素側にそ
   の範囲のモルイオン強度を達成させ、それによってアル
   コール オキシダーゼ結晶を生成させ、こうして製造し
   た結晶アルコール オキシダーゼを透析媒体から分離す
   ることを特徴とする上記製造方法。 ７ メタノール資化性ピキア−タイプ微生物はピキア
   パストリス、ピキアピヌス、ピキア トレハロフイラも
   しくはピキア モリシアナである特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 ８ メタノール資化性ピキア−タイプ微生物はピキア
   パストリス微工研菌寄５６８２ （ＮＲＲＬＹ−１１４
   ３０）もしくはピキア パストリス微工研菌寄５６８３
   （ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）菌株である特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 ９ 回収範囲溶液は平衡状態で達成する特許請求の範囲
   第６項から第８項のいずれか１項に記載の方法。 １０回収範囲溶液は０．０２Ｍのモルイオン強度を有す
   る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 回収範囲溶液は平衡前に達成する特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 １２ その回収範囲溶液が約０．０２Ｍイオン強度であ
   る時に透析媒体からこうして製造した結晶アルコール
   オキシダーゼを分離することより成る特許請求の範囲第
   ６項から第１１項のいずれか１項に記載の方法。 １３透析媒体から湿潤スラリーとしてこうして製造した
   結晶アルコール オキシダーゼを分離し、次いで凍結乾
   燥することより成る特許請求の範囲第６項から第１２項
   のいずれか１項に記載の方法。 １４ メタノール資化性ピキア−タイプ使用微生物は
   メタノール制限条件下で培養する特許請求の範囲第６項
   から第１３項のいずれか１項に記載の方法。 １５ メタノール資化性ピキア−タイプ微生物は炭素
   およびエネルギー源としてメタノールを使用する水性好
   気醗酵条件下で培養し、細胞含有醗酵液を産生ずる特許
   請求の範囲第６項から第１４項のいずれか１項に記載の
   方法。 １６醗酵液の部分は細胞サスペンションを含有する流体
   として使用する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７醗酵流出液から遠心分離により細胞を分離し、水性
   媒体中に再サスペンドし、細胞サスペンションを含有す
   る流体を形成させることより成る特許請求の範囲第１５
   項もしくは第１６項記載の方法。 １８醗酵流出液からｒ過により細胞を分離し、水性媒体
   中に再サスペンドし、細胞サスペンションを含有するそ
   の流体を形成させることより成る特許請求の範囲第１５
   項もしくは第１６項記載の方法。 １９細胞は流体１１につき乾燥重量基準で７５ｇより多
   い細胞を含む流体密度を有する特許請求の範囲第１６項
   から第１８項のいずれか１項に記載の方法。 ２０懸濁固体は遠心分離により均質物から除去する特許
   請求の範囲第６項から第１９項のいずれか１項に記載の
   方法。 ２１ メタノール、エタノール、ｎ−７’ロバノール
   もしくはｎ−ブタノールを含む流体試料中の化合物濃度
   の定量方法において、酵素活性に融和性条件を有する流
   体試料を製造し、ピキア属のメタノール資化性微生物か
   らのアルコール オキシダーゼ標品をその試料に添加し
   、そしてその試料中の酵素、過酸化水素もしくはアルデ
   ヒド生成物の濃度変化を測定することより成りそのアル
   コールオキシダーゼはメタノール存在下の酵素反応性に
   ほぼ等しい反応性をエタノール存在下に有し、そのアル
   コール オキシダーゼは第１の基質としてｎ−プロパツ
   ールもしくはｎ−ブタノールの存在下に、メタノール存
   在下の酵素反応性の約７５％より少ない反応性を有し、
   そのアルコール オキシダーゼは第２の基質として２−
   プロパツール、２−メチル−１−プロパツールもしくは
   １−ペンタノールの存在下に、メタノール存在下の酵素
   反応性の１０％より少ない反応性を有することを特徴と
   する、上記定量方法。 ２２酵素活性に融和性のその条件は、約６〜約９の範囲
   のｐＨおよび約２５〜約４５°Ｃの範囲の温度を有する
   その流体試料を含み、そのアルコールオキシダーゼ標品
   は電気泳動的に均質なアルコール オキシダーゼである
   特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３ そのｐＨは約８で、その温度は約４５°Ｃである
   特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４ アルコール オキシダーゼは溶解酵素電極の先端
   に固定し、その電極のその先端はその試料中に挿入し、
   そして酸素もしくは過酸化水素の濃度変化をポーラログ
   ラフで測定する特許請求の範囲第２１項から第２３項の
   いずれか１項に記載の方法。 ２５流体試料は生物学的流体より成る特許請求の範囲第
   ２４項記載の方法。 ２６生物学的流体は血液で、アルコールはエタノールで
   ある特許請求の範囲第２５項記載の方法。