【発明の詳細な説明】
インフルエンザ菌Rdゲノムのヌクレオチド配列、
そのフラグメント及びその使用
本発明の展開中に実施された研究の1部は米国政府の資金を使用した。政府は
本発明に一定の権利を有することができる。NIH-5R01GM48251
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関するものである。本発明はインフルエンザ菌(
ヘモフィルスインフルエンザ)のヌクレオチド配列、そのフラグメントを含む組
成物並びに産業的発酵及び製薬的開発における使用法を開示する。
発明の背景
自由に生存する細胞生物の完全なゲノム配列は未だ決定されていない。最初の
ミコバクテリウム配列は1996年までに完了し、一方大腸菌及びS.セレビシエは19
98年前までに完了すると期待されている。これらはオーバラップコスミドクロー
ンの無作為及び/又は指令配列決定によってなされている。ランダムショットガ
ン方法によって1メガベース又はそれ以上のオーダーの配列を決定しようと試み
た者はいなかった。
インフルエンザ菌は、唯一の天然宿主がヒトである小さい(概ね0.4×1ミク
ロン)非自動性、非胞子形成、胚芽陰性の細菌である。これは子供や成人の上部
呼吸器粘膜に住みついており、そして殆どが子供で中耳炎や気道感染を生じさせ
る。最も重篤な合併症は髄膜炎であり、そしてこれは感染児の50%までで神経病
学的続発症をもたらす。免疫学的に異なる莢膜多糖抗原に基づいて、6種のイン
フルエンザ菌血清型(aからf)が同定されている。型を決定できない多数の株
も知られている。血清型bは大多数のヒト疾病の原因となる。
インフルエンザ菌生物学の医学的に重要な特徴における関心は、この生物
のビルレンス特徴を決定する遺伝子に特に焦点が集まっている。莢膜多糖に寄与
する多数の遺伝子のマップが作成されそして配列が決定された(Kroll等、Mol
.Microbiol.5(6); 1549〜1560(1991年)。幾つかの外層膜タンパク質(OMP
)遺伝子が同定されそして配列が決定された(Langford等、J.Gen.Microbi
l.138:155〜159(1992年))。外層膜のリポオリゴ糠(LOS)成分及びその合
成経路の遺伝子は集中的に研究されている(Weiser等、J.Bacteriol.172:33
04〜3309(1990年))。1984年以降ワクチンは利用可能であるが、外層膜成分の
研究は、改良ワクチンに対する需要によって或る程度動機づけられている。最近
、カタラーゼ遺伝子はビルレンス関連遺伝子の可能性があるとして特徴付けられ
そして配列が決定された(Bishni等、印刷中)。インフルエンザ菌ゲノムの解明
はインフルエンザ菌がどのようにして侵襲性疾患を引き起こすのかそしてどのよ
うにして感染と最も良く闘うのかの理解を高めるであろう。
インフルエンザ菌は非常に効率的な天然DNA形質転換系を有しており、そし
てこの系は非封入(R)、血清型d株で集中的に研究されている(Kahn及びSmith
、J.Membrans Biology 81:89〜103(1984年)).少なくとも16の形質転換特
異的遺伝子が同定されそして配列が決定されている。これらのうち、4つは調節
遺伝子であり(Redfield.J.Bacteriol.、173:5612〜5618(1991年)及びCh
andler、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1626〜1630(1992年))、少な
くとも2つは組換え過程に関係しており(Barouki及びSmith.J.Baoteriol.
、163(2):629〜634(1985年))、そして少なくとも7つは膜及び細胞周辺腔に向
けられており(Tomb等、Gene 104:1〜10(1991年)及びTomb.Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 89:10252〜10256(1992年))、そしてそこでこれら遺伝子は
構造成分として又はDNA輸送機構のアッセンブリー内で機能するように思われ
る。インフルエンザ菌Rdの形質転換は、前列特異的DNA取り込み、コンピテ
ント細胞当たり数個の二本鎖DNA分子のトランスフォーマソムと呼ばれる膜小
室中への迅速な取込み、ドナーDNAの1本鎖の細胞質中への直線的トランスロ
ーケーション、並びに1本鎖置換メカニズムによる1本鎖と染色体の対合及び組
換えを含む
多数の興味ある特徴を示している。インフルエンザ菌Rd形質転換系はグラム陰
性系の中で最も完全に研究された系であり、そしてグラム陽性系とは多数の態様
で異なっている。
インフルエンザ菌Rdゲノムの大きさは制限滴化物のパルスフィールドアガロ
ースゲル電気泳動法によって概ね1.9Mbであると決定されており、このゲノムは
大膓菌の大きさの概ね40%である(Lee及びSmith、J.Bacteriol.170:4402
〜4405(1988年))。インフルエンザ菌の制限マップは円形である(Lee等、J.
Bacteriol.171:3016〜3024(1989年)並びにRedfield及びLee、「インフルエ
ンザ菌Rd」、2110〜2112頁、O’Brien,S.J.(編集)、Ganetic Maps: Loc
us Maps of Comples Genomex、Cold Spring Harbor Press、ニューヨー
ク)。種々の遺伝子が制限洞化DNAバンドのサザンハイブリッド形成プローブ
法によって制限フラグメントにマッピングされている。このマップは無作為に配
列決定されたフラグメントから得られた完全なゲノム配列のアッセンブリーを証
明するのに価値があろう。ジーンバンク(GenBank)には現在約100kbの冗長の
ないインフルエンザ菌DNA配列がある。約半分は血清型bからのものでありそ
して半分はRdからのものである
発明の要約
本発明はインフルエンザ菌Rdゲノムの配列決定に基づいている。得られた一
次ヌクレオチド配列は配列識別番号:1で提供する。
本発明はインフルエンザ菌Rdゲノムの得られたヌクレオチド配列又はその代
表的なフラグメントを熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈できる形態
で提供する。1つの実施態様では、本発明は配列識別番号:1で示されるヌクレ
オチド配列に相当する一次配列情報の連続列として提供される。
本発明は更に、配列識別番号:1のヌクレオチド配列と少なくとも99.9%同一
のヌクレオチド配列を提供する。
配列識別番号:1のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント又は配列識
別番号:1のヌクレオチド配列と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列はそ
の使用を容易にする多様な媒体中で提供することができる。この実施態
様の1つの適用では、本発明の配列はコンピューター読み出し媒体に記載される
。このような媒体には、磁気保存媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディ
スク保存媒体及び磁気チープ; CD-ROMのような光学保存媒体; RAM及び
ROMのような電気保存媒体; 並びにこれらカテゴリーの合成物、例えば磁気/
光学保存媒体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は更に、システム、特に、データ保存手段に保存され本明細書に記載さ
れた配列情報を有しているコンピューターに基づくシステムを提供する。このよ
うなシステムはインフルエンザ菌Rdゲノムの商業的に重要なフラグメントを同
定するように設計されている。
本発明のもう1つの実施態様はインフルエンザ菌Rdゲノムの単離フラグメン
トに向けれらている。本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントには
、ペプチドをコードしているフラグメント(以下、読み取り枠(ORF))、操作可
能的に結合されたORFの発現を調節するフラグメント(以下、発現調節フラグ
メント(EMF))、結合DNAフラグメントの細胞内取込みに介在するフラグ
メント(以下、取込み調節フラグメント(UMF))、及び試料中のインフルエン
ザ菌Rdの存在を診断するために使用できるフラグメント(以下、診断フラグメ
ント(DF))が含まれるが、これらに限定されない。
インフルエンザ菌Rdゲノムの各ORFフラグメントは表1(a)及び2に開示
し、そしてORFの5'に見られるEMFはポリヌクレオチド試薬として膨大な
数の方法で使用することができる。これらの配列は、試料中の特定の微生物の存
在についての診断プローブ又は診断増幅プライマーとして、商業的に重要な医療
品を製造するために、そして遺伝子発現を選択的に制御するために使用すること
ができる。
本発明には更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムの1つ又はそれより多
いフラグメントを含んでいる組換え構築物が含まれる。本発明の組換え構築物は
、インフルエンザ菌Rdのフラグメントが挿入されているベクター、例えばプラ
スミド又はウイルスベクターを含んでいる。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムの単離フラグメントの任
意の1つを含有する宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞は哺乳動物細
胞のような高等真核生物宿主、酵母細胞のような下等真核細胞であることができ
るか又は細菌細胞のような原核細胞であることができる。
本発明は更に、本発明のORFでコードされている単離タンパク質に向けられ
ている。当該技術分野で知られている多様な方油を使用して本発明のタンバク質
の任意の1つを取得することができる。最も簡単なレベルでは、商業的に入手で
きるペプチド合成器を使用してアミノ酸配列を合成することができる。代替的方
法では、タンパク質は天然にタンパク質を産生する細菌細胞から精製される。最
後に、本発明のタンパク質は所望のタンパク質を発現するように改変されている
細胞から代替的に精製することができる。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノ4のフラグメントの相同体
及び本発明のORFによってコードされるタンパク質の相同体を取得する方法を
提供する。詳細には、本明細書に開示されたヌクレオチド及びアミノ酸配列をプ
ローブ又はプライマーとして使用しそしてPCRクローニング法やコロニー/プ
ラークハイブリッド形成法のような技術を使用することによって、当該技術分野
の熟練者は相同体を取得することができる。
本発明は更に、本発明のタンパク質の1つと選択的に結合する抗体を提供する
。このような抗体にはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方が含まれ
る。
本発明は更に、上記抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドー
マは特異的なモノクローナル抗体を分秘し得る不死化細胞株である。
本発明は更に、本発明のORFの1つ又はその相同体を発現する細胞から誘導
された試験試料の同定方法を提供する。このような方法は、試験試料を本発明の
1つ若しくはそれより多い抗体又は本発明の1つ若しくはそれより多いDFと共
に、試料がORF又はこれから産生された生成物を含有しているかどうかを熟練
者が測定できる条件下でインキュベートすることを含んでいる。
本発明のもう1つの実施態様では、上記アッセイを実施するために必要な試薬
を含有しているキットを提供する。
詳細には、本発明は、(a)本発明の抗体の1つ又はDFの1つを含んで
いる第1の容器; 及び(b)1つ又はそれより多い次の試薬: 洗浄試薬、結合し
た抗体又はハイブリッド化したDFの存在を検出し得る試薬を含んでいる1つ又
はそれより多い他の容器、を含んでいる1つ又はそれより多い容器を、近接して
閉じ込めて受け入れる隔室キットを提供する。
本発明の単離タンパク質を使用して、本発明は更に、本発明のORFの1つに
よってコード化されるタンパク質と結合し得る物質を取得しそして同定する方法
を提供する。詳細には、このような物質には抗体(上記した)、ペプチド、炭水化
物、医薬品等が含まれる。このような方法は次の段階を含んでいる:
(a) 物質を、本発明のORFの1つによってコードされる
単離タンパク質と接触させること; 及び
(b) 上記物質が上記タンパク質と結合するかどうかを測定
すること。
インフルエンザ菌の完全なゲノム配列は、この生物で研究している全ての研究
室にとってそして多様な商業的目的で非常に価値があろう。インフルエンザ菌R
dゲノムの多数のフラグメントはジーンバンク又はタンパク質データベースの類
似性検索によって直ちに同定され、そしてヘモフィルス属研究者にとって当面の
価値があり、そしてタンパク質の製造又は遺伝子発現の制御にとって当面の商業
的な価値があるであろう。特別の例はPHAシンターゼに関するものである。ポ
リヒドロキシブチレートはインフルエンザ菌Rdの膜に存在しておりそしてその
量は形質転換に必要な能力レベルと相互関係があることが報告されている。この
ポリマーを合成するPHAシンターゼは多数の細菌で同定されそして配列が決定
されているが、それら細菌はどれもインフルエンザ菌と進化的に近くない。この
遺伝子は、ハイブリッド形成ブローブ又はPCR技術を使用してインフルエンザ
菌から未だ単離しなければならない。しかし乍ら、本発明のゲノム配列は以下に
記載する検索手段を使用することによってこの遺伝子の同定を可能にする。
細菌や他の小ゲノムの全ゲノム配列を解明する方法論や技術の発展によって染
色体組織を分析する能力や理解が大いに高められておりそして高められ
るであろう。特に、配列が決定されたゲノムは、ゲノムDNAの大きい断片内の
遺伝子を同定し得ること、調節要素の構造、位置及び間隔、産業的適用の可能性
を有する遺伝子を同定すること、並びに比較ゲノム及び分子系統発生学を行い得
ることを含めて、染色体の構造及び機能を分析する手段を開発するモデルを提供
するであろう。
図面の説明
図1 − インフルエンザ菌Rdゲノムの制限マップ。
図2 − 本発明のコンピューターに基づくシスチムを実行するために使用でき
るコンピューターシステム102の組立て分解図。
図3 − 460bpの平均配列長及び25bpの重複を有する2.5Mbゲノム(三角)及
び1.6Mbゲノム(丸)についてのランダー・ウォーターマン(Lander-Waterma
n)の予測と比較した、オートアッセンブラー(AutoAssembler)(四角)で組
み立てた概ね4000個までのランダム配列フラグメントの実験的範囲の比較。
図4 − インフルエンザ菌ゲノムを管理し、組み立て、編集しそして注釈をつ
けるために使用したデータフロー及びコンピュータープログラム。マッキントッ
シュ(Macintosh)とユニックス(Unix)の両プラットフォームを使用してA
B373配列データファイル(Kerlavage等、Proceedings of the Twenty-Sixt
h Annual Hawaii International Conference on System Sciences、IE
EE Computer Socity Prees、ワシントンD.C.、585(1993年))を処理す
る。ファクチュラ(Factura)(AB)は配列ファイルの自動ベクター配列除去
及び末端切り取り用に設計したマッキントッシュのプログラムである。プログラ
ムespはマッキントッシュプラットフォームで作動しそしてファクチュラによっ
て配列ファイルから抽出された特徴データをユニックスに基づくインフルエンザ
菌関連データベースに書き込む。組み立ては、stp、X-ウィンドウグラフィック
インターフェース、及び使用者によって特定されるか又は標準的なSQL照会を
使用してインフルエンザ菌データベースから配列を取り出すことができる制御プ
ログラムを使用して特定
の配列ファイルセット及びそれらの関連特徴を取り出すことによって達成される
。配列ファイルは、数千もの配列フラグメントを迅速且つ正確に組み立てるため
にTIGRで設計された組み立て装置、TIGRアッセンブラーを使用して組み
立てられた。TIGRエディター(Editor)はTIGRアッセンブラーアウト
プットから得られる整列した配列ファイルを書き込みそして連続編集用にこの整
列及び関連エレクトロフェログラムを表示することができるグラフィックインタ
ーフェースである。推定上のコード化領域の同定はジーンマーク(Genemark)(
Borodovsky及びMcIninch、Computers Chem。17(2):123(1993年))、即ち遺
伝子の位置を予測するマーコフ(Markov)及びベイズ(Bayes)のモデル化プロ
グラムで実施し、そしてインフルエンザ菌配列データセットに向けた。ペプチド
検索は、4096個のマイクロプロセッサーを有するマスパル(Maspar)MP-2大
規模パラレルコンピューターで実行されるblaze(Brutag等、Computers Chem
.17:203(1993年))を使用してジーンマークで予測される各コード化領域の3
つの読み取り枠に対して実施した。各読み取り枠から得られる結果をmblztによ
って単一のアウトプットファイル中に組み合わせた。最適のタンパク質整列は潜
在的なフレームシフト間に整列を延長させるプログラムprazeを使用して取得し
た。アウトプットは、インフルエンザ菌データベースと直接相互作用するオーダ
ーメードのグラフィックビュープログラム、gbyobを使用して調べた。これらの
整列は潜在的なフレームシフトエラーを同定するために使用しそして更に編集す
るための目標とした。
図5 − データベースとの適合を有する各予測コード化領域の位置並びにゲノ
ムの選択された全体的特徴を示しているインフルエンザ菌Rd染色体の円形表示
。外部円周: 特有のNotI制限部位(ヌクレオチド1と呼称される)、RarII部位
及びSmaI部位の位置。外部同心円: 遺伝子同定を行った各同定コード化領域の
位置。各コード化領域の位置は図6の色コードによる役割に関してコード化され
ている。第2の同心円: 高いG/C含有量の領域(>42%、赤色; >40%、青色
)及び高いA/T含有量の領域(>66%、黒色; >64%、緑色)。高いG/C含有
量の領域は6個のリボソームオペロンとミュー様プロ
ファージと特に関係がある。第3の同心円: ラムダクローンによる範囲(青色)。
300個を超えるラムダクローンは各末端から配列決定して、ゲノムの構造全体を
確認しそして6個のリボソームオペロンを同定した。第4の同心円: 6つのリボ
ソームオペロン(緑色)、tRNA(黒色)及び曖昧なミュー様プロファージ(青
色)の位置。第5の同心円: 単純な一列に並んだ繰返し。次の繰返しの位置が示
されている: CTGGCT、GTCT、ATT、AATGGC、TIGA、TT
GG、TTTA、TTATC、TGAC、TCGTC、AACC、TTGG、C
AAT、CCAA。推定上の複製起源は塩基603,000付近で始まる外側で方向を
指している矢印(緑色6)によって示される。2つの潜在的終結配列は円の反対側
の中間点付近で示されている(赤色)。
図6(A)〜6(D) − インフルエンザ菌Rdゲノムの完全なマップ。予測
コード化領域を各鎖上に示す。rRNA及びtRNA遺伝子はそれぞれ直線及び
三角として示す。遺伝子は凡例に記載された役割カテゴリーによって色でコード
化されている。遺伝子識別(GeneID)番号は表1(a)、1(b)及び2の番号
に対応する。可能な場合、3文字表記も扱供する。
図7 − インフルエンザ菌b型中に存在するふさ状へり遺伝子集団の8個の遺
伝子を含有するインフルエンザ菌染色体の領域とインフルエンザ菌Rd中の同じ
領域との比較。この領域では両生物共に pepN及びpurE遺伝子が側部に結合し
ている。しかし乍ら、非感染性Rd株では、ふさ状へり遺伝子集団の8個の遺伝
子が切り取られている。Rd株のこの領域には172bpのスペーサー領域が位置して
おり、そしてpepN及びpurE遺伝子が側部に結合している。
図8 − 5つの予測チャンネルタンパク質の疎水性分析。既知のペプチド配列
(GenBankのリリース87種)との相同性を示していない5つの予測コード化領
域のアミノ酸配列であって、各アミノ酸配列はチャンネル形成タンパク質の特徴
である複数の疎水性ドメインを示している。予測コード化領域の配列は、ジーン
ワークス(GeneWorks)ソフトウェアパッケージ(Intelligenetics)を使用
してカイト・ドーリトル(Kyte-Doolittle)アルゴリズム(Kyte及びDoolit
tle、J.Mol.Biol.157:105(1982年))(11残基の範囲で)で分析した。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明はインフルエンザ菌Rdゲノムの配列決定に基づいている。得られた一
次ヌクレオチド配列は配列識別番号:1で提供されている。本明細書で使用する
とき、「一次前列」とはIUPAC命名法で表わされるヌクレオチド記列を言う
。
配列識別番号:1で提供される配列はインフルエンザ菌Rdゲノム中に見られる
特有のNotI制限エンドヌクレアーゼ部位に関連して適応されている。熟練技術
者は、この開始/停止点が便宣上選択されたものでありそして構造的意義を反映
していないことを容易に認識するであろう。
本発明は配列識別番号:1のヌクレオチド配列又はその代表的なフラグメント
を、熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈できる形態で提供する。1つ
の実施態様では、配列は配列識別番号:1で提供されるヌクレオチド配列に対応
する一次配列情報の連続列として提供される。
本明細書で使用するとき、「配列識別番号:1で示されるヌクレオチド配列の
代表的なフラグメント」とは、公に利用可能なデータベース内で現在示されてい
ない配列識別番号:1の任意の部分を言う。本発明の好ましい代表的なフラグメ
ントはインフルエンザ菌読み取り枠、発現調節フラグメント、取込み調節フラグ
メント及び試料中のインフルエンサ菌Rdの存在を診断するために使用できるフ
ラグメントである。このような好ましい代表的なフラグメントの識別は表1(a
)及び2に提供されるがこれらに限定されない。
配列識別番号:1で提供されたヌクレオチド配列情報は、メガベースショット
ガン配列決定方法を使用してインフルエンザ菌Rdゲノムの配列を決定すること
によって得られた。下記実施例で考察した正確さに関する3つのパラメーターを
使用して、本発明者は配列識別番号:1の配列が最大99.98%の正確さを有してい
ると計算した。かくして、配列識別番号:1で提供されたヌクレオチド前列は、
必ずしも100%完全ではないが、インフルエンザ菌Rdゲノムのヌクレオチド配列
を非常に正確に示すものである。
以下で詳細に検討するように、配列識別番号:1並びに表1(a)及び2で
提供された情報を定型的なクローニング及び配列決定方法と一緒に使用して、当
該技術分野の通常の技倆を有する者は、非常に多様なインフルエンザ菌タンパク
質をコードする読み取り枠(ORF)を含む重要な全ての「代表的なフラグメン
ト」をクローン化しそしてそれらの配列を決定することができるであろう。極く
稀な場合に、これは配列識別番号:1で開示されたヌクレオチド配列中に存在す
るヌクレオチド配列の誤謬を明らかにすることがある。それ故、本発明が一度利
用可能になると(即ち、配列識別番号:1並びに表1(a)及び2の情報が一度利用
可能になると)、配列識別番号:1中の配列決定の稀な誤謬の解決は正に当該技術
分野の技倆の範囲内であろう。ヌクレオチド配列編集ソフトウエアは公に利用可
能である。例えば、アプライドバイオシステム(Applied Biosysytem)(AB
)のオートアッセンブラー(商標)はヌクレオチド配列を視覚的に調べている間
の補助物として使用することができる。
たとえ配列識別番号:1の非常に稀な配列決定の誤謬が全て訂正されたとして
も、得られるヌクレオチドは配列識別番号:1のヌクレオチド配列と依然として
少なくとも99.9%同一であろう。
異なるインフルエンザ菌株から得られるゲノムのヌクレオチド配列は僅かに異
なっている。しかし乍ら、全てのインフルエンザ菌株のゲノムのヌクレオチド配
列は配列識別番号:1で提供されたヌクレオチド配列と少なくとも99.9%同一で
あろう。
かくして、本発明は更に、配列識別番号:1のヌクレオチド配列と少なくとも9
9.9%同一のヌクレオチド配列を熟練技術者が容易に使用し、分析しそして解釈
できる形態で提供する。ヌクレオチド配列が配列識別番号:1のヌクレオチド配
列と少なくとも99.9%同一であるかどうかを決定する方法は定型的でありそして
熟練技術者にとって容易に利用可能である。例えば、周知のfastaアルゴリズム
(Pearson及びLipman、Proc.Natl.Acad.Soi.USA 85:2444(1988年
)を使用してヌクレオチド配列の同一性パーセントを得ることができる。
コンピューター関連実施態様
配列識別番号:1で提供されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント
又は配列識別番号:1と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列はそれらの使
用を容易にする多様な媒体中で「提供され」得るであろう。本明細書で使用する
とき、提供されたとは、本発明のヌクレオチド配列、即ち、配列識別番号:1で
提供されたヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号:1
と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列を含有する単離核酸分子以外の製造
物を言う。このような製造物はインフルエンザ菌Rdゲノム又はそのサブセット
(例えば、インフルエンザ菌Rd読み取り枠(ORF))を、インフルエンザ菌
Rdゲノム又は天然若しくは精製形態で存在している該ゲノムのサブセットを試
験するために直接適用できない手段を使用して、熟練技術者がこの製造物を試験
できるようになる形態で提供する。
この実施態様の1つの適用では、本発明のヌクレオチド配列をコンピューター
読み出し媒体に記録することができる。本明細書で使用するとき、「コンピュー
ター読み出し媒体」とはコンピューターが読み出しそして直接アクセスできる任
意の媒体を言う。このような媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク保
存媒体及び磁気テープのような磁気保存媒体; CD-ROMのような光学保存媒
体: RAM及びROMのような電気保存媒体; 並びにこれらカテゴリーの合成物
、例えば磁気/光学保存媒体が含まれるが、これらに限定されない。熟練技術者
は、現在知られているコンピューター読み出し媒体をどのように使用して、本発
明のヌクレオチド配列が記録されているコンピューター読み出し媒体を含んでい
る製造物を創製するのかを容易に理解することができるであろう。
本明細書で使用するとき、「記録された」とはコンピューター読み出し媒体に
情報を保存する過程を言う。熟練技術者は、現在知られているコンピューター読
み出し媒体への情報記録方法を容易に採用して、本発明のヌクレオチド配列情報
を含む製造物を作ることができるであろう。
本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピューター読み出し媒体を創作
するために、熟練技術者は多様なデータ保存構造物を利用することがで
きる。データ保存構造物の選択は一般的には、保存情報にアクセスするために選
択される手段に基づいている。加えて、多様なデータプロセッサープログラム及
びフォーマットを使用して本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読み
出し媒体に保存することができる。配列情報は、ワープロテキストファイル中に
示すか、ワードパーフェクト(WordPerfect)やマイクロソフトワード(Micr
oSoft Word)のような市販で入手可能なソフトウエア中にフォーマットするか
、又はDB2、Sybase、Oracle等のようなデータベースアクリケーション中に
保存されたASCIIファイルの形態で示すことができる。熟練技術者は、本発明
のヌクレオチド配列情報が記録されているコンピューター読み出し媒体を得るた
めに、任意の数のデータプロセッサー構築フォーマット(例えば、テキストファ
イル又はデータベース)を容易に適合させることができる。
配列識別番号:1のヌクレオチド配列、その代表的なフラグメント、又は配列
識別番号:1と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列をコンピューター読み
出し形態で提供することによって、熟練技術者は多様な目的で配列情報に定型的
にアクセスすることができる。熟練技術者がコンピューター読み出し媒体中に提
供された配列情報にアクセスすることができるコンピューターソフトウエアは公
に入手可能である。以下の実施例は、SybaseシステムでBLAST(Altschul
等、J.Mol.Biol.215:403〜410(1990年))及びBLAZE(Brutlag等
、Comp.Chem.17;203〜207(1993年))検索アルゴリズムを実行するソフト
ウエアをどのように使用して、インフルエンザ菌Rdゲノム内の読み取り枠(O
RF)を、他の生物から得られるその相同体又はタンパク質を含めて同定するの
かを示している。このようなORFはインフルエンザ菌Rdゲノム内のフラグメ
ントをコードしているタンパク質であり、そして発酵反応及び商業的に有用な代
謝物の製造に使用される酵素のような商業的に重要なタンパク質を製造するのに
有用である。
本発明は更に、本明細書に記載された配列情報を含有しているシステム、特に
コンピューターに基づくシステムを提供する。このようなシステムはインフルエ
ンザ菌Rdゲノムの商業的に重要なフラグメントを同定するように設
計されている。
本明細書で使用するとき、「コンピューターに基づくシステム」は、本発明の
ヌクレオチド配列情報を分析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウ
エア手段及びデータ保存手段を言う。本発明のコンピューターに基づくシステム
の最小限のハードウエア手段は中心処環ユニット(CPU)、インプット手段、ア
ウトプット手段及びデータ保存手段を含んでいる。熟連技術者は、現在利用可能
なコンピューターに基づくシステムのいずれも本発明で使用するのに適している
ことを容易に理解することができる。
上記したように、本発明のコンピューターに基づくシステムは本発明のヌクレ
オチド配列を保存しているデータ保存手段並びに必要なハードウエア手段及び検
索手段を支持しそして実施するソフトウエア手段を含んでいる。本明細書で使用
するとき、「データ保存手段」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を保存でき
るメモリー、又は本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製造物にアクセ
スできるメモリーアクセス手段を言う。
本明細書で使用するとき、「検索手段」とは、標的配列又は標的構造モチーフ
をデータ保存手段内に保存された配列情報と比較するために、コンピューターに
基づくシステムで実行される1つ又はそれより多いプログラムを言う。検索手段
は特定の標的配列又は標的モチーフに適合するインフルエンザ菌Rdゲノムのフ
ラグメント又は領域を同定するために使用される。多様な既知のアルゴリズムが
公に開示されており、そして検索手段実行用の市販で入手可能な多様なソフトウ
エアが本発明のコンピューターに基づくシステムで使用されそして使用すること
ができる。このようなソフトウエアの例はマックパターン(MacPattern)(E
MBL)、BLASTN及びBLASTX(NCBIA)であるが、これらに限
定されない。熟練技術者は、相同性検索を実施するための利用可能なアルゴリズ
ム又は実行用ソフトウエアパッケージのどれも本発明のコンピューターに基づく
システムで使用するために適応させ得ることを容易に認識することができる。
本明細書で使用するとき、「標的配列」は6個若しくはそれより多いヌクレオ
チド又は2個若しくはそれより多いアミノ酸の任意のDNA又はアミノ
酸配列であることができる。熟練技術者は、標的配列が長ければ長いほど、標的
配列がデータベース中にランダム発生として存在する可能性は少なくなることを
容易に認識することができる。標的配列の最も好ましい配列の長さは約10から10
0個のアミノ酸又は約30から300個のヌクレオチド残基である。しかし乍ら、イン
フルエンザ菌Rdゲノムの商業的に重要なフラグメント、例えば遺伝子発現やタ
ンパク質プロセシングに関与する配列フラグメントの検索はより短い長さのフラ
グメントであることが良く認識されている。
本明細書で使用するとき、「標的構造モチーフ」又は「標的モチーフ」とは、
配列(単数又は複数)が標的モチーフの折りたたみによって形成される三次元配
置に基づいて選択される合理的に選択された任意の配列又は配列の組合せを言う
。多様な標的モチーフが当該技術分野で知られている。タンパク質標的モチーフ
には酵素活性部位及びシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。核酸
標的モチーフにはプロモーター配列、ヘアピン構造体及び誘導可能な発現要素(
タンパク質結合配列)が含まれるが、これらに限定されない。
インプット及びアウトプット手段用の多様な構造フォーマットを使用して、本
発明のコンピューターに基づくシステムで情報をインプット又はアウトプットす
ることができる。アウトプット手段用の好ましいフォーマットは標的配列又は標
的モチーフと種々の相同度を有するインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメント
をランクづける。このようにして示されたものは熟練技術者に種々の量の標的配
列又は標的モチーフを含有する配列のランクづけを提供し、そして同定されたフ
ラグメント中に含まれる相同度を同定する。
多様な比較手段を使用して標的配列又は標的モチーフをデータ保存手段と比較
して、インフルエンザ菌Rdゲノムの配列フラグメントを同定することができる
。本発明の実施例では、BLAST及びBLAZEアルゴリズム(Altschul等
、J.Mol.Biol.215:403〜410(1990年))を実行する実行用ソフトウエアを
使用してインフルエンザ菌Rdゲノム内の読み取り枠を同定した。熟練技術者は
、公に入手可能な相同性検索プログラムがどれも本発明のコンピューターに基づ
くシステム用の検索手段として使用できることを容易に認
識することができる。
この実施態様の1つの適用は図2で提供する。図2は、本発明を実行するため
に使用できるコンピューターシステム102の分解組立て図を提供する。コンピュ
ーターシステム102は母線104に連結されたプロセッサー108を含んでいる。母線
には主メモリー108(好ましくはランダムアクセスメモリー、RAMとして実行
される)及び多様な二次的保存デバイス110、例えばハードドライブ112及び取外
し可能媒体保管デバイス114も連結されている。取外し可能媒体保管デバイス114
は、例えばフロッピーディスクドライブ、CD-ROMドライブ、磁気テープド
ライブ等を表わすことができる。コントロール論理学及び/又はデータが記録さ
れている取外し可能保存媒体116(例えば、フロッピーディスク、コンパクトデ
ィスク、磁気テープ等)は取外し可能媒体保管デバイス114中に挿入することが
できる。コンピューターシステム102は、取外し可能媒体保管デバイス114で一度
挿入された取外し可能媒体保管デバイス114からコントロール論理学及び/又は
データを読み出すのに適するソフトウエアを含んでいる。
本発明のヌクレオチド配列は、主メモリー108、任意の二次的保存デバイス110
及び/又は取外し可能保存媒体116に周知の方法で保存することができる。ゲノ
ム配列にアクセスしそしてこれを処理するソフトウエア(例えば、検索ツール、
比較ツール等)は実行中の主メモリーに存在している。
生化学的実施態様
本発明のもう1つの実施態様はインフルエンザ菌Rdゲノムの単離フラグメン
トに向けられている。本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントには
、ペプチドをコードしているフラグメント(以下、読み取り枠(ORF))、操作
可能的に結合されたORFの発現を調節するフラグメント(以下、発現調節フラ
グメント(EMF))、結合DNAフラグメントの細胞内取込みに介在するフラ
グメント(以下、取込み調節フラグメント(UMF))、及び試料中のインフルエ
ンザ菌Rdの存在を診断するために使用できるフラグメント(以下、診断フラグ
メント(DF))が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「単離核酸分子」又は「インフルエンザ菌Rdゲノ
ムの単離フラグメント」とは.精製手段に付されて、通常組成物に関連する化合
物の数が組成物から減少している特異的なヌクレオチド配列を有する核酸分子を
言う。多様な精製手段を使用して本発明の単離フラグメントを生成させることが
できる。これらには電荷、溶解度又は大きさに基づいて溶液の構成成分を分雛す
る方法が含まれるが、これらに限定されない。
1つの実施態様では、インフルエンザ菌Rd DNAを機械的に剪断して15〜20
kbの長さのフラグメントを作ることができる。次に、これらのフラグメントを使
用して、以下の実施例で記載したようにしてラムダクローン中に上記フラグメン
トを挿入することによってインフルエンザ菌Rdライブラリーを生じさせること
ができる。次いで、配列識別番号;1で提供されるヌクレオチド配列情報を使用
して、例えば、標1(a)で提供されるORFを側部に付けたプライマーを生成さ
せることができる。次いで、PCRクローニング法を使用してラムダDNAライ
プラリーからORFを単離することができる。PCRクローニング法は当該技術
分野で周知である。かくして、配列識別番号:1、表1(a)及び表2の利用可能
性が与えられると、本発明の任意のORF又は他の核酸フラグメントを単離する
ことは定型的となろう。
本発明の単離核酸分子には一本鎖及び二本鎖DNA並びに一本鎖RNAが含ま
れるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「読み取り枠」、ORFは終結コドンを有していな
いアミノ酸をコードする一連の3塩基連鎖を意味し、そしてタンパク質に翻訳可
能な配列である。表1a、1b及び2はインフルエンザ菌Rdゲノム中のORF
を識別している。特に、表1aは、括弧内の生物(表1(a)の第4欄参照)から
得られるタンパク質配列に適合する相同性に基づいて記載されたタンパク質をコ
ードしているインフルエンザ菌ゲノム内のORFの位置を示している。
表1(a)の第1欄は特定のORFの「遺伝子識別」を提供している。この情
報は2つの理由により有用である。第1に、図6(A)〜6(D)で提供されるイン
フルエンザ菌Rdゲノムの完全なマップはこれらの遺伝子識別番号
に従ってORFに普及している。第2に、表1(b)は遺伝子識別番号を使用して
、どのORFが公のデータベースでこれまでに提供されたかを示している。
表1(a)の第2及び第3欄は配列識別番号:1で提供されたヌクレオチド配列
中のORFの位置を示している。通常の技倆を有する者は、ORFがインフルエ
ンザ菌ゲノム内で反対方向を向いていることがあることを認識するであろう。こ
れは2及び3欄に示されている。
表1(a)の第5欄は、ORFによってコードされているタンパク質と第4欄の
括弧内の生物から得られる対応するタンパク質との同一性パーセントを示してい
る。
表1(a)の第6欄は、ORFによってコードされているタンパク質と第4欄の
括弧内の生物から得られる対応するタンパク質との類似性パーセントを示してい
る。2つのポリペプチド配列の同一性パーセント及び類似性パーセントの概念は
当該技術分野で良く理解されている。例えば、3個のアミノ酸の位置(例えば、
1、3及び5位)が異なっている10個のアミノ酸の長さの2つのポリペプチドは
70%の同一性パーセントを有すると言われる。しかし乍ら、この同じ2つのポリ
ペプチドは、例えば、5位のアミノ酸部分が、同一ではないが、「類似」してい
る(即ち、同様な生化学的特徴を有している)場合、80%の類似性パーセントを
有すると考えられるであろう。
表1(a)の第7欄はアミノ酸相同性適合の長さを示している。
表2は、別の生物から得られる既知のタンパク質配列との「相同性適合」をも
たらさなかったポリペプチド配列をコードしているインフルエンザ菌Rdゲノム
のORFを提供している。相同性検索に使用したアルゴリズムと規準に関する詳
細は以下の実施例で更に提供されている。
熟練技術者は、表1(a)、1(b)及び2に示された以外のインフルエンザ菌R
dゲノム内のORF、例えば、本発明のコンピューターに基づくシステムを使用
して確認可能なものに加えて、同定されたORFと重複しているか又はこれと反
対側の鎖によってコードされているORFを容易に同定することができる。
本明細書で使用するとき、「発現調節フラグメント」、EMFは、操作可能的
に結合したORF又はEMFの発現を調節する一連のヌクレオチド分子を意味す
る。
本明細書で使用するように、配列の発現がEMFの存在によって変更するとき
、配列は「操作可能的に結合した配列の発現を調節する」と言う。EMFにはプ
ロモーター及びプロモーター調節配列(誘導要素)が含まれるが、これらに限定
されない。EMFの1つのクラスは、特異的な調節因子又は生理学的事象に応答
して操作可能的に結合したORFの発現を誘導するフラグメントである。ヘモフ
ィルス属から得られる既知のEMFの総説はトム(Tomb)等(Gene 104:1〜1
0(1991年))及びチャンドラー エム.エス.(Chandler,M.S.)(Proc.
Natl.Aoad.Sci.USA 89:1826〜1830(1992年))によって記載されてい
る。
EMF前列は、表1(a)、1(b)及び2に提供されたORFへの近接性によっ
てインフルエンザ菌Rdゲノム内で同定することができる。表1(a)、1(b)又
は2のORFの任意の1つの5'で取った約10から200個までのヌクレオチドの長
さの遺伝子間断片又は遺伝子間断片のフラグメントは、天然に結合したORF配
列で見られるものと類似した態様で、操作可能的に結合した3'ORFの発現を
調節するであろう。本明細書で使用するとき、「遺伝子間断片」とは、本明細書
で記載した2つのORF間のヘモフィルス属ゲノムのフラグメントを言う。或い
は、EMFは本発明のコンピューターに基づくシステムで標的配列又は標的モチ
ーフとして既知のEMFを使用して同定することができる。
EMFの存在及び活性はEMFトラップベクターを使用して確認することがで
きる。EMFトラップベクターはマーカー配列に対するクローニング部位5'を
有している。マーカー配列は同定可能な表現型、例えば、抗生物質耐性又は補充
栄養要求性因子をコードしており、そしてEMFアトラップベクターを適当な条
件下で適当な宿主内に入れたとき上記表現型を同定又はアッセイすることができ
る。上記したように、EMFは操作可能的に結合したマーカー配列の発現を調節
するであろう。種々のマーカー配列の更に詳細な考察
は以下で提供する。
EMFであると考えられる配列を、EMFトラップベクター内のマーカー配列
から上流の1つ又はそれより多い制限部位の3つの読取り枠の全てでクローン化
する。次いで、既知の方法を使用してこのベクターを適当な宿主内に形質転換し
、そして形質転換した宿主の表現型を適当な条件下で試験する。上記したように
、EMFは操作可能的に結合したマーカー配列の発現を調節する。
本明細書で使用するとき、「取込み調節フラグメント」、UMFは、結合DN
Aフラグメントの細胞内への取込みに介在する一連のヌクレオチド分子を意味す
る。UMFは上記したコンピューターに基づくシステムを用いて標的配列又は標
的モチーフとして既知のUMFを使用して容易に同定することができる。
UMFの存在及び活性は、UMFと考えられるものをマーカー配列に結合させ
て確認することができる。次に、得られた核酸分子を適当な条件下で適当な宿主
とともにインキュベートし、そしてマーカー配列の取込みを測定する。上記した
ように、UMFは結合したマーカー配列の取込み頻度を高める。ヘモフィルス属
におけるDNA取込みの総説はグッドガル エス.エイチ.(Goodgall,S.H.)
等、J.Bact.172:5924〜5928(1990年)によって提供されている。
本明細書で使用するとき、「診断フラグメント」、DFはインフルエンザ菌配
列と選択的にハイブリッドを形成する一連のヌクレオチド配列を意味する。DF
は、インフルエンザ菌Rdゲノム内の特有の配列を同定することによってか又は
、増幅若しくはハイブリッド形成選択性を測定する適当な診断フォーマットでD
F配列からなるプローブ若しくは増幅プライマーを発生させそして試験すること
によって容易に同定することができる。
本発明の範囲内に入る配列は本明細書に記載された特定の配列に限定されない
で、それらの対立遺伝子や種異体も含んでいる。対立遺伝子及び種異体は配列識
別番号:1で提供される配列、その代表的なフラグメント又は配列識別番号:1と
少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列を同じ種の別の単離物
から得られる配列と比較することによって定型的に測定することができる。更に
、コドン変動性を受け入れるために、本発明には本明細書で開示された特定のO
RFがコードするものと同一のアミノ酸配列をコードする核酸分子が含まれる。
換言すれば、ORFのコード化領域において、1つのコドンを、同じアミノ酸を
コードしているもう1つのコドンで置き換えることが明白に意図されている。
本明細書で開示された任意の特定の配列は、ORFのような特別のフラグメン
トを両方向(即ち、両鎖の前列)で配列を再度決定することによって誤謬を容易
にスクリーニングすることができる。或いは、誤謬のスクリーニングは、プロー
ブ又はプライマーとして問題のフラグメントの1部又は全てを使用して単離した
インフルエンザ菌起源の対応するポリヌクレオチドの配列を決定することによっ
て実施することができる。
表1(a)、1(b)及び2に開示されたインフルエンザ菌Rdゲノムの各ORF
並びにORFの6'に見られるEMFはポリヌクレオチド試薬として多数の方法
で使用することができる。これらの配列は、試料中のインフルエンザ菌RDのよ
うな特定の微生物の存在を検出する診断プローブ又は診断増幅プライマーとして
使用することができる。これは、インフルエンザ菌に対して非常に選択的な表2
のフラグメント又はORFの場合に特に当てはまる。
加えて、広範囲に記載した本発明のフラグメントを使用して、三重らせん形成
又はアンチセンスDNA若しくはRNAによって遺伝子発現を制御することがで
き、そしてこれら方法は共にポリヌクレオチド配列とDNA又はRNAの結合に
基づいている。これらの方法で使用するのに適するポリヌクレオチドは通常、20
から40塩基の長さでありそして転写に係わる遺伝子領域(三重らせん − Lee等
、Nucl.Acids Res.6:3073(1979年); Cooney等、Science 241:456(1988年
); 及びDervan等、Science 251:1360(1991年)参照)又はmRNA自体(ア
ンチセンス − Okano、J.Neurochem.56:560(1991年); Oligodeoxynucleot
ides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、フロ
リダ州ボカレートン(1988年))に相補的であるように設計される。三重らせん
形成はDNAからRNAの転写を最
適に停止させ、一方アンチセンスRNAハイブリッド形成はmRNA分子のポリ
ペプチドへの翻訳を遮断する。両技術共モデルシスチムで有効であることが証明
されている。本発明の配列に含まれている情報はアンチセンス又は三重らせんオ
リゴヌクレオチドを設計するために必要である。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムの1つ又はそれより多い
フラグメントを含む組換え構築物を提供する。本発明の組換え構築物はベクター
、例えば、プラスミド又はウイルスベクターを含んでおり、そしてこの中にイン
フルエンザ菌Rdが、前方向又は逆方向に挿入されている。本発明のORFの1
つを含んでいるベクターの場合には、ベクターは更に、例えば、ORFに操作可
能的に結合したプロモーターを含めて、調節配列を含んでいることができる。本
発明のEMF及びUMFを含むベクターでは、ベクターは更にEMF又はUMF
と操作可能的に結合したマーカー配列又は異種ORFを含んでいることができる
。多数の適当なベクター及びプロモーターが当該技術分野の熟練者に知られてお
り、そして本発明の組換え構築物を生成させるために商業的に入手することがで
きる。次のベクターは例として提供する。細菌性: pBs、ファージスクリプト、
PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、p
NH46a(Stratagene); pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRI
T6(Pharmacia)。真核生物性: pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTI、pS
G(Stratagene); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。
プロモーター領域は、OAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベ
クター又は選択性マーカーを有する他のベクターを使用して所望の遺伝子から選
択することができる。2つの適当なベクターはpKK232-8及びpCM7である。特
別に名前を挙げられる細菌性プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、
ラムダPE及びtrcが含まれる。真核生物性プロモーターにはCMV最初斯、HS
Vチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスから得られるLTR
並びにマウスメタロチオナイン-Iが含まれる。適当なベクターやプロモーター
の選択は正に当該技術分野の通常の技倆レベルの範囲内である。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムの単離フラグメントのい
ずれか1つを含有する宿主細胞を提供し、その際フラグメントは既知の形質転換
方法を使用して宿主細胞中に導入されている。宿主細胞は、哺乳動物細胞のよう
な高等真核生物宿主細胞、酵母細胞のような下等真核生物宿主細胞であることが
できるか、又は宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞であることができる。宿主
細胞中への組換え構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DE
AE、デキストラン介在トランスフェクション又はトランスポーレーションによ
って実施することができる(Davis,L.等、Basic Methods in Molecular
Biology(1986年))。
本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントの1つを含有する宿主細
胞を慣用の態様で使用して、単離フラグメントでコードされている遺伝子産生物
を生じさせることができ(ORFの場合)るか又はEMFの制御下で異種タンパ
ク質を産生させるために使用することができる。
本発明は更に、本発明の核酸フラグメントによって又は本発明の核酸フラグメ
ントの縮重改変体によってコードされている単離ポリペプチドを提供する。「縮
重改変体」によって、本発明の核酸フラグメント(例えば、ORF)とヌクレオ
チド配列が異なっているが、遺伝暗号の縮重により同一のポリペプチド配列をコ
ードしているヌクレオチドフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フ
ラグメントはタンパク質をコードしている表1(a)に示されたORFである。
当該技術分野で知られている多様な方法論を使用して本発明の単離ポリペプチ
ド又はタンパク質のいずれか1つを取得することができる。最も簡単なレベルで
は、市販で入手可能なペチド合成器を使用してアミノ酸配列を合成することがで
きる。これは、より大きいポリペプチドの小さいペプチドやフラグメントの製造
で特に有用である。フラグメントは、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体
の産生で有用である。代替的方法では、ポリペプチド又はタンパク質はポリペプ
チド又はタンパク質を天然に産生する細菌細胞から精製される。当該技術分野の
熟練者はポリペプチドやタンパク質を単離する既知の方法に容易に従って本発明
の単離ポリペプチド又はタンパク質の
1つを取得することができる。これらにはイムノクロマトグラフィー、HPLC
、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びイムノア
フィニティクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のポリペプチドやタンパク質は代替的に、所望のポリペプチド又はタン
パク質を発環するように改変されている細胞から精製することができる。本明細
書で使用するとき、細胞が通常は産生しないか又は細胞が通常はより低いレベル
で産生するポリペプチド又はタンパク質を細胞が産生するように遺伝子操作でな
されているとき、この細胞は所望のポリペプチド又はタンパクを発現するように
改変されていると言う。当該技術分野の熟練者は、本発明のポリペプチド又はタ
ンパク質の1つを産生する細胞を作るために、真核又は原核細胞中に組換え配列
か又は合成配列のどちらかを導入しそして発現させる方法を容易に適合させるこ
とができる。
任意の宿主/ベクター系を使用して、本発明の1つ又はそれより多いORFを
発現させることができる。これらには真核生物宿主、例えば、HeLa細胞、Cv-
1細胞、COS細胞及びSfs細胞、並びに原核生物宿主、例えば大腸菌及び枯草
菌が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、通常は特定のポ
リペプチド若しくはタンパク質を発現しないか若しくはポリペプチド又はタンパ
ク質を低い天然レベルで発現する細胞である。
本明細書で使用するとき、「組換え体」は、ポリペプチド又はタンパク質が組
換え体(例えば、微生物又は哺乳動物)の発現系から誘導されることを意味する
。「微生物」とは、細菌又は真菌(例えば、酵母)発現系で製造される組換えポ
リペフチド又はタンパク質を言う。生成物として、「組換え微生物」は、天然の
内在性物質を本質的に含有せずそして関連する天然のグリコシル化を伴わないポ
リペプチド又はタンパク質を明示する。大部分の細菌培養物、例えば大腸菌内で
発現されるポリペプチド又はタンパク質はグリコシル化修飾を有していない; 酵
母内で発現されるポリペプチド又はタンパク質は哺乳動物細胞で発現されるもの
と異なるグリコシル化パターンを有している。
「ヌクレオチド配列」とはデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを言う
。一般的に、本発明で提供されるポリペプチド及びタンパク質をコードするDN
A断片は、微生物又はウイルスオペロンから誘導される調節要素を含んでいる組
換え体転写ユニット中で発現され得る合成遺伝子を堤供するために、インフルエ
ンザ菌Rdゲノムのフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから、又は
一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられている。
「組換え発現媒体又はベクター」とは、DNA(RNA)配列からポリペプチ
ドを発現させるためのプラスミド又はファージ又はウイルス又はベクターを言う
。発現媒体は、(1)遺伝子発現で調節の役割を有している1つ又は複数の遺伝
子要素、例えば、プロモーター又はエンハンサー、(2)mRNAに転写されそ
してタンパク質に翻訳される構造又はコード化配列、及び(3)適当な転写開始
及び終止配列のアッセンブリーを含む転写ユニットを含んでいることができる。
酵母又は真核生物発現系で使用するように意図された構造ユニットは好ましくは
、宿主細胞で翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含
有している。或いは、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現され
る場合、これはN末端メチオニン残基を含有することができる。この残基は最終
生成物を提供するために発現された組換えタンパク質からその後開裂することが
できるか又はできない。
「組換え発現系」は、染色体DNA内に安定的に組換え転写ユニットを組み込
んでいるか又は組換え転写ユニットを染色体外に有している宿主細胞を意味する
。細胞は原核又は真核細胞であることができる。本明細書で特定した組換え発現
系は、発現されるDNA断片又は合成遺伝子に結合した調節要素の誘導に基づい
て異種ポリペプチド又はタンパク質を発現する。
成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌
又は他の細胞内で発現することができる。細胞不含翻訳系を使用し、本発明のD
NA構築物から誘導されるRNAを使用してこのようなタンパク質を製造するこ
ともできる。原核生物及び真核生物宿主で使用するのに適するクローニング及び
発現ベクターは、サムブルック(Sambrook)等、モレキュラークローニング:
実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual)、第2版、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)、
ニューヨーク(198年)(この開示は参照として本明細書に組み入れる)によっ
て記載されている。
一般的に、組換え発現ベクターは宿主細胞の形質転換を可能にする複製起源及
び選択マーカー、例えば大腸菌のアンビシリン耐性遺伝子及びS-セレビシエT
RP1遺伝子並びに高度発現遺伝子から誘導され下流の構造配列の転写を指令す
るプロモーターを含有している。このようなプロモーターは、なかんずく、3-ホ
スホグリセレートキナーゼ(PGK)、a因子、酸ホスファターゼ又は熱ショッ
クタンパク質のような解糖酵素をコードしているオペロンから誘導することがで
きる。異種構造配列は翻訳開始及び終止配列、(そして好ましくは、細胞周辺腔
又は細胞外媒体中へ翻訳タンパク質の分泌を指令し得るリーダー配列と共に適当
な相で組み立てられる。任意に、異種配列は、所望の特徴、例えば発現された組
換え産生物を安定化し又は精製を単純化するN末端同定ペプチドを含有する融合
タンパク質をコードすることができる。
細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、機能プロモーターを有する操作可
能な読み取り相内で、適当な翻訳開始及び終止シグナルと一緒に所望のタンパク
質をコードする構造DNA配列を挿入することによって構築される。ベクターは
、ベクターの維持を確保するために、そして所望の場合、宿主内での増幅を堤供
するために、1つ又はそれより多い表現型の選択マーカー及び複製起源を含んで
いる。形質転換用の適当な原核生物宿主には大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌並
びにシュードモナス、ストレプトミセス及びスタフィロコッカス属内の種々の種
が含まれるが、他のものを選択対象として使用することもできる。
代表的な実施例として、細菌で使用するのに有用な発現ベクターは選択マーカ
ー及び周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子要素
を含んでいる市販で入手可能なプラスミドから誘導される細菌性複製起源を含む
ことができるが、こ例に限定されない。このような市販のベクターには、例えば
、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals、スウェーデン国ウフサラ)及び
GEM1(Promega Biotec、米国ウィスコンシン州マ
ディソン)が含まれる。これらのpBR322「バックボーン」切片は適当なプロ
モーター及び発現すべき構造配列と共に組合せられる。
適当な宿主株を形質転換しそして適当な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な手段(例えば、温度シフト又は化学的誘導)に
よって活性化し、そして細胞を更なる期間培養する。細胞は典型的には遠心によ
って採集し、物理的又は化学的手段によって破壊し、そして得られた粗製抽出物
は更に精製するために維持する。
種々の哺乳動物細胞培養系を使用して組換えタンパク質を発現することもでき
る。哺乳動物発現系の例には、グルズマン(Gluzman)、セル(Cell)23:175(1
981年)によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOA-7株並びに適合可能な
ベクターを発現し得る他の細胞株、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa及び
BHK細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは複製起源、適当なプロモータ
ー及びエンハンサー、そして更には必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化
部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終止配列、並びに5'側部非
転写配列を含んでいよう。SV40ウイルスゲノムから誘導されるDNA配列、例
えばSV40起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニ
ル化部位を使用して必要な非転写遺伝子要素を堤供することができる。
細菌培養物内で産生される組換えポリペプチド及びタンパク質は通常、1回又
はそれより多い塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー段階の
前に細胞ペレットから初期抽出して単離される。成熟タンパク質の配置を完了さ
せる際には、必要な場合、タンパク質の再生段階を使用することができる。最後
に、最終精製段階用に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用するこ
とができる。タンパク質の発現で使用された微生物細胞は、凍結−解凍サイクル
、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解の使用を含む任意の好都合な方法によっ
破壊することができる。
本発明は更に、本明細書に記載したものと実質的に同等な単離ポリペプチド、
タンパク質及び核酸分子を含む。本明細書で使用するとき、実質的に同等とは、
1つ又はそれより多い置換、欠失又は付加によって参照配列と異な
っておりそしてその最終的な効果が参照配列と対象配列間で不利な機能的相違を
もたらしていない核酸及びアミノ酸配列の両方、例えば、突然変異配列を言うこ
とができる。本発明の目的では、同等な生物学的活性及び同等な発現特徴を有す
る配列は実質的に同等と考えられる。同等性決定の目的では、成熟配列の一部切
断は無視すべきである。
本発明は更に、本発明のインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントの、イン
フルエンザ菌の他の株から得られる相同体及び本発明のORFによってコードさ
れているタンパク質の相同体を取得する方法を提供する。本明細書で使用すると
き、インフルエンザ菌の配列又はタンパク質が本発明のインフルエンザ菌Rdゲ
ノムのフラグメントの1つ又は本発明のORFの1つによってコードされている
タンパク賀と顕著な相同性を共有している場合、これは本発明のインフルエンザ
菌Rdゲノムのフラグメント又はORFの1つによってコードされているタンパ
ク質の相同体として特定される。詳細には、本明細書で開示した配列をプローブ
又はプライマーとして使用し、そしてPCRクローニング法及びコロニー/プラ
ークハイブリッド形成法のような技術を使用して、当該技術分野の熟練者は相同
体を取得することができる。
本明細書で使用するとき、2つの核酸分子又はタンパク質は、これら2つが85
%を超える配列(アミノ酸又は核酸)相同性を有する領域を含有している場合、
「顕著な相同性を共有する」と言う。
配列識別番号:1で堤供されたヌクレオチド配列又は配列識別番号:1と少なく
とも99.9%同一のヌクレオチド配列から誘導される領域特異的プライマー又はプ
ローブを使用して、DNA合成及びRNA増幅をプライムし、そして既知の方怯
(Innis等、PCR Protocols、Academic Press、カリフォルニア州サンデ
ィエゴ(1990年))を使用して相同体をコードするクローン化したDNAを含有
するコロニーを同定することができる。
配列識別番号:1又は配列識別番号:1と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド
配列から誘導されるプライマーを使用するとき、当該技術分野の熟練者は、高い
緊縮条件(例えば、50〜60℃でのアニーリング)を用いることによって、このプ
ライマーと75%以上相同な配列しか増幅されないことを認識し
ているであろう。より低い緊縮条件(例えば、35〜37℃でのアニーリング)を使
用することによって、このプライマーと40〜50%以上相同な配列も増幅されるで
あろう。
コロニー/プラークのハイブリッド形成用に、配列識別番号:1又は配列識別
番号:1と少なくとも99.9%同一のヌクレオチド配列から誘導されるDNAプロ
ーブを使用するとき、当該技術分野の熟練者は高い緊縮条件(例えば、5X S
SPC及び50%ホルムアミド中50〜65℃でのハイブリッド形成並びに0.5X SS
PC中50〜65℃での洗浄)を使用することによって、このプローブと90%以上相
同な領域を有する配列を取得することができ、そしてより低い緊縮条件(例えば
、5X SSPC及び40〜45%ホルムアミドでのハイブリッド形成並びにSSP
C中42℃での洗浄)を使用することによって、このプローブと35〜45%以上相同
な領域を有する配列が取得されることを認識しているであろう。
生物がこのようなタンパク質を天然に発現するか又はこのようなタンパク質を
コードしている遺伝子を含有している限り、本発明の相同体の供給源として任意
の生物を使用することができる。相同体を単離するための最も好ましい生物は,
インフルエンザ菌Rdと密接に関係のある細菌である。
本発明の組成物の使用
表1(a)で提供された各ORFはリレイ エム.(Riley,M.)(Microbiol
ogy Reviews 57(4):862(1993年))から書きかえた102の生物学的役割カテゴリ
ーの1つに割り当てた。これによって熟練技術者は同定された各コード化配列の
用途を決定することができる。表1(a)は更に、各ORFによってコードされる
ペプチドのタイプの確認を提供している。その結果、当該技術分野の熟練者は本
発明のポリペプチドを、推定上のポリペフチド同定のタイプと一致した商業的、
治療的及び産業的目的に使用することができる。
このような同定によって、当該技術分野の熟練者はインフルエンザ菌ORFを
、同定されている配列の既知のタイプと類似した態様で; 例えば、特定の蔗糖供
給源を発酵させるために又は特定の代謝物を産生させるために使用
することができる。(営利産業内で使用される酵素の総説については、Bioohem
ical Engineering and Biotechnology Handbook 第2版、Macmillan Publ
.Ltd.、ニューヨーク(1991年)及びBiocatalysts in Organic Syntheses
、編集J.Tramper等、Elsevier Science Publishers、オランダ国アムステ
ルダム(1985年)参照)。
1.生合成酵素
代謝の中間産生物の分解に関与する酵素、中心的な中間代謝に関与する酵素、
呼吸に関与する酵素、発酵に関与する好気性及び嫌気性の両酵素、ATPプロト
ン駆動力変換に関与する酵素、広範囲の調節機能に関与する酵素、アミノ酸合成
に関与する酵素、ヌクレオチド合成に関与する酵素、補因子及びビタミン合成に
関与する酵素を含めて、中間的及び巨大分子代謝に係わる触媒反応、小分子の生
合成、細胞過程及び他の機能の介在に関与するタンパク質をコードしている読み
取り枠を産業的な生合成用に使用することができる。ヘモフィルス属に存在する
種々の代謝経路は、絶対栄養要件に基づいて、並びに表1(a)で確認される種々
の酵素の試験によって同定することができる。
中間代謝のカテゴリー内で同定され、表1(a)で確認されるORFによってコ
ードされている多数のタンパク質は中間代謝物の分解並びに非巨大分子代謝に特
に関与している。同定された酵素の幾つかにはアミラーゼ、グルコース、オキシ
ダーゼ及びカタラーゼが含まれる。
タンパク質分解酵素は商業的に重要なもう1つのクラスの酵素である。タンパ
ク質分解酵素は、亜麻及び他の植物繊維の加工を含む多数の産業的処理、果汁の
抽出、清澄化及びペクチン除去、植物油の抽出並びに単細胞果実を得るために果
実及び植物の柔軟化での用途が見い出されている。食品産業で使用されるタンパ
ク質分解酵素の詳細な総説はロムボウツ(Rombouts)等(Symbiosis 21:79(1
986))及びボラーゲン(Voragen)等(Biocatalyst in Agricultural Biot
echnology、編集 J.R.Whitater等、American Chemical Society Sympos
ium Series 389:93(1989年))によって提供
されている。
グルコース、ガラクトース、フルトース及びキシロースの代謝はヘモフィルス属
の初期代謝の重要な部分である。これらの糖類の分解に関与する酵素は産業的な
発酵で使用することができる。商業的な観点から重要な糖変換酵素の幾つかには
グルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼが含まれる。ケトグロン酸(K
GA)を産生するグルコースオキシダーゼのような他の代謝酵素に商業的な用途
が見い出されている。KGAは、ライヒシュタイン(Reichstein)の方法(Kr
ueger等、Biotechnology 6(A)、Rhine,H.J.編集、Verlag Press、ド
イツ国バインハイム(1984年)参照)を使用するアスコルビン酸の商業的製造に
おける中間体である。
グルコースオキシダーゼ(GOD)は市販で入手可能であり、そしてビールの
酸素除去用に精製形態並びに固定形態で使用されている。ハルトマイヤー(Har
tmeir)等、(Biotechnology Letters 1: 21(1979年)参照。最も重要なGO
Dの適用はグルコン酸の産業的規模の発酵である。グルコン酸を使用する市場は
洗剤、織物、成革、写真、医薬品、食品、飼料及びコンクリート産業である(B
igelis、Gene Manipulations and Fungi、Benett J.W.等編集、Academic
Press、ニューヨーク(1985年)、357頁参照)。産業的な適用に加えて、GOD
は体液中のグルコースの定量測定用の医薬品、最近は澱粉及びセルロース加水分
解物から得られるシロップを分析するバイオテクノロジーにおいて適用が見い出
されている。オウス(Owusu)等(Biochem.at Biophysics.Acta.872:83
(1986年))参照。
世界で今日使用されている主要な甘味料はテンサイやサトウキビから得られる
蔗糖である。産業的酵素の分野では、グルコースイソメラーゼ方法が今日の市場
で最も大きい広がりを示している。最初、可溶性酵素が使用され、そしてその後
固定酵素が開発された(Krueger等、Biotechnology、The Textbook of Ind
ustrial Microbiology、Sinauer Associated Incorporated、マサチューセ
ッツ州サンダーランド(1890年))。今日、固定酵素を使用してグルコースから
製造される高フルクトースシロップの使用は断然大きい産業的事業である。これ
ら酵素の産業的使用の総説はジョルゲンセン(Jorg
ensen)(Starch 40:307(1988年))によって堤供されている。
プロテイナーゼ、例えばアルカリ性セリンプロテイナーゼは洗剤添加物として
使用されるので、産業的分野で使用される最も大きい微生物酵素量の1つを表わ
している。それらが産業的に重要であるため、産業的方法でのこれら酵素の使用
に関する発表及び未発表情報が多数存在している。(Faultman等、Acid Prot
eassa Structure Function and Biology、Tang,J.編集、Plenum Press
、ニューヨーク(1977年)及びGodfrey等、Industrial Enzymes、MacMilla
n Publishers、英国サリー(1983年)及びHepner等、Report Industrial E
nzymes by 1990、Hel Hepner & Associates、ロンドン(1986年)参照)。
本発明のもう1つのクラスの商業的に使用可能なタンパク質は表1で確認され
る微生物リパーゼである(Macrae等、Philosophical Transactions of the C
hirai Society of London 310:227(1985年)及びPoserke、Journal of the
American Oil Chemist Society 61:1758(1984年)参照)。リパーゼは、容
易に入手できるトリグリセリドのリパーゼ触媒相互エステル化を使用して中性グ
リセリドを製造する油脂産業で主として使用されている。リパーゼの適用には、
洗浄方法中に織物から脂肪の除去を容易にする洗剤添加物としての使用が含まれ
る。
複雑な有機分子の合成で主要段階の触媒として酵素、そして特に微生物酵素を
使用することは非常な速度で人気を得てきている。非常に重要な1つの分野はキ
ラル中間体の製造である。キラル中間体の製造は広範囲の合成化学者、特に新薬
、農薬、芳香剤及び風味剤の製造に関与している科学者にとって重要である。(
Davies 等、Recent Advances in the Generation of Chiral Intermediat
es Using Enzymes、CRC Press、フロリダ州ポカレートン(1990年)参照)
。酵素によって触媒される以下の反応は有機化学者にとって重要である: カルボ
ン酸エステル、リン酸エステル、アミド及びニトリルの加水分解、エステル化反
応、トランス-エステル化反応、アミドの合成、アルカノン及びオキソアルカネ
ートの還元、アルコールからカルボニル化合物への酸化、スルフィドからスルホ
キシドへの酸化、並びにアルドール
反応のような炭素結合形成反応。バイオトランスフォーメーションや有機合成に
対して本発明のORFの1つによってコードされている酵素の使用を考えるとき
、単離酵素とは全く異なって、微生物使用の利点及び不利益をそれぞれ考慮する
ことが時には必要となる。一方では全細胞系、又は他方では部分的に精製して単
離された酵素を使用することの賛否両論がブッド(Bud)等(Chemistry in B
ritain(1987年)、127頁)によって詳細に記載されている。
アミノ酸の生合成及び代謝に関与する酵素、アミノトランスフェラーゼはアミ
ノ酸の触媒的製造で有用である。微生物に基づく酵素系を使用する利点はアミノ
トランスフェラーゼ酵素がl-アミノ酸だけの立体選択的合成を触媒しそして一般
的に一様に高い触媒速度を有していることである。アミノ酸製造に対してアミノ
トランスフェラーゼを使用する説明はロゼル・デービッド(Roselle-David)
(Methods of Enzymology 136:479(1987年))によって提供されている。
本発明のORFによってコードされている有用なタンパク質のもう1つの有用
なカテゴリーには核酸合成、修復及び組換えに関与する酵素が含まれる。商業的
に重要な多様な酵素がこれまでにヘモフィルス種のメンバーから単離されている
。これらには、Hinc II、Hind III及びHinf I制限エンドヌクレアーゼが含ま
れる。表1(a)で、バイオテクノロジー産業で直接的な用途を有している制限酵
素、リガーゼ、ギラーゼ及びメチラーゼのような広範な酵素列が確認される。
2.抗体の産生
本明細書に記載したように、本発明のタンパク質、並びにそれらの相同体は、
現在他のタンパク質に対して適用されており当該技術分野で知られている多様な
手順や方法で使用することができる。本発明のタンパク質は更に、タンパク質に
選択的に結合する抗体を生成させるために使用することができる。このような抗
体はモノクローナル抗体か又はポリクローナル抗体のいずれか、並びにこれら抗
体のアラグメント及びヒト型化形態であることができ
る。
本発明は更に、本発明のタンパク質の1つに選択的に結合する抗体及びこれら
抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは、特異的なモノク
ローナル抗体を分泌し得る不死化細胞株である。
一般的に、ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びに所望の抗体を産生し
得るハイブリドーマを作成する技術は当該技術分野で周知である(Campbell,A
.M.、Monoolonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Bio
chemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers、オラ
ンダ国アムステルダム(1984年); St.Groth等、J.Immunol.Methods 35:
1〜21(1980年); Kohler及びMilstein、Nature 256:495〜497(1975年))、ト
リオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等、Immunology Toda
y 4:72(1983年); Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、
Alan R.Liss,Inc.(1985年)、77〜96頁)。
抗体を産生することが知られている動物(マウス、ウサギ等)を偽遺伝子ポリ
ペプチドで免疫化することができる。免疫法は当該技術分野で周知である。この
ような方法には、ポリペプチドの皮下又は腹腔内注射が含まれる。当該技術分野
の熟練者は、免疫法で使用される本発明のORFによってコードされているタン
パク質の量は免疫化される動物、ペプチドの抗原性及び注射部位に基づいて変動
することを認識しているであろう。
免疫原として使用されるタンパク質は、タンパク質の抗原性を高めるために修
正するか又はアジュバント中で投与することができる。タンパク質の抗原性を高
める方法は当該技術分野で周知であり、そしてこれらには抗原と異種タンパク質
(例えば、グロブリン又はβ-ガラクトシダーゼ)との結合又は免疫法中にアジ
ュバントを含めることが含まれるが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体に関しては、免疫化した動物から脾臓細胞を取り出し、ミ
エローマ細胞、例えばSP2/0-Ag14ミエローマ細胞と融合させ、そしてモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とすることができる。
当該技術分野で周知の多数の方法のうちの任意の1つを使用して、所望の特徴
を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。
これらにはエリザアッセイ、ウエスタンブロット分析又はラジオイムノアッセイ
によるハイブリドーマのスクリーニングが含まれる(Lutz等、Exp.Cell Re
s.175:109〜124(1988年)。
所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローン化しそして当該技術分野で知
られている方法を使用してクラス及びサブクラスを決定する(Campbell,A.M.
、Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochem
istry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers、オランダ
国アムステルダム(1984年))。
1本鎖抗体を製造するために記載された方法(米国特許 4,946,778)を、本発
明のタンパク質に対する1本鎖抗体を製造するように適合させることができる。
ポリクローナル抗体に関しては、抗体を含有する抗血清を免疫化した動物から
単離し、そして上記した方法の1つを使用して所望の特異性を有する抗体の存在
についてスクリーニングする。
本発明は更に、上記した抗体を検出できるように標識された形態で提供する。
抗体は放射性同位体、アフィニティ標識(例えば、ビオチン、アビジン等)、酵素
標識(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等)、蛍光標識(例えば、FITC又はローダミン等)、常磁性体原子等を使用し
て検出できるように標識することができる。このような標識化を達成する方法は
当該技術分野で周知であり、例えば(Sternberger,L.A.等、J.Histochem
.Cytochem.18:315(1970年); Bayer,E.A.等、Meth.Enzym.62:308(197
8年); Engval,E.等、Immunol.109:129(1972年); Goding,J.W.、J.I
mmunol.Meth.13:215(1976年))を参照されたい。
本発明の標識抗体は、インフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントが発現され
ている細胞又は組織を同定するためにインビトロ、インビボ及びインシトウアッ
セイで使用することができる。
本発明は更に、固形支持体に固定した上記抗体を提供する。このような固形支
持体の例にはポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースやセ
ファロースのような複雑な炭水化物、ポリアクリルアミドのようなアクリル樹脂
並びにラテックスビーズが含まれる。抗体をこのような固形支持体に結合する技
術は当該技術分野で周知である(Weir,D.M.等、「Handbook of Experiment
al Immunlogy」第4版、Blackwell Scientific Publications、英国オック
スフォード、10章(1986年); Jacoby,W.D.等、Meth.Enzym.34 Academic
Press、ニューヨーク(1974年))。本発明の固定抗体は、本発明のタンパク質
のインビトロ、インビボ及びインシトウアッセイ並びにイムノアフィニティ精製
法で使用することができる。
3.診断アッセイ及びキット
本発明は更に、本発明のDF又は抗体の1つを使用して、試験試料中における
本発明のORFの1つ又はその相同体の発現を同定する方法を提供する。
詳細には、このような方法は試験試料を1つ若しくはそれより多い抗体又は1
つ若しくはそれより多い本発明のDFと共にインキュベートし、そしてDF又は
抗体と試験試料内の成分との結合をアッセイすることを含んでいる。
DF又は抗体を試験試料と共にインキュベートする条件は変動する。インキュ
ベーション条件はアッセイで使用される様式、使用される検出方法及びアッセイ
で使用されるDF又は抗体のタイプや性質に依存する。当該技術分野の熟練者は
、通常利用可能なハイブリッド形成、増幅又は免疫学的アッセイ様式の任意のも
のを、本発明のDF又は抗体を使用するために容易に適合させ得ることを認識し
ているであろう。このようなアッセイの例はチャード ティ.(Chard,T.)(An
Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques、Elsevier
Science Publishers、オランダ国アムステルダム(1986年)); バロック ジー
.アール.(Bullock,G.R.)等(Techniques in Immunocytochemistry、Ac
ademic Press、フロリダ州オーランド、1巻(1982年)、2巻(1983年)、3巻(1
985年)); ティーセン ピー.(Tijssen,P.)(Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays: Laboratory Techiques in Biochemistry and Mole
cular Biology、Elsevier Science Publishers、オランダ国アムステルダム
(1985年))中に見ること
ができる。
本発明の試験試料には細胞、細胞のタンパク質若しくは膜抽出物、又は生物学
的液体、例えば痰、血液、血清、血漿若しくは尿が含まれる。上記した方油で使
用される試験試料はアッセイ様式、検出方法の性質、及びアッセイすべき試料と
して使用される組織、細胞又は抽出物に基づいて変動する。細胞のタンパク質抽
出物又は膜抽出物の調製方法は当該技術分野で周知であり、そして使用される系
と適合し得る試料を得るために容易に適合させることができる。
本発明のもう1つの実施態様では、本発明のアッセイを実施するのに必要な試
薬を含有するキットが提供される。
詳細には、本発明は(a)本発明のDF又は抗体の1つを含んでいる第1の容
器; 及び(b)1つ又はそれより多い次の試薬: 洗浄試薬、結合したDF又は抗
体の存在を検出し得る試薬を含んでいる1つ又はそれより多い他の容器、を含ん
でいる1つ又はそれより多い容器を、近接して閉じ込めて受け入れる隔室キット
を提供する。
詳細には、隔室キットには試薬が別々の容器に入れられている任意のキットが
含まれる。このような容器には小さいガラス容器、プラスチック容器又はプラス
チック片若しくは紙片が含まれる。このような容器によって、試料と試薬が互い
に夾雑しないように試楽を1つの隔室からもう1つの隔室に効率的に輸送するこ
とができ、そして各容器の試薬又は溶液を1つの隔室からもう1つの隔室に定量
的態様で添加することができる。このような容器には、試験試料を受け入れる容
器、アッセイで使用される抗体を含有する容器、洗浄試薬(例えば、リン酸緩衝
食塩液、トリス緩衝液等)を含有する容器及び結合した抗体又はDFを検出する
ために使用される試薬を含有する容器が含まれるであろう。
検出試薬のタイプには、標識核酸プローブ、標識した第2の抗体、若し〈は二
者択一的に、第1の抗体が標識されている場合、酵素、又は標識抗体と反応し得
る抗体結合試薬が含まれる。当該技術分野の熟練者は、本発明で開示されたDF
及び抗体が当該技術分野で周知の確立されたキット様式の1つ
に容易に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。
4.結合物質のスクリーニングアッセイ
本発明の単離タンパク質を使用して、本発明は更に、本発明のORFの1つに
よってコードされているタンパク質又は本明細書で記載したヘモフィルス属ゲノ
ムのフラグメントの1つと結合する物質を取得しそして同定する方法を提供する
。
詳細には、上記方法は次の段階を含んでいる:
(a)物質を、本発明のORFの1つによってコードされて
いる単離タンパク質又はヘモフィルス属ゲノムの単離フラグメ
ントと接触させ; そして
(b)上記物質が上記タンパク質又は上記フラグメントと結
合するかどうかを測定する。
上記アッセイでスクリーニングされる物質は、ペプチド、炭水化物、ビタミン
誘導体又は他の医薬品であることができるが、これらに限定されない。これらの
物質は無作為に選択しそしてスクリーニングすることができるか又はタンパク質
モデル化技術を使用して合理的に選択若しくは設計することができる。
無作為スクリーニングでは、ペプチド、炭水化物、医薬品等のような物質が無
作為に選択されそしてそれらが本発明のORFによってコードされているタンパ
ク質と結合する能力についてアッセイされる。
或いは、物質は合理的に選択又は設計することができる。本明細書で使用する
とき、物質が特別のタンパク質の配置に基づいて選択されるとき、この物質は「
合理的に選択又は設計する」と言う。例えば、当該技術分野の熟練者は現在利用
可能な方法を、特異的なペプチド配列と結合し得るペプチド、医薬品等を生成す
るように容易に適合させて、合理的に設計された抗ペプチドペプチド(例えば、
Hurby等、Application of Synthetio Peptides: Antisense Peptides,I
n Synthetic Peptides,A User's Guide、W.H.Freeman、ニューヨーク(
1992年)、288〜307頁、及びKaspczak等、Bio
chemistry 28:9230〜9238(1989年)参照)又は医薬品等を生成させることがで
きる。
上記に加えて、広範に記載した本発明の物質の1つのクラスを使用して、本発
明のORF又はEMFの1つと結合させて遺伝子発現を制御することができる。
上記したように、このような物質は無作為にスクリーニングするか又は合理的に
設計/選択することができる。ORF又はEMFを標的化することによって、熟
練技術者は、発現制御に関して同一のEMFに依存している単一のORFか又は
複数のORFのどちらかの発現を調節する配列特異的又は要素特異的物質を設計
することができる。
DNA結合物質の1つのクラスは、DNA又はRNAと結合することによって
ハイブリッドを形成するか又は三重らせん形態を形成する塩基残基を含有してい
る物質である。このような物質は古典的なホスホジエステル、リポ核酸パックボ
ーンに基づいていることができるか又は塩基結合能力を有する多様なスルフヒド
リル若しくはポリマー誘導体であることができる。
これらの方法で使用するのに適する物質は通常20から40塩基を有しており、そ
して転写に関する遺伝子領域(三重らせん − Lee等、Nucl.Acids Res.6:
3073(1979年); Cooney等、Science 241:456(1988年); 及びDervan等、Scien
ce 251:1360(1991年)参照)又はmRNA自体(アンチセンス − Okano、J
.Neurochem.56:560(1991年); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhi
bitors of Gene Expression、CRC Press、フロリダ州ボカレートン(1988
年))に相補的であるように設計される。三重らせん形成はDNAからRNAの
転写を停止させ、一方アンチセンスRNAハイブリッド形成はmRNA分子のポ
リペプチドへの翻訳を遮断する。両技術共モデルシステムで有効であることが証
明されている。本発明の配列に含まれている情報はアンチセンス又は三重らせん
オリゴヌクレオチド及び他のDNA結合物質を設計するために必要である。
本発明のORFの1つによってコードされているタンパク質と結合する物質は
、ORFによってコードされているタンパク質の活性を調節することによって細
菌感染を制御させる際に、診断薬として使用することができる。本
発明のORFの1つによってコードされているタンパク質と結合する物質を既知
の技術を使用して処方して、ヘモフィルス属の増殖及び感染の制御で使用する医
療品組成物を製造することができる。
5.ワクチン及び医薬品組成物
本発明は更に、インフルエンザ菌又は別の関連生物の増殖をインビボ又はイン
ビトロで調節するために使用できる医薬品を提供する。本明細書で使用するとき
、「医薬品」は、医薬品組成物を提供するために既知の技術を使用して処方でき
る組成物として定義される。本明細書で使用するとき、「本発明の医薬品」とは
、本発明のORYによってコードされているタンパク質から誘導されるか又は本
明細書で記載したアッセイを使用して同定される物質である医薬品を言う。
本明細書で使用するとき、医薬品が問題の生物の増殖速度、分裂速度又は生存
性を減少させるとき、その医薬品は「ヘモフィルス種又は関連生物の増殖をイン
ビボ又はインピトロで調節する」と言われる。本発明の医薬品の使用を実施する
には作用の基礎になっているメカニズムを理解する必要はないが、本発明の医薬
品は多数の態様で生物の増殖を調節することができる。医薬品のなかには重要な
タンパク質と結合し、その結果タンパク質の生物学的活性を遮断することによっ
て増殖を調節するものもあり、一方他の医薬品は生物の外部表面の成分と結合し
て付着を遮断するか又は生物が多数の天然の免疫系と一層作用し易いようにする
ことがある。或いは、医薬品は本発明のORFの1つによってコードされている
タンパク質を含みそしてワクチンとして役立つことができる。外層膜成分、例え
ばLPSに基づくワクチンの開発及び使用は当該技術分野で周知である。
本明細書で使用するとき、「関連生物」とは、本発明の医薬品の1つによって
増殖を調節し得る任意の生物を言う。一般的には、このような生物はワクチンと
して使用される医薬品又はタンパク質の標的であるタンパク質の相同体を含有す
る。このようなものとして、関連生物は細菌である必要はなく、真菌又はウイル
ス病原体であることができる。
本発明の医薬品及び医薬品組成物は慣用の態様で、例えば経口、局所、静脈内
、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内又は皮内経路で投与することができる。医薬品
組成物は、特定の適応症の治療及び/又は予防に有効である量で投与される。一
般的に、医薬品組成物は少なくとも約10μg/体重kgの量で投与され、そして殆
どの場合、1日当たり約8mg/体重kgを超えない量で投与される。殆どの場合、
投与量は、投与経路、症状等を考慮に入れて、1日当たり約10μg/体重kgから
約1mg/体重kgまでである。
本発明の物質は天然形態で使用することができるか又は修飾して化学的誘導体
を形成させることができる。本明細書で使用するき、分子が通常は分子の1部で
はない追加的な化学的部分を有しているとき、この分子は別の分子の「化学的誘
導体」であると言われる。このような部分は分子の溶解度、吸収、生物学的半減
期等を改善することができる。これらの部分は代替的に、分子の毒性を減少させ
、分子の望ましくない副作用を消失させるか又は弱化させる等の可能性がある。
このような効果を媒介し得る部分はレミントンのファーマシューチカルサイエン
ス(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1980年)に開示されている。
例えば、機能的誘導体の免疫学的特徴、例えば一定の抗体に対する親和性の変
化は競合タイプのイムノアッセイによっ測定される。免疫調節活性の変化は適当
なアッセイによって測定される。酸化還元若しくは熱安定性、生物学的半減期、
疎水性、タンパク質分解を受け易いこと又は担体と凝集するか若しくは多量体に
凝集する傾向のようなタンパク質特性の修正は通常の技倆を有する技術者に良く
知られている方法でアッセイされる。
本発明の医薬品の治療効果は任意の適当な手段(即ち、吸入、静脈内、筋肉内
、皮下、腸又は非軽口)によって医薬品を患者に提供することによって得ること
ができる。生物の増殖を制御すべき血液又は組織内で有効な濃度を達成するよう
に、本発明の医薬品を投与することが好ましい。
有効な血液濃度を達成するために好ましい方法は注射によって医薬品を投与す
ることである。投与は連続注入又は単回若しくは多数回注射によることができる
。
患者に本発明の医薬品の1つを提供する際には、投与する医薬品の投与量は、
患者の年齢、体重、身長、性、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴等のよう
な要素に従って変動するであろう。一般的には、より少ないか又はより多い投与
量を投与することができるが、約1pg/kgから10mg/kg(患者の体重)の範囲内
の医薬品投与量を受容者に提供することが望ましい。治療的に有効な投与量は、
本発明の医薬品又は他の医薬品の組合せ物を使用して少なくすることができる。
本発明で使用するとき、(1)各化合物の生理学的効果か又は(2)各化合物
の血清濃度のどちらかを同時に測定することができるとき、2つ若しくはそれよ
り多い化合物又は医薬品は互いに「組み合わせて」投与されると言われる。本発
明の組成物は、他の医薬品の投与と同時に、投与前に又は投与後に投与すること
ができる。
本発明の医薬品は標的生物の増殖速度(上記で特定したような)を低下させる
のに十分な量で受容被験者に提供することを意図している。
本発明の医薬品(単数又は複数)の投与は「予防的」か又は「治療的」のどち
らかを目的とすることができる。予防的に提供するときには、医薬品(単数又は
複数)は生物増殖を示す何らかの症状に先立って提供される。医薬品(単数又は
複数)の予防的投与はその後の感染開始率の防止、弱化又は低下に役立つ。治療
的に提供するときには、医薬品(単数又は複数)は感染の徴候の開始時(又は直
後)に提供する。化合物(単数又は複数)の治療的投与は感染の病理学的症状の
弱化及び回復速度の上昇に役立つ。
本発明の医薬品は製薬的に許容できる形態でそして治療的に有効な温度で哺乳
動物に投与される。組成物は、受容患者がその投与に耐えることができる場合、
「製薬的に許容可能」であると言う。このような医薬品は、投与される量が生理
学的に有意である場合、「治療的に有効な量」で投与されると言う。医薬品の存
在によって受容患者の生理学における検出可能な変化が生じる場合、医薬品は生
理学的に有意である。
本発明の医薬品は製薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って処方す
ることができ、そしてその方法によってこれらの材料又はそれらの機能
的誘導体は製薬的に許容可能な担体媒体と混合して組み合わせられる。他のヒト
タンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて、適当な媒体及びそれらの処方
は例えば、レミントンのファーマシューチカルサイエンシズ(Remington's Ph
armaceutical Sciences)(第16版、Osol,A.、編集、Mack、ペンシルベニ
ア州イーストン(1980年))に記載されている。有効な投与に適する製薬的に許
容可能な組成物を形成するために、このような組成物は有効量の1つ又はそれよ
り多い本発明の医薬品を適量の担体媒体と一緒に含有するであろう。
追加的な製薬方法を使用して作用持続を制御することができる。放出制御製剤
は本発明の1つ又はそれより多い医薬品をコンプレックス化するか又は吸収する
ためにポリマーを使用して達成することができる。送達の制御は適当な巨大分子
(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニ
ルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタ
ミン)及び巨大分子の温度並びに放出を制御するために導入する方法を選択する
ことによって実施することができる。放出制御製剤による作用持続を制御するも
う1つの考えられる方法は本発明の医薬品を、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒ
ドロゲル、ポリ(乳酸)又はエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリ
マー材料の粒子中に導入することである。或いは、これらの医薬品をポリマー粒
子中に導入する代わりに、これらの材料を、例えばコアセルペーション技術又は
界面ポリマー化によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒド
ロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタク
リレート)マイクロカプセル内に、又はコロイド医薬品送達系、例えばリボソー
ム、アルブミン微小球体、微小エマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル又はマ
クロエマルジョン中に閉じ込めことができる。このような技術はレミントンのフ
ァーマシューチカルサイエンシズ(1980年)中に記載されている。
本発明は更に、本発明の製薬組成物の1つ又はそれより多い成分を充填した1
つ又はそれより多い容器を含む製薬パック又はキットを提供する。このような容
器(単数又は複数)に関係があるのは、医薬品又は生物学的製品の
製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定された形態の通知であり、
そしてこの通知はヒトに投与するために製造、使用又は販売の当局による承認を
反映している。加えて、本発明の医薬品は他の治療用化合物と一緒にして使用す
ることができる。
6.メガペースDNA配列決定に対するショットガン方法
本発明は更に、無作為ショットガン方法を使用して1メガベースより大きい配
列の配列を決定できることを最初に示すものである。以下の実施例で詳細に記載
されたこの方法によって、配列決定プロトコールを開始する前の重複するか又は
連続したサブクローンを単離しそして順序づける前段階費用が削除された。
以下の実施例では本発明の或る種の特徴を一層詳細に記載するが、これらによ
って限定されるものではない。
実施例
実験計画及び方法
1.ショットガン配列決定戦略
全ゲノムの配列決定に対するショットガン方法の戦略全体は表3に概略して示
す。ショットガン配列決定の理論は、ポワソン分布の等式px=mxe-m/x!(
式中、xは事象発生数であり、mは平均発生数であり、そしてpxは、一定量の
無作為配列が生じた後に与えられた塩基が配列を決定されない確率である)のラ
ンダー(Lander)及びウォーターマン(Waterman)(Lander及びWaterman、
Genomics 2:231(1988年))の適用に従っている。Lがゲノムの長さであり、
nが配列決定されたクローン挿入末端の数であり、そしてwが配列決定読み取り
の長さである場合には、m=nw/Lであり、そしてクローンが一定の塩基に先
行するw個の塩基のいずれでも生じない確率、即ち塩基が配列決定されない確率
はp0=e-mである。mの単位として折りたたみ範囲を使用すると、1.8Mbの配
列を無作為に発生させた後に、m=1であり、1X範囲を表わすことが分かる。
この場合には、p0=e-1=0.37であるので、概ね37%が配列決定されていない
。例えば5X範囲(挿入末端と平均配列読み取り長さがともに460bpのものから
概ね9500個のクローンの配列が決定される)からp0=e-5=0.0067又は0.67%
の配列未決定が得られる。全
体の]ギャップ長はLe-mであり、平均ギャップサイズはL/nである。5X範
囲は128のギャップを残し、平均約100bpの大きさである。この処理はランダー及
びウォーターマン(Genomics 2:231(1988年))と本質的に同じである。表4
は、460bpの平均フラグメントサイズを有する1.9Mbゲノムでの範囲を示す。
2.無作為ライブラリー構築
実際の配列決定中に上記した無作為モデルを概算するためには、クローン化ゲ
ノムフラグメントのほぼ理想的なモデルが必要である。次のライブラリー構築方
法はこれを達成するために開発した。
H.インフルエンザRd KW20 DNAはフェノール抽出によって調製した。60
0μgのDNA、300mM酢酸ナトリウム、10mMトリス-HCl、1mM Na-EDT
A、30%グリセリンを含有する混合物(3.3ml)は、3mmプローブを使用して1
分間0℃に設定した最低エネルギーで超音波処理した(Branson Model 450 So
nicator)。DNAをエタノール沈殿させ、そしてTE緩衝液500μlに再度溶解し
た。ブラント末端を作るために、100μl分別物を、5単位のBAL31ヌクレアー
ゼ(New England BioLabs)を有するBAL31緩衝液200μl中30℃で10分間
消化した。DNAをフェノール抽出し、エタノール沈殿し、TE緩衝液100μlに
再度溶解し、1.0%低融解アガロースゲル上で電気泳動にかけ、そして1.6〜2.0k
bの大きさのフラクションを切り取り、フェノール抽出し、そしてTE緩衝液20
μlに再度溶解した。2段階結合方法を使用して、>99%が1本鎖挿入物である9
7%の挿入物を有するプラスミドライブラリーが得られた。最初の結合混合物(5
0μl)はDNAフラグメント2μg、SmaI/BAP pUC18 DNA(Pharmaci
a)2μg及びT4リガーゼ(GIBCO/BRL)10単位を含有しており、そし
てインキュベーションは14’で4時間であった。フェノール抽出及びエタノール
沈殿後、DNAはTE緩衝液20μlに溶解し、そして1.0%の低融解アガロースゲ
ル
上で電気泳動にかけた。大きさによって挿入物(i)、ベクター(v)、v+i、
v+2i、v+3i、...として同定された、臭化エチジウム染色線形バンドの梯
子状のものを360nmUV光線で視覚化し、そしてv+iDNAを切り取り、そし
てTE 20μl中に回収した。v+iDNAは、v+i線形物、4個の各dNTP
500μM及びT4 ポリメラーゼ(New England BioLabs)9単位を含有する
反応混合物(50μl)中推奨される緩衝条件下37℃で5分間T4 ポリメラーゼ処
理してプラント末端とした。フェノール抽出及びエタノール沈殿後に、回復した
v+i線形物をTE 20μlに溶解した。円形物にするための最終の結合はv+i
線形物5μl及びT4リガーゼ5単位を含有する反応物50μl中14'で一夜実施した
。70'で10分後、反応混合物を−20'で貯蔵した。
この2段階方法によって、二重挿入キメラ(<1%)又は遊離ベクター(<3
%)から最小限の夾雑を有する一重挿入プラスミド組換え体の分子的に無作為収
集物が得られた。無作為さからの逸脱がクローニング中に最も生起しそうに思わ
れるので、組換え及び制限機能を全て欠いている大腸菌宿主細胞(A.Greener
、Strategies 3(1):5(1990年))を使用して、制限による再配列、欠失及びク
ローンの損失を防止した。形質転換細胞を抗生物質拡散プレートに直接まいて、
最も迅速に増殖する細胞の増加及び選択を可能にする通常のブイヨン回復相を回
避した。播種は次のようにして行った:
エピキュリアンコリ SURE IIスーパーコンピーテント細胞(Stratagene
200152)の分別物100μlを氷上で解凍し、そして氷上の冷却ファルコン(Falc
on)2059管に移した。1.4Mのβ-メルカプトエタノールの分別物1.7μlを細胞分
別物に加えて25mMの最終濃度にした。細胞を氷上で10分間インキュベートした
。最終結合物の分別物1μlを細胞に添加し、そして氷上で30分間インキュベー
トした。細胞を42'で30秒間パルス加熱し、そして氷上に2分間戻した。任意の
一定の形質転換細胞の優先的増殖を最小限にするために、液
体培養物中の生育期間はこのプロトコールから除いた。その代わりに、形質転換
体を、SOB寒天(1.5% SOB寒天: トリプトン20g、酵母抽出物5g、Na
Cl 0.5g、1.5%Difco Agar/L)の底部層5mlを含有する栄養に富むSOB
プレート上に直接まいた。底部層5mlに0.4mlのアンビシリン(50mg/ml)/S
OB寒天100mlを補充する。SOB寒天の上部層15mlにX-Gal(2%)1ml,M
gCl2(1M)1ml及びMgSO4/SOB寒天100mlの1mlを補充する。上部層15
mlを播種する直前に注いだ。我々の力価は概ね100個のコロニー/形質転換分別
物10μlであった。
コロニーは全て大きさに関係なく鋳型製造用に採取した。ライブラリーからは
「有毒」DNA又は有害遺伝子産生物によって失われるクローンしか欠失せず、
ギャップ数は予想されたより僅かしか増加しないであろう。
H.インフルエンザライブラリーの品質を評価するために、M13-21プライマー
を使用して概ね4000個の鋳型から配列データを取得した。1300、1800、2500、32
00及び3800個の配列フラグメントを取得した後に、無作為配列フラグメントを、
オートアッセンブラー(登録商標)ソフトウエア(Perkin-Elmer(AB)のA
pplied Biosystems部門)を使用して組み立て、そして組み立てられた特有の塩
基対の数を決定した。上記した式に基づいて、2.5X106及び1.9X106bpのゲノム
について460bpの平均読み取り長さで得られた配列フラグメント数の関数として
、配列決定されていない塩基対の数の理想的なプロットを決定した(図3)。38
00個までの配列フラグメントのアッセンブリーから得られた実際のデータを使用
してアッセンブリーの進展をプロットし、そして理想的なプロットで提供されて
いるデータと比較する(図3)。図3は、実際のアッセンブリーデータが理想的
なプロットから本質的には逸脱していなかったことを示しており、我々が二重挿
入物キメラによる夾雑が最小限度でありそしてベクターを有していない理想的な
無作為ライブラリーと近似して構
築していたことを示している。
3.無作為DNA配列決定
品質の高い二本鎖DNAプラスミド鋳型(19,687)は、アドバンスト ジェネ
チック テクノロジーコーポレーション(メリーランド州ガイザーズバーグ)と
共同して開発した「沸騰ビーズ」法を使用して製造した(Adams等、Science 25 2
:1651(1991年); Adams等、Nature 355:632(1992年))。プラスミドの調製は
、細菌増殖から最終DNA精製までの全てのDNA調製段階を96ウエル様式で実
施した。鋳型濃度はヘキストダイ(Hoechst Dye)及びミリポアサイトフルオ
ル(Millipore Cytofluor)を使用して測定した。DNA濃度は調整しなかっ
たが、可能な場合、低産生鋳型を同定しそして配列は決定しなかった。鋳型は2
つのH.インフルエンザラムダゲノムライブラリーからも調製した。増幅ライブ
ラリーはベクターラムダGEM-12(Promega)中で構築し、そして非増幅ライ
ブラリーはラムダDASH II(Stratagene)中で構築した。特に非増幅ラムダ
ライブラリーについては、H.インフルエンザRd KW20 DNA(>100kb)を
、DNA50μg、1X Sau3AI緩衝液、Sau3AI 20単位を含有する反応混合物
(200μl)中23'で6分間部分的に消化した。消化したDNAはフェノール抽出
し、そして0.5%の低融解寒天ゲル上で2V/cmで7時間電気泳動にかけた。15
から25kbのまでのフラグメントを切り取り、そして6μlの最終容量で回収した
。フラグメント1μlは、推奨される結合反応でDASHIIベクター(Stratage
ne)1μlと一緒に使用した。ギガパック(Gigapack)II XLパッケージング
エキストラクト(Stratagene、#227711)による推奨プロトコール後のパッケー
ジング反応当たり結合混合物1μlを使用した。ファージは、パッケージング混
合物から増幅しないで直接まいた(推奨されるSM緩衝液500μlによる希釈及び
クロロホルム処理後)。収量は約2.5×103 pfu/μlであった。増幅ライブラリー
は、
ラムダGEM-12ベクターを使用したことを除いて、上記と本質的に同じように
して作成した。パッケージング後、約3.5×104 pfuを制限NM539宿主にまいた
。溶解物をSM緩衝液2ml中に採取し、そして7%ジメチルスルホキシド中で凍
結して保存した。このファージ力価は概ね1×109pfu/mlであった。
液体溶解物(10ml)は、無作為に選択したプラークから調製し、そして鋳型は
陰イオン交換樹脂(Qiagen)上で調製した。配列決定反応は、M13前向き(M1
3-21)及びM13逆向き(M13RP1)プライマー(Adams等、Nature 368:474(
1994年))用のアプライドバイオシスチムズ PRISM レディ リアクション
ダイ プライマー サイクル シークェンシング キット(Ready Reaction Dye
Primer Cycle Sequencing Kits)を用いてAB触媒ラブステーション(Lab
Station)を使用してプラスミド鋳型上で実施した。染料ダーミネーター配列決
定反応は、アプライド バイオシステムズ レディ リアクション ダイ ターミネ
ーター サイクル シークェンシング キットを使用してパーキン-エルマー 9600
サーモサイクラーでラムダ鋳型で実施した。T7及びSP6プライマーを使用して
ラムダGEM-12ライブラリーから得られる挿入物末端の配列を決定し、そして
T7及びT3プライマーを使用してラムダDASH IIライブラリーから得られる
挿入物の末端の配列を決定した。AB373 DNAシークエンサーを1日当たり平
均14個使用して3ヵ月間配列決定反応(28,643)を8人で実施した。配列決定反
応は全て、AB 373のストレッチ修飾を使用し、そして主として34cmのウエル対
読み取り距離を使用して分析した。全体の配列決定成功率はM13-21配列に対し
ては84%、M13RP1配列に対しては83%、そして染料ターミネーター反応に対
しては65%であった。平均使用可能読み取り長さはM13-21配列については485bp
であり、M13RP1配列については444bpであり、そして染料ターミネーター反応
については375bpであった。表5は本発明の高い処理量の配列決定相を要約する
ものである。
リチャード(Richards)等(Richards等、Automated DNA sequencing a
nd Analysis、M.D.Adams、C.Fields、J.C.Venter、編集(Academic
Press、ロンドン、1994年)、28章)は、ラムダ及びコスミドクローンのショッ
トガンアッセンブリープロジェクトで連続物整列を促進する配列決定鋳型の両末
端から得られる配列を使用すること価値を記載している。我々は、M13-21(前
向き)プライマーと比較してM13RP1(逆向き)で実施した配列決定反応での
より短い読み取り長さに対する両末端配列決定の望ましさ(鋳型総数の減少によ
る費用減少を含めて)を比較衡量した。概ね鋳型の半分が両末端から配列決定さ
れた。合計で、9,297のM13RP1配列決定反応を実施した。無作為逆向き配列決
定反応は成功した前向き配列決定反応に基づいて実施された。幾つかのM13RP
1配列は半方向づけ態様で得られた: 連続物の末端で外方向を指しているM13-21
配列は特に連続物を整列させる努力でM13RP1配列決定用に選択した。半方向
づけ戦略は有効であり、そしてクローンに基づく整列はアッセンブリーとギャッ
プ閉じの統合部分を形成した(以下参照)。
4.自動サイクル配列決定用プロトコール
配列決定は8つのABIカタリスト(Catalyst)ロボット及び14のAB 373
自動DNAシークエンサーを使用することからなっていた。カタリストロボット
は、DNAの配列決定反応用に特別に開発された公に入手できる精巧なピペット
化及び温度制御ロボットである。このカタリストは予め分別した鋳型と、デオキ
シヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチド、Taq熱安定性DNAポリメラーゼ
、蛍光標識配列決定プライマー及び反応緩衝液からなる反応混合物を組み合わせ
ている。反応混合物と鋳型はアルミニウムの96ウエル熱サイクルプレートのウエ
ル内で一緒に組み合わせた。変性、プライマーと鋳型のアニーリング及びDNA
合成の伸長を含む直線的増幅
(例えば、1プライマー合成)の30回連続サイクル段階を実施した。熱循環プレ
ート上のゴムガスケット付き加熱蓋は蒸発を防止し、油を上塗りする必要はなか
った。
2つの配列決定プロトコールを使用した: 染料標識プライマーと染料標識ジデ
オキシチェインターミネーター。ショットガン配列決定法は4つのターミネータ
ーヌクレオチドの各々について1つずつの、4つの染料標識配列決定プライマー
の使用に係わるものである。各染料-プライマーは異なる蛍光染料で標識されて
おり、4つの個々の反応を電気泳動、検出及び塩基呼出しのために373DNAシ
ークエンサーの1つのレーン中に組み合わせることができる。ABは現在、予め
混合した反応混合物を、配列決定に必要な全ての非鋳型試薬を含有するバルクパ
ッケージで供給している。プラスミド鋳型によって一般的にはより長い使用可能
な配列が得られるが、配列決定はプラスミドと、厳密性が概ね同等の染料-プラ
イマーと染料-ターミネーターの両方を有するPCR発生鋳型の両方を用いて実
施することができる。
合計960個の試料について、373 シークエンサー当たり32の反応を毎日行った
。電気泳動は製造者のプロトコールに従って夜間に実施し、そしてデータを12時
間集めた。電気泳動及び蛍光検出後に、AB 373は自動レーントラッキング及び
塩基呼出しを実施する。レーントラッキングは視覚的に確認された。各配列のエ
レクトロフェログラム(又は蛍光レーントレース)は視覚的に点検しそして品質
について評価した。低品質配列を追跡して取り出し、そしてその配列自体をソフ
トウエアによってSybaseデータベースに入れた(8mmテープに毎日保管した)。
リーディングベクターポリリンカー配列はソフトウエアプログラムで自動的に取
り除いた。標準ABI373から編集した平均配列長さは400bp位であり、そしてこ
れは大部分、配列決定反応用に使用した鋳型の品質に依存していた。ABI373
シークエンサーは全てストレッチライナーズ(Stretch Liners)に変換し、
そしてこれによって蛍光検出前により長い電気泳動通路が提供され、その結果使
用可能な塩基の平均数は500〜600bpに増加した。
情報科学
1.データ管理
大規模配列決定研究室(lab)用の多数の情報管理システムが開発されている(
Kerlavage等、Proceedings of the Twenty-Sixth Annual Hawaii Intern
ational Conference on System Sciences、IEEE Computer Society
Press、ワシントンD.C.、585(1993年))。配列データを集めそして組み立て
るために使用されるこのシステムはSybase関連データ管理システムを使用して
開発され、そしてできるだけデータの流れを自動化して使用者のエラーを減少さ
せるように設計された。データベースは、鋳型調製からゲノムの最終分析までの
全操作中に集められた全ての情報を保存しそして相互に関連させている。AB37
3シークエンサーの生アウトプットはマッキントッシュプラットフォームに基づ
いており、そして選択されたデータ管理システムはユニックスプラットフォーム
に基づいていたので、生データ並びに分析結果を最小限の使用者の努力でデータ
ベース中に継ぎ目なく流すようにできる多様な多数の使用者、依頼者のサーバー
アプリケーションを設計しそして実行することが必要であった。大きい配列の組
み立てや管理に使用するソフトウエアプログラムの説明は図4に提供する。
2.組み立て
組み立てエンジン(TIGR Assenbler)は数千の配列フラグメントを迅速
且つ正確に組み立てるために開発された。AB オートアッセンブラー(商標)
を、TIGRアセンブラーの整列配列ファイルアウトプットと関連したデータ編
集の目的でエレクトロフェログラムにグラフィックインターフェースを提供する
ように修正した
(そしてTIGR Editorと呼ばれる)。TIGRエディター(Editor)はマ
ッキントッシュプラットフォームのエレクトロフェログラムファイルとユニック
スプラットフォームのインフルエンザ菌データベース中の配列データ間の同時性
を維持している。
TIGRアセンブラーはゲノムのフラグメントを同時に集めそして組み立てる
。104個より多いフラグメントを組み立てるのに必要な速度を得るために、アル
ゴリズムによって10bpのオリゴヌクレオチド配列の寄せ集め表を作って配列フラ
グメント重複表を作成した。各フラグメントの可能性のある重複数は、どのフラ
グメントが反復要素中に入ると思われるのかを決定する。単一の種配列フラグメ
ントで開始して、TIGRアセンブラーはオリゴヌクレオチド含有量に基づいて
最良の適合フラグメントを加えるように試みることによって最新連続物を伸長す
る。最新連続物及び候補フラグメントは、最適のギャップ整列を提供するスミス
・ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズム(Waterman,M.S.、Me
thods in Enzymology 164:765(1988年))の修正版を使用して整列される。最
新連続物は適合の品質に関する厳密な規準が満たされている場合にだけフラグメ
ントによって伸長される。適合規準には最小限の重複の長さ、最大限の非適合末
端の長さ及び最小限の適合割合が含まれる。これらの規準は、最小限範囲の領域
ではアルゴリズムによって自動的に低下し、そして考えられる反復要素を有する
領域内では上昇する。各フラグメントの可能性のある重複数は、どのフラグメン
トが反復要素中に入ると思われるのかを決定する。反復要素と潜在的にキメラで
あるフラグメントの境界を表わすフラグメントはしばしば、整列末端の部分的不
適合に基づいて拒絶され、そして最新速続物から除かれる。TIGRアセンブラ
ーは各鋳型の両末端からの配列決定と一緒にクローンの大きさの情報を利用する
ように設計されている。これによって、同一の鋳型の2つの末端から得られる配
列フラグメントが連続物内で互いに向き合っておりそして一定の塩基対整
列(与えられたライブラリーに関して、既知のクローンの大きさ範囲に基づいて
各クローンで特定可能な)内に位置しているという制約が強制される。インフル
エンザ菌の24,304個の配列フラグメントの組み立てには、512MbのRAMを有す
るSPARCenter 2000の1つのプロセッサーを使用して、30時間のCPU時間
が必要であった。この方法で概ね210個の連続物が得られた。TIGRアセンブ
ラーの厳密度が高いため、grasta(修正されたfasta(Person及びLipman、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988年))を使用して全ての連
続物を互いに検索した。このようにして、140個の連続物中にセットされたデー
タの要約を可能にする重複を更に検出した。連続物内の各フラグメントの位置及
びコンセンサス配列自体に関する広範な情報をインフルエンザ菌関連データベー
スに入れた。
3.組み立てられた連続物の整列
組み立て後、140個の連続物の相対的な位置は知られていなかった。これらの
連続物はasm alignによって整列させた。asm alignは互いに隣接する連続物を同
定しそして整列させるために多数の関係を使用する。このアルゴリズムを使用し
て、140個の連続物を42の群に入れ、合計して42の物理的ギャップ(この領域の
鋳型DNAがない)と98の配列ギャップ(ギャップを埋めるために鋳型が利用で
きる)となった。
物理的ギャップによって分離された連続物を整列させそしてギャップを埋める
物理的ギャップで分離された連続物を整列させるために4つの統合戦略を開発
した。オリゴヌクレオチドプライマーを設計しそして各連続物群の末端から合成
した。それ故、これらのプライマーは以下に概略する1つ又はそれより多い戦略
で使用するためにを使用す
ることができた:
1. 上記オリゴヌクレオチドの72のサブセットについて固有の「フィンガー
プリント」を発生させるためにサザン分析を行った。この方法は、隣接連続物の
末端と相同の標識オリゴヌクレオチドが共通のDNA制限フラグメントとハイブ
リッドを形成し、そしてその結果類似するか若しくは同一のハイブリッド形成パ
ターン又は「フィンガープリント」を共有するという仮定に基づいていた。オリ
ゴヌクレオチドは50pmolの各20量体及び250mCiの[γ-32P]ATP並びにT4
ポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識した。標識したオリゴヌクレオチドは
、セファデックスG-25スーパーファイン(Pharmacia)を使用して精製し、そ
して1つの頻繁に使用されるカッター(AseI)と5つの頻繁には使用されない
カッター(BglII、EcoRI、PstI、XbaI及びPvuII)で消化したインフルエ
ンザ菌Rd染色体DNAのサザンハイブリッド分析で各々107cpmのオリゴヌクレ
オチドを使用した。各消化物から得られるDNAを0.7%アガロースゲルで分画
し、そしてニトランプラス(Nytran Plus)ナイロン膜(Schleicher & Schu
ell)に移した。ハイブリッド形成は40'で16時間実施した。非特異的シグナルを
除去するために、各プロットを室温で、緊縮度条件を0.1XSSC+0.5%SDS
にまで高め乍ら連続洗浄した。プロットをホスホルイメージャー(PhosphorIm
ager)カセット(Molecular Dynamics)に数時間暴露し、そしてハイブリッド
形成パターンを視覚的に比較した。
このようにして同定された隣接連続物を特異的PCR反応の標的とした。
2. ペプチド結合はペプチドデータベースに対してblastx(Altschul等、
J.Mol.Biol.215:403(1990年))を使用して各連続物端の検索を行った。
2つの連続物の末端が適当な方法で同じデータベース配列に適合していた場合に
は、これら2つの連続物は違いに隣接していると暫定的に考えた。
3. インフルエンザ菌ゲノムDNAから構築された2つのラムダライブラリ
ーは、連続物群の末端から設計したオリゴヌクレオチドで探索した(Kirkness等
、Genomics 10:985(1991年))。次に、陽性プラークを使用して鋳型を作成し
、そしてラムダクローン挿入物の各末端から配列を決定した。これらの配列フラ
グメントは全ての連続物のデータベースに対してgrastaを使用して検索した。同
じラムダクローンの反対末端から得られる配列に適合する2つの連続物を整列さ
せた。次いで、このラムダクローンによって隣接速続物間の配列ギャップを埋め
るための鋳型が提供された。ラムダクローンは反復構造を解読するのに特に価値
がある。
4. 他の方法によって見い出された連続物の整列を確認しそして整列してい
ない連続物の順番を確立するために、標準的で且つ範囲の長い(XL)PCR反
応を次のようにして実施した。
標準的なPCRは次のようにして実施した。各反応は混合物37μl; H2O 16.
5μl、25mM MgCl2 3μl、dNTPミックス(1.25mMの各dNTP)8μl
、I0X PCRコア緩衝液II(Perkin Elmer)4.5μl、インフルエンザ菌Rd
KW20ゲノムDNA 25ngを含んでいた。適当な2つのプライマー(4μl、3.2p
mole/μl)を各反応に加えた。ホットスタートは95 で5分間、続いて75'で維
持して実施した。維持している間に、H2O 4.3μl、10X PCRコア緩衝液II
0.5μl中のアンプリタク(Amplitaq)DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)0
.3μlを各反応に加えた。PCRプロフィールは、94'/45秒の変性; 55'/1分
のアニーリング; 72'/3分の伸長の25回サイクルであった。反応は全て、パー
キンエルマー GeneAmp PCRシステム9600で96ウエル様式で実施した。
長い範囲のPCR(XL PCR)は次のようにして実施した: 各反応は混合
物35.2μl; H2O 12.0μl、25mM Mg(OAc)2 2.2μl、dNTPミックス(20
0μMの最終濃度)4μl、3.3X PCR緩衝液 12.0μl、インフルエンザ菌Rd
KW20ゲノムDNA 25ngを含ん
でいた。適当な2つのプライマー(5μl、3.2pmole/μl)を各反応に加えた。
ホットスタートは94'で1分間で実施した。各反応に、3.3X PCR緩衝液II 2.
8μl中2.0μlのrTthポリメラーゼ(4U/反応)を加えた。PCRプロフィー
ルは、94'/15秒の変性; 62'/8分のアニーリング及び伸長の18回のサイクル、
続いて94'/15秒の変性; 62'/8分(1サイクル当たり15秒増加)のアニーリン
グ及び伸長の12回のサイクル; 72'/10分の最終伸長であった。反応は全て、パ
ーキンエルマーGeneAmp PCRシステム9600で96ウエル様式で実施した。
PCR反応は本質的に物理的ギャップ末端の組合せ毎に実施したが、互いに隣
接する連続物を整列させそしてギャップを完全に埋めるために必要なコンビナト
リーPCR反応数を減少させるためには、サザンフィンガープリント法、データ
ベース適合化及び大きい挿入物クローン探索のような技術が特に価値があった。
これらの戦略をより大規模に将来のゲノムプロジェクトに使用しても完全にゲノ
ムを埋める全体的な有効性が高められるであろう。これらの各技術によって整列
させられそして埋められる物理的ギャップの数は表5に要約する。
15〜20kbのクローン末端から得られる配列情報はギャップを埋め、反復構造を
解明し、そして全体的なゲノム組立ての一般的な情報を提供するのに特に適して
いる。我々はまた、インフルエンザ菌ゲノムのフラグメントのなかには大腸菌の
高コピープラスミド中でクローン化できないものがあることにも関心があった。
我々は、溶解性ラムダクローンがこれら断片のDNAを提供すると考えた。増幅
したラムダライブラリー、作成された鋳型及び各末端から得られた配列情報から
概ね100個の無作為プラークを集めた。これらの配列を連続物に対して検索し(gr
asta)、そしてデータベースでそれらの適当な連続物と結合し、そしてその結果
ゲノムアセンブリーの正確さを更に支持するのに寄与するラムダクローンの足場
が提供された(図
5)。連続構造の確認に加えて、ラムダクローンは23の物理的ギャップを埋めた
。ゲノムの概ね78%がラムダクローンによってカバーされた。
ラムダクローンは反復構造の解明にも有用であった。ゲノム中で同定された反
復構造は、6個のリボソームRNAオペロン及び長さ5,340bpの1個の反復(2
コピー)を除いて、無作為挿入物ライブラリーから得られる単一クローンで埋め
ることができるほど十分に小さかった。オリゴヌクレオチドプローブは各反復の
初めの特有の側部から設計しそしてラムダライブラリーとハイッブリッドを形成
させた。各側部について陽性プラークを同定しそして各クローンの末端から得ら
れる配列フラグメントを使用してゲノム内の反復を正しく方向づけた。
インフルエンザ菌の6個のリボソームRNA(rRNA)オペロン(16Sサブ
ユニット−23Sサブユニット−5Sサブユニット)を識別できそして組み立てる
ことができるかどうかが、かなりの数の反復領域を有していると思われる複雑な
ゲノムの配列を決定しそして組み立てるための我々の全体的な戦略の試験であっ
た。高度の配列類似性及び6個のオペロンの長さによって、基礎になっている全
ての配列を識別不能な2,3の連続物に集める組み立て方法が得られた。配列内
でのオペロンの正しい配置を決定するために、それぞれについて1対の特有の側
部配列が必要であった。左(16S rRNA)末端には特有の側部配列は全く見る
ことができなかった。この領域はリボソームプロモーターを有しており、そして
高コピー数pUC18プラスミド中でクローン化できないように思われた。しかし
乍ら、特有の配列は右(5S)末端で確認することができた。オリゴヌクレオチ
ドプライマーはこれらの6個の側部領域から設計しそして2つのラムダライブラ
リーを提案するために使用した。6個の各rRNAオペロンについて、rRNAオ
ペロンを完全に埋めそして16S及び5S末端に特有の側部配列を有する少なくと
も1個の陽性プラークが確
認された。これらのプラークは、特有の配列を得る鋳型を6個のrRNAオペロ
ンの各々に提供した。
組み立てた円形ゲノムの全体的構造の更なる配置は、酵素ApaI、SmaI及びR
srIIについて組み立てた配列に基づくコンピューター発生制限マップをレッドフ
ィールド(Redfield)及びリー(Lee)(Genetic Maps: locus maps of compl
ex genomes、S.J.O'Brien編集、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、ニューヨーク州ニューヨーク、1990年、2110)の予測物理的マップと比較す
ることによって得られた。配列から誘導されたマップの制限フラグメントは物理
的マップから得られたものと大きさ及び相対的順序が一致していた(図5)。
編集
ABオートアッセンブラー(登録商標)及びファーストデータファインダー(
Fast Data FinderfM)ハードウエアを使用して連続物の重複10kb断片を組み
立てることによって視覚的に編集した。オートアッセンブラー(登録商標)は編
集用にエレクトロフェログラムデータにグラフィックインターフェースを提供す
る。エレクトロフェログラムデータを使用して各位置に最も可能性のある塩基を
割り当てた。相違点を解決できなかったか又は明確な割り当てを行えなかった場
合、自動塩基呼出しは変更しなかった。個々の配列の変更はエレクトロフェログ
ラムファイルに書き込みそして複製プロトコール(crash)を使用してインフル
エンザ菌データベースとエレクトロフェログラムファイル間の配列データの同時
性(同一性?)を維持した。編集後、注釈を付ける前にTIGRアセンブラーヲ
用いて連続物を再度組み立てた。
ゲノムに注釈を付ける途中に確認された潜在的フレームシフトはデータベース
のレポートとして省いた。これらのレポートには、整列ソフトウエア(praze)
が逸失又は挿入塩基の最も可能性のある市
であると予測する連続物の組合せ及びフレームシフトを含む配列整列の表示が含
まれる。明らかなフレームシフトは、更に編集する必要があると思われる配列の
領域を示すために使用した。フレームシフトは、明白なエレクトロフェログラム
データがフレームシフトと一致しない場合にも訂正しなかった。フレームシフト
の編集はTIGRエディター(Editor)を用いて実施した。
rRNA及び他の反復領域はTIGRアセンブラーによる円形ゲノムの完全な
組み立てを妨げた。ゲノムの最終的な組み立ては、短い重複に基づいて複数の連
続物を一緒に継ぎ合わせるcomb asmを使用して達成された。
ゲノム配列の正確さ
インフルエンザ菌ゲノム配列の正確さは、これまでに同定されたインフルエン
ザ菌配列が非常に少なくそしてこれら配列の大部分が他の種のものであるため、
定量することが困難である。しかし乍ら、データに適用することができる3つの
正確さパラメーターが存在している。第1は、データベースの類似性に基づいて
、予測されるインフルエンザ菌遺伝子の明白なフレームシフトの数は148である
。これらの明白なフレームシフトの幾つかはは、特に、49の明白なフレームシフ
トが他の生物から得られる仮定のタンパク質に対する適合に基づいているという
ことを考慮すると、我々の配列中にあるというよりはむしろデータベース配列中
にあると思われる。第2に、ゲノム中にはNとして曖昧なままの塩基が188個が
ある(1/9,735bp)。これら2つのタイプの「知られている」エラーを組み合わ
せると、我々は99.98%の最大配列正確度を計算することができる。平均範囲は6
.5Xであり、そしてゲノムの1%は1倍の範囲である。
遺伝子の同定
インフルエンザ菌Rdゲノムの全てのコード化領域を予測しそして
遺伝子、tRNA及びrRNA並びにDNA配列の他の特徴(例えば、反復、調
節部位、複製、起源部位、ヌクレオチド組成)を同定する試みを行った。容易に
明白は配列特徴の幾つかの説明以下に提供する。
インフルエンザ菌Rdゲノムは1,830,121bpの円形染色体である。全体的なG/
Cヌクレオチドの含有量は概ね38%(A=31%、C=19%、G=19%、T=31%
、IUB=0.035%)である。ゲノムのG/C含有量は全体的な構造特徴を探す
ために幾つかの長さのウインドウで調べた。5,000bpのウインドウでは、G/C
の含有量は、7ラージG/Cに富む領域及びA/Tに富む領域を除いて比較的均
等である(図5)。G/Cに富む領域は6個のrRNAオペロン及び不可解なミ
ュー様プロファージの位置に対応する。バクテリオファージミューによってコー
ドされるタンパク質と類似性を有する幾つかのタンパク質の遺伝子はゲノムの概
ね1.56〜1.59Mbpの位置に位置している。ゲノムのこの領域はインフルエンザ菌
の平均より顕著に高いG/C含有量を有している(ゲノムの残りの領域の約38%
と比較して約50%のG/C)。A/Tに富む領域の原因又は重要性については有
意性は未だ確認されていない。
大腸菌の最小複製起源(oriC)は、1つの末端のGATCコア配列を含有す
る13塩基対の反復の3個のコピー及び他の末端のTIATコア配列を含有する9
塩基対の反復の4個のコピーによって特定される245bp領域である。GATC部
位はメチル化標的及び制御複製であり、一方TIAT部位はDnaAの結合部位を
提供し、複製プロセスの最初の段階である(Genes V,B.Lewin編集(Oxford
University Press、ニューヨーク、1994年)、18〜19章)。限界がこれらの同じ
コア配列によって特定されている概ね281bpの配列(602,483〜602,764)はイン
フルエンザ菌Rdで複製起源を特定しているように思われる。これらのコーディ
ネートはリボソームオペロンの組合せrrnF、rrnE、rrnDとrrnA、rrnB、rrn
C間に存在する。リ
ボソームオペロンのこれら2つの群は反対方向に転写されそして起源の置換がそ
れらの転写の極性と一致する。大腸菌複製の終結は、2つの複製フォークが出会
う中間点の一方の側の約100bpに配置された2つの23bp終止配列によって示され
る。大腸菌の終止配列と10bpコア配列を共有する2つの潜在的終止配列はインフ
ルエンザ菌ではコーディネート1,375,949〜1,375,958及び1,558,759〜1,558,768
で同定された。これら2つの組のコーディネートは、提案されたインフルエンザ
菌の複製起源の180'反対の点から概ね100kbをカバーする。
6個のrRNAオペロンが同定された。各rRNAオペロンは3つのrRNA
サブユニット及び種々のスペーサー領域を次の順序で含有している: 16Sサブユ
ニット − スペーサー領域 − 23Sサブユニット − 5Sサブユニット。これら
のサブユニットの長さはそれぞれ1539bp、2653bp及び116bpである。これら3つ
のリボソームサブユニットのG/C含有量(50%)はゲノムより全体として多い
。スペーサー領域のG/C含有量(38%)はゲノムの残りと一致する。3つのr
RNAサブユニットのヌクレオチド配列は6つのリボソームオペロンの全てで10
0%同一である。rRNAオペロンは、16S配列と23S配列間のスペーサー領域
に基づいて2つのクラスに分類することができる。2つのスペーサー領域のうち
より短いものは長さが478bpであり(rrnB、rrnE及びrrnF)そしてtRNA
Gluの遺伝子を含んでいる。より長いスペーサーは長さが723bpであり(rrnA、
rrnC及びrrnD)そしてtRNA Ile及びtRNA Alaの遺伝子を含んでいる
。これら2つのスペーサー領域の組も3つのオペロンの各群で100%同一である
。tRNA遺伝子はまた、2つのtRNAオペロンの16S及び5S末端にも存在
している。tRNA Arg、tRNA His及びtRNA Proの遺伝子はrrnEの
16S末端に位置しており、一方tRNA Trp及びtRNA ASPの遺伝子はrrn
Aの5S末端に位置している。
インフルエンザ菌のゲノムの予測されたコード化領域は最初、ジーンバンクの
122個のインフルエンザ菌コード化配列から誘導されるコドン頻度マトリックス
を使用してプログラムジーンマーク(Borodovsky及びMcIninch、Computers
Chem.17(2):123(1993年))でコード化能を評価して特定した。予測されたコ
ード領域配列(プラス300bpの側部配列)は、注釈を付けるために特に作られた
非冗長細菌タンパク質(NRBP)のデータベースの検索で使用された。DNA
コード化領域は全てジーンバンクから引き出し(リリース85)、そして同一種か
ら得られた配列を互いに検索した。>100個のヌクレオチドの領域に亘って>97
%の類似性を有する配列を組み合わせた。更に、配列を翻訳させ、そしてスイス
プロット(Swiss-Prot)の全ての配列(リリース30)とのタンパク質比較で使
用した。同じ種に属しそして33個のアミノ酸に亘って>98%の類似性を有する配
列を組み合わせた。NRBPは1,099の異なる種から得られた23,751個のジーン
バンク配列と11,183個のスイスプロット配列から引き出された21,445個の配列か
ら構成されている。
合計1,749の構成予測コード化領域が同定された。インフルエンザ菌の予測コ
ード化領域の検索は、NRBPを検索するために3つの付加鎖(ストランド)読
み取り枠内の疑問DNA配列を翻訳し、疑問配列に適合するタンパク質配列を同
定し、そしてprazeを使用してタンパク質−タンパク質の適合を整列させるアル
ゴリズム、即ち修正スミス・ウォーターマン(Smith-Wateroman)(Pearson
及びLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988))アル
ゴリズムを使用して実施した。DNA配列内の挿入又は欠失によってフレームシ
フトエラーが生じた場合には、整列アルゴリズムは最大類似性の領域で開始し、
そして300bpの側部領域を使用して別のフレームで同じデータベース適合に整列
を伸長した。フレームシフトエラーを含んでいることが知られている領域はデー
タベースで省きそして修正の可能性について評価した。同定されなかった予測
コード化領域及び残りの遺伝子間配列はスイス・プロット、PIR及びジーンバ
ンクから入手できる全てのペプチド配列のデータセットを検索した。オペロン構
造の同定は転写プロモーター及び終結部位の実験的測定によって促進されるであ
ろう。
推定して同定した各インフルエンザ菌遺伝子は、リレイ(Riley)(Riley,
M.、Microbiology Reviews 57(4):862(1993年))から適合させた102の生物
学的役割カテゴリーの1つに割り当てた。割り当ては、予測コード化領域のタン
パク質配列をリレイデータベース中のスイス・プロット配列と関連させて実施し
た。1,749の予測コード化領域のうち724は役割を割り当てられていない。これら
のうち、384についてはデータベース適合が見い出されず、一方340はデータベー
スの「仮定上のタンパク質」に適合した。役割割り当ては予測コード領域の1,02
5で行われた。予測コード化領域の編集、それらの特有の識別物、3文字遺伝子
識別記号、同一性パーセント、類似性パーセント及びアミノ酸適合長さは表1(
a)に示す。
インフルエンザ菌Rdの注釈を付けた完全なゲノムマップは図6(A)〜(D
)に示す。このマップは各予測コード化領域をインフルエンザ菌染色体上に置き
、その転写方向を示し、そして色はその役割割り当てを暗号化している。役割割
り当ては図5にも示す。
インフルエンザ菌Rdの遺伝子及び遺伝子染色体機構を調査すると代謝過程の
説明が可能になる。インフルエンザ菌は自由な生存生物として生き残るために、
実験室で増殖するための栄養要求及び、特にその病原性やビルレンス(菌力)に
関連するような他の生物と異なるようになる特徴を必要とする。ゲノムは生命に
とって必須であることが知られている或るクラスの遺伝子の完全な補体を有して
いると期待されるであろう。例えば、インフルエンザ菌データベースの潜在的相
同体と大腸菌リボソームの発表されたタンパク質配列は一対一で対応している。
同様に、表1(a)に示されるように、アミノアシルtRNAシンテターゼは各
アミノ酸についてゲノム内に存
在している。最後に、tRNA遺伝子の位置をゲノム上にマップした。代表的な
20種のアミノ酸を含めて54の同定されたtRNA遺伝子がある。
自由な生存生物として生き残るためにインフルエンザ菌は発酵及び/又は電子
輸送によってエネルギーをATPの形態で生じさせなければならない。偶発的嫌
気性生物として、インフルエンザ菌Rdはグルコース、フルクトース、ガラクト
ース、リボース、キシロース及びフコースを発酵することが知られている(Doro
cicz等、J.Bacteriol.175:7142(1993年))。表1(a)で確認される遺伝子
は、ホスホエノールピルビン酸−ホスホトランスフェラーゼ系(PTS)及び非
PTSメカニズムによるこれら糖類の取込みに輸送系を利用できることを示して
いる。PTS系の共通のホスフェート担体酵素I及びHpr(ptsI及びptsH)を
特定する遺伝子並びにグルコース特異性crr遺伝子が同定された。ptsI、ptsH
及びcrr遺伝子はptsオペロンを構成する。しかし乍ら、我々は膜結合グルコース
特異的酵素IIを同定していない。後者の酵素はPTS系でのグルコース輸送に必
要である。フルクトースの完全なPTS系が同定された。
完全な解糖系及び発酵最終生成物の産生をコードする遺伝子が同定された。増
殖利用嫌気性呼吸メカニズムは、硝酸塩、亜硝酸塩及びジメチルスルホキシドの
ような無機電子受容体を使用して機能的電子輸送系をコードしている遺伝子を同
定することによって見い出された。トリカルボン酸(TCA)回路の3つの酵素
をコードしている遺伝子はゲノムにはないように思われる。クエン酸シンターゼ
、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びアコルドターゼ(acordtase?アコニット
酸ヒドラターゼのことか)は予測コード化領域を検索するか又は大腸菌酵素を翻
訳における全ゲノムに対するペプチド照会として使用しても見い出されなかった
。これは、特定された培養培地で要求される非常に高いグルタミン酸塩値(1g
/L)の説明を提供している(Klein及びLuginbuhl、J.Gen.Microbiol.113
:
409(1979年)。グルタミン酸塩は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってアル
ファ-ケトグルタレートに変換することによってTCA回路に向けることができ
る。完全なTCA回路がない場合、グルタミン酸塩は多分、TCA回路から分岐
するプリカーサーを使用することによってアミノ酸の生合成の炭素源として役立
つ。機能的な電子輸送系は、最終電子受容体として酸素を使用してATPの産生
に利用することができる。
これまでに答えられなかった病原性及びビルレンスに関する問題は、癒着及び
リポオリゴ糖発生遺伝子のような或るクラスの遺伝子を試験することによって取
り扱うことができる。モキソン(Moxon)及び共同研究者(Weiser等、Cell 5 9
:657(1987年))は、これらのビルレンス関連遺伝子が縦に並んだ四量体反復
を含んでおり、そしてこの反復は複製中に1つ又はそれより多い反復単位の頻繁
な付加及び欠失を受け、その結果この遺伝子の読み取り枠が変更されそしてそれ
によってその発現が変更されているという証拠を得ている。今や、完全なゲノム
配列を使用して、このような縦に並んだ全ての配列区域の位置を決め(図5)そ
してこのような潜在的ビルレンス遺伝子の相変動におけるそれらの役割を決定す
ることを開始することが可能である。
インフルエンザ菌Rdは非常に効率的な天然のDNA形質転換系を有している
(Kahn及びSmith、J.Membrane Biol.138:155(1984年)。特有のDNA取
込み配列部位、ゲノム内の多数のコピー中に存在している5'AAGTGCGG
Tは効率的なDNA取込みに必要であることが示されている。今や、これらの全
ての部位の位置を決めそしてそれらの分布を完全に記載することが可能である。
形質転換に関係のある15の遺伝子は既に記載されており、そして配列が決定され
ている(Redfield,R.、J.Bacteriol.173:5612(1991年); Chandler,M.
、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:1616(1992年); Barouki及びSmi
th、J.Bacteriol.163(2)
: 629(1985年); Tomb等、Gene 104:1(1991年); Tomb,J.、Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.89:10252(1992年))。6つの遺伝子、comAからcomF
は、プロモーターの上流で1つのらせんターンの周囲の22bpのバリンドローム受
容能調節要素(CRE)によって明白に(?)制御されているオペロンを含んで
いる。rec-2形質転換遺伝子もこの要素によって制御されている。今や、ゲノム
内のCREの追加的コピーの位置を決定しそしてCRE制御下の潜在的形質転換
遺伝子を発見することが可能である。更に、他の広範囲の調節要素を今や容易に
発見することが可能であり、これはこれまでは可能でなかった。
細菌における1つの良好に記載された遺伝子調節系は、或る種の環境シグナル
を検出するセンサー分子とセンサーの活性化形態でリン酸化されている調節分子
から構成された「2成分」系である。調節タンパク質は一般的には、センサーに
よって活性化されたとき特定の遺伝子組を開始又は停止させる転写因子である(
総説については、Albright等、Ann.Rev.Genet.23;311(1989年); Parkin
son及びKofoid、Ann.Rev.Genet.26:71(1992年)参照)。大腸菌は40のセン
サー−調節対を有していると考えられている(Albright等、Ann.Rev.Gene
t.23:311(1989年); Parkinson及びKofoid、Ann.Rev.Genet.26:71(1992
年))。インフルエンザ菌ゲノムはtblastn及びtfastaを使用して、代表的なタン
パク質を用いてセンサーと調節タンパク質の各科から検索した。4つのセンサー
及び5つの調節タンパク質が同定され、他の種から得られるタンパク質と類似し
ていた(表6)。CpxRを除いて、各調節タンパク質用の対応するセンサーがあ
るように思われる。大腸菌から得られるCpxAタンパク質で検索することによっ
て、表6に示された4つのセンサーのうち3つが同定されたが、追加的な顕著な
適合は見られなかった。配列類似性のレベルがtfastaで検出できないほど十分に
低い可能性がある。NtrCのクラスの調節タンパク質を代表するも
のは全く見られなかった。このクラスのタンパク質はRNAポリメラーゼのシグ
マ54サブユニットと直接相互作用し、そしてこれはインフルエンザ菌には存在し
ていない。調節タンパク質はすべてOmpRサブクラスに入る(Albright等、Ann
.Rev.Genet.23:311(1989年); Parkinson及びKofoid、Ann.Rev.Gene
t.26:71(1992年))。インフルエンザ菌のphoBR及びbasRS遺伝子は互いに隣
接しており、そして多分オペロンを形成する。nar及びarc遺伝子は互いに隣接し
て位置していない。
完全なゲノム配列によって答えることができる最も興味のある問題は、どの遺
伝子又は経路を欠いているかに関するものである。非病原性のインフルエンザR
d株は病原性の血清型b株と顕著に異なっている。これら2つの株間の差異の多
くは感染性に影響を与える因子であるように思われる。例えば、細菌と宿主細胞
との接着に関与する繊毛のある遺伝子集団(vanHam等、Mol.Microbiol.13:
673(1994年))を形成する8つの遺伝子はRd株には存在していないことが今や
示されている。インフルエンザ菌タイプb株では繊毛のある集団が側部に付いて
いるpepN及びpurE遺伝子はRd株では互いに隣接しており(図7)、繊毛のあ
る集団(duster→cluster)全体が切り取られていることを示唆している。より
広いレベルでは、大腸菌から得られるタンパク質コード化遺伝子の冗長でない組
、即ちウィスコンシン大学のジーンバンクのゲノムプロジェクト(Genome Pro
ject)連続物: ジーンバンク受理 D10483、L10328、U00006、U00039、U140
03及びU118997から得られる1,216個の予測タンパク質配列(Yura等、Nucleic
Acids Research 20:3305(1992年); Burland等、Genomics 16:551(1993年
))を利用して、我々は大腸菌のどのタンパク質がインフルエンザ菌に存在して
いないかを決定した。適合の最小閾は、弱い適合であっても陽性として得点し、
そしてそれによってインフルエンザ菌にはいない大腸菌の遺伝子の最小見積もり
を与えた。tblastnを使用して、大腸菌のタンパク
質の各々を完全ゲノムに対して検索した。>100のblast得点は適合と考えた。合
計627種の大腸菌タンパク質がインフルエンザ菌ゲノムの少なくとも1つの領域
で適合し、そして589種のタンパク質は適合しなかった。589種の非適合タンパク
質を調べそして大腸菌の仮定上のタンパク質を不釣り合いに多数含有しているこ
とが分かった。同定された大腸菌タンパク質68パーセントがインフルエンザ菌の
配列によって適合され、一方仮定上のタンパク質の38%しか適合しなかった。タ
ンパク質は、他のどの既知のタンパク質とも適合しないことに基づいて仮定上の
タンパク質として注釈を付ける(Yura等、Nucleic Acids Research 20:3395(
1992年); Burland等、Genomics 16:551(1993年))。適合しないタンパク質の
なかで仮定上のタンパク質が過剰に提示されることについて少なくとも2つの可
能性のある説明を提供することができる: 仮定上のタンパク質は実際には翻訳さ
れない(少なくとも注釈を付けたフレームでは)かんたはこれらは大腸菌特異的
タンパク質であり、最も密接に関連した種、例えばネズミチフス菌を除いて如何
なる種にも見られないように思われる。
合計384の予測コード化領域はジーンバンクリリース87の6フレーム翻訳とあ
まり類似性を示さなかった。これらの同定されていないコード化領域はfastaを
用いて互いに比較した。幾つかの新規な遺伝子群が同定された。例えば、データ
ベースと適合しない2つの予測コード化領域(HI0591、HI0852)はそれらの
ほぼ完全な長さ(それぞれ、139及び143個のアミノ酸残基)で75%の同一性を共
有している。これら領域は互いに類似しているが現在のデータベースで得られる
どのタンパク質とも適合しないことは、それらが新規な細胞機能を表わし得るこ
とを示唆している。
同定されなかったコード化領域には、顕著なアミノ酸同一性がない場合であっ
てもレセプターのメンバーと輸送遺伝子群間にしばしば保持される潜在的膜−ス
パニングドメインのパターンを示してい
る水治療法を含めて他のタイプの分析を当てはめることができる。膜結合チャン
ネンルタンパク質に特徴的である周期的パターンを有する潜在的トランスメンブ
レインドメインを示している同定されなかった予測コード化領域の5つの例を図
8に示す。このような情報を使用して、これら遺伝子の標的とされた欠失又は突
然変異によって影響を受ける細胞機能の特異的な特徴に焦点を合わせることがで
きる。
インフルエンザ菌生物学の医学的に重要な特徴における興味はこの生物のビル
レンス特徴を決定する遺伝子に特に集中している。細菌、カタラーゼ遺伝子の特
徴が決定され、そして可能性のあるビルレンス関連遺伝子として配列が決定され
た(Bishai等、J.Bacteriol.176:2914(1994年))。莢膜多糖類の原因であ
る多数の遺伝子がマップされそして配列が決定された(Kroll等、Mol.Microb
iol.5(6):1549(1991年))。幾つかの外層膜タンパク質遺伝子が同定されそし
て配列が決定された(Langford等、J.Gen.Microbiol.138:155(1992年))
。外層膜のリポオリゴ糖成分及びその合成経路の遺伝子は集中的に研究されてい
る(Weiser等、J.Bacteriol.173:3304(1990年)。ワクチンは利用可能であ
るが、外層膜成分の研究はワクチンを改良する必要性によって幾分動機付けられ
ている。
データの入手可能性
インフルエンザ菌ゲノム配列は受理番号L42023でゲノム配列データベース(
Genome Sequence DataBase)(GSDB)に入れられている。同定された開
始及び停止コドンを有する各予測コード化領域のヌクレオチド配列及びペプチド
翻訳もGSDBによって受理されている。
インフルエンザ菌タンパク質に対する抗体の産生
実質的に純粋なタンパク質又はポリペプチドは、トランスフェクションされる
か又は形質転換された細胞から当該技術で既知の方法のいずれか1つを使用して
単離される。タンパク質はまた、組換え原核生物発現系、例えば大腸菌内で産生
させることができるか又は化学的に合成することができる。最終調製物中のタン
パク質の濃度は、例えば、アミコン(Amicon)フィルターデバイスで濃縮して
2,3マイクログラム/mlのレベルに調整される。次に、このタンパク質に対す
るモノクローナル又はポリクローナル抗体を次のようにして調製することができ
る:
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載したようにして同定しそして単離したペプチドのいずれかのエピトープに
対するモノクローナル抗体は、コーラー ジー(Kohler,G.)及びミルスタイ
ン シー(Milstein C.)(Nature 25:495(1975年))の古典的な方法又はそ
の修正方法に従ってネズミハイブリドーマから調製することができる。簡単に言
えば、マウスを、2,3週間に亘って2,3マイクログラムの選択したタンパク質
で繰り返し接種する。次いで、マウスを屠殺し、そして脾臓の抗体産生細胞を単
離する。脾臓細胞をポリエチレングリコールによってマウスミエローマ細胞と融
合させ、そして過剰の融合していない細胞は、アミノブテリン含む選択培地(H
AT培地)で系を増殖させて破壊する。成功裏に融合した細胞を希釈し、希釈分
別物を微量滴定ウエルに入れ、そこで培養物の増殖を継続する。抗体産生クロー
ンは、エングバール イー(Engvall,E.)(Meth.Enzymol.70:419(1980
年)によって最初に記載されたエリザ法及びその修正方法のような免疫アッセイ
方法によってウエルの上清液中の抗体を検出して同定する。選択した陽性クロー
ンを拡張しそしてそれらのモノクローナル抗体産生物を使用するために採集する
ことができる。モノクローナル抗体の詳細な産生方法はデービス エル(Davis
L.)等
(Basic Methods in Molecular Biology Elsevier、ニューヨーク、21-2章
(1989年)で記載されている。
免疫法によるポリクローナル抗体産生
単ータンパク質の異種エピトープを含有するポリクローナル抗血清は、修正し
ないか又は免疫原性を高めるために修正することができる上記の発現タンパク質
で適当な動物に免疫を与えることによって製造することができる。効果的なポリ
クローナル抗体産生は高原と宿主種の両方に関連した多数の因子によって影響を
うける。例えば、小分子は他の分子より免疫原になりにくい傾向があり、そして
担体やアジュバントの使用を必要とすることがある。更に、宿主動物は接種部位
や投与量に応答して変動し、不適切又は過剰の抗原投与量では低力価の抗血清が
得られる。多数の皮内部位に投与した少量(ngレベル)の抗原は最も信頼性があ
るように思われる。ウサギに対する効乗的な免疫法プロトコールはバイツカイチ
ス ジェイ(Vaitukaitis,J.)等(J.Clin.Metab.33:988〜991(1978年
)に見ることができる。
規則的な間隔でブースター注射を与え、そして半定量法、例えば既知の濃度の
抗原に対する寒天中の二重免疫拡散法によって測定するとき、抗血清の抗体力価
が下降し始めたとき、抗血清を採集することができる。例えば、オウチターロニ
ー オー(Ouchterlony,O)等(Handbook of Experimental Immunology、
Wier D,編集、Blackwell(1973年)中の19章)参照。抗体の高原濃度は通常0
.1〜0.2mg/血清ml(約12μM)の範囲内である。抗原に対する抗血清の親和性
は、例えば、フィッシャー ディ(Fisher D.)(Manual of Clinical Immn
ology、第2版、Rose及びFriedman編集、Amer.Soc.For Microbiology、
ワシントンD.C.(1980年)中の42章)が記載したようにして、競合結合曲線
を作成して測定する。
どちらかのプロトコールに従って調製した抗体製剤は、生物学的
試料中の抗原を有する物質の濃度を測定する定量的イムノアッセイで有用である
; それらはまた、生物学的試料中の抗原の存在を同定するために半定量的に又は
定性的にも使用される。
PCRプライマーの作成及びDNAの増幅
表1(a)及び2に開示されたようなインフルエンザ菌Rdゲノムの種々のフラ
グメントを、多様な用途用のPCRプライマーを作成するために本発明に従って
使用することができる。PCRプライマーは好ましくは少なくとも15塩基、そし
て更に好ましくは少なくとも18塩基の長さであることができる。プライマー配列
を選択するとき、プライマー対は、融点が概ね同一であるように、概ね同一のG
/C比率を有することが好ましい。この実施例のPCRプライマー及び増幅DN
Aには以下の実施例での用途がある。
ORFに対応するDNA配列からの遺伝子発現
表1(a)又は2で提供されるインフルエンザ菌Rdゲノムのフラグメントは、
慣用の技術を使用して発現ベクター中に導入される。(クローン化した配列を、
哺乳動物、酵母、昆虫又は細菌発現系でのタンパク質翻訳を指令する発現ベクタ
ー中に移す技術は当該技術分野で周知である。)市販で入手できるベクター及び
発現系は、ストラタジーン(Stratagene)(カリフォルニア州ラジョラ)、プ
ロメガ(Promega)(ウィスコンシン州マジソン)及びインビトロジェン(Inv
itrogen)(カリフォルニア州サンディエゴ)を含む多様な供給者から入手する
ことができる。所望の場合、発現を高めそして適当なタンパク質の折りたたみを
促進するために、ハットフィールド(Hatfield)等の米国特許第5,082,767号(
これは参照として本明細書に組み入れる)で説明されているようにして、配列の
コドン関連及びコドン対合を特定の発現生物用に最適化することができる。
以下は、ヘモフィルス属のゲノムフラグメントのクローン化ORFからポリペ
プチド(単数又は複数)を発生させる1つの例示的方法として提供する。このO
RFは細菌起源であるためポリA配列を欠いているので、この配列は、例えば、
ポリA配列を添加し、BglI及びSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用し、そ
して真核生物発現系で使用するための哺乳動物ベクターpXT1(Stratagene)
中に導入してpSG5(Stratagene)からスプライシングして構築することがで
きる。pTX1はLTR及びモロニ−マウス白血病ウイルスから得られるgag遺伝
の1部を含有している。構築物中のLTRの位置によって安定なトランスフェク
ションが可能になる。ベクターは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター及
び選択性ネオマイシン遺伝子を含んでいる。ヘモフィルス属のDNAは、ヘモフ
ィルス属のDNAと相補的であるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して細菌
ベクターからPCRによって取得し、そして5'プライマー中に導入されたPstI
用及び対応するヘモフィルス属DNA3'プライマーの5'末端のBglII用の制限
エンドヌクレアーゼ配列を有しており、ヘモフィルス属のDNAが確実にポリA
配列と共に後に続くように注意して配置されている。生じたPCR反応から得ら
れた精製フラグメントをPstIで消化し、エキソヌクレアーゼでブラント末端と
し、BglIIで消化し、精製しそしてpTX1と結合し、今やポリA及び消化された
BglIIを含有している。
結合した産生物は、産生物明細書に概略した条件下でリポフェクチン(Lipof
ectin)(Life Technologies,Inc.、ニューヨーク州グランドアイランド)
を使用してマウスNIH 3T3細胞中にトランスフェクションする。陽性のトラ
ンスフェクション産物は、トランスフェクションした細胞を600μg/mlのG418
(Sigma、ミズーリー州セントルイス)中で増殖させた後に選択する。タンパク
質は好ましくは上清液中に放出される。しかし乍ら、タンパク質が膜結合ドメイ
ンを有している場合、タンパク質は細胞内に保持されるか又
は発現が細胞表面に限定される。
トランスフェクション産物を精製しそして配置しなければならないので、予測
ヘモフィルス属DNA配列から合成された合成15量体ペプチドをマウスに注射し
て、ヘモフィルス属DNAによってコードされているポリペプチドに対する抗体
を発生させる。
抗体産生ができない場合、ヘモフィルスDNA配列を真核発現ベクター中に追
加的に導入し、そして例えば、β-グロビンとのキメラとして発現させる。β-グ
ロビンに対する抗体はキメラを精製するために使用される。次に、β-グロビン
遺伝子とヘモフィルスDNA間で処理された対応するプロテアーゼ開裂部位を使
用して、翻訳後に2つのポリペプチドフラグメントを互いに分離する。β-グロ
ビンキメラ(chimerics)を発生する1つの有用な発現ベクターはpSG5(Strat
agene)である。このベクターはウサギβ-グロビンをコードしている。ウサギβ
-グロビン遺伝子のイントロンIIは発現された転写物のスプライシングを促進し
、そしてこの構築物中に導入されたポリアデニル化シグナルは発現値を高める。
記載したこれらの技術は分子生物学の分野の熟練者には周知である。標準的な方
法はデービス(Davis)(既出か)等のような方法教科書で発表されており、そ
してストラタジーン、ライフテクノロジーインク(Life Technologies,Inc.
)又はプロメガ(Promega)の技術支援代理人から多数の方法を入手することが
できる。ポリペプチドは、インビトロ エクスプレス トランスレーション キッ
ト(ExpressTM Translation Kit)(Stratagene)のようなインビトロ翻訳
系を使用してどちらかの構築物から追加的に産生させることができる。
本発明は明確さ及び理解を目的として幾らか詳細に記載したが、当該技術分野
の熟練者は、様式や詳細における種々の変更が本発明の真の範囲から逸脱するこ
となくなされ得ることを理解するであろう。
上記で言及した特許、特許出願及び刊行物はすべて参照として本
明細書に組み入れる。
脂肪酸/リン脂質代謝
アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ(チオラーゼ)(fadA){クロス
トリジウム・アセトブチリカム}
脂肪酸代謝に含まれるfadR蛋白質(fadR){大腸菌}
(3R)−ヒドロキシミリストールアシル担体蛋白質デヒドラーゼ(fabZ){大
腸菌}
3−ケトアシル−アシル担体蛋白質レダクターゼ(fabG){大腸菌}
アセチル−CoAカルボキシラーゼ(accA){大腸菌}
アシル担体蛋白質(acpP){大腸菌}
アシル−CoAチオエステラーゼII(tesB){大腸菌}
ベーターケトアシル−ACPシンターゼ(fabB){大腸菌}
ベーターケトアシル−アシル担体蛋白質シンターゼIII(fabH){大腸菌}
ビオチンカルボキシル担体蛋白賀(accB){大腸菌}
ビオチンカルボキシラーゼ(accC){大腸菌}
D−3−ヒドロキシデカノイル−(アシル担体蛋白質)デヒドラターゼ(fabA)
{大腸菌}
ジアシルグリセロールキナーゼ(dgkA){大腸菌}
長鎖脂肪酸coAリガーゼ{ホモ・サピエンス}
マロニル補酵素A−アシル担体蛋白質トランスアシラーゼ(fabD酵素{大腸菌
}
短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ同族体(envM){大腸菌}
USG−1蛋白質(usg){大腸菌}
1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(plsC){
大腸菌}
CDP−ジグリセリドシンテターゼ(cdsA){大腸菌}
グリセセール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(plsB){大腸菌}
ホスファチジルグリセロリン酸ホスファターゼB(pgpB){大腸菌}
ホスファチジルグリセロリン酸シンターゼ(pgsA){大腸菌}
ホスファチジルセリンデカルポキシラーゼプロ酵素(psd){大腸菌}
ホスファチジルセリンシンターゼ(pssA){大腸菌}
蛋白質D(hpd){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
プリン類、ピリミジン類、ヌクレオシド類およびヌクレオチド類プリンリボヌク
レオチド生合成
5'−ホスホリボシル−5−アミノ−4−イミダゾールカルボキシラーゼII(pu
rK){大腸菌}
5'−ホスホリボシル−5−アミノイミダゾールシンテターゼ(purM){大腸
菌}
5'グアニル酸キナーゼ(gmk){大腸菌}
アデニル酸キナーゼ(ATP−AMPトランスホスホリラーゼ)(adk){ヘモフ
ィルス・インフルエンゼ}
アデニロコハク酸リアーゼ(purB){大腸菌}
アデニロコハク酸シンテターゼ(purA){大腸菌}
アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(purF){大腸菌}
ホルミルグリシンアミドリボヌクレオチドシンテターゼ(purL){大腸菌}
ホルミルテトラヒドロ葉酸ヒドロラーゼ(purU){大腸菌}
guaA蛋白質(guaA){大腸菌}
イノシン−5'−一リン酸デヒドロゲナーゼ(guaB){アシネトバクター・カル
コアセチカス}
ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(ndk){大腸菌}
ホスホリボシルアミン-グリシンリガーゼ(purD){大腸菌}
ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒サブユニット(pur
E){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ
(purH){大腸菌}
ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ(purN){大腸菌}
ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼ(prsA){ネズミチフス菌}
SAICARシンテターゼ(purC){肺炎棹菌}
ピリミジンリボヌクレオチド生合成
ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ(ジヒドロオロト酸オキシダーゼ)(pyrD)
{大腸菌}
オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ(pyrE){大腸菌}
pyrFオペロンコード付けオロチジン5'−一リン酸(OMP)デカルボキシラ
ーゼ{大腸菌}
pyrF蛋白質(pyrF){大腸菌}
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(pyrR){バシラス・カルドリチ
カス}
2'−デオキシリボヌクレオチド代謝
嫌気性リボヌクレオシド−三リン酸レダクターゼ(nrdD){大腸菌}
デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ(dod){大腸菌}
デオキシウリジントリホスファターゼ(dut){大腸菌}
グルタレドキシン(grx){大腸菌}
nrdB蛋白質(nrdB){大腸菌}
リボヌクレオシド−二リン酸レダクターゼ1アルファ鎖(nrdA){大腸菌}
チオレドキシンレダクターゼ(trxB){大腸菌}
チミジル酸シンテターゼ(thyA){大腸菌}
ヌクレオシド類およびヌクレオチド類の再利用
2',3'−環式−ヌクレオチド2'−ホスホジエステラーゼ(cpdB){大腸菌}
アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(apt){大腸菌}
アデノシオン−テトラホスファターゼ(apaH){大腸菌}
シチジンデアミナーゼ(シチジンアミノヒドロラーゼ)(cda){大腸菌}
シチジル酸キナーゼ(cmk){大腸菌}
シチジル酸キナーゼ(cmk){大腸菌}
プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ(deoD){大腸菌}
チミジンキナーゼ(tdk){大腸菌}
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(upp){大腸菌}
ウリジンホスホリラーゼ(udp){大腸菌}
キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼgpt(xgprt){大
腸菌}
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(xgprt){ネズミ
チフス菌}
推定ATPase(mrp){大腸菌}
糖−ヌクレオチド生合成、変換
5'−ヌクレオチダーゼ(ushA){ホモ・サピエンス}
CMP−NeuNAcシンテターゼ(siaB){髄膜炎菌}
ガラクトース−1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ(galT){ヘモフィル
ス・インフルエンゼ}
グルコースリン酸ウリジルトランスフェラーゼ(galU){大腸菌}
udp−グルコース4−エピメラーゼ(ガラクトワルデナーゼ)(galE){ヘモ
フィルス・インフルエンゼ}
UDP−N−アセチルグルコサミンピロホスホリアーゼ(glmU){大腸菌}
ヌクレオチドおよびヌクレオシド相互変換
デオキシグアノシン三リン酸トリホスホヒドロラーゼ(dgt){大腸菌}
ウリジンキナーゼ(ウリジンモノホスホキナーゼ)(udk){大腸菌}
調節機能
アデニル酸シクラーゼ(cyaA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
嫌気性呼吸調節蛋白質ARCA(DYE耐性蛋白質)(arcA){大腸菌}
嫌気性呼吸調節感知因子蛋白質(arcB){大腸菌}
araC−様転写調節因子{ストレプトマイセス・リピダンス}
アルギニン抑制因子蛋白質(argR){大腸菌}
arsC蛋白質(arsC){プラスミドR773}
ATP−依存性プロテイナーゼ(lon){大腸菌}
ATP:GTP3'−ピロホスホトランスフェラーゼ(relA){大腸菌}
炭素飢餓蛋白質(cstA){大腸菌}
炭素貯蔵調節因子(csrA){大腸菌}
環式AMP受容因子蛋白質(crp){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
環式AMP受容因子蛋白質(crp){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
cysレグロン転写活性化因子(cysB){大腸菌}
第二鉄吸収調節蛋白質(fur){大腸菌}
繊毛転写調節抑制因子(pilB){淋菌}
繊毛転写調節抑制因子(pilB){淋菌}
ホリルポリグルタミン酸−ヒジドロ葉酸シンテターゼ発現調節因子(accD){
大腸菌}
フマル酸(および硝酸)還元調節蛋白質(fnr){大腸菌}
ガラクトースオペロン抑制因子(galS){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
グルコキナーゼ調節因子{ラッタス・ノルペギカス}
グリセロール−3−リン酸ルグロン抑制因子(glpR){大腸菌}
グリセロール−3−リン酸ルグロン抑制因子(glpR){大腸菌}
グリシン切断系転写活性化因子(gcvA){大腸菌}
GTP−結合蛋白質(era){大腸菌}
GTP−結合蛋白質(obg){枯草菌}
過酸化水素−誘導性活性化因子(oxyR){大腸菌}
L−フコースオペロン活性化因子(fucR){大腸菌}
lacZ発現調節因子(icc){大腸菌}
ロイシン応答性調節蛋白質(lrp){大腸菌}
ロイシン応答性調節蛋白質(lrp){大腸菌}
LEXA抑制因子(lexA){大腸菌}
リポオリゴ糖蛋白質(lex2A){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
リポオリゴ糖蛋白質(lex2A){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
metFアポ抑制因子(metJ){大腸菌}
モリブデン輸送系交互ニトロゲナーゼ調節因子(modD){ロドバクター・カプ
スラタス}
msbB蛋白質(msbB){大腸菌}
msbB蛋白質(msbB){大腸菌}
翻訳の負の調節因子(relB){大腸菌}
負のrpo調節因子(mclA){大腸菌}
硝酸感知因子蛋白質(narQ){大腸菌}
硝酸/亜硝酸応答調節因子蛋白質(narP){大腸菌}
窒素調節因子蛋白質P−II(glnB){大腸菌}
五リン酸グアノシン−3'−ピロホスホヒドロラーゼ(spoT){大腸菌}
リン酸レグロン感知因子蛋白質(phoR){大腸菌}
リン酸レグロン転写調節蛋白質(phoB){大腸菌}
推定nadAB転写調節因子(nadR){大腸菌}
プリンヌクレオチド合成抑制因子蛋白質(purR){大腸菌}
推定ムレイン遺伝子調節因子(bolA){大腸菌}
rbs抑制因子(rbsR){大腸菌}
調節蛋白質(asnC){大腸菌}
マルトース代謝に含まれる調節蛋白質sfsl(sfsA){大腸菌}
チトクロームP450用の抑制因子(Bm3R1)巨大菌}
RNAポリメラーゼシグマ−32因子(熱衝撃調節蛋白質F334)(rpoH){
大腸菌}
RNAポリメラーゼシグマ−70因子(rpoD){大腸菌}
RNAポリメラーゼシグマ−E因子(rpoE){大腸菌}
basR用の感知因子蛋白質(basS){大腸菌}
緊縮飢餓蛋白質(sspB){大腸菌}
緊縮飢餓蛋白質A(sspA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
metEおよびmetH用のトランス−活性化因子(m8tR){ヘモフィルス・
インフルエンゼ}
転写活性化因子(tenA){枯草菌}
転写活性化因子蛋白質(ilvY){大腸菌}
転写調節蛋白質(basR){大腸菌}
転写調節蛋白質(tyrR){大腸菌}
トリプトファン抑制因子(trpR){エンテロバクター・アエロゲネス}
uxuオペロン調節因子(uxuR){大腸菌}
キシロースオペロン調節蛋白質(xylR){大腸菌}
複製
DNA=複製、限定/修飾、組み換え
A/G−特異的アデニングリコシラーゼ(mutY){大腸菌}
染色体複製開始因子蛋白質(dnaA){大腸菌}
染色体複製開始因子蛋白質(dnaA){大腸菌}
交差結合エンドデオキシリボヌクレアーゼ(ruvC){大腸菌}
dfp蛋白質(dfp){大腸菌}
DNAアデニンメチラーゼ(dam){大腸菌}
DNAジャイレース、サブユニットA(gyrA){大腸菌}
DNAジャイレース、サブユニットB(gyrB){大腸菌}
DNAヘリカーゼII(urvD){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
DNAリガース(lig){大腸菌}
DNA不適性蛋白質(mutH){大腸菌}
DNA不適性修復蛋白質(mutS){大腸菌}
DNA不適性修復蛋白質MUTL(mutL){大腸菌}
DNAポリメラーゼI(polA){大腸菌}
DNAポリメラーゼIIIベーターサブユニット(dnaN){大腸菌}
DNAポリメラーゼIIIデルタプライムサブユニット(holB){大腸菌}
DNAポリメラーゼIIIデルタサブユニット(holA){大腸菌}
DNAポリメラーゼIIIイプシロンサブユニット(dnaQ){大腸菌}
DNAポリメラーゼIII、アルファ鎖(dnaE){大腸菌}
DNAポリメラーゼIII、chiサブユニット(holC){ヘモフィルス・インフ
ルエンゼ}
DNAポリメラーゼIII、psiサブユニット(holD){大腸菌}
DNAプリマーゼ(dnaG){大腸菌}
DNAリコンビナーゼ(recG){大腸菌}
DNA修復蛋白質(recN){大腸菌}
DNAトポイソメラーゼI(topA){枯草菌}
DNA−3−メチルアデニングリコシダーゼI(tagl){大膓菌}
DNA−依存性ATPase、DNAヘリカーゼ(recQ){大腸菌}
dod蛋白質(dod){セレイシア・マルセッセンス}
用量−依存性dnaK抑制因子蛋白質(dksA){大腸菌}
ホルムアミドピリミジン−DNAグリコシラーゼ(fpg){大腸菌}
グルコース抑制された分割蛋白質(gidA){大腸菌}
グルコース抑制された分割蛋白質(gidB){大腸菌}
Hin組み換え促進因子結合蛋白質(fis){大腸菌}
Hincllエンドヌクレアーゼ(Hincll){ヘモフィルス・インフルエン
ゼ}
Hindlll修飾メチルトランスフェラーゼ(hindlllM){ヘモフィル
ス・インフルエンゼ}
Hindlll制限エンドヌクレアーゼ(hindlllR){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
ホリデイ結合DNAヘリカーゼ(ruvA){大腸菌}
ホリデイ結合DNAヘリカーゼ(ruvB){大腸菌}
インテグラーゼ/リコンビナーゼ蛋白質(xerC){大腸菌}
組み込み宿主因子アルファ−サブユニット(himA){大腸菌}
組み込み宿主因子ベーターサブユニット(IHF−ベータ)(himD){大腸菌}
メチル化された−DNA−蛋白質−システインメチルトランスフェラーゼ(da
tl){枯草菌}
mioC蛋白質(mloC){大腸菌}
修飾メチラーゼHgiDl(MHgiDl){ヘルペトシフォン・アウランチアク
ス}
修飾メチラーゼHincll(hincllM){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
突然変異誘発因子mutT(AT−GC変異){大腸菌}
複製の開始の負の調節因子(seqA){大腸菌}
プライモソーム蛋白質n前駆体(priB){大腸菌}
プライモソーム蛋白質複製因子(priA){大腸菌}
推定ATP−依存性ヘリカーゼ(dinG){大腸菌}
recF蛋白質(recF){大腸菌}
recO蛋白質(recO){大腸菌}
リコンビナーゼ(recA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
組み換え蛋白質(rec2){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
recR蛋白質(recR){大腸菌}
調節蛋白質(recX){シュードモナス・フルオレッセンス}
repヘリカーゼ(rep){大腸菌}
複製蛋白質(dnaX){大腸菌}
複製DNAヘリカーゼ(dnaB){大腸菌}
制限酵素(hgiDIR){ヘルペトシホン・ギガンテウス}
S−アデノシルメチオニンシンテターゼ2(metX){大腸菌}
シャフロン−特異的DNAリコンビナーゼ(rci){大腸菌}
一本鎖DNA結合蛋白質(ssb){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
部位−特異的リコンビナーゼ(rcb){大腸菌}
トポイソメラーゼI(topA){大腸菌}
トポイソメラーゼIII(topB){大腸菌}
トポイソメラーゼIVサブユニットA(parC){大腸菌}
トポイソメラーゼIVサブユニットB(parE){大腸菌}
転写−修復共役因子(trcF)(mfd){大腸菌}
I型制限酵素ecokl特異性蛋白質(hsdS){大腸菌}
I型制限酵素ECOR124/3 1M蛋白質(hsdM){大腸菌}
I型制限酵素ECORI24/3 1M蛋白質(hsdM){大腸菌}
I型制限酵素ECOR124/3 R蛋白質(hsdR){大腸菌}
III型制限−修飾ECOP15酵素(mod){大腸菌}
ウラシルDNAグリコシラーゼ(ung){大腸菌}
xprB蛋白質(xerD){大腸菌}
DNAの分解
エンドヌクレアーゼIII(nth){大腸菌}
エクシヌクレアーゼABCサブユニットA(urvA){大腸菌}
エクシヌクレアーゼABCサブユニットB(urvB){大腸菌}
エクシヌクレアーゼABCサブユニットC(urvC){大腸菌}
エキソデオキシリボヌクレアーゼI(sboB){大腸菌}
エキソデオキシリボヌクレアーゼV(recB){大腸菌}
エキソデオキシリボヌクレアーゼV(recC){大腸菌}
エキソデオキシリボヌクレアーゼV(recD){大腸菌}
エキシヌクレアーゼIII(xthA){大腸菌}
エキシヌクレアーゼVII、大サブユニット(xseA){大腸菌}
一本鎖−DNA−特異的エキソヌクレアーゼ(reoJ){大腸菌}
転写
RNA合成、修飾およびDNA転写
ATP−依存性ヘリカーゼHEPA(hepA){大腸菌}
ATP−依存性RNAヘリカーゼ(srmB){大腸菌}
ATP−依存性RNAヘリカーゼDEAD(deaD){大腸菌}
DNA−依存性RNAポリメラーゼアルファ鎖(rpoA){大腸菌}
DNA−依存性RNAポリメラーゼベータ鎖(rpoB){ネズミチフス菌}
DNA−依存性RNAポリメラーゼベータ鎖(rpoC){大腸菌}
N利用物質蛋白質B(nusB){大腸菌}
プラスミドコビー数調節蛋白質(pcnB){大腸菌}
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ(pnp){大腸菌}
推定ATP−依存性RNAヘリカーゼ(rhlB){大腸菌}
RNAポリメラーゼオメガサブユニット(rpoZ){大腸菌}
シグマ因子(algU){緑膿菌}
転写抗終結因子蛋白質(nusG){大腸菌}
転写延長因子(greB){大腸菌}
転写因子(nusA){ネズミチフス菌}
転写終結因子rho(rho){大腸菌}
RNAの分解
アンチコドンヌクレアーゼ遮断剤(prrD){大腸菌}
エキソリボヌクレアーゼII(RNasell){大腸菌}
リボヌクレアーゼD(md){大腸菌}
リボヌクレアーゼE(me){大腸菌}
リボヌクレアーゼH(mh){大腸菌}
リボヌクレアーゼHII(EC31264)(RNASE HII){大腸菌}
リボヌクレアーゼIII(rnc){大腸菌}
リボヌクレアーゼPH(rph){大腸菌}
RNaseP(mpA){大腸菌}
RNaseT(mt){大腸菌}
翻訳
リボソーム蛋白質一合成・修飾
リボソーム蛋白質L1(rpL1){大腸菌}
リボソーム蛋白質L10(rpL10){ネズミチフス菌}
リボソーム蛋白質L11(rpL11){大腸菌}
リボソーム蛋白質L11メチルトランスフェラーゼ(prmA){大膓菌}
リボソーム蛋白質L13(rpL13){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
リボソーム蛋白質L14(rpL14){大腸菌}
リボソーム蛋白質L15(rpL15){大腸菌}
リボソーム蛋白質L16(rpL16){大腸菌}
リボソーム蛋白質L17(rplQ){大腸菌}
リボソーム蛋白質L18(rpL18){大腸菌}
リボソーム蛋白質L19(rpL19){大腸菌}
リボソーム蛋白質L2(rpL2){大腸菌}
リボソーム蛋白質L20(rpL20){大腸菌}
リボソーム蛋白質L21(rpL21){大腸菌}
リボソーム蛋白質L22(rpL22){大腸菌}
リボソーム蛋白質L23(rpL23){大腸菌}
リボソーム蛋白質L24(rpL24){大腸菌}
リボソーム蛋白質L25(rpL25){大腸菌}
リボソーム蛋白質L27(rpL27){大腸菌}
リボソーム蛋白質L28(rpL28){大腸菌}
リボソーム蛋白質L29(rpL29){大腸菌}
リボソーム蛋白質L3(rpL3){大腸菌}
リボソーム蛋白質L30(rpL30){大腸菌}
リボソーム蛋白質L31(rpL31){大腸菌}
リボソーム蛋白質L32(rpL32){大腸菌}
リボソーム蛋白質L33(rpL33){大腸菌}
リボソーム蛋白質L34(rpL34){大腸菌}
リボソーム蛋白質L35(rpL35){大腸菌}
リボソーム蛋白質L4(rpL4){大腸菌}
リボソーム蛋白質L5(rpL5){大腸菌}
リボソーム蛋白質L6(rpL6){大腸菌}
リボソーム蛋白質L7/L12(rpL7/L12){大腸菌}
リボソーム蛋白質L9(rpL9){大腸菌}
リボソーム蛋白質S1(rpS1){大腸菌}
リボソーム蛋白質S10(rpS10){大腸菌}
リボソーム蛋白質S11(rpS11){大腸菌}
リボソーム蛋白質S13(rpS13){大腸菌}
リボソーム蛋白質S14(rpS14){大腸菌}
リボソーム蛋白質S15(rpS15){大腸菌}
リボソーム蛋白質S15(rpS15){大腸菌}
リボソーム蛋白質S16(rpS16){大腸菌}
リボソーム蛋白質S17(rplQ){大腸菌}
リボソーム蛋白質S18(rpS18){大腸菌}
リボソーム蛋白質S19(rpS19){大腸菌}
リボソーム蛋白質S2(rpS2){大腸菌}
リボソーム蛋白賀S21(rpS21){大腸菌}
リボソーム蛋白質S3(rpS3){大腸菌}
リボソーム蛋白質S4(rpS4){大腸菌}
リボソーム蛋白質S5(rpS5){大腸菌}
リボソーム蛋白質S6(rpS6){大腸菌}
リボソーム蛋白質S6修飾蛋白質(rimK){大腸菌}
リボソーム蛋白質S7(rpS7){大腸菌}
リボソーム蛋白質S8(rpS8){大腸菌}
リボソーム蛋白質S9(rpS9){ヘモフィルス・ソンナス}
リボソーム−蛋白質−アラニンアセチルトランスフェラーゼ(riml){大腸菌}
ストレプトマイシン耐性蛋白質(strA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
アミノアシルtRNAシンテターゼ類、tRNA修飾
アラニル−tRNAシンテターゼ(alaS){大腸菌}
アルギニル−tRNAシンテターゼ(argS){大腸菌}
アスパラギニル−tRNAシンテターゼ(asnS){大腸菌}
アスパルチル−tRNAシンテターゼ(aspS){大腸菌}
cys−tRNAシンテターゼ(cysS){大腸菌}
システイニル−tRNA(ser)セレントランスフェラーゼ(selA){大腸菌}
グルタミニル−tRNAシンテターゼ(glnS){大腸菌}
グルタミル−tRNAシンテターゼ(gltX){大腸菌}
グリシル−tRNAシンテターゼアルファ鎖(glyQ){大腸菌}
グリシル−tRNAシンテターゼベータ鎖(glyS){大腸菌}
ヒスチジン−tRNAシンテターゼ(hisS){大腸菌}
イソロイシル−tRNAリガーゼ(ileS){大腸菌}
ロイシル−tKNAシンテターゼ(leuS){大腸菌}
リシル−tRNAシンテターゼ(lysU){大腸菌}
リシル−tRNAシンテターゼ同族体(genX){大腸菌}
メチオニル−tRNAホルミルトランスフェラーゼ(fmt){大腸菌}
メチオニル−tRNAシンテターゼ(metG){大腸菌}
ペプチジル−tRNAヒドロラーゼ(pth){大腸菌}
フェニルアラニル−tRNAシンテターゼベーターサブユニット(pheS){大
腸菌}
フェニルアラニル−tRNAシンテターゼペーターサブユニット(pheT){大
腸菌}
プロリル−tRNAシンテターゼ(proS){大腸菌}
プソイドウリジル酸シンテターゼI(hisT){大腸菌}
キューオシン生合成蛋白質(queA){大腸菌}
セレン代謝蛋白質(selD){大腸菌}
セリル−tRNAシンテターゼ(serS){大腸菌}
スレオニル−tRNAシンテターゼ(thrS){大腸菌}
転移RNA−グアニントランスグリコシラーゼ(tgt){大腸菌}
tRNA(グアニン−N1)−メチルトランスフェラーゼ(M1G−メチルトラン
スフェラーゼ)(trmD){大腸菌}
tRNA(ウラシル−5−)−メチルトランスフェラーゼ(trmA){大腸菌}
tRNAデルタ(2)−イソベンテニルピロリン酸トランスフェラーゼ(trpX)
{大腸菌}
tRNAヌクレオチジルトランスフェラーゼ(oca){大腸菌}
tRNA−グアニン−トランスグリコシラーゼ(tgt){大腸菌}
トリプトファニル−tRNAシンテターゼ(trpS){大腸菌}
チロシルtRNAシンテターゼ(tyrS){チオバシラス・フェロオキシダンス}
バリル−tRNAシンテターゼ(valS){大腸菌}
核蛋白質
DNA結合蛋白質(推定){枯草菌}
DNA−結合蛋白質(rdgB){エルウィニア・カルトボーラ}
DNA−結合蛋白質H−NS(hns){大腸菌}
DNA−結合蛋白質HU−ALPHA(NS2)(HU−2){大腸菌}
蛋白質−翻訳および修飾
ジスルフィドオキシドレダクターゼ(por){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
DNA処理鎖A(dprA){大腸菌}
延長因子EF−TS(tsf){大腸菌}
延長因子EF−Tu(重複)(tufB){大腸菌}
延長因子EF−Tu(重複)(tufB){大腸菌}
延長因子G(fusA){大腸菌}
延長因子P(efp){大腸菌}
グルタミン酸−アンモニア−リガーゼアデニリルトランスフェラーゼ(glnE)
{大腸菌}
開始因子3(infC){大腸菌}
開始因子IF−1(infA){大腸菌}
開始因子IF−2(infB){大腸菌}
抗生物質MccB17(pmbA)の成熟
メチオニンアミノペプチダーゼ(地図){大腸菌}
オキシド−レダクターゼ(dsbB){大腸菌}
ペプチド鎖放出因子2(prfB){ネズミチフス菌}
ペプチド鎖−放出因子3(prfC){大腸菌}
ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼB(ppiB){大腸掴}
ポリペプチド鎖放出因子1(prfA){ネズミチフス閑}
ポリペプチドデホルミラーゼ(ホルミルメチオニンデホルミラーゼ)(def){大
腸菌}
リボソーム放出因子(frr){大腸菌}
ロタマーゼ、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ(slyD){大腸
菌}
ロタマーゼ、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ(slyD){大腸
菌}
転写延長因子(greA){大腸菌}
翻訳因子(selB){大腸菌}
xprA蛋白質(xprA){大腸菌}
蛋白質、ペプチド類、糖ペプチド類の分解
アミノペプチダーゼA(pepA){リケツチア・プロワツェキィイ}
アミノペプチダーゼa/i(pepA){大腸菌}
アミノペプチダーゼN(pepN){大腸菌}
アミノペプチダーゼP(pepP){大腸菌}
ATP−依存性プロテアーゼ蛋白質分解成分(clpP){大腸菌}
ATP−依存性プロテアーゼATPaseサブユニット(clpX){大腸菌}
ATP−依存性プロテアーゼ結合サブユニット(clpB){大腸菌}
コラゲナーゼ活性コラゲナーゼ(prtC){ポルフィロモナス・ジンジバリス}
HFLC蛋白質(hflC){大腸菌}
lgA1プロテアーゼ(igal){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
lgA1プロテアーゼ(igal){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
lgA1プロテアーゼ(igal){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
lonプロテアーゼ(lon){バシラス・ブレビス}
オリゴペプチダーゼA(priC){大腸菌}
ペプチダーゼD(pepD){大腸菌}
ペプチダーゼE(pepE){大腸菌}
ペプチダーゼT(pepT){ネズミチフス菌}
ペリプラズムセリンプロテアーゼDoおよび熱衝撃蛋白質(htrA){大腸菌}
推定ATP−依存性プロテアーゼ(sms){大腸菌}
プロリンジペプチダーゼ(pepQ){大膓菌}
プロテアーゼ(prtH){ポルフィロモナス・ジンジバリス}
プロテアーゼIV(sppA){大腸菌}
ファージに特異的なプロテアーゼラムダcll抑制因子(hflK){大腸菌}
推定プロテアーゼ(sohB){大腸菌}
シアログリコプロテアーゼ(gcp){パスツレラ・ヘモリチカ}
輸送/結合蛋白賀
アミノ酸類、ペプチド類、アミン類
アルギニン輸送ATP−結合蛋白質artP(artP){大腸菌}
アルギニン輸送系ペルメアーゼ蛋白質(artM){大腸菌}
アルギニン輸送系ペルメアーゼ蛋白質(artQ){大腸菌}
生重合体輸送蛋白質(exbB){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
生重合体輸送蛋白質(exbD){大腸菌}
分枝鎖aa輸送系II担体蛋白質(braB){緑膿菌}
D−アラニンペルメアーゼ(dagA){アルテロモナス・ハロブランクチス}
ジペプチド輸送ATP−結合蛋白質(dppD){大腸菌}
ジペプチド輸送ATP−結合蛋白質(dppF){大腸菌}
ジペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(dppB){大腸菌}
ジペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(dppB){大腸菌}
ジペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(dppC){大腸菌}
グルタミン酸ペルメアーゼ(glts){大腸菌}
グルタミン輸送系ペルメアーゼ蛋白質(glnP){大腸菌}
グルタミン−結合ペリプラズム蛋白質(glnH){大腸菌}
ロイシン−特異的輸送蛋白買(livG){大腸菌}
膜−関連成分、LIV−II輸送系(brnQ){ネズミチフス菌}
糖ペプチド結合蛋白質(oppA){大腸菌}
糖ペプチド結合蛋白質(oppA){大腸菌}
糖ペプチド輸送ATP−結合蛋白質(oppD){ネズミチフス菌}
糖ペプチド輸送ATP−結合蛋白質(oppF){ネズミチフス菌}
糖ペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(oppC)C{ネズミチフス菌}
ペプチド輸送ペリプラズミ蛋白質(sapA){ネズミチフス菌}
ペプチド輸送系ATP−結合蛋白質(sapD){ネズミチフス菌}
ジペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(dppC){大腸菌}
ペプチド輸送系ペルメアーゼ蛋白質(sapB){ネズミチフス菌}
ペリプラズミアルギニン−結合蛋白質(artl){バスツレラ・ヘモリチカ}
プロトングルタミン酸共輸送蛋白質(gltp){バシラス・カルドテナックス}
プトレッシン輸送蛋白質(potE){大腸菌}
セリン輸送因子(sdaC){大腸菌}
スペルミジン/プトレッシン輸送ATP−結合蛋白質(potA){大腸菌}
スペルミジン/プトレッシン系ペルメアーゼ蛋白質(potB){大腸菌}
スペルミジン/プトレッシン系ペルメアーゼ蛋白質(potC){大腸菌}
スペルミジン/プトレッシン系ペルメアーゼ蛋白質(potD){大腸菌}
スペルミジン/プトレッシン系ペルメアーゼ蛋白質(potD){大腸菌}
トリプトファン−特異的ペルメアーゼ(mtr){大腸菌}
チロシン−特異的輸送蛋白質(tyrP){大腸菌}
チロシン−特異的輸送蛋白質(tyrP){大腸菌}
カチオン
パクテリオフェリチンコミグラトリ−蛋白質(bcp){大腸菌}
第二鉄エンテロバクチン輸送ATP−結合蛋白質(fepC){大腸菌}
第二鉄エンテロバクチン輸送ATP−結合蛋白質(fepC){大腸菌}
フェリクロム−鉄受容因子(fhuA){大腸菌}
フェリチン様蛋白質(rsgA){大腸菌}
フェリチン様蛋白質(rsgA){大腸菌}
鉄(III)ジクエン酸輸送ATP−結合蛋白質FECE{大腸菌}
鉄(III)ジクエン酸輸送系ペルメアーゼ蛋白質(fecD){大腸菌}
マグネシウムおよびコバト輸送蛋白質(corA){大腸菌}
主要第二鉄結合蛋白質蛋白質前駆体(fbp){淋菌}
水銀輸送蛋白質(merT){緑膿菌}
水銀スカベンジャー蛋白質(merP){シュードモナス・フルオレッセンス}
水銀スカベンジャー蛋白質(merP){シュードモナス・フルオレッセンス}
モリブデン酸−結合ペリプラズム蛋白質前駆体(modB){アゾトパクター・ビ
ネランジイ}
NA(+)/H(+)対抗輸送1(nhaA){大腸菌}
NA+/H+対抗輸送1(nhaB){大腸菌}
NA+/H+対抗輸送1(nhaC){バシラス・フィルマス}
ペリプラズム−結合−蛋白質−依存性鉄輸送蛋白質(sfuB){セレイシア・マ
ルセッセンス}
ペリプラズム−結合−蛋白質−依存性鉄輸送蛋白質(sfuC){セレイシア・マ
ルセッセンス}
カリウム流出系(kefC){大腸菌}
カリウム/銅−輸送ING ATPase A(copA){エンテロコッカス・フ
ェカリス}
ナトリウム/プロリン共輸送(プロリンペルメアーゼ)(putp){大腸菌}
tonB蛋白質(tonB){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
TRK系カリウム吸収蛋白質(trkA){大腸菌}
炭水化物類、有機アルコール類および酸類
2−オキソグルタル酸/マレイン酸転位因子(SODiT1){スピナシア・オレ
ラセア}
D−ガラクトース−結合ペリプラズム蛋白質(mglB){大腸菌}
D−キシロース輸送ATP−結合蛋白質(xylG){大腸菌}
D−キシロース−結合ペリプラズム蛋白質(rbsB){大腸菌}
酵素1(PtS1){ネズミチフス菌}
蟻酸輸送因子(蟻酸経路){大腸菌}
フルクトース−ペルメアーゼIIA/FPR成分(fruB){大腸菌}
フルクトース−ペルメアーゼIIBC成分(fruA){大腸菌}
フコースオペロン蛋白質(fucU){大腸菌}
glpF蛋白質(glpF){大腸菌}
glpF蛋白質(glpF){大腸菌}
グルコン酸ペルメアーゼ(gntP){枯草菌}
グルコースホスホトランスフェラーゼ酵素III−glc(crr){大腸菌}
グリセロール−3−ホスファターゼ輸送因子(glpT){大腸菌}
高親和性リボース輸送蛋白質(rbsA){大腸菌}
高親和性リボース輸送蛋白質(rbsC){大腸菌}
高親和性リボース輸送蛋白質(rbsD){大腸菌}
L−フコースペルメアーゼ(fucP){大腸菌}
L−乳酸ペルメアーゼ(lctp){大腸菌}
ラクタム利用蛋白質(lamB){エメリセラ・ニデュランス}
mglA蛋白質(mglA){大腸菌}
mglC蛋白質(mglC){大腸菌}
ペリプラズムリボース−結合蛋白質(rbsB){大腸菌}
ホスホヒスチジノ蛋白質−ヘキソースホスホトランスフェラーゼ(ptsH){大
腸菌}
カリウム経路同族体(kch){大腸菌}
推定アスパラギン酸輸送蛋白質(dcuA){大腸菌}
推定アスパラギン酸輸送蛋白質(dcuA){大腸菌}
リボース輸送ペルメアーゼ蛋白質(xylH){大腸菌}
ナトリウム−および塩化物−依存性GABA輸送{ホモ・サビエンス}
ナトリウム−依存性ノラドレナリン輸送{ホモ・サビエンス}
ヌクレオシド類、プリン類およびピリミジン類
リボヌクレオチド輸送ATP−結合蛋白質(mkl){癩菌}
ウラシルペルメアーゼ(uraA){大腸菌}
アニオン
システインシンテターゼ(cysZ){大腸菌}
親水性の膜−結合された蛋白質(modC){大腸菌}
疎水性の膜−結合された蛋白質(modB){大腸菌}
組み込み膜蛋白質(pstA){大腸菌}
硝酸輸送ATPase成分(nasD){肺炎棹菌}
周囲膜蛋白質B(pstB){大腸菌}
周囲膜蛋白質c(pstC){大腸菌}
ペリプラズムリン酸−結合蛋白質(pstS){大腸菌}
ペリプラズムリン酸−結合蛋白質(pstS){大腸菌}
リン酸ペルメアーゼ(YBR296C){サッカロミセス・セレビシエ}
その他
ATP依存性転位因子同族体(msbA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
ATP−結合蛋白質(abc){大腸菌}
膿胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンス調節因子{ボス・タウラス}
ヘム−結合リボ蛋白質(dppA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
ヘム−ヘモペキシン−結合蛋白質(hxuA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
ヘミンペルメアーゼ(hemU){エルニシア・エンテロコリチカ}
高親和性コリン輸送蛋白質(betT){大腸菌}
ラクトフェリン結合蛋白質(lbpA){髄膜炎菌}
Na+/硫酸共輸送因子{ラッツス・ノルベギカス}
パントテン酸ペルメアーゼ(panF){大腸菌}
トランスフェリン結合蛋白質1前駆体(tbp1){髄膜炎菌}
トランスフェリン結合蛋白質1前駆体(tbp1){髄膜炎菌}
トランスフェリン結合蛋白質1前駆体(tbp1){髄膜炎菌}
トランスフェリン結合蛋白質2前駆体(tbp2){髄膜炎菌}
トランスフェリン−結合蛋白質(tfbA){アクチノバシラス・プレウロニュー
モニエ}
トランスフェリン−結合蛋白質1(tbp1){髄膜炎菌}
トランスフェリン−結合蛋白質1(tbp2){髄膜炎菌}
輸送ATP−結合蛋白質(cydD){大腸菌}
輸送ATP−結合蛋白質(cydD){大腸菌}
細胞処理
チャペロン類
チャペロニン(groES)(mopB){大腸菌}
熱衝撃蛋白質(groEL)(mopA){ヘモフィルス・ジュクレイ}
熱衡撃蛋白質(dnaJ){大腸菌}
熱蛋白質c62.5(htpG){大腸菌}
hsc66蛋白質(hsc66){大腸菌}
hsp70蛋白質(dnaK){大腸菌}
細胞分裂
細胞分裂ATP−結合蛋白質(ftsE){大腸菌}
細胞分裂抑制因子(sulA){ビブリオ・コレレ}
細胞分裂蛋白質(ftsA){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsH){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsH){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsJ){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsL){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsQ){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsW){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsY){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(ftsZ){大腸菌}
細胞分裂蛋白質(mukB){大腸菌}
細胞質軸フィラメント蛋白質(cafA){大腸菌}
ftsX蛋白質(ftsX){大腸菌}
mukB抑制因子蛋白質(smbA){大腸菌}
ペニシリン−結合蛋白質3(ftsl){大腸菌}
蛋白質、ペプチド分泌
GTP−結合膜蛋白質(lepA){大腸菌}
コリシンV分泌ATP−結合蛋白質(cvaB){大腸菌}
リボ蛋白質シグナルペプチダーゼ(lspA){大腸菌}
ペプチド輸送系ATP−結合蛋白質SAPF(sapF){大腸菌}
プレ蛋白質トランスロカーゼ(secE){大腸菌}
プレ蛋白質トランスロカーゼSECYサブユニット(secY){大腸菌}
蛋白質−輸送膜蛋白質(secD){大腸菌}
蛋白質−輸送膜蛋白質(secF){大腸菌}
蛋白質−輸送膜蛋白質(secG){大腸菌}
蛋白質−輪送蛋白質(secB){大腸菌}
secA蛋白質(secA){大腸菌}
シグナルペプチダーゼI(lepB){大腸菌}
シグナル認識粒子蛋白質(54同族体)(ffh){大腸菌}
始動因子(tig){大腸菌}
4型プレピリン−様蛋白質特異的リーダーペプチダーゼ(hopD){大腸菌}
xopS蛋白質(xcpS){シュードモナス・ビュチダ}
解毒
KW20カタラーゼ(hktE){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
スーパーオキシドジスムターゼ(sodA){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
チオフェンおよびフラン酸化蛋白質(thdF){大腸菌}
細胞死滅
ヘモリシン(tlyc){セルプリナ・ヒオジセンテリエ}
ヘモリシン、21kDa(hly){アクチノバシラス・プロウロニューモニエ}
死滅蛋白質(kicA){大腸菌}
死滅蛋白質抑制因子(kicB){大腸菌}
ロイコトキシン分泌ATP−結合蛋白質(lktB){アクチノバシラス・アクチ
ノミセテンコミタンス}
転換
com101A蛋白質(comF){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
反応遺伝子座E(comE1){枯草菌}
tfoX蛋白質(tfoX){ヘモフィルス・インフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_1)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_10)(com){ヘモフィルス・
インフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_2)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_3)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_4)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_5)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_6)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_7)(com){ヘモフィルス・イ
ンフルエンゼ}
他の階級
コリシン−関連機能
コリシン耐性蛋白質(tolB){大腸菌}
コリシンV生産蛋白質(purレグロン)(cvpA){大腸菌}
内膜蛋白質(tolQ){大腸菌}
内膜蛋白質(tolR){大腸菌}
外膜組み込み蛋白質(tolA){大腸菌}
外膜組み込み蛋白質(tolA){大腸菌}
ファージー関連機能およびブロファージ類
E16蛋白質(muE16){バクテリオファージmu}
G蛋白質(muG){バクテリオファージmu}
G蛋白質(muG){バクテリオファージmu}
gam蛋白質{バクテリオファージmu}
熱衝撃蛋白質B253(grpE){大腸菌}
宿主因子−l(HF−l)(hfq){大腸菌}
I蛋白質(mul){バクテリオファージmu}
MuB蛋白質(muB){バクテリオファージmu}
N蛋白質(muN){バクテリオファージmu}
P蛋白質{バクテリオファージmu}
ターミナーゼサブユニット1{バクテリオファージSF6}
トランスポザーゼA(muA){バクテリオファージmu}
トランスポゾン−関連機能
挿入配列IS1016(V−4)仮定蛋白質(GB:X58176_2){ヘモフィ
ルス・インフルエンゼ}
IS1016−V6蛋白質(IS1016−V6){ヘモフィルス・インフルエン
ゼ}
IS1016−V6蛋白質(IS1016−V6){ヘモフィルス・インフルエン
ゼ}
IS1016−V6蛋白質(IS1016−V6){ヘモフィルス・インフルエン
ゼ}
薬品/同族体感受性
アクリフラビン耐性蛋白質(acrB){大腸菌}
ampDシグナル用蛋白質(ampD){大腸菌}
ビシクロマイシン耐性蛋白質(bor){大腸菌}
水銀耐性調節蛋白質(merR2){チオバシラス・フェロオキダンス}
薬品活性の調節因子(mda66){大腸菌}
複合薬品耐性蛋白質(emrB){大腸菌}
複合薬品耐性蛋白質(emrA){大腸菌}
複合薬品耐性蛋白質(mdl){大腸菌}
結節蛋白質T(nodT){リゾビウム・レグミノサラム}
rRNA(アデノシン−N6,N6−)−ジメチルトランスフェラーゼ(ksgA){
大腸菌}
テルル酸耐性蛋白質(tehA){大腸菌}
テルル酸耐性蛋白質(tehB){大腸菌}
放射感受性
radC蛋白質(radC){大腸菌}
適応、非定型条件
自家成長蛋白質(aut){アルカリゲネス・ユートロファス}
熱衝撃蛋白質(htpX){大腸菌}
熱衝撃蛋白質B(ibpB){大腸菌}
htrA−様蛋白質(htrH){大腸菌}
侵入蛋白質(invA){バルトネラ・バシリホルミス}
NAD(P)H:メナジオンオキシドレダクターゼ{ムス・ムスクラス}
生存蛋白質(surA){大腸菌}
uspA蛋白質(uspA){大腸菌}
ビルレンスプラスミド蛋白質(vagC){サルモネラ・ダブリン}
ビルレンス関連蛋白質A(vapA){ジケロバクター・ノドサス}
ビルレンス関連蛋白賀C(vapC){ジケロバクター・ノドサス}
ビルレンス関連蛋白質C(vapC){ジケロバクター・ノドサス}
ビルレンス関連蛋白質D(vapD){ジケロバクター・ノドサス}
ビルレンスプラスミド蛋白質(mlgA){シェワネラ・コルワリアナ}
未同定
15kDa蛋白質(P15){大腸菌}
2−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼス同族体(ddh){ジモモナス・モビリス}
ベータ−ラクタマーゼ調節同族体(mazG){大腸菌}
接合伝達補抑制因子(finO){大腸菌}
デルタ−1−ピロリン−5−カルボキシル酸レダクターゼ(proC){緑膿菌}
devA蛋白質(devA){アナベナ種}
devB蛋白質(devB){アナベナ種}
胚富裕蛋白質、3群{トリチカム・エスチバム}
遺伝子外抑制因子(suhB){大腸菌}
GCPE蛋白質(蛋白質E)(gpcE){大腸菌}
GerC2蛋白質(gerC2){枯草菌}
glpX蛋白質(glpX){大腸菌}
グリオキシル酸−誘導蛋白質{大腸菌}
hslU蛋白質(hslU){大腸菌}
hslV蛋白質(hslV){大腸菌}
ilv−関連蛋白質{大腸菌}
イソコリスミ酸シンターゼ(entC){枯草菌}
膜関連ATRase(cbiO){プロピオニバクテリウム・ロイデンレイチイ}
膜蛋白質(lapB){バステウレラ・ヘモリチカ}
膜蛋白質(lapB){バステウレラ・ヘモリチカ}
N−カルバミル−L−アミノ酸アミドヒドロラーゼ{バシラス・ステアロサーモ
フィラス}
窒素固定蛋白質(nifS){アナベナ種}
窒素固定蛋白質(nifS){ミコバクテリウム・レプレ}
窒素固定蛋白質(nifS){ミコバクテリウム・レプレ}
窒素固定蛋白質(nifU){肺炎棹菌}
窒素固定蛋白質(nnfE){ロードバクター・カプサラタス}
窒素固定蛋白質(nnfE){ロードバクター・カプサラタス}
ナイトロゲナーゼC(nifC){クロスチリジウム・パステウリアナム}
ナイトロゲナーゼC(nifC){クロスチリジウム・パステウリアナム}
nmt1蛋白質(nmt1){アスペルギルス・パステウリアナム}
分配系蛋白質(parB){プラスミドRP4}
rarD蛋白質(rarD){大腸菌}
rarD蛋白質(rarD){大腸菌}
skp蛋白質(skp){パステウレラ・マルトシダ}
小蛋白質(smpB){大腸菌}
spolllE蛋白質(spolllE){コキシエラ・プメチイ}
抑制因子蛋白質(msgA){大腸菌}
サーファクチン(sfpo){枯草菌}
toxRレグロン(tagD){ビブリオ・コレレ}
traN蛋白質(traN){プラスミドRP4}
輸送ATP−結合蛋白質(cydC){大腸菌}
輸送ATP−結合蛋白質(cydC){大腸菌}
vanH蛋白質(vanH){トランスポソンTn1546}
粘液状態遺伝子座蛋白質(mucB){緑膿菌}
フェノールヒドロキシラーゼ(ORF6){アシネトバクター・カルコアセチカス}
プラズマプロテアーゼC1抑制因子{ホモ・サピエンス}
既知
ATP依存性転位同族体(msbA)
外膜蛋白質P2(ompP2)
一本鎖DNA結合蛋白質(ssb)
tonB蛋白質(tonB)
ヘム−ヘモペキシン−結合蛋白質(hxuA)
アデニル酸キナーゼ(ATP−AMPトランスホスホリラーゼ)(adk)
仮定蛋白質(SP:P24326)
udp−グルコース4−エピメラーゼ(ガラクトワルデナーゼ)(galE)
仮定蛋白質(SP:P24324)
PC蛋白質(15kdペプチドグリカン−関連外膜リボ蛋白質)(pal)
外膜蛋白質P1(ompP1)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_7)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_6)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_5)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_4)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_3)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_2)(com)
転換遺伝子群仮定蛋白質(GB:M62809_1)(com)
Hinollエンドヌクレアーゼ(Hincll)
修飾メチラーゼHincll(hincllM)
リポオリゴ糖生合成蛋白質
ストレプトマイシン耐性蛋白質(strA)
リコンビナーゼ(recA)
tfoX蛋白質(tfoX)
アデニル酸シクラーゼ(cyaA)
28kDa膜蛋白質(hlpA)
蛋白質D(hpd)
リボ蛋白質(hel)
アルドース1−エピメラーゼ前駆体(ムタロターゼ)(mro)
ガラクトキナーゼ(galK)
ガラクトース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(galT)
ガラクトースオペロン抑制因子(galS)
仮定蛋白質(GB:M94205_1)
ジスルフィドオキシドレダクターゼ(por)
ヘム−結合リボ蛋白質(dppA)
保護表面抗原D15
KW20カタラーゼ(hktE)
環式AMP受容因子蛋白質(crp)
スーパーオキシドジスムターゼ(sodA)
外膜蛋白質P5(ompA)
DNAヘリカーゼII(uvrD)
Hindlll修飾メチルトランスフェラーゼ(hindlllM)
Hindlll制限エンドヌクレアーゼ(hindlllR)
DNAポリメラーゼIII、chiサブユニット(holC)
lic−1オペロン蛋白質(licC)
lic−1オペロン蛋白質(licD)
15kdペプチドグリカン−関連リボ蛋白質(1pp)
ホルミルテトラヒドロ葉酸ヒドロラーゼ(purU)
エノールピルビルシキム酸リン酸シンターゼ(aroA)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_8)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_7)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_6)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_5)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_4)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_3)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_2)
lsg遺伝子座仮定蛋白質(GB:M94855_1)
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12R 1:91)
C07K 16/08
(31)優先権主張番号 08/487,429
(32)優先日 1995年6月7日
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ,
DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I
S,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,S
D,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,TT
,UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 フレイシュマン,ロバート・ディ
アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ
イザーズバーグ、チフリー・スクエア・ロ
ード470番
(72)発明者 アダムス,マーク・ディ
アメリカ合衆国20878メリーランド州 ノ
ース・ポトマック、ダフィーフ・ドライブ
15205番
(72)発明者 ホワイト,オーウェン
アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ
イザーズバーグ、クィンス・オーチャー
ド・ブールバード886番 アパートメン
ト・ナンバー 202
(72)発明者 スミス,ハミルトン・オー
アメリカ合衆国21204メリーランド州 タ
ウソン、カーブリッジ・サークル8222番
(72)発明者 ベンター,ジェイ・クレイグ
アメリカ合衆国20854メリーランド州 ポ
トマック、グレン・ミル・ロード11915番