JPH11504332A

JPH11504332A - 白血病抑制因子およびエンドテリンアンタゴニストの用途

Info

Publication number: JPH11504332A
Application number: JP8532613A
Authority: JP
Inventors: フェラーラ，ナポレオン; キング，キャスリーン; ルイス，エリザベス・エイ; マザー，ジェニー・ピー; パオニ，ニコラス・エフ
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-04-24
Filing date: 1996-04-17
Publication date: 1999-04-20
Also published as: DE69626510D1; DK0830143T3; EP1287832A2; ZA963274B; EP0830143A1; AU5665896A; CA2214636C; IL117998A0; ATE313333T1; ES2254564T3; DE69626510T2; DE69635630T2; DK1287832T3; CA2214636A1; EP0830143B1; MX9707939A; ATE233570T1; IL117998A; AU702375B2; EP1287832A3

Abstract

(57)【要約】白血病抑制因子アンタゴニストは単独またはエンドテリンアンタゴニストと組み合わせて心不全の処置のために用いられ得る。この目的を達成するために、アンタゴニストは治療的有効量を慢性的に投与される。

Description

【発明の詳細な説明】白血病抑制因子およびエンドテリンアンタゴニストの用途発明の背景発明の分野本発明は心臓疾患の処置における心機能の調節方法に関する。発明の背景約３００万人のアメリカ人が心不全におかされており、毎年４０万人が発病している。現在ではアメリカにおける主要な認可診断の１種である。急性心筋梗塞を含む急性心臓疾患の処置における最近の進歩はいずれ慢性の心不全を発病するであろう患者人口にまで拡大している。現在の心不全の治療は主としてアンギオテンシン変換酵素（Angiotensin-conv erting enzyme:ＡＣＥ）阻害剤および利尿剤の使用であった。心不全の処置に長期に用いられてきたが、ＡＣＥ阻害剤は心不全末期への進行を遅らせると考えられており、ＡＣＥ阻害剤の患者の大多数は機能第III期心不全である。さらに、ＡＣＥ阻害剤は６０％以上の心不全患者の症状を持続的に緩解することは不可能であり、約１５−２０％のみが心不全死を減少させると考えられている。心臓移植は提供される心臓の入手によって制限される。さらに、ジゴキシンを除いて、筋変力陽性剤の慢性投与は有効な薬物にかならず不利な副作用、例えば、不整脈、突然死または生死に関連する他の有害な副作用をもたらす。現在の治療におけるこれらの欠点は別の治療手段の必要性を示唆している。大量のデータは心不全の処置における心筋の病的肥大が有害であり得ることを示唆しており、心室の拡大、心壁の緊張／圧迫、心筋細胞の縦対横の比の増大および心臓の動きおよび機能に伴う減退を特徴とする。事実、ＡＣＥ阻害剤の作用は心臓に負担をかけないばかりか、心筋層内の局部的レニン−アンギオテンシン系に関係すると予想されている病的肥大応答を阻害すると主張されてきた。細胞レベルでは、心臓は筋細胞と非−筋細胞と称される周囲の支持細胞のシンシチウムとして機能する。非筋細胞は本質的に線維芽細胞／間葉細胞であるが、内皮および平滑筋細胞も含む。実際、筋細胞は成人心筋肉の大部分を構成しているが、心臓に存在する総細胞数の約３０％のみである。インビボの心臓筋細胞に密接に関連するために、非−筋細胞は筋細胞の成長および／または発達に影響を与え得る。この相互作用は細胞−細胞の接触によって直接的にまたはパラクリン因子によって間接的に伝達される。非−筋細胞数およびそれらが相互に作用する細胞外マトリックスの両方が心筋肥大においておよび損傷および梗塞に応答して増加することから、インビボのこの関係は重要である。これらの変化は異常な心筋機能に関連している。心筋細胞は誕生直後に分化し得ない。さらなる成長は各細胞の肥大によって行われる。筋細胞肥大の細胞培養モデルはよく研究されおり、心臓筋細胞肥大のメカニズムより解明されている。シンプソンら、Circ．Res.，51:787-801(1982)；チャンら、FASEB J.，5:3037-3046(1991)。培地中の心臓筋細胞の研究の多くは非−筋細胞による汚染を最小化に関するものである。例えば、シンプソンおよびサビヨン、Cir．Cres.，50:101-116(1982)；リビイ、J．Mol．Cell．Cardiol.， 16:803-811(1984); イワキら、J．Biol．Chem.，265:13809-13817(1990)。成人心臓心室筋細胞の肥大は慢性的過剰負荷に至る種々の症状に対する１種の反応である。この反応は筋細胞の大きさ、および共存細胞の分裂を伴わない収縮性蛋白含有量の増加、および心房のナトリウム排泄増加性ペプチド（atrial nat riuretic peptide：ＡＮＰ）の遺伝子を含む胎芽遺伝子の活性化を特徴とする。チャンら、上掲。成人筋細胞肥大は、主として各筋肉線維の負担の減少を可能にすることによって、悪化した心臓機能に対する短期的反応として有効である。過酷で長期の負荷については、しかしながら、肥大細胞は悪化し死滅し始める。カッツ、「心臓疾患」、カッツＡＭ編集、Physiology of the Heart（New York:Ra ven Press;1992）pp.638-668。内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞／間葉細胞は心臓で筋細胞のごく近くに存在する。ナグ、Cytobios.，28:41-61(1980)。インビトロの研究では、これらの「非−筋細胞」支持細胞によって産生されるパラクリン因子が肥大に関与しているかもしれないことを示唆している。このような因子の確認が心臓生態学および薬物における主要な研究として残されている。チャンら、Science，260:9 16-917(1993)。また、この重要な生理学的反応を伝達し得る新規な活性体の分離および定性のための心筋細胞肥大に関するインビトロ試験系の利用に関して、チャンら、Annu．Rev．Physiol.，S5:77-95(1993)。肥大およびその原因の研究のために細胞培養モデルの開発が行われてきた。すなわち、例えば、全能マウス胎芽幹細胞は、線維芽細胞のフィーダー層の不存在下または白血病阻害因子（ＬＩＦ）の除去下で培養したとき、多細胞の嚢胞性胎芽様体に分化する。ロビンら、J．Biol．Chem.，265:11905-11909(1990)。これらの胎芽様体は心臓の特定のマーカーを攻撃し、提示し（ロビンら、上掲、デチュマンら、J．Embryol．Exp．Morphol.，87:27-45[1985]；ミラー−ハンスら、J ．Biol．Chem.，268:25244-25252[1993]）、これらはインビトロ肥大反応を誘発し得る因子の有効な資源として役立つかもしれない。チャン、Science、上掲；ミラー−ハンスら、上掲。さらに、ロングら、Cell Reg.，2:1081-1095(1991)、は培養新生児ラット心臓非筋細胞、これは本来的には線維芽様細胞であるが、インビトロ心臓筋細胞の肥大を誘導する未確認蛋白を産生することを発見した。ヘパリン−セファローズに結合したこの因子はホスホイノシトール加水分解を刺激せず、４５−５０ｋＤのみかけの分子量を有していた。血小板ー誘導成長因子、腫瘍壊死因子α、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子および形質転換成長因子β１に対する抗血清を中和する実験により、これらの成長因子は候補としての可能性から除去された。エンドテリンはインビトロおよびインビボの両方で心臓中の細胞に作用することが示されている。インビボのエンドテリンは、正常および疾患性の心臓の心房および心室の心筋中の両方に存在しており、心筋の変力性活性、心臓中の血管の平滑筋増殖および冠状血管収縮を増強する。ウエイら、Circulation，89:1580-1 586(1994)。インビトロエンドテリンは、培養成人心臓心筋細胞中の多種の細胞 −信号経路を刺激する。ヒラル−ダンダンら、Mol．Pharm.，45:1183-1190(1994 )；ジョーンズら、Am．J．Physiol.(Heart Circ．Physiol．32)263:H1447-H1454 [1992]。数人の研究者はエンドテリン−１、これは内皮細胞中に産生されることが知られているが、インビトロの心臓筋細胞の肥大を誘発することが知られている。スベイタら、J．Biol．Chem.，265:20555-20562(1990)、イトーら、Circ Res.， 69:209-215(1991)、スズキら、J．Cardiovasc．Pharmacol.，17 Suppl 7:S182-S 186(1991)。１９９４年９月６日発行Ｕ.Ｓ.特許第５,３４４,６４４号も参照。ＬＩＦはまた、その具体的な活性または作用によって、白血球阻害因子、分化誘導因子（ＤＩＦ、Ｄ−因子）、肝細胞刺激因子（ＨＳＦ−II、ＨＳＦ−III）および黒色腫誘導ＬＰＬ阻害剤（ＭＬＰＬＩ）としても知られている（ヒルトンら、J．Cell．Biochem.，46:21-26[1991]）が、筋細胞および非筋細胞の両方でのラット新生児心臓細胞培養物からコリン作動性ニューロン分化因子（ＣＤＦ）として確認された。ヤマモリら、Science，246:1412-1416(1989)。さらに、ＬＩＦは、心筋梗塞および虚血性組織の保護を含む、反応性酸素種の有害作用の防護、阻害および予防に有効であることが判明した。Ｕ.Ｓ.特許第５,３７０,８７０号。最終的にＬＩＦおよび、ＧＨ／サイトカイン受容体に結合する蛋白類の別の物質であるカルジオトロフィン−１は培養物中の新生児ラット心臓筋細胞に対して蛋白類のうちで最も高い肥大活性を示し、そしてまたそれらは類似の形態特徴を示す。ペニカら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:1142-1146(1995)。発明の要約今回の発明によって、非−筋細胞が、ＬＩＦおよびエンドテリンとして同定されている肥大因子を産生することが判明した。従って、本発明の１つの態様は、肥大を阻害または軽減するために心不全歴のある哺乳動物を処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物にＬＩＦアンタゴニストの治療的有効量を慢性的に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、肥大を阻害または軽減するために心不全歴のある哺乳動物を処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物にＬＩＦアンタゴニストおよびエンドテリンアンタゴニストの治療的有効量を慢性的に投与することを含む方法を提供する。さらなる態様において、本発明は医薬的に許容され得る担体とともに、ＬＩＦアンタゴニストおよびエンドテリンアンタゴニストを含む医薬組成物を提供する。図面の簡単な説明図１は、培養ラット新生児の心臓筋細胞の大きさに対する、新生児ラットからの非−筋細胞−調整培地（ＮＣＭ）の効果を肥大度およびＡＮＰ産生量によって表したものである。筋細胞はＮＣＭで４８時間処理した。培養培地をＡＮＰについて試験し（Ｆig．１Ｂ）、細胞を結晶性バイオレットによって染色し、肥大を測定した（Ｆig．１Ａ）。未処理対照には３点をつけ、最大肥大細胞に７点をつけた。データは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。図２は、ラット新生児の心臓ＮＣＭにおける肥大活性の経時的な観察を示す。継代−１ラット新生児心臓非筋細胞は１０％血清含有培地中で５日間培養され、ついで、血清無含有培地で２回洗浄された。試験培地を添加し、所定時間の培養後一部を採取した。データは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。図３は、ラット新生児心臓ＮＣＭにより誘導された筋細胞肥大に対する、ＢＱ −１２３、ＬＩＦモノクローナル抗体（Ｍab）Ｄ６２.３.２およびそれらの組み合わせの効果を示す。筋細胞はＮＣＭ（黒丸）、ＮＣＭおよび１００μモル／ＬＢＱ−１２３（白丸）、ＮＣＭおよび５０μｇ／ｍＬＬＩＦＭabＤ６２.３. ２（白四角）、および１００μモル／ＬＢＱ−１２３および５０μｇ／ｍＬＬＩＦＭabＤ６２.３.２（白三角）で処理した。培養培地はＡＮＰについて試験され（Ｆig．３Ｂ）、細胞は染色され、肥大を点数で示した（Ｆig．３Ａ）。Ｆ ig．３Ａのデータは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。*ｐ＜０.０５値は共変数分析による。Ｆｉｇ．３Ｂのデータは３連で行われ、２連で測定された１回の実験を示す。図４は、エンドテリン−１、マウスＬＩＦ、フェニルエフリン、およびＣＴ− １によって誘導された心臓筋細胞肥大に対するＢＱ−１２３の効果を示す。培養ラット新生児心臓筋細胞は、エンドテリン−１（ａ）、マウスＬＩＦ（ｂ）、フェニルエフリン（ｃ）およびＣＴ−１（ｄ）の存在下、０μモル／Ｌ（黒丸）、１００μモル／Ｌ（白丸）、１０μモル／Ｌ（白四角）および１μモル／Ｌ（白三角）のＢＱ−１２３で処理された。データは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。図５は、エンドテリン−１、マウスＬＩＦ、フェニルエフリン、およびＣＴ− １によって誘導された心臓筋細胞肥大に対するＬＩＦＭabＤ６２.３.２の効果を示す。培養ラット新生児心臓筋細胞は、エンドテリン−１（ａ）、マウスＬＩＦ（ｂ）、フェニルエフリン（ｄ）およびＣＴ−１（ｅ）の存在下、０μｇ／ｍＬ（黒丸）、５０μｇ／ｍＬ（白丸）、５μｇ／ｍＬ（白四角）および０.５μｇ／Ｌ（白三角）のＬＩＦＭａｂＤ６２.３.２で処理された。データは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。図６は、培養新生児ラット心臓筋細胞肥大およびＡＮＰ産生に対するＬＩＦおよびエンドテリンの効果を示す。筋細胞はマウスＬＩＦ（白丸）、エンドテリン −１（黒丸）およびマウスＬＩＦとエンドテリン−１の組み合わせ（黒三角）で処理した。試験培地はＡＮＰ（Ｆig．６Ａ）について試験され、結晶性バイオレットで染色され、細胞の大きさについて点数が付けられた（Ｆig．６Ｂ）。データは２連で行われ、２連で測定された３回の実験の平均値および標準誤差を示す。ＬＩＦおよびエンドテリンの組み合わせの濃度は各試剤の濃度をたして測定された。好ましい具体例の詳細な説明１．定義一般的に、詳細な説明、実施例および請求の範囲で用いられる場合は、下記の用語または語句は定義された意味を有する：この明細書で用いられる「ＬＩＦアンタゴニスト」および「エンドテリンアンタゴニスト」は、ＬＩＦまたはエンドテリンとそれらの各受容体間の相互作用を遮断または阻害するなんらかの分子を意味する。このようなアンタゴニストは種々の方法でこの作用を示す。例えば、ある種のアンタゴニストは、十分な親和性と特異性をもって、ＬＩＦまたはエンドテリンに結合し、それぞれの受容体がなんら作用しないようにＬＩＦまたはエンドテリンを中和する。別の種類のアンタゴニストはＬＩＦまたはエンドテリンおよびそれらの各受容体間の相互作用に基づく分子である。このような分子は、ＬＩＦまたはエンドテリン受容体のフラグメント、または小さい有機化学分子を含む、例えば、各受容体とＬＩＦまたはエンドテリン間の相互作用を阻害するペプチド類似体である。ＬＩＦは、例えば、メトカーフ、Growth Factors，7:169-173(1992)およびクルツロックら、Endocri ne Reviews，12:208-217(1991)に記載されている。ＬＩＦ受容体の活性化は細胞間のチロシンキナーゼを刺激することが知られている。キシモトら、Science，2 58:593-597(1992)。いくつかの研究所は、培養中の線維芽細胞がＬＩＦを産生し得ることを示した（エリアスら、Am．J．Physiol.(Lung Cell．Mol．Physiol．1 0)266:L426-L435[1994]、ロレンツォら、Clin．Immunol．Immunopath.，70:260- 265[1994]、ハミルトンら、J．Immunol.，150:1496-1502[1993]）。３種のエンドテリン−関連ペプチド、エンドテリン−１、−２および−３、が存在する。イノウエら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:2863-2867(1989)。エンドテリン−１は２１個のアミノ酸ペプチドであり、強い静脈および動脈血管収縮剤である。成熟した生物学的に活性なペプチドは３８−３９個のアミノ酸分子「ビッグエンドテリン」の蛋白分解生成物である。ヤナギサワおよびマサキ、Tr ends Pharm．Sci.，10:374-378(1989)。エンドテリンは、大動脈平滑筋細胞、糸球体間質細胞および骨芽細胞中の蛋白チロシンリン酸化を誘導することが知られている（バチスチーニら、Peptides，14:385-399[1993]）が、培養物中の新生児ラット筋細胞ではエンドテリンは、αアドレナリン剤と同様に、ホスホイノシチド加水分解およびジアシルグリセリンの蓄積を刺激する。スベイタら、上掲およびイトーら、上掲。エンドテリン類は血管の内皮細胞、上皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞および他の多種類の細胞から産生される。バチスチーニら、上掲。これらの分子に対するアンタゴニストは心臓の成長または肥大活性に影響を与え、これらは、例えば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）分泌または、特定の平板培養培地および平板培養密度、好ましくは読み出しのための結晶性バイオレットによる染色を用いてここに記載の筋細胞肥大試験によって測定される。アンタゴニストの好ましい機能は心臓の筋肉組織の成長と減少間の連続的な平衡に望ましい結果をもたらすことである。ＬＩＦアンタゴニストの例としてはこれに限定されるものではないが、抗体、蛋白、ペプチド、糖蛋白、糖脂質、糖ペプチド、多糖類、少糖類、核酸、有機化学分子、ペプチド様物、薬理学的試剤およびそれらの代謝物、転写および翻訳制御配列などが挙げられる。別の種類のアンタゴニストは、当該受容体とＬＩＦまたはエンドテリン間に生じる細胞内または膜関連現象を遮断または阻害する。具体例において好ましくは、アンタゴニストは抗体であり、この抗体は、ＬＩＦまたはエンドテリンに結合する性質を有し、当該受容体との相互作用を阻害する所望の性質を有する。このような抗体は好ましくは、組換ヒトＬＩＦに対して産生され、ヒトおよびマウスＬＩＦの両方によって誘導される肥大を中和するが、ＣＴ−１、エンドテリン−、またはフェニルエフリン−誘導肥大は中和しないものである。例えば、下記の実施例において、これらの基準に合致する３種のモノクローナル抗体が確認され、各々は組換ヒトＬＩＦの別々の抗原決定基を認識する。これらの３種の抗体はすべてマウスおよびヒトＬＩＦによって誘導される筋細胞肥大を中和し、そのうちの２種はＮＣＭによって誘導される肥大を同程度に阻害する。これらの抗体の１種またはそれ以上は１９９３年１１月２５日に公開されたＷＯ９３／２３５５６に記載されている。キムら、J．Immunol．Meth. ，156:9-17(1992)およびアルホンソら、J．Leukocyte Biology(Abstracts of th e 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biology，vol．O，no ．SP.2(1991))(NY，NY，p.49)（Ｍab Ｄ４.１６.９、ＭabＤ２５.１.４およびＭabＤ６２.３.２）。別の好ましい態様において、このアンタゴニストはエンドテリンまたはＬＩＦ受容体の根本的な構造に基づく可溶性受容体であり、ＬＩＦまたはエンドテリンと当該受容体との相互作用を阻害する所望の性質を有する。別の好ましい態様において、このアンタゴニストは有機分子であり、通常、分子モデル研究に基づく経口活性化合物であり、ＬＩＦまたはエンドテリンと当該受容体との相互作用を阻害する所望の性質を有する。別の好ましい態様において、このアンタゴニストはＬＩＦまたはエンドテリンインビボ発現の転写調節剤である。エンドテリンアンタゴニストの例は下記のものに限定されるものではないが、ある種のエンドテリンに対するアンタゴニストであり、エンドテリン−１、−２および−３、ビッグエンドテリン、またはそれらの組み合わせが含まれる。このようなアンタゴニストは抗体だけでなく、エンドテリンＡまたはエンドテリンＢ受容体またはその両方の選択的遮断剤であるペプチドも含む。上で指摘したように、エンドテリンＡ受容体は、エンドテリン−３に優先してエンドテリン−１およびエンドテリン−２に対して選択的である。エンドテリンＢ受容体は同じ親和性で３種の総てに結合する。一例はＢＱ−１２３（イハラら、Life Science，50 :247-250[1992]、１９９３年８月３日公開ＪＰ５１−９４２５４、ウエブら、Bi ochem．Biophys．Res．Comm.，185:887-892[1992]）、エンドテリンＡ受容体の強力かつ特異的遮断剤であり、ＣＴ−１、マウスＬＩＦまたはフェニルエフリンではなく、エンドテリン−１によって誘導される肥大活性のみを遮断する環状ペンタペプチドである。他の例はイハラら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，178: 132-137(1991)に記載のＢＱ−１２３への親化合物である。さらなる例はＥＰ６４７２３６、ＥＰ６４７４４９、ＥＰ６３３２５９（フェニル−スルホニルアミノ−ピリミジン誘導体）、ＥＰ６０１３８６（スルホンアミド化合物）、ＵＳ特許第５２９２７４０号（フェニルスルホンアミドピリミジン類）、およびＵＳ特許第５２７０３１３号（フェニル−スルホニル−アミノピリミジン誘導体）。「抗体」（Ａbs）および「免疫グロブリン」（Ｉgs）は同じ構造的特徴を有する糖蛋白である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の部類のポリペプチドは、例えば、リンパ系で低濃度で産生され、骨髄腫では高濃度で産生される。「生来の抗体および免疫グロブリン」とは、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白であり、２個の同一の軽鎖（Ｌ）および２個の同一の重鎖（Ｈ）からなる。各軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖は規則的に間隔をおいた鎖間ジスルフィドブリッジを有する。各重鎖は一方の末端に可変領域（Ｖ_H）を有し、ついで、多数の定常領域を有する。各軽鎖は一方の末端に可変領域（Ｖ_L）を有し、他端に１個の定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の最初の可変領域と一列になっている。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変領域間に界面を形成していると考えられている（クロチアら、J．Mol．Biol.，186:651-663[1985]、ノボトニーおよびヘーバー、Proc． Natl．Acad．Sci．USA，82:4592-4596[1985]）。「可変」なる用語は可変領域のある部分が抗体間の配列が非常に異なり、その特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性に用いられるという事実をいう。しかしながら、可変性は抗体の可変領域全体に平等に分布しているわけではない。軽鎖および重鎖領域の両方中の相補性決定領域（ＣＤＲs）または超可変領域と称される３つの部分に集中している。可変領域のより高度に保存されている部分はフレーム枠（frame work：ＦＲ）と称される。生来の重および軽鎖はそれぞれ、大部分はβ−シート構造を採用し、３つのＣＤＲsに結合し、β −シート構造に結合するループを形成しているか、ある場合にはβ−シート構造の一部を形成している４つのＦＲ領域を含む。各鎖中のＣＤＲsは共にＦＲ領域のすぐ近くにあり、他の鎖からのＣＤＲsとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（カバトら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition，National Institute of Health，Bethesda，MD[1991]）。定常領域は直接抗原抗体結合に関与しているが、抗体依存性細胞毒性の抗体の関与などの種々のエフェクター機能を表す。抗体のパパイン消化は２個の同じ抗原結合フラグメント、「Ｆab」フラグメントと称され、各フラグメントは１個の抗体結合部位を有し、残余の「Ｆc」フラグメントを産生する。この名称は容易に結晶化するのに由来する。ペプシン処理は、２個の抗原結合部位を有し、さらに交差−結合抗原でもあり得る、１個のＦ (ab')₂を産生する。「Ｆv」は完全な抗原−認識および結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は緊密な非共有結合の１本の重鎖−および１本の軽鎖−可変領域の２量体からなる。この配置で各可変領域の３個のＣＤＲsが相互作用し、Ｖ_H−Ｖ_L ２量体の表面の抗原−結合部位を決定している。まとめると、６個のＣＤＲsは抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、１個の可変領域（または、抗原に対してたった３個のＣＤＲs特異性を含むＦvの半分）でも、全結合部位より低い親和性にて抗原を認識し結合する能力を有する。Ｆabフラグメントはまた軽鎖の定常領域および重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆab'フラグメントは抗体ヒンジ部から１個またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に少数個の残基が追加されている点でＦabフラグメントと異なる。Ｆab'−ＳＨとは、この明細書中では定常領域のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦabと定義されるものである。Ｆ(ab' )₂抗体は本来的に、その間にヒンジのシステインを有する１対のＦ(ab')₂として産生される。脊椎動物類からの抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて明確に区別される２種のカッパー鎖およびラムダ鎖の１種に特定できる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、イムノグロブリン類は異なる種類に特定することができる。イムノグロブリンには５種の主な種類はＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧおよびＩgＭがあり、これらのいくつかはさらに、例えば、ＩgＧ− １、ＩgＧ−２、ＩgＧ−３、ＩgＧ−４、ＩgＡ−１およびＩgＡ−２などのサブクラス（アイソタイプ）に分類される。イムノグロブリンの異なる種類に対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、μと称される。イムノグロブリンの異なる種類のサブユニット構造および３次元の配置は周知である。広義で用いられる「抗体」なる用語は広義においておよび具体的には単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物を含む。この明細書で用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は１つの集団の実質的に均質な抗体から得られる抗体をいい、すなわち、各抗体はより少ない量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異以外は同一である集団を含む。モノクローナル抗体は高度の特異性を有し、唯一の抗原性部位に対して向けられる。さらに、典型的には種々の決定基（エピトープ）に対して向けられる種々の抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製剤に対して、各モノクローナル抗体はその抗原の唯一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養物によって合成され、他のイムノグロブリンによって汚染されていないという利点がある。この明細書中のモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、起源の種属やイムノグロブリンの種類およびサブクラスの指定とは無関係に、抗−ＬＩＦまたは抗−エンドテリン抗体の可変（超可変を含む）領域と定常領域を（例えば、「ヒト化」抗体）、または重鎖と軽鎖を、または他の種属からの鎖と別種属からの鎖をスプライシングすることによって、または異種蛋白との融合によって、産生されるハイブリッドおよび組換抗体または抗体フラグメント（Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')₂、およびＦv）を含む（カビリーら、米国特許第４,８１６,５６７号およびメージおよびラオミ、Monoclonal Antibody Production Tech niques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)参照）。すなわち、修飾語「モノクローナル」とは抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を指し、なんらかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものであると解釈されるべきでない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体はコーラーおよびミルステイン、Nature，256:495(1975)にはじめて記載されたハイブリドーマ法によって、または組換ＤＮＡ法によって製造され得る（カビリーら上掲）。この明細書に記載のモノクローナル抗体は具体的には、所望の生物学的活性を示すかぎり、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種属から誘導される抗体の対応する配列に一致しているか、または相同であるか、または特定の抗体の種類またはサブクラスに属するが、鎖の残部は別の種属から誘導される抗体に対応する配列に一致するか、または相同であるか、別の抗体の種類またはサブクラスに属する、「キメラ」抗体（イムノグロブリン）およびその抗体のフラグメントを含む（カビリーら、上掲、モリソンら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:685 1-6855[1984]）。非−ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非−ヒトイムノグロブリンから誘導される最小配列を含む、特定のキメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆv、Ｆab、Ｆab'およびＦ(a b')₂、または抗体の他の抗原−結合配列）である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性−決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、またはウサギ非−種属（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのＦvフレーム枠残基は対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見当たらない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の挙動を精製し、適正化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は実質的に少なくとも１つの、典型的には２つの可変領域を含み、可変領域にはすべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非−ヒトイムノグロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてのまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒトイムノグロブリン共通配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は所望によりまたイムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも１部を含み、典型的にはヒトイムノグロブリンのものである。さらなる詳細、ジョーンズら、 Nature，321:522-525(1986); ライクマンら、Nature，332:323-329(1988); およびプレスタCurr．Op．Struct．Biol.，2:593-596(1992)参照。「ヒトの非−ヒト免疫原性」とは、医薬的に許容され得る担体および医薬的有効量におけるポリペプチドとヒトの適当な組織を接触させた時に、適当な潜伏期間（例えば、８〜１４日）後にポリペプチドを次ぎに投与したときに、ポリペプチドの感受性または耐性の状態を示さないことを意味する。「心不全」とは、代謝組織の条件に必要な割合で心臓が血液を送らない心臓の機能の異常をいう。心不全は、虚血、先天性、リョーマチ性または特発性の形態を含む幾つかの要素によって惹起される。「処置」とは、治療的または予防もしくは防止手段の両方をいい、その目的は肥大の阻害または減弱（少なくする）ことである。処置の必要な人には障害をすでにもっている人、および障害をもつ傾向がある人または障害が阻害されている人を含む。肥大は特発性、心臓栄養または筋栄養的原因を含むか、または虚血もしくは心筋梗塞などの虚血性発作の結果としてのなんらかの原因に由来する。典型的には、処置は肥大の進行の停止または減速のために、特に、虚血からなどの心臓損傷が生じた後に行われる。好ましくは、心筋梗塞の処置のためには、薬剤が肥大の防止または減弱のために心筋梗塞直後に与えられる。「慢性」投与は、急性的方法に対して、継続的方法での薬剤の投与をいい、最初の抗−肥大効果を維持するために長期間にわたって投与される。処置の目的のための「哺乳動物」とは、犬、馬、猫、牛などの、人、家畜ならびに農業用動物、および動物園、スポーツまたは愛玩動物を含む、哺乳動物として分類される動物をいう。この明細書で用いられる「ＡＣＥインヒビター」とは、アンギオテンシンＩからアンギオテンシンIIへの変換を阻害するアンギオテンシン−変換酵素阻害薬物をいう。ＡＣＥインヒビターは全身の血管の抵抗を減らし、循環性うっ血を緩和することによってうっ血性心不全に効果がある。ＡＣＥインヒビターには以下のようなものがあるが、これに限定されるものではない。商品名アクプリル（キナプリル）、商品名アルテース（ラミプリル）、商品名カポテン（カプトリル）、商品名ロテンシン（ベナゼプリル）、商品名モノプリル（ホシノプリル）、商品名プリニビル（リシノプリル）、商品名バソテック（エナラプリル）および商品名ゼストリル（リシノプリル）。ＡＣＥインヒビターの１つの例は商品名カポテンの名称で市販されているものである。一般に、カプトリルといい、このＡＣＥインヒビターは化学的には１−［（２Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル−］−Ｌ−プロリンを指す。 II ．発明の実施の方法本発明は心不全を有する哺乳動物の処置方法であり、ＬＩＦアンタゴニストの治療的有効量を慢性的に哺乳動物に投与するものである。所望により、ＬＩＦアンタゴニストはエンドテリンに対するアンタゴニストの有効量と組み合わせて慢性的に投与される。別の任意の要素として、ＣＴ−１アンタゴニストなどの心臓栄養インヒビター、カプトリルなどのＡＣＥインヒビター、および／またはヒト成長ホルモンおよび／またはうっ血性心不全の場合にＩＧＦ−Ｉ、または、他の種類の心不全または心臓障害の場合に他の抗−肥大または心筋栄養因子とともに挙げられる。１．アンタゴニストの製造および同定Ａ．一般的製法ＬＩＦおよびエンドテリンに対するアンタゴニストはエンドテリンまたはＬＩＦの受容体の推測される属（family）を用いて製造することができる。エンドテリンＡ受容体は、エンドテリン−３以上にエンドテリン−１およびエンドテリン −２に対して選択的である。エンドテリンＢ受容体は同じ親和性で３つのすべてに結合する。アライら、Nature，348:730-735(1990)。ＬＩＦおよび線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン− １１（ＩＬ−１１）、ＣＴ−１およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、ＧＨ／サイトカイン受容体属の構成員であるＧＰ１３０を含む蛋白であることを示す関連受容体を用いる。キシモトら、Cell，76:253-262(1994); キタムラら、Trends E ndocrinol．Metab.，5:8-14(1994); デイビスおよびヤンコポウロズ、Curr．Opi n．Cell Biol.，5:281-285(1993); ペニカら、上掲。ＬＩＦおよびエンドテリンの受容体はそれらの当該属からクローン化された発現であってもよい；ついで、受容体の可溶体は細胞外ドメインの同定およびそれらからの膜内外ドメインを削除することによって製造される。受容体の可溶体はついでアンタゴニストとして用いられるか、またはその受容体は、それぞれのＬＩＦまたはエンドテリン活性と拮抗するであろう小分子を遮蔽するために用いられる。別法として、アンタゴニストとして作用する生来のＬＩＦまたはエンドテリンの変異体が製造される。ＬＩＦおよびエンドテリンの受容体結合部位は結合研究によって決定することができ、またそれらの１つまたはそれ以上は標準の技術（削除または適当な核酸のラジカル置換）によって削除され、分子はアンタゴニストとして作用する。アンタゴニスト活性はここに記載の肥大試験を含むいくつかの手段によって測定され得る。Ｂ．抗体調製 (i)出発原料および方法イムノグロブリン（Ｉｇ）およびある種のそれらの変異体は公知であり、多くは組換細胞培養で製造される。Ｕ.Ｓ.特許第４,７４５,０５５号; ＥＰ第２５６ ,６５４号; ＥＰ第１２０,６９４号; ＥＰ第１２５,０２３号; ＥＰ第２５５,６９４号; ＥＰ第２６６,６６３号; ＷＯ８８／０３５５９; フォークナーら、Nat ure，298:286(1982); モリソン、J．Immun.，123:793(1979); コウナーら、Proc . Natl．Acad．Sci．USA，77:2197(1980); ラソら、Cancer Res.，41:2073(1981 ); モリソンら、Ann．Rev．Immunol.，2:239(1984); モリソンら、Science，229 :1202(1985); およびモリソンら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6851(1984) 参照。再構成されたイムノグロブリン鎖もまた公知である。例えば、Ｕ.Ｓ.特許第４,４４４,８７８号; ＷＯ８８／０３５６５号およびＥＰ第６８,７６３号およびここに記載の文献参照。本発明のキメラのイムノグロブリン部分はＩgＧ− １、ＩgＧ−２、ＩgＧ−３またはＩgＧ−４サブタイプ、ＩgＡ、ＩgＥ、ＩgＤまたはＩgＭから得られるが、好ましくはＩgＧ−１またはＩgＧ−３から得られる。 (ii)ポリクローナル抗体ＬＩＦまたはエンドテリンに対するポリクローナル抗体は一般に、ＬＩＦまたはエンドテリンおよびアジュバントの多重皮下（ｓｃ）、または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で産生される。ＬＩＦまたはエンドテリンまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを免疫化されるべき種属に、免疫原性である蛋白、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、牡ウシチオグロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターを、例えば、マレイミドベンゾイルスルホンスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣl₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ¹は異なるアルキルである）などの二官能基または誘導体化剤を用いて結合するのが有効であり得る。ペプチドまたはコンジュゲートの１ｍｇまたは１μｇ（それぞれ、ウサギまたはマウスに）をフロイント完全アジュバント３容と混和し、この溶液を皮内の複数部位に注射して、動物をＬＩＦまたはエンドテリンペプチドまたはフラグメント、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。１カ月後動物にフロイント完全アジュバント中最初の量の１／５または１／１０量のペプチドまたはコンジュゲートを複数部位に皮下注射することによって追加抗原注射する。７〜１４日後に動物から採血し、ＬＩＦまたはエンドテリンまたはそれらのフラグメントに対する抗体力価について血清の試験をする。力価がプラトーに達するまで動物に追加抗原注射を行う。好ましくは、動物は、別の蛋白および／または別の架橋剤によって結合されているが、同じＬＩＦまたはエンドテリンまたはそれらのフラグメントのコンジュゲートで追加抗原注射されるのが好ましい。コンジュゲートはまた組換細胞培養中で蛋白融合物として製造され得る。またミョウバンなどの凝集剤が免疫応答を増強させるために適当に用いられる。 (iii)モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体、すなわち、少数量存在していることがある潜在的な天然の突然変異を除いて同じポピュレーションを構成する個々の抗体のポピュレーションから得られる。このように修飾語句「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないものとしての抗体の特徴を表す。例えば、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein，Nature，256: 495(1 975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製するか、または組換えDN A法（Cabillyら、上記）により製造することができる。該ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスターのような他の適切な宿主動物を上記のごとく免疫し、免疫に使用するＬＩＦまたはエンドテリンまたはそれらのフラグメントと特異的に結合する抗体を製造するかまたは製造することができるリンパ球を誘発する。あるいはまた、リンパ球はin vitroで免疫することができる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適切な融合物質を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding，M onoclonal Antibodies: Principles and Practice，59-103頁[Academic Press, 1986])。このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含む適切な培養液中に接種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合は、典型的には、ハイブリドーマ用の培養液は、HGPRT−欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT培地）を含むであろう。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選ばれた抗体産生細胞による高レベルの抗体産生を支持し、HAT培地のような培地に対して感受性の細胞である。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Distribution Center， San Diego，California USAから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍、およびAmerican Type Culture Collection，Rockville，Maryland USAから入手可能なSP-2細胞から誘導されるようなネズミ骨髄腫系である。ハイブリドーマ細胞が増殖している培養液において、ＬＩＦおよびエンドテリンに対するモノクローナル抗体の産生が試験される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、放射性免疫試験法(RIA)または酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ELISA)のようなin vitro結合試験法によるかまたは免疫沈降法によって測定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、MunsonおよびPollard、Anal.Bi ochem.，107: 220(1980)のScatchard分析によって測定することができる。所望の特異性、親和性、および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を確認し、次いで該クローンを、限界希釈法によってサブクローンし、標準的方法により増殖させることができよう（Goding，上記）。本目的に適した培養液には、例えばD-MEMまたはPRMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような通常のイムノグロブリン精製法によって培養液、腹水、または血清から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され、通常の手順（例えば、ネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源として用いられる。単離されたら、DNAを発現ベクター中に入れ、次いでこれをE.coli細胞、サルC OS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または該発現ベクターをトランスファーしなければイムノグロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスファーする。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する総説的文献には、Skerraら、Curr．Opinion in Immunol.,5: 256-262(1993)、およびPluckthun，Immunol．Revs.，130: 151-188（1992）が含まれる。該DNAは、ホモローガスなネズミ配列の代わりにヒト重−および軽−鎖定常ドメインをコードする配列で置換するか(Cabillyら、上記；Morrisonら、Proc．Na t．Acad．Sci.，81: 6851[1984])、または非イムノグロブリンポリペプチドをコードする配列のすべてまたは一部を、イムノグロブリンコード配列と共有結合することにより修飾することもできる。この方法において、ここに記載の抗−ＬＩＦまたは抗−エンドテリンモノクローナル抗体に結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が製造される。典型的にはそのような非イムノグロブリンポリペプチドで、本発明の抗体の定常領域を置換するか、または該ポリペプチドで抗体の１つの抗原結合部位の可変領域を置換することによりＬＩＦまたはエンドテリンに対する特異性を有する抗原結合部位、および別の抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を含む方法を含む合成タンパク質化学で知られた方法を用いてin vitroで製造することもできる。例えば、イムノトキシンはジスルフィド−交換反応を用いるかまたはチオエーテル結合を形成させることにより構築することができる。本目的に適した試薬の例にはイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。 (iv)ヒト化抗体非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野でよく知られている。一般的には、ヒト化抗体はヒト以外の供給源からその中に導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変領域から取り出される。ヒト化は、Winterおよび共同研究者らの方法(Jonesら、Nature，321: 522-525[1986]; Riechmannら、Nature 332: 323-327[1988]; Verhoeyenら、Science，239: 1534-1536[1988])に従い、齧歯類のCDRｓまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することにより実質的に行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に完全なヒト可変領域以下がヒト以外の種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（Cabillyら、上記）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基が齧歯類抗体中の類似の部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体を作製するのに用いられるヒト可変領域（軽および重両方）の選択は抗原性を減らすのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯類抗体の可変領域の配列は既知のヒト可変領域配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングされる。次に、齧歯類の配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレーム枠（ＦＲ）として認められている(Simsら、J．Immunol.，151: 2296[1993]; ChothiaおよびLesk，J．Mol．Biol.，196: 9 01[1987])。別の方法では、軽または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列由来の特定のフレーム枠を用いる。同じフレーム枠をいくつかの異なるヒト化抗体用に用いることができよう(Carterら、Proc．Natl．Acad．Sci . USA，89: 4285[1992]; Prestaら、J．Immunol.，151: 2623[1993])。さらに、抗体が抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特徴を保持してヒト化されることが重要である。好ましい方法によればこの目的を達成するには、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる種々の概念的ヒト化生成物、および親配列の分析方法によって製造される。三次元イムノグロブリンモデルは当業者によく知られており、普通に利用可能である。選ばれた候補イムノグロブリン配列の、有望な三次元的立体構造を図解し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補イムノグロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補イムノグロブリンのその抗原に対する結合能に影響を及ぼす残基の分析を行うことができる。このように、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性の増加といった所望の抗体特性を達成するために共通および輸入配列から選び、結合することができる。一般的には、CDR残基は抗原の結合に対する影響に直接および最も実質的に関与している。 (v)ヒト抗体ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により製造され得る。ヒトモノクローナル抗体製造のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、例えば、コズボル、J．Immunol.，133:3001(1984); ブロデュールら、Monoclona l Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekke r，Inc.，New York，1987); およびボウナーら、J．Immunol.,147:86-95(1991) に記載されている。今や免疫に関して、内因性イムノグロブリン生成物の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラおよび生殖系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（J_H）のホモ接合体の欠失は内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系突然変異マウスにおけるヒト生殖系イムノグロブリン遺伝子配列のトランスファーは、抗原免疫注射によりヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Jakobovitsら、Proc．Natl．Acad．Sci. USA，90: 2551-255(1993); Jakobovitsら、Nature，362: 255-258(1993); Brug germannら、Year in Immuno.，7: 33(1993)参照）。別法として、ファージ提示技術(the pharge display technology)(マックカフェティら、Nature，348:552-553[1990])が、非−免疫化ドナーからのイムノグロブリン可変(Ｖ)領域遺伝子レパートリーからインビトロでのヒト抗体および抗体フラグメントの製造のために用いられる。この技術により、抗体Ｖ領域遺伝子はＭ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要かまたは主要でない被覆遺伝子のいずれかにインフレーム（in-frame）クローン化されファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡ複写物を含み、抗体の機能的特徴に基づく選択はまたこれらの特徴を表す抗体をコードする遺伝子の選択に帰着するからである。すなわち、ファージはＢ−細胞の特徴のいくつかに似ている。ファージの提示（display）は種々の形式（フォーマット）で行われ得る；それらの概説については、ジョンソンおよびチスウェル、Curr．Op．Struct．Biol.，3:564-571(1993)。Ｖ−遺伝子切片のいくつかの供給源はファージの提示のために用いられ得る。クラックソンら、 Nature，352:624-628(1991)は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さい任意の順列組み合わせのライブラリーから抗−オキサゾロン抗体の異なった配列を分離した。非−免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーは構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の異なった配列に対する抗体は本質的に、マークスら、J．Mol．Biol.，222:581-597(1991); またはグリフィスら、EMBO J., 12:725-734(1993)に記載の技術によって分離することができる。本来の免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積している（体細胞過剰突然変異）。導入された変化のいくつかはより高い親和性をもたらし、高親和性表面イムノグロブリンを提示しているＢ−細胞は、後の抗原免疫注射の間に優先的に複製され分化される。この本来の方法は「チェインシャフリング」として知られている技術を採用して模倣され得る(マークスら、Bio/Technology, 10:779-783[1992])。この方法において、ファージ提示物よって得られる第１次（primary）ヒト抗体の親和性は重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を非−免疫化ドナーから得られるＶ領域遺伝子の天然由来の変異体のレパートリーで順次置換することによって改良され得る。この技術はｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーの作成のための方策はウォーターハウスら、Nucl．Acids Res.，21:2265-2266(199 3)に記載されている。遺伝子のシャフリングはまた、ヒト抗体が初めのげっ歯類抗体と同様の親和性および特異性を有する場合に、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するのに用い得る。「エピトーププリンティング」とも称される、この方法により、ファージ提示技術により得られるげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖ領域遺伝子がヒトＶ領域遺伝子のレパートリーで置換され、げっ歯類−ヒトキメラを創造し得る。抗原の選択は、機能的抗原結合部位を回復し得るヒト可変領域の分離に帰着し、言い換えれば、エビトープはパートナーの選択を支配（刻印）する。この方法を反復して、残りのげっ歯類Ｖ領域を置換し、ヒト抗体を得る（ＰＣＴＷＯ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公開）。ＣＤＲ移植よるげっ歯類抗体の伝統的ヒト化と異なり、この技術は完全なヒト抗体を提供し、げっ歯類起源のフレーム枠またはＣＤＲ残基をもたない。 (vi)二特異性抗体二特異性抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくはヒトまたはヒト化抗体であり、少なくとも２種の抗原に対して結合特異性を有する。本発明の場合、結合特異性の１つはＬＩＦに対するものであり、もう１つはエンドテリンに対するものである。二特異性抗体の調製方法は公知である。伝統的に二特異性抗体の組換製造法は、２本のイムノグロブリン重鎖−軽鎖が異なる特異性を有する該重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている(Millsteinおよび Cuello、Nature，305: 537-539[1983])。イムノグロブリン重および軽鎖が無作為に寄せ集まっているために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つだけが正しい二特異性構造を有する１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成する。通常、アフィニティクロマトグラフィー段階によって行われる正しい分子の精製はかなりやっかいであり、生成物の収量は低い。同様な手順がWO93/0 8829（1993年５月13日公開）およびTrauneckerら、EMBO J.，10: 3655-3659(199 1)に開示されている。別のより好ましい方法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を、イムノグロブリン定常領域配列と融合させる。好ましくは融合は、少なくとも、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含むイムノグロブリン重鎖定常領域と行われる。融合の少なくとも１つ中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。イムノグロブリン重鎖融合物および所望によりイムノグロブリン軽鎖をコードしているDNAを別の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。これは、構築物において用いられる３本のポリペプチド鎖の比が等しくないときに最適の収量が得られる態様において３本のポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する際の大きな柔軟性をもたらす。しかしながら、等比の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収量を生じるか、または該比が特別の有意性を有しないときは、１つの発現ベクター中に２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。この方法の好ましい態様では、二特異性抗体は１つの腕に第1の結合特異性を有するハイブリッドイムノグロブリン重鎖、および他の腕にハイブリッドイムノグロブリン重鎖−軽鎖対（第2の結合特異性をもたらす）からなる。この非対称構造は、二特異性分子の１方の半分のみにイムノグロブリン軽鎖が存在することで分離が容易となるので、所望しないイムノグロブリン鎖の組み合わせからの所望する二特異性化合物の分離が促されることがわかった。二特異性抗体のさらなる詳細は、例えば、スレッシュら、Methods in Enzymology，121:210(1986)参照。 (vii)ヘテロコンジュゲート抗体ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は２個の共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、望まれない細胞に対する免疫系を標的とし(Ｕ.Ｓ.特許第４,６７６,９８０号)、ＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／００３７３号；およびＥＰ０３０８９号)に提案された。ヘテロコンジュゲート抗体はなんらかの都合のよい架橋法を用いて製造され得る。適切な架橋剤は当分野で周知であり、多数の架橋技術とともにアメリカ合衆国特許第４６７６９８０号に記載されている。Ｃ．アンタゴニストの生成不純物からアンタゴニストの分離に用いられる技術は採用される当該抗体が何であるかにより変化する。これらの方法には、イムノアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（例えば、カルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含むＤＥＡＥまたはマトリックス）、ブルーセファローズクロマトグラフィー、ＣＭブルーセファローズ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファローズ、ＷＧＡ−セファローズ、Ｃｏｎ−Ａセファローズ、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパールまたはプロテインＡセファローズ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、付加した脂肪族基を有するシリカゲル）、例えば、セファデックスモレキュラーシーブまたはサイズ排除クロマトグラフィーを用いるゲル濾過、選択的にＬＩＦアンタゴニストまたはエンドテリンアンタゴニストに結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈澱から選択される１またはそれ以上の方法を挙げることができる。プロテアーゼインヒビターは蛋白分解を阻害するために上記の工程のいずれかに含まれる。適切なプロテアーゼインヒビターとしては、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩−ベスタチン、キモスタチンおよびベンズアミジンの例がある。Ｄ．肥大試験肥大阻害活性が推測されるアンタゴニストを試験するために予備試験を行った。この試験において、用いられた培地は血清を含まず低プレーティング密度で生存可能なものである。この培地中に直接プレーティングすることによって、より少ない細胞を除去するように、洗浄工程が省かれる。このプレーティング密度は重要である：多くのより少数の(many fewer)細胞および生存細胞が減少し；多くのより多くの(many more)細胞および筋細胞が自己誘導肥大を始める。その段階には： (a)少なくともインシュリン、トランスフェリンおよびアプロチニンで補足されたＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中１ｍＬ当たり、約７.５×１０⁴細胞の細胞密度の筋細胞の懸濁液を９６−ウェルにプレートし； (b)ＬＩＦまたはエンドテリンの存在下で細胞を培養し； (c)（ＬＩＦまたはエンドテリンのアンタゴニストの疑いのある）試験されるべき物質を加え； (d)細胞を当該物質とともに培養し； (e)肥大について測定する段階が含まれる。培地は、細胞の成育を確実により長くするＥＧＦなどの追加の要素で補足することができるが、そのような補足は必須ではない。Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地はギブコＢＲＬ、ゲティスバーグ、ＭＤから購入することができ、下記の媒質からなる。より好ましい肥大試験は、 (a)雌ウシ血清を含む培地で、好ましくは４％胎子雌ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地で、９６−ウェル組織培養プレートのウェルを、好ましくは、ウェルを約８時間３７℃にてインキュベートして、プレーコーティングし； (b)培地を除去し； (c)インシュリン、トランスフェリンおよびアプロチニンで補足されたＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中１ｍＬ当たり７.５×１０⁴細胞で内側の６０ウェルに筋細胞の懸濁液をプレートし； (d)ＬＩＦまたはエンドテリンの存在下、少なくとも２４時間筋細胞を培養し; (e)被験物質を添加し； (f)細胞を被験物質とともに（好ましくは２４−７２時間、より好ましくは４８時間）培養し； (g)肥大を（好ましくは、結晶バイオレット染色後）顕微鏡試験により測定する。好ましくは、工程(c)で用いられる培地は、血清無含有であり、またペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep）およびグルタミンを含有している。最も好ましくは、培地はＤ−ＭＥＭＦ−１２の１００ｍＬ、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、インスリン（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、アプロチニン（２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ、pen/strep(ＪＲＨバイオサイエンスＮｏ.５９６０２−７７Ｐ)１ｍＬ、およびＬ−グルタミン（２００ｍＭ）１ｍＬを含む。他の肥大試験法は、ラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩgＧ融合蛋白に対する¹²⁵Ｉ−ラットＡＮＰの結合に関する競合の測定による、心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）放出の測定である。使用に適した方法は、チャモウら、Biochemist ry, 29: 9885-9891(1990)に記載のＣＤ４−ＩgＧ融合蛋白を用いるＧＰ１３０を測定に用いられる方法に似ている。２．治療的組成物およびアンタゴニストの投与ＬＩＦに対するアンタゴニスト単独またはたはエンドテリンに対するアンタゴニストと組み合わせたものは、心不全の経歴のある哺乳動物（例えば、動物またはヒト）のインビボ処置の薬物としての使用が発見され、肥大作用を防止し、減少させる。例えば、ＬＩＦアンタゴニスト単独またはエンドテリンアンタゴニストを伴って、ＡＣＥインヒビターを用いることができないかまたは効果がない場合にうっ血性の心臓疾患の処置に有用である。心臓疾患処置のためのアンタゴニストの治療用製剤は、所望の生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定剤と所望の純度を有するアンタゴニストを混和して凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で貯蔵用に製造される（Remington's Ph armaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.[1980]）。許容され得る担体、賦形剤、または安定剤は採用される投与量および濃度にてレシピエントに対して毒性のない、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンなどの蛋白；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどののキレート剤：マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはツイーン、プルロニックス、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非−イオン性界面活性剤である。アンタゴニストはまた、Ｕ.Ｓ.特許第４,６４０,８３５; ４,４９６,６８９；４,３０１,１４４；４,６７０,４１７；４,７９１,１９２または４,１７９,３３７号に記載の方法で、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの種々の非蛋白性ポリマーの１つと適切に結合される。インビボ投与に用いられるアンタゴニストは無菌でなければならない。これは凍結乾燥または解凍の前後に容易に滅菌濾過膜による濾過によって容易になし得る。通常、アンタゴニストは凍結乾燥または溶液の状態で保存される。治療用アンタゴニスト組成物は一般に、滅菌利用可能な口を有する容器、例えば、静脈内注射液袋または皮下注射針による貫通が可能な密栓を有するバイアルに入っている。アンタゴニスト投与は慢性的投与方法で、例えば、下記の経路の１つを用いてなされる：静脈内注射または点滴、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、病巣内経路、経口活性な小分子を用いるか、または下記の持続性放出系を用いる場合は経口的投与である。アンタゴニストはクリアランス率が十分遅い時は点滴または腹腔内巨丸剤投与か、または血流またはリンパへの投与により継続的に投与される。好ましい投与方法は、直接心臓に投与し、原因箇所に分子を直接送り、アンタゴニストの副作用を最小化するようにするものである。持続製剤の適切な例としては、蛋白を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルなどの成型品の形態である。持続性マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ランガーら、J．Biomed．Mater．Res.，15:167-277[1981 ]およびランガー、Chem．Tech.，12:98-105[1982]に記載のポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド類( Ｕ.Ｓ.特許第３,７７３,９１９号、ＥＰ第５８,４８１号)、Ｌ−グルタミン酸およびγ エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー(シッドマンら、Biopolymers，2 2:547-556[1983])、非−分解性エチレンビニルアセテート（ランガーら、上掲）、商品名ルプロンデポ（乳酸−グリコール酸コポリマーとロイプロリドアセテートからなる注射可能なマイクロスフィア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３,９８８）などが挙げられる。アンタゴニストはまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により製造されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ［メチルメタアクリレート］マイクロカプセル）中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノ−カプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に挿入され得る。このような技術はRemington' s Pharmaceutical Sciences、上掲に記載されている。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日以上にわたって放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはより短期間蛋白を放出する。カプセル封入されると、蛋白は長期に体内に残留し、３７℃で湿気にさらされた結果、変性または凝集し得、生物学的活性の損失または免疫原性の変化の可能性の原因になり得る。合理的な方法によってこれに関与するメカニズムに基づいて蛋白の安定性を図り得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の生成であると判明した場合は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結乾燥、湿度含有率の調節、適当な添加剤の使用および具体的なポリマーマトリックス組成物の開発により安定性を確保し得る。持続性−放出アンタゴニスト組成物はまたリポソーム性捕捉アンタゴニストを含む。アンタゴニストを含むリポソームはそれ自体公知の方法により製造され得る：ＤＥ第３,２１８,１２１号; エピステインら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA , 82:3688-3692(1985); ハワンら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:4030-4034 (1980); ＥＰ第５２,３２２号; ＥＰ第３６,６７６号; ＥＰ第１４３,９４９号; ＥＰ第１４２,６４１号; 日本特許出願８３−１１８００８号; Ｕ.Ｓ.特許第４ ,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号およびＥＰ第１０２,３２４号。通常、リポソームは小さく（約２００−８００オングストローム）単層型であり、脂質含有が約３０モル％コレステロールより大であり、選択部分が、最適アンタゴニスト治療のために調整される。適切な持続性製剤はＥＰ６４７,４４９に記載されている。治療用に採用されるアンタゴニストの有効量は、例えば、治療目的、投与経路、患者の症状による。従って、治療者は所望の治療効果を得るために、投与量の力価を測定し、要求される投与経路を変更する必要がある。上記の要素に基づいて変化するが、ＬＩＦアンタゴニスト単独で用いられる典型的１日投与量は約１ μｇ／ｋｇ患者の体重〜１００ｍｇ／ｋｇ患者の体重または１日当たりそれ以上であり、好ましくは、約１０μｇ／ｋｇ・日〜１００ｍｇ／ｋｇ・日である。もし、２種類のアンタゴニストを一緒に投与するならば、同じ経路で投与する必要はないし、同じ製剤中で投与する必要もない。しかし、所望により１つの製剤に結合することができる。両方のアンタゴニストを、各自の有効量で、または最適とは言えないが、結合すれば有効である各自の量で患者に投与できる。好ましくはこのような各自の量は約１０μｇ／ｋｇ・日〜１００ｍｇ／ｋｇ・日である。他の好ましい具体例は、両方のアンタゴニストの注射による投与であり、例えば、用いるアンタゴニストの種類によるが、静脈内または皮下注射による。典型的には施療者は心臓機能障害の処置のための所望の効果を達成する投与量に達するまで、アンタゴニストを投与する。例えば、その量は肥大を減少させ、心室収縮性を増大させ、末梢血管抵抗を減少させるか、またはうっ血性心臓疾患患者における同じような重篤性の症状の緩解しまたは処置する、すなわち、心臓筋肉組織を拡張と収縮の間の平衡の連続に望ましい結果を得る量である。この治療の進行は容易に常用の試験方法で観察され得る。２種類のアンタゴニストを、もし一緒に用いるならば、好ましくは細胞を含まない医薬組成物を調製するために適当な担体中で共に製剤化され得る。１つの具体例において、製剤に用いられる緩衝液は組成物が混合してすぐに用いられるか、または後の使用のために保存されるかどうかにより変化する。なぜなら長期の保存は溶解性および凝集などの安定性の問題を起こし得るが、これはｐＨを変えることによって対処し得るからである。最終的な製剤は安定な溶液かまたは凍結乾燥固体であり得る。アンタゴニストは所望により、ＡＣＥインヒビター、ＣＴ−１インヒビター、ｈＧＨ、および／またはＩＧＦ−Ｉを含む心不全処置のための他の薬剤と結合させまたは協奏させて投与される。このような薬剤の有効量は、用いる場合は、医師または熟練者の判断による。投与量および調節はうっ血性心不全の最良の管理を達成するために行われ、理想的には利尿剤またはジギタリスの使用、および低血圧および腎臓障害などの症状を考慮する。さらに投与は用いられる薬剤の種類および処置されるべき具体的な患者などの要素に依存する。典型的には用いられる量はもしその薬剤がアンタゴニストとともではなく用いられるときの量と同じである；しかしながら、より少ない量が、副作用の存在、処置される症状、患者の種類、アンタゴニストおよび薬剤の種類などに依存して採用されるが、ただし、薬剤の総量は処置される症状に対する有効な投与量である。すなわち、例えば、ＡＣＥインヒビターの場合、エナラプリルの試験投与量は５ｍｇである。ついでこれは、患者がそれに耐えるならば、１日１回、１日当たり１０−２０ｍｇに上昇させる。他の例としては、カプトリルは最初試験投与量６.２５ｍｇでヒトの患者に経口的に投与され、ついで患者がそれに耐えるならば、１日２回（ＢＩＤ）または１日３回（ＴＩＤ）２５ｍｇに上昇させ、ＢＩＤまたはＴＩＤ５０ｍｇに上昇させ得る。耐性濃度は低血圧の兆候による血圧の減少が伴うかどうかを測定することによって推定する。もしその兆候があれば、もし、指示があれば、投与量はＢＩＤまたはＴＩＤ１００ｍｇまで増加させ得る。カプトリルは有効成分としてヒドロクロロチアジドと組み合わせて、およびカプトリルが結腸に到達するまで保護する腸内または遅延放出コーティングを有するｐＨ安定化コアとして投与用に製造される。カプトリルは錠剤またはカプセルの形態での投与用として得られる。カプトリルおよび他のＡＣＥインヒビターに関連する投与量、投与、処方戔および禁忌は、the Physician Desk Reference,Med ical Economics Data Production Co.,Montvale,NJ.2314-2320(1994)に記載されている。下記の実施例は説明のためのものであり、限定のためのものではない。明細書中のすべての引用文献は特にここに引用して明細書の記載とする。実施例１１．材料および方法Ａ．材料コラゲナーゼＣＬＳ２をWorthinton（Freehold，NJ）およびPercoll^TMをPharm acia Biotech AB（Uppsala，スウェーデン）のものである。培養培地および補足物質はＧＩＢＣＯＢＲＬ（Grand Island，NY）のものである。アプロチニンおよび結晶バイオレットはSigma、St．Louis，MOのものである。結晶化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はICN Biomedicals（Aurora，IL）のものである。ファルコン９６ウェルプレートをBecton Dickenson（Oxnard，CA）およびLab Tek^TM チェンバー・スライドはNunc（Naperville，IL）のものである。ヒト／ブタエンドテリン−１はAmerican Peptides（Sunnyvale，CA）のものである。マウスおよびヒトＬＩＦは組換手法により調製した。Rose and Todaro，ＷＯ９３／０５１６９およびKimら、上掲参照。ここで用いられる組換マウスＬＩＦはGenzyme， Massのものであり、抗−ヒトＬＩＦモノクローナル抗体をKimら、上掲およびＷＯ９３／２３５５６、上掲、に記載と同様にして得た。ＢＱ−１２３はIharaら、 Life Science,上掲; 特開昭51-94254号上掲; Webbら、上掲、に記載と同様にして得; およびＡＮＰおよびＡＮＰ−受容体ＩgＧ融合蛋白はChamowら、上掲、に記載と同様にして得た。Ｂ．筋細胞培養および肥大試験新生児のラットの心室筋細胞をPennicaら、上掲、に記載と同様にして、９６ −ウェルプレート中で培養した。要約すると、一連のコラゲナーゼ消化、続いて商品名ペルコール勾配精製により１日令のスプラーグ・ドーリー・ラットから、筋細胞を単離した。Iwakiら、J．Biol．Chem.，265:13809-13817(1990)。低勾配界面でバンドになっている筋細胞を集め、２回洗浄し、１５％（vol／vol）ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁させた。細胞をトランスフェリン１０μg／mL、インスリン１μg／ml、アプロチニン１μg／ml、グルタミン２mmol／L、ペニシリンＧ１００Ｕ／mＬおよびストレプトマイシン１００μg／m lで補足した、血清無含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（試験培地）中に希釈し、最終濃度を７.５×１０⁴細胞／mＬとした。細胞を含むこの試験培地の最終血清濃度は＜０.１％であった。筋細胞を９６−ウエルのウェル当たり２００μL平板培養し、平底プレートを予め４％（v／v）ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地中で８時間３７℃でコーティングした。５％ＣＯ₂中３７℃で２４時間後、試験物質を加えた。試験物質を加え４８時間後細胞を固定し、メタノールおよびホルムアルデヒド中５％（wt／vol）結晶バイオレットで染色し、肥大を顕微鏡試験により１〜７度までの点をつけた。未処理の細胞を陰性対照として用い、３度とした。毒性試験の結果は０〜２度とした。各試験の陽性対照はフェニレフリン１００μmol／Lであり、７度とした。Ｃ．非−筋細胞培養上記の方法では上部勾配界面のバンドに非−筋細胞が豊富である。それを集めて２回洗浄し、１０％（v／v）ウシ胎児血清（３０mＬ／５０心臓）を含むＤ− ＭＥＭ／Ｆ１２培地中に再懸濁させた。５％ＣＯ₂中３７℃で１時間後、フラスコを緩やかに回転させながら振盪し、培地を入れた。培地中で４日後、細胞をトリプシン処理し、Ｔ２５フラスコ（５mＬ／フラスコ）中ｍＬ当たり４×１０⁵細胞を再プレーティングした。混じっていた筋細胞はすべてこの方法で破壊された。培地中５日後、細胞を血清無含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２回洗浄し、調整培地（１mg／mLＢＳＡを含む試験培地）を加えた。調整培地を２４時間後に除去し、遠心分離して細胞および残骸を除去し、４℃で保存した。Ｄ．ＡＮＰ測定ラットＡＮＰ濃度を、ラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩgＧ融合蛋白に対するラット¹ ²⁵ Ｉ−ＡＮＰの結合の競合により測定した。Chamowら、上掲。Ｅ．エンドテリン測定エンドセリン濃度をアマーシャム・エンドテリン１，２（高感度）試験システム（Amercham，Arlington Heights，IL）を用いて測定した。Ｆ．ＬＩＦ測定ＬＩＦサンドウイッチＥＬＩＳＡを、以下の修正を加えてKimら、上掲、記載と同様にして行った。マイクロタイタープレートをＭab Ｄ４.１６.９（ヒトＬＩＦに対する）とともに一晩コーティングし、０.５％（w／v）ＢＳＡでブロックし、洗浄した後、マウスＬＩＦ標準および試料を加え、プレートを２時間室温にてインキュベートした。ついで、ビオチン化された（商品名Pierce ImmunoPur e、商品名Sulfo-NHS-Biotin^TM）Ｍab Ｄ６２.３.２（ヒトＬＩＦに対して）を加え、プレートを室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプタビジン−パーオキシダーゼコンジュゲート（ベーリンガー−マンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス、ＩＮ）を加え、プレートを３０分間室温にてインキュベートした。そのプレートを洗浄し、パーオキシダーゼの基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）（Kirkegaard and Perry，Gaithersburg、MD）を加えた。Ｈ₃ＰＯ₄を添加することにより１０分後発色を終了させた。４５０nmでの吸光度をマイクロタイタープレート・リーダーを用いて測定した。ＮＣＭ中のラットＬＩＦの濃度評価は、マウスＬＩＦ標準曲線と比較して決定した。Ｇ．免疫細胞化学筋細胞を、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地中４％（v／v）ウシ胎児血清とともに予めコーティングした４−チェンバーLab Tek（商品名）グラス・チェンバー・スライド中にプレーティングし、２４時間培養した。それらを試験物質に４８時間暴露し、ついで、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、９５％（v／v）エタノールで１５分間固定した。ついで、スライドを０.１％（v／v）ツイーン- 20（商品名）界面活性剤とともにＰＢＳ含有１％（w／v）ＢＳＡで３０分間ブロックし、BODIPY FL（商品名）ブランド試薬（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１０μg／ml ）（Molecular Probes，Eugene OR）にコンジュゲートさせたファラシジンと４０分間インキュベートし、収縮性線維中に存在するｆ-アクチンを染色した。ついで、そのスライドを０.１％ツイーン-20（商品名）界面活性剤中ＰＢＳで３回洗浄した。ファラシジン染色細胞をUltima（商品名）レーザー−走査型共焦点顕微鏡（Meridian Instruments，Okemos，MI）で画像化した。Ａ１.４ＮＡ６０Ｘ（商品名）油浸漬対物レンズを４８８nm励起と協調させて用い、得られた蛍光を５２５−nmロング−パス・フィルターにより測定した。データを０.２μmの水平および垂直分解および０.５μmのz-分解で集めた。各データ点を平均２００測定点集めた。最終画像を、複合ｚまたは深部画像を１つの二次元表現に圧縮して最大蛍光投影アルゴリズムを構築した。非−筋細胞を４−チェンバーLab Tek（商品名）グラス・チェンバー・スライド中にプレーティングし、５日間培養し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、９５％エタノールで１５分間固定した。スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、０.１％（v／v）トリトン X-100（商品名）界面活性剤とともにＰＢＳ含有１％ＢＳＡで３０分間ブロックし、以下の一次抗体とともに２時間インキュベートした：（１）筋細胞を染色するためのモノクローナル抗−トロポミオシン（サルコメリック）（Sigm a，St．Louis，MO）１：５０、（２）線維芽細胞の染色のためのモノクローナル抗−アルファ平滑筋アクチン（Sigma）１：２５００、（３）内皮細胞を染色するためのウサギ抗−ヒトVon Willebrandt因子（DAKO，Carpenteria，CA）１：５００。ＰＢＳ中で３回洗浄後、スライドを適当な蛍光複合二次抗体（Sigma）１：２００と４５分間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄した。２．結果Ａ．培養心臓非−筋細胞による肥大活性の産生５０％（v/v）ＮＣＭに４８時間暴露後、新生児ラット心室筋細胞は未処理細胞（肥大度３）と比較して、収縮性線維の器室化が進行し肥大した(肥大度７)。筋細胞の大きさの増大は肥大度として示されるが、投与量依存性であり（Ｆig１Ａ）、ＡＮＰ産生の増大を伴う（Ｆig１Ｂ）。ＮＣＭにおける肥大活性は５時間まで急速に蓄積し、２４時間でピークに達する（Ｆig２）。最大活性に１ｍＬ当たり０.２〜０.４百万細胞の接種密度が必要である。Ｂ．エンドテリン受容体遮断剤およびＬＩＦモノクローナル抗体による非− 筋細胞調整培地肥大活性の阻害エンドテリンＡ受容体遮断剤ＢＱ−１２３および組換ヒトＬＩＦに対するＭab （ＭabＤ６２.３.２）は各々ＮＣＭ肥大活性を一部阻害した。両方を１緒に添加したとき、活性は殆ど完全に遮断された（Ｆig３）。ＢＱ−１２３およびＬＩＦＭabは特異的インヒビターであると思われる。ＢＱ−１２３はエンドテリン−１によって誘発された肥大活性のみを遮断し、ＣＴ−１、マウスＬＩＦ（ｍＬＩＦ）またはフェニルエフリンにより誘発された肥大活性を遮断しなかった（Ｆig４）。ＬＩＦＭabは、ｍＬＩＦにより誘発された活性を一部分中和したが、エンドテリン−１、ＣＴ−１またはフェニルエフリンにより誘発された活性に影響を与えなかった。ＢＱ−１２３およびＬＩＦＭabそれ自体は筋細胞の形態学に影響を与えなかった。ＮＣＭにおけるエンドテリンおよびＬＩＦの存在は免疫試験により確認された。ＮＣＭ中のエンドテリン（エンドテリン−１および−２およびビッグエンドテリン）は放射性免疫試験によって測定され、３つの製剤につき、平均２２９±１０ｐｍｏｌ／Ｌであった。ＮＣＭ中のＬＩＦの濃度は、２つの抗−ヒトＬＩＦモノクローナル抗体および標準としてのマウスＬＩＦによるＥＬＩＳＡサンドイッチ法を用いて測定された。この方法を用いたＬＩＦの濃度について得られた値は３つの製剤につき、１９０±５０ｐｍｏｌ／Ｌであった。Ｃ．インビトロ心筋細胞肥大に対する精製ＬＩＦおよびエンドテリンの作用精製ＬＩＦおよびエンドテリン−１単独、および２つの試剤の組み合わせの最大濃度に４８時間暴露後、筋細胞の具体的な形態学が検討された。ＬＩＦに暴露された細胞は樹枝状−様進行で伸長する傾向があった。エンドテリンに暴露された細胞は進行はなくより緊密であった。組み合わせに暴露したものは進行はなく、大きさが増大した混合表現型であり、フェニルエフリンおよびＮＣＭによる処置から得られた形態に似ている。収縮性線維の器質化は、ｆ−アクチンを可視化する蛍光ファラシジンで染色した筋細胞につき観察された。未処理対照の線維は器質化されず、筋細胞中の線維と比較して短かったが、肥大していた。エンドテリン−処理細胞中の線維は並列で器質化されず、外観はもつれたようであったが、顕著な凝結はみられなかった。ｍＬＩＦ、ｍＬＩＦおよびエンドテリンの組み合わせ、およびフェニルエフリンでの処理筋細胞中の線維は並んで、肉腫様ユニットを示す顕著な凝結を伴って器質化した。ｍＬＩＦ−処理細胞中で収縮性線維は突起の先端に伸長しているのが見られた。Ｆig６の結果はＬＩＦおよびエンドテリンがＡＮＰ産生に関して加法的であることを示しており（Ｆig６Ａ）、細胞の大きさに関して肥大度として示されている（Ｆig６Ｂ）。Ｄ．非−筋細胞の確認免疫化学的検討では、培養心臓非−筋細胞の大多数は緊張した線維状態で、平滑筋アクチンに対する抗体で染色された。アルファ平滑筋アクチンの発現が新生ラット心臓組織から誘導された培養線維芽細胞中で観察された。Brouty-Boyleら、In Vitro Cell Dev．Biol.,28A:293-296(1992)。これらの検討における筋細胞はこのアクチンイソフォームもまた発現し、染色像による線維芽細胞と区別することができた。類似の緊張線維染色像が、ロングら、上掲、により心臓非−筋細胞の検討において報告されている。非−筋細胞の１％以下は内皮細胞（フォンヴィレブラント因子に対する抗体により）および筋細胞（肉腫トロポミオシンに対する抗体により）であることが判明した。一次抗体が除去されたスライド上には染色はなかった。エンドテリンおよびＬＩＦ肥大活性を遮断するためにこの実施例中で用いられた試剤は特異的であると見られる。ＢＱ−１２３のみがエンドテリン−１により誘発された肥大活性を遮断し、ＣＴ−１、マウスＬＩＦ、またはフェニルエフリンにより誘発された肥大活性を遮断しなかった。エンドテリン−１および−２およびビッグエンドテリンを測定した、エンドテリンについての放射性免疫試験ではＮＣＭ中のエンドテリンの存在についての受容体遮断剤データが確認された。この実施例中で用いられたＬＩＦモノクローナル抗体は、組換ヒトＬＩＦに対して創生され、ヒトおよびマウスＬＩＦによって誘発された肥大に対して中和活性を示しが、ＣＴ−１−、エンドテリン−、またはフェニルエフリン−誘発肥大に対しては中和活性を示さなかった。４つのモノクローナル抗体（ＭabＤ３.１４.１、ＭabＤ４.１６.９、ＭabＤ２５.１.４、ＭabＤ６２.３.２、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランドに、１９９２年６月２３日付で寄託され、それぞれ、ＨＢ１１０７６、ＨＢ１１０７７、ＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のＡＴＣＣ受託番号が与えられた）が購入され、それぞれ組換ヒトＬＩＦの異なるエピトープを認識した。これらのうちの３つ（ＭabＤ４.１６.９、ＭabＤ２５.１.４、ＭabＤ６２.３.２）はマウスおよびヒトＬＩＦにより誘発された筋細胞肥大を中和し、２つ（ＭabＤ２５.１.４、ＭabＤ６２.３.２）は、ＮＣＭにより誘発された肥大の阻害が同程度であった。ＭabＤ３.１４.１は筋細胞肥大を誘発するマウスまたはヒトＬＩＦの能力を中和しなかった。ＮＣＭ中のラットＬＩＦ濃度の概算は、マウスおよびヒトＬＩＦ−誘発肥大活性を中和するモノクローナル抗体のうちの２つおよび標準としてのマウスＬＩＦによるＥＬＩＳＡサンドイッチ法を用いて行った。ラットＬＩＦのアミノ酸配列はマウスＬＩＦとの類似が９２％である。グーら、Growth Factors，7:175-179(1992)。この培養系では、精製ＬＩＦもエンドテリン単独でも、筋細胞の大きさおよびＡＮＰ産生の両方に関して、ナノモル濃度でさえも最大肥大応答を誘発しなかった。さらに、各試剤はフェニルエフリンによって誘発されたものとは異なる形態学的特徴を誘発した。しかし、ＬＩＦおよびエンドテリンを一緒にしたときは、細胞の大きさ、形態学的特徴、および収縮性線維器質化において、ＮＣＭで処理したものに類似した最大肥大が筋細胞中に誘発された。もしエンドテリン活性が遮断されているとしたら予想されるように、ＮＣＭおよびＢＱ−１２３で処理された筋細胞は、精製ＬＩＦで処理された筋細胞に似ていた。ＬＩＦおよびエンドテリンで誘発された応答は細胞の大きさおよびＡＮＰ形成に関して加法的である。免疫蛍光試験は、この実施例における非−筋細胞培養は、１％以下の内皮細胞および筋細胞とともに、本質的に線維芽細胞−様細胞（平滑筋アクチンに対する抗体で染色された）を含むことを示している。要約すると、ＬＩＦおよびエンドテリンが、培養心臓新生児ラット筋細胞に対する肥大活性の大部分に応答し得る、培養心臓新生児ラットＮＣＭ中の因子として確認された。エンドテリンおよびＬＩＦの存在は免疫試験により確認され、２００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあることが判明した。精製ＬＩＦおよびエンドテリンは、各分子についての形態学的特徴を伴った部分的肥大応答を誘発したが、因子単独では組み合わせで見られた最大肥大応答を促進しなかった。両方の試剤の組み合わせに対する応答は、筋細胞の大きさ、形態学的特徴、ＡＮＰ産生および収縮性線維の器質化に関して加法的であると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ルイス，エリザベス・エイアメリカ合衆国94117カリフォルニア州サン・フランシスコ、ベイカー・ストリート・ナンバー602、333番 (72)発明者マザー，ジェニー・ピーアメリカ合衆国94030カリフォルニア州ミルブレイ、ラ・プレンダ・ドライブ269 番 (72)発明者パオニ，ニコラス・エフアメリカ合衆国94002カリフォルニア州ベルモント、テラス・ドライブ1756番

Claims

【特許請求の範囲】１．肥大を阻害または減少させるための心不全の経歴のある哺乳動物の処置方法であって、上記処置を必要とする哺乳動物に、白血病抑制因子アンタゴニストの治療的有効量を慢性的に投与することを特徴とする方法。２．アンタゴニストが抗体である、請求項１記載の方法。３．抗体がモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。４．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７７、ＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項３記載の方法。５．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項４記載の方法。６．肥大を阻害または減少させるための心不全の経歴のある哺乳動物の処置方法であって、上記処置を必要とする哺乳動物に、白血病抑制因子（ＬＩＦ）アンタゴニストおよびエンドテリンアンタゴニストの治療的有効量を慢性的に投与することを特徴とする方法。７．エンドテリンアンタゴニストが環状ペンタペプチドである、請求項６記載の方法。８．環状ペンタペプチドエンドテリンアンタゴニストがＢＱ１２３である、請求項７記載の方法。９．ＬＩＦアンタゴニストが抗体である、請求項６記載の方法。 10．エンドテリンアンタゴニストが環状ペンタペプチドである、請求項９記載の方法。 11．抗体がモノクローナル抗体である、請求項９記載の方法。 12．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７７、ＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項１１記載の方法。 13．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項１２記載の方法。 14．２つのアンタゴニストが別々に投与される、請求項６記載の方法。 15．２つのアンタゴニストが１個の製剤で投与される、請求項６記載の方法。 16．白血病抑制因子（ＬＩＦ）アンタゴニストおよびエンドテリンアンタゴニストの治療的有効量を含む組成物。 17．白血病抑制因子に対するアンタゴニスト抗体と環状ペンタペプチドエンドテリンアンタゴニストおよび医薬的に許容され得る担体を含む、請求項１６記載の組成物。 18．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７記載の組成物。 19．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７７、ＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項１８記載の組成物。 20．モノクローナル抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１０７４およびＨＢ１１０７５のもとに寄託された、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体からなる群から選ばれるものである、請求項１９記載の組成物。