JPH1072495A - 免疫関連因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫応答に関わる新規なポリペプチドを得る
ものである。 【解決手段】 免疫応答に関わる新規なポリペプチドを
コードする新規なＤＮＡ、そのＤＮＡがコードするポリ
ペプチド、及びそのＤＮＡを有する発現ベクター、さら
に該ポリペプチドを特異的に認識する抗体からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は免疫関連因子に関
し、更に詳しくは、ヒト由来細胞が発現する新規ポリペ
プチド、及びその製造方法に関する。本発明はまた、遺
伝子工学的技術を用いてクローニングされた該ポリペプ
チドの遺伝子に関する。また本発明は該ポリペプチドの
アミノ酸配列から合成されたＤＮＡ断片並びにＲＮＡ断
片に関する。また本発明は遺伝子工学的技術を応用して
作製される該ポリペプチドをコードするＤＮＡとベクタ
ーＤＮＡからなる組換えＤＮＡ体に関する。本発明はま
た、遺伝子工学的技術を応用して作製される該ポリペプ
チドを発現する形質転換細胞に関する。更に本発明は、
遺伝子工学の技術を応用した、該ポリペプチドの製造方
法に関する。更にまた本発明は、該ポリペプチドと特異
的に結合する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】リンパ系はリンパ球、上皮細胞及び支持
細胞から成り、器官、或いは組織を形成して免疫反応を
担っている。リンパ器官は、リンパ球がリンパ系幹細胞
から分化、増殖して機能を持つ効果細胞にまで成熟する
場である１次リンパ器官と、リンパ球が相互に或いは抗
原と反応し得る環境を作り出し、いったん起こった免疫
応答を広める役目を果たす２次リンパ器官とに分類され
る。

【０００３】リンパ節は、２次リンパ器官として機能す
る主要器官の一つであり、皮質、傍皮質（Ｔ細胞領域）
及び中心部の髄索から成る。皮質に存在する胚中心（二
次濾胞）や濾胞樹状細胞（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅ
ｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ＦＤＣ）がＴ細胞依存性
抗原刺激特異的なＢ細胞の増殖分化の誘導などに深く関
わっていると考えられている。

【０００４】リンパ球の活性化には細胞間相互作用が重
要であると考えられており、リンパ球間での細胞間相互
作用においてはサイトカインとともにＣＤ４０／ＣＤ４
０ＬやＣＤ８０、ＣＤ８６とそのリガンドであるＣＤ２
８などの接着分子を介したシグナルが重要な役割を果た
していることが明らかになりつつある。しかし、リンパ
球の支持組織としてリンパ球の活性化に関与するリンパ
節については組織、細胞の性状を含めて活性化の機構に
ついてよくわかっていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】免疫応答を制御する上
で抗原提示細胞と応答性細胞との細胞間相互作用を解析
することは重要である。リンパ節は二次免疫応答におい
て重要な役割を果たしているが、リンパ節組織細胞とリ
ンパ球細胞間の細胞間相互作用に関わる因子については
まだ明らかになっていない。従って本発明の目的はリン
パ節組織細胞に特異的に発現し、免疫応答に関わる新規
ポリペプチドを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】特定の組織細胞に特異的
に発現する遺伝子のクローニングは、例えばサブトラク
ションクローニング法、ディファレンシャルディスプレ
ー法（Ｐ．Ｌｉａｎｇａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，９６７，１９９２）、ディフ
ァレンシャルスクリーニング法、また、適当なプローブ
を用いたクロスハイブリダイゼーション法などを用いて
行われる。

【０００７】サブトラクションクローニング法は、特定
の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、
該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすることにより遺伝子をクローニングする
方法である。即ち、目的とする特定の細胞、つまりリン
パ節からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製し、
そして対照となる細胞、即ち生物種が同一で異なる系列
の細胞、例えば末梢血、胸腺、脾臓などからもＲＮＡを
抽出する。

【０００８】次いで、リンパ節から精製したｍＲＮＡを
鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に
α−³²ＰｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識するこ
とができる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮ
Ａは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成し
ているが、アルカリ存在下で高温処理することによりｍ
ＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一
本鎖ｃＤＮＡと対照細胞から抽出したＲＮＡを混合し、
適当な条件下で静置すると塩基配列の相補性に依存して
安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。

【０００９】即ち、対照細胞でも発現しているｍＲＮＡ
を鋳型として合成されたｃＤＮＡはハイブリッドを形成
するが、リンパ節に特異的に発現しているｍＲＮＡを鋳
型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。ハイドロキシ
アパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
と一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精
製する。このステップを繰り返すことで目的とした細胞
に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮され
た特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素で標識されているの
で、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプロー
ブとして使用することができる。

【００１０】ディファレンシャルディスプレー法は、Ｒ
ＮＡｍａｐＴＭＫｉｔ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ社製）を用い、添付のプロトコールに従
って行うことができる。即ち、目的の細胞、つまりリン
パ節から抽出したＲＮＡからアンカープライマー［Ｔ１
２ＭＧ、Ｔ１２ＭＡ、Ｔ１２ＭＴ、Ｔ１２ＭＣ（Ｍ：
Ａ，Ｇ，Ｃミクスチュアー）］を用いてｃＤＮＡを合成
し、次に、このｃＤＮＡを鋳型としてランダム １０ｍ
ｅｒ プライマー（ＡＰ１〜ＡＰ２０）とアンカープラ
イマーにより³⁵Ｓ存在下でＰＣＲを行う。

【００１１】ここで得たＰＣＲ産物をアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分離する。対照となる細胞、例えば
末梢血、胸腺、脾臓などから抽出したＲＮＡについて同
様の操作を行って得た電気泳動像を前述の電気泳動像と
比較し、リンパ節において強く増幅されているバンドを
特定し、バンドの位置のゲルを切り出す。切りだしたゲ
ル断片からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲに
よってバンドを増幅し、適当なベクター、例えばｐＴ７
Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクロー
ニングし、塩基配列を決定することができる。

【００１２】ディファレンシャルスクリーニング法は、
目的の細胞から精製したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ
ライブラリーを、目的の細胞のｍＲＮＡから合成した³²
Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと対照の細胞のｍＲＮＡから作
製したプローブを用いてスクリーニングし、目的細胞の
プローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する
方法である。即ち、リンパ節から精製したｍＲＮＡから
常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製する。そのラ
イブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。

【００１３】次に、リンパ節から精製したｍＲＮＡを鋳
型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時にα
−³²ＰｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識すること
ができる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡ
は安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成して
いるが、アルカリ存在下で高温処理することによりｍＲ
ＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様に
して対照の細胞、例えば末梢血、脾臓、胸腺などから精
製したｍＲＮＡを鋳型にして³²Ｐで標識された一本鎖ｃ
ＤＮＡを作製する。

【００１４】両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして
リンパ節ライブラリーから作製したフィルターとハイブ
リダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオ
グラフィー像を比較し、リンパ節ｃＤＮＡプローブにの
みハイブリダイズするクローンを選ぶことによりリンパ
節に特異的に発現する遺伝子をクローニングすることが
できる。

【００１５】クロスハイブリダイゼーション法は、目的
の細胞のｃＤＮＡライブラリーを適当なＤＮＡをプロー
ブとしてストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイ
ゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られたクロ
ーンをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーション
を行い目的細胞にのみ発現しているクローンを選択す
る。本発明者らは、本発明のリンパ節特異的に発現する
新規なポリペプチド遺伝子を取得するために上述したサ
ブトラクションスクリーニング法、ディファレンシャル
ディスプレー法を試みたが目的とする遺伝子のクローニ
ングには至らなかった。

【００１６】次に、下記の理由により、１）ＣＤ４０
Ｌ、２）ＶＣＡＭ−１、３）Ｈｔｋリガンド（以下Ｈｔ
ｋ−Ｌという）（国際公開番号 ＷＯ９６／１１２１
２）、の遺伝子断片をそれぞれプローブとしてリンパ節
ｃＤＮＡライブラリーのクロスハイブリダイゼーション
によるスクリーニングを試みた。

【００１７】１）ＣＤ４０ＬはＴＮＦスパーファミリー
に属するタイプII型の膜糖蛋白である（Ｄ．Ｈｏｌｌｅ
ｎｂａｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，
４３１３，１９９３）。活性化Ｔ細胞に発現し、成熟Ｂ
細胞上に発現するＣＤ４０との相互作用によってＴ細胞
依存性のＢ細胞活性化において重要な補助刺激シグナル
が伝達され、その結果、Ｂ細胞の増殖並びに抗体産生が
誘導されると考えられている。従って、ＣＤ４０Ｌに関
連した、リンパ節に特異的に発現し免疫応答に関与する
因子が存在する可能性が考えられる。

【００１８】２）ＶＣＡＭ−１はサイトカイン刺激によ
り血管内皮細胞に発現するリンパ球接着機能をもつ接着
分子であり、白血球の再循環や炎症局所への白血球浸潤
に関与するとともに、ＦＤＣに恒常的に発現し、活性化
Ｂ細胞を結合してリンパ濾胞の形成と胚中心におけるＢ
細胞の選択に関与していると考えられている（Ａ．Ｓ．
Ｆｒｅｅｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４９，１０３０，１９９０）。しかし、一方では当初、
生体の炎症反応に重要な役割を果たしていると考えられ
ていたが、炎症部位の血管内皮細胞についての発現が低
いことから、炎症部位への浸潤には関係ないとも見られ
ている。従って、ＶＣＡＭ−１に関連した、リンパ節に
特異的に発現し免疫応答に関与する因子が存在する可能
性が考えられる。

【００１９】３）Ｈｔｋ−ＬはＥｐｈファミリーに属す
るチロシンキナーゼのリガンドの一つであり、神経系、
造血系の未分化細胞の分化・増殖に関与しているとの知
見に基づき、同リガンドファミリーが免疫担当細胞の成
熟・分化にも関与している可能性があると考えられる。

【００２０】上記のＣＤ４０Ｌ、ＶＣＡＭ−１の遺伝子
断片をプローブとしたスクリーニングの結果、複数の陽
性クローンを得たが新規、かつリンパ節に特異的に発現
するクローンを取得することはできなかった。しかし、
Ｈｔｋ−Ｌ遺伝子断片の一部をプローブとしてリンパ節
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを試み、４８ク
ローンの陽性クローンを単離し、各々についてノーザン
ハブリダイゼーションを行って発現組織の解析を行った
結果、リンパ節、虫垂に特異的に発現する本発明の新規
ポリペプチド遺伝子のクローニングに成功した。

【００２１】本発明者らは直ちに該ポリペプチド遺伝子
の全長を含むｃＤＮＡを取得し、塩基配列を決定し、該
ポリペプチドの全長のアミノ酸配列を決定した。次に、
該ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを用いて該ポリペプチド
の発現系を作製し、組換え該ポリペプチドを得た。更
に、該組換えポリペプチドを免疫原として抗体を作製
し、精製法を確立し本発明を完成した。

【００２２】即ち本発明によれば、配列表の配列番号１
で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペプチドが提
供される。また、本発明の他の態様によれば、配列表の
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有する、配列番
号２で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペプチド
が提供される。また、本発明の他の態様によれば、配列
表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡが提供される。また、本発
明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表される
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａが提供される。

【００２３】更に又、本発明の他の態様によれば、配列
表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細
胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換
えＤＮＡ体が提供される。更に又、本発明の他の態様に
よれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を
含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配
列と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結
してなる組換えＤＮＡ体が提供される。更にまた、本発
明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表される
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクター
ＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体により形質転換
された細胞が提供される。

【００２４】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主
細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組
換えＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供される。
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番
号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
産生し得る細胞を培地中にて培養し、その培養液中に該
ポリペプチドを産生させ、培養液から培養上清を回収
し、回収した培養上清から該ポリペプチドを分離・精製
することを含む該ポリペプチドの製造方法が提供され
る。

【００２５】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを産生し得る細胞を培地中にて培養後細胞を
集め、これを破壊した後、細胞抽出液を該ポリペプチド
と特異的に結合することを特徴とする抗体を用いて免疫
沈降させることにより、ポリペプチドを分離・精製する
ことを含む該ポリペプチドの製造方法が提供される。更
にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号
２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの少
なくとも一部と特異的に結合する抗体が提供される。

【００２６】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号４の塩基配列の少なくとも１８個の連続
した塩基配列を含有するセンスＤＮＡ、該センスＤＮＡ
に相補的なアンチセンスＤＮＡからなる群より選ばれる
単離されたＤＮＡ断片、及び該センスＤＮＡ及び該アン
チセンスＤＮＡを、それぞれ、メチル化、メチルフォス
フェート化、チオフォスフェート化または脱アミノ化す
ることにより得られる、該センスＤＮＡ及び該アンチセ
ンスＤＮＡの誘導体からなる群より選ばれる単離された
ＤＮＡ断片が提供される。

【００２７】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号４の塩基配列に相補的な少なくとも１８
個の連続した塩基配列を含有するアンチセンスＲＮＡ、
該アンチセンスＲＮＡに相補的なセンスＲＮＡからなる
群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片、及び該アンチセ
ンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡを、それぞれ、メチル
化、メチルフォスフェート化、チオフォスフェート化ま
たは脱アミノ化することにより得られる、該アンチセン
スＲＮＡ及び該センスＲＮＡの誘導体からなる群より選
ばれる単離されたＲＮＡ断片が提供される。

【００２８】本発明の新規なポリペプチド遺伝子のクロ
ーニング方法について以下に詳細に述べる。本発明の新
規なポリペプチドの遺伝子は該ポリペプチドを産生して
いる組織または細胞、例えばリンパ節の遺伝子ライブラ
リーからクローニングすることができる。遺伝子ライブ
ラリーは目的とする細胞からｍＲＮＡを精製し、該ｍＲ
ＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重
鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラ
スミドで宿主を形質転換することにより作製することが
できる。

【００２９】ヒトリンパ節からのＲＮＡは、グアニジン
チオシアネート法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂ．，１９８９）などによって調製することが
できる。次に、常法に従ってｍＲＮＡを得る。この際、
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファル
マシア社製）を用いることができる。この様にして得ら
れたｍＲＮＡを鋳型とし、例えば岡山バーグの方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，２，１６１，１９８２及び、同誌，３，２８
０，１９８３）に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤ
ＮＡをプラスミドに組み込む。

【００３０】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社
販）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主
内で複製増殖できるものであればいずれをも用いること
ができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターと
しては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられ
るが、その他のものであっても宿主内で増殖できるもの
であれば用いることができる。この様にして得られたプ
ラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属菌などにカルシウムクロライド法などを用いて導入す
る。

【００３１】上記エシェリヒア属菌の例としては、エシ
ェリヒア コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ
３９２、ＪＭ１０５などが挙げられる。上記バチルス属
菌の例としては、バチルス サチリスＭＩ１１４などが
挙げられる。またファージベクターは、例えば増殖させ
た大腸菌にインビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７１，２４４
２］を用いて導入することが出来る。

【００３２】上記の方法により本発明ポリペプチドのｃ
ＤＮＡを含有する該ポリペプチド産生細胞のｃＤＮＡラ
イブラリーを作製することが出来る。該ｃＤＮＡライブ
ラリーから該ポリペプチドをコードするＤＮＡをクロー
ニングする方法としては、例えばファージベクターλｇ
ｔ１０を用いて作製した該ポリペプチドｃＤＮＡライブ
ラリーとＨｔｋリガンド遺伝子（国際公開番号 ＷＯ９
６／１１２１２：寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５００８）
のＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３）
をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーショ
ン法などが挙げられる。

【００３３】上記ハイブリダイゼーションで陽性となっ
たクローンの発現組織を例えばノーザンブロットハイブ
リダイゼーションによって解析し、リンパ節に特異的に
発現するクローンを得ることができる。このようにして
得られたＤＮＡの塩基配列を例えばサンガーらの方法
［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３］
によって決定することができる。以上のようにして該ポ
リペプチドをコードするＤＮＡが得られる。該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を配列
表の配列番号４に示した。

【００３４】本ＤＮＡ配列には９８番目に始まる開始コ
ドン（ＡＴＧ）から１６９６番目で終わる終止コドン
（ＴＧＡ）まで、５３２個のアミノ酸配列をコードし得
るオープンリーディングフレームが存在した。該オープ
ンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配
列表の配列番号２に示した。該アミノ酸配列をＫｙｔｅ
−Ｄｏｏｌｉｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１
５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から
疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明
のポリペプチドは細胞膜タンパクとして、細胞上に発現
されることが予想された。尚、本新規ポリペプチドｃＤ
ＮＡの全塩基配列を含むプラスミドｐ＃５３−４を大腸
菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に遺伝子導入して得た形質
転換体をＪＭ１０９−ｐＵＣＬＩＣと命名した。この形
質転換体株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＥ．
ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＬＩＣとして平成８年１
０月３０日に寄託され、受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５
９２１である。

【００３５】つまり、この解析結果によれば該ポリペプ
チドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸
配列の−１６番から−１番にあたる１６アミノ酸から構
成されるシグナルペプチド、配列表の配列番号２のアミ
ノ酸配列の１番から４３６番にあたる４３６アミノ酸か
ら構成される細胞外部分、配列表の配列番号２のアミノ
酸配列の４３７番から４５９番にあたる２３アミノ酸か
ら構成される細胞膜貫通部分、配列表の配列番号２のア
ミノ酸配列の４６０番から５１６番にあたる５７アミノ
酸から構成される細胞内部分より構成される。ただし、
各部分はあくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイ
ン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態
は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記
に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から
１０アミノ酸配列前後することも考えられる。

【００３６】配列表の配列番号３に記載したアミノ酸配
列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の５０番から
１５９番に当たるアミノ酸配列であり、後述するポリＩ
ｇレセプターにホモロジーが最も高いドメインのアミノ
酸配列を示す。また、配列表の配列番号１に記載したア
ミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１
番から４２８番に当たる部分のアミノ酸配列、すなわち
シグナルペプチドを除く上記の細胞外部分のアミノ酸配
列を示す。

【００３７】アミノ酸配列から予想されることとして、
糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンがＮ−グリコシド結合可能な部分として、配列表の配
列番号２のアミノ酸配列の１５１番及び２６０番のアス
パラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−
ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分と
して、セリンまたはスレオニン残基の頻出する部分が考
えられるが、特にその可能性の高い部分として、配列表
の配列番号２のアミノ酸配列の１６０番のセリン残基が
挙げられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方が
ポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対
して安定性であり、また強い生理活性を有していると考
えられる。

【００３８】本発明で明らかにされた該ポリペプチドの
遺伝子配列並びにアミノ酸配列をジェンバンク（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ、１９９５年１０月、リリース９１）において
検索したところ、最も類似性のある物質として、ポリＩ
ｇレセプター（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｍｏｓｔｏｖ，
Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３０８，３７，１
９８４，：Ｋｒａｊｃｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５
８，７８３，１９８９、ジャンピエール、特許公表 平
５−５０１１１８号参照）が挙げられたが、全長として
は有意なホモロジーは見出されず、最も類似性の高い部
分は配列表の配列番号２の５０番から１５９番にあたる
領域であったが、この部分においても相同性は４５％程
度と極めて低いものであった。

【００３９】従って、本発明のポリペプチドは全く新規
な物質である。また、プローブとして用いたＨｔｋ−Ｌ
分子のｃＤＮＡとのホモロジーは、配列表の配列番号４
の５１１番から７００番に見いだされたが４７％程度し
かなく、またアミノ酸としてのホモロジーも１９％しか
なかった。

【００４０】この類似性が見いだされたポリＩｇレセプ
ターは５個の免疫グロブリン様ドメインをもつ膜貫通型
タンパク質であり、細胞外の第一ドメインで二量体Ｉｇ
Ａと結合し、これを上皮細胞へと取り込む。次に、細胞
内輸送小胞として上皮細胞の腸管腔側へ移動し腸管側細
胞膜と癒合することによって分泌型ＩｇＡが腸管腔へ分
泌される。分泌に際しポリＩｇレセプターは蛋白質分解
酵素により細胞膜付近で切断され、分泌成分（ｓｅｃｒ
ｅｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＣ）としてＩｇＡ
やＪ鎖とともに分泌型ＩｇＡを構成する。分泌型ＩｇＡ
は以下に示す機構により腸管粘膜において感染防御機能
を発揮する。即ち、分泌型ＩｇＡは特異抗原との間に架
橋を起こしやすく、その結果分泌型ＩｇＡが結合した微
生物の運動や増殖を著しく抑制する。

【００４１】また、分泌型ＩｇＡはＳＣをもち親水性に
富むため抗原と結合して親水性の高い複合体をつくり粘
液層内への抗原親和性を高めると考えられる。これは同
時に疎水性に富む細胞膜への抗原の親和性を低下させる
ことにもつながり、細菌などが上皮細胞へ接着すること
を阻害する。分泌型ＩｇＡは細菌表面分子に対する抗体
であることが多く、細菌表面に存在する上皮細胞への接
着分子を遮蔽することにより感染防御機能を発揮する。
また、分泌型ＩｇＡや分泌型ＩｇＡ抗原複合物はＦｃレ
セプターを介してリンパ球、マクロファージ、単球など
に結合し、抗原特異的ＩｇＡ免疫応答を更に高め、粘膜
に於ける二次免疫応答持続に働いていると考えられてい
る（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２，１６６５，１９９
０）。

【００４２】腸管粘膜において二量体ＩｇＡが分泌型Ｉ
ｇＡとして上述のような免疫作用を発揮するためにはポ
リＩｇレセプターが必須であり、粘膜が皮膚同様生体の
内外を分ける隔壁であり、外界からの侵襲に対する粘膜
の防御機構が生体にとって極めて重要であることから、
ポリＩｇレセプターは感染防御の観点から重要な分子の
一つである。

【００４３】配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と
上記のポリＩｇレセプターのアミノ酸配列を詳細に比較
したところ、ポリＩｇレセプターの抗体結合ドメインで
ある第一ドメインと本新規ポリペプチドの配列表の配列
番号３が最も高いホモロジーを示し約４５％であり、該
ポリペプチドが抗体結合活性を有することが示唆され
た。また、細胞内部分の配列表の配列番号２のスレオニ
ンを含む４６９番から４７２番の４アミノ酸はポリＩｇ
レセプターのトランスサイトーシスに関わるリン酸化部
位である６６４番目のセリンを含む６６２番から６６５
番の４アミノ酸（Ｈｉｒｔ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ，７４，２４５，１９９３）と配列相同性が認め
られた。

【００４４】タンパク質における分子間相互作用は、例
えば免疫沈降法、酵素免疫測定法、また、表面プラズモ
ン共鳴センサーであるＢＩＡｃｏｒｅ（フアルマシアバ
イオテク社製）を用いて調べることができる。免疫沈降
法とは抗体を用いて目的のタンパク質を微小なスケール
で精製して解析する実験法である。つまり、目的のタン
パク質を含む溶液に抗体とプロテインＡビーズを加え、
抗原−抗体−プロテインＡビーズ複合体を形成させて、
遠心して分離する。この複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、ウエスタンブロットなどを行い、目的のタンパク質
と結合しているタンパク質の探索を行うことができる。

【００４５】ＢＩＡｃｏｒｅでの分子間相互作用の検出
は以下のようにして行うことができる。まず、相互作用
する分子の一方をリガンドとしてセンサーチップ上に固
定し、他方をアナライトとしてセンサーチップ上にイン
ジェクトする。インジェクトされたアナライトは一定の
流速でセンサーチップ上に供給され、固定化されたリガ
ンド中に拡散していくことになる。両者にアフイニテイ
ーが存在すればアナライトはリガンドと結合し、アナラ
イトがセンサーチップ上に濃縮される。そのときのセン
サーチップのマス変化が光学的に検出されリアルタイム
にセンサーグラムが描かれ、結合曲線として観察するこ
とができる（実験医学別冊 バイオマニュアルＵＰシリ
ーズ タンパク質の分子間相互作用実験法 羊土社）。

【００４６】本発明者らは、本新規ポリペプチドとヒト
抗体との分子間相互作用を、実施例１０に記載した酵素
免疫測定法を用いて検出した。即ち、実施例８に記載の
方法に従って取得した本発明の新規なポリペプチドの細
胞外部分蛋白を９６穴のイムノプレート（ヌンク社製）
に固定し、次にヒト免疫グロブリンを含む溶液を反応さ
せ、本新規ポリペプチドとヒト免疫グロブリンの複合体
を形成させる。次いでヒト免疫グロブリンを特異的に認
識するペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ
抗体を反応させ、ペルオキシダーゼに対する基質を作用
させて吸光度を測定する。本新規ポリペプチドの細胞外
部タンパク質の吸光度は対照に比べ有意に高く、本発明
の新規ポリペプチドがヒト抗体と結合する活性を有して
いることが示された。従って、本発明の新規ポリペプチ
ドは、２次リンパ器官であるリンパ節、虫垂において、
抗原抗体複合体と結合することによって抗原特異的な二
次免疫応答を誘導する因子の一つとして働いている可能
性が極めて高いことが示唆された。

【００４７】本発明のポリペプチドは、配列表の配列番
号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを構
成成分とし、好ましくは配列表の配列番号１、更に好ま
しくは配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを構成成分とする。また本発明のポリ
ペプチドは配列表の配列番号１または２または３のアミ
ノ酸配列の一部を欠くもので有り得るし、ポイントミュ
ーテーションの手法により部分的に変異させることもで
きるものであって、いずれにせよ本発明のポリペプチド
の配列表の配列番号１または２または３の性質を失わな
いものは本発明に含まれる。

【００４８】また、そのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ
末端に多少のアミノ酸残基、ペプチド残基が付加される
ことも有り得る。更にまた、そのアミノ酸配列中にＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミンなどの糖鎖が、Ｎ−グリコシドあるいはＯ−
グリコシド結合してなるものも本発明に含まれる。上記
の該ポリペプチドの変異体と該ポリペプチドとのアミノ
酸配列の相同性は、通常６０％以上であることが好まし
く、特に７０％以上が好ましく、さらに８０％以上が好
ましく、とりわけ９０％以上である場合が好ましい。

【００４９】上記のようにしてクローン化された本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのま
ま、または所望により制限酵素で消化して使用すること
ができる。クローン化されたＤＮＡから発現させたい領
域を切り出し、発現に適したベクター中のプロモーター
の下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。

【００５０】実施例３及び５に記載したように、本発明
のポリペプチドの発現させる形態としては、配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするｃＤＮＡを用いる方法でもよい。しかしなが
ら、この状態では膜結合型であり、精製、製剤化などを
より効率的に行うために、実施例４及び６に記載したよ
うに、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列、す
なわち該ポリペプチドの細胞外部分のみを発現させるこ
とができ、またその方が好ましい。したがって、細胞外
部分を含有する形態を配列表の配列番号４に記載のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、分泌型で発現、生
産させることも可能である。

【００５１】また、さらにその形態としては単独の化合
物でもかまわないが、複合体の形態を有するポリペプチ
ドでも可能である。本発明で使用する”複合体”は２種
類以上の物質を単に混ぜ合わせた混合物ではなく、１種
類もしくは２種類以上の化合物が共有結合を含む何らか
の結合様式を有してなる化合物、コンジュゲート、また
はコンプレックスの総称を意味する。そのような例とし
ては、イムノグロブリンとのキメラタンパクのジスルフ
ィド結合による共有結合を介した複合体、または実施例
６で作製されたＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドと抗
ＦＬＡＧ抗体による抗原抗体反応を介した複合体などの
形態が挙げられる。

【００５２】さらに、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラ
タンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジ
スルフィド結合をした多量体として発現させる方法、ま
た、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキ
メラタンパクとして発現させ、発現させた該ポリペプチ
ドの細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ
末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させ
ることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。

【００５３】さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領
域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィ
ド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他の
該ポリペプチドの活性に何等影響を与えない方法でジス
ルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末
端もしくはその他の部位に発現するように作成された融
合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有
する多量体型該ポリペプチドを得ることもできる。

【００５４】また、さらに配列表の配列番号１のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡをアミノ酸に翻訳するさいに
フレームの合う形で２つ以上直列に並べ多量体構造を発
現させる方法などもある。その他、現在知られている２
量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可
能である。したがって、遺伝子工学的な技術により２量
体もしくはそれ以上の形態を有す形の該ポリペプチド、
もしくは配列表の配列番号３もしくは１に記載のアミノ
酸配列の１部もしくは全部を含有してなる化合物に関し
ても本発明に含まれる。かくして得られた該複合体を用
いれば、研究用試薬として新規免疫関連因子の生理活性
探索が可能である。該免疫関連因子はリンパ節、虫垂に
特異的に高い発現が認められる。これらの部位の組織を
分離し、あるいは各種細胞株を利用して、該複合体を作
用させることにより、インビトロの生理活性探索が可能
である。さらにこのアッセイ系を応用すれば、該複合体
の作用を阻害する化合物のスクリーニングが可能であ
る。

【００５５】本発明の新規ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、又３’末
端には翻訳終結コドンを有していてもよい。これらの翻
訳開始コドンや翻訳終結コドンは、適当な合成ＤＮＡア
ダプターを用いて付加することもできる。さらに該ＤＮ
Ａを発現させるにはその上流にプロモーターを接続す
る。ベクターとしては上記の大腸菌由来のプラスミド、
枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラスミド、或いは
λファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙
げられる。

【００５６】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好
ましく、宿主がバチルス属菌である場合はＳＰＯ１プロ
モーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主
が酵母である場合はＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモ
ーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。

【００５７】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーターなどがそれぞれ利用できる。この様にして構築さ
れた該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現
プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。宿主とし
ては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動
物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサ
ル細胞であるＣＯＳ−１、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハム
スター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられ
る。

【００５８】このようにして本発明の新規ポリペプチド
をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドで形質転
換された形質転換体が得られる。各形質転換体をそれぞ
れ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件に
より培養することによって該ポリペプチドを製造するこ
とができる。上記培養物から該ポリペプチドを分離精製
するには、例えば下記の方法により行うことができる。

【００５９】該ポリペプチドを培養菌体或いは細胞から
抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体或いは
細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リ
ゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体或いは
細胞を破壊した後、遠心分離や濾過により該ポリペプチ
ドの粗抽出液を得る方法などを適宜用い得る。緩衝液中
に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン
Ｘ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培
養液中に該ポリペプチドが分泌される場合には、培養終
了後、それ自体公知の方法で菌体或いは細胞と上清とを
分離し上清を集める。この様にして得られた培養上清、
或いは抽出液中に含まれる該ポリペプチドは、実施例９
に記載した方法により得た該ポリペプチドに対する抗体
により精製することができる。

【００６０】かくして得られた新規なポリペプチドは、
研究用試薬として、また該ポリペプチド単独で、あるい
は少なくとも１種の薬剤として投与可能な担体、希釈液
または賦型剤を添加して適当な剤型とし、リンパ球の活
性化を制御し、免疫関連疾患及び感染症の治療用薬剤と
しても使用される。対象となる免疫関連疾患としては、
例えば重症複合免疫不全症などの免疫不全症、あるい
は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの
自己免疫疾患が挙げられる。本発明のポリペプチドを医
薬品として用いる場合には本発明のポリペプチドの凍結
乾燥品を、注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用
することが望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／
ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供するこ
とが簡便である。また、マウスに対して本発明のポリペ
プチド１ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した実験において、マ
ウスの死亡例は確認されなかったことから、医薬品とし
て使用可能であることが確認された。

【００６１】本発明の新規なポリペプチドの成人１回当
りの投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異
なるが、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであ
り、１日当り１回または必要に応じて数回投与すること
ができる。また本発明の新規なポリペプチドを注射剤と
して用いる場合、ショ糖、グリセリン、メチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース等の増粘剤、各種無機
塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えることができる。

【００６２】また、本発明の新規なポリペプチド遺伝子
を用いて、ゲノムから該ポリペプチド遺伝子の発現を制
御し得るプロモーター配列を取得することが可能であ
り、該プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子など
のレポーター遺伝子を連結し、適当な細胞にトランスフ
ェクトし、該細胞を各種の検体、例えば任意の配列を有
するペプチド、または各種の化合物、または各種の微生
物による発酵生産物などを用いて刺激し、レポーター遺
伝子の発現を比較することにより該ポリペプチド遺伝子
の発現を誘導する因子、或いは阻害する因子をスクリー
ニングすることが可能である。

【００６３】また、本発明の新規なポリペプチドは細胞
治療方法への適応として固定化することが可能である。
固定化の方法としては該ポリペプチドのアミノ基、カル
ボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いた
り、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器に該ポリペ
プチドを共有結合させることができる。したがって、固
体表面に存在する形態を有し、さらに少なくとも新規ポ
リペプチド活性を有し、さらに配列表の配列番号１及び
２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部も
しくは全部のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含
む化合物に関しても本発明に含まれる。

【００６４】また、実施例２に示したように配列表の配
列番号４の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードする
ＤＮＡを用いれば、ノーザンブロットが可能である。し
たがって、本遺伝子の発現を調べる方法として、配列表
の配列番号４の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒか
ら１６ｍｅｒ以上、好ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し
得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそ
れらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ
化、またはチオフォスフェート化された誘導体によって
行うことが出来る。また、これらのセンス及びアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法で
も本遺伝子の発現を調べることが可能である。

【００６５】さらに、実施例２に示した方法と同様な方
法、もしくはＰＣＲ法でマウス、ラット等の他の生物の
本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができ
る。また、さらに人を含めたゲノム上の遺伝子のクロー
ニングも同様に可能である。従って、そのようにしてク
ローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本ポリペプ
チドの更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例
えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェ
ニックマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、
本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノッ
クアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。ま
た、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、
遺伝子治療への応用も可能である。

【００６６】また、実施例９に示した本発明のポリペプ
チドを特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のポリ
ペプチドの検出、測定が可能であり、本発明のポリペプ
チドの異常に起因する疾患などの診断薬として使用でき
得る。また、本抗体を用いて特定の免疫担当細胞群を分
離することが可能である。また、本発明に述べたあらゆ
る形態をとった該ポリペプチド、すなわち配列表の配列
番号１及び２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配
列の一部もしくは全部のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを含む化合物およびそれらから構成される複合体
を組み合わせてなるものは本発明に含まれるものとす
る。

【００６７】尚、本明細書に記載されているＤＮＡ、組
換え体宿主としての大腸菌の取扱いに必要な一般的な操
作は当業者間で通常行われているものであり、例えばＭ
ａｎｉａｔｉｓらの実験操作書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
１９８２，１９８９）に従えば容易に実施できる。使
用する酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることが
でき、特に断らない限り、製品で指定されている使用条
件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができ
る。

【００６８】

【発明の実施の形態】本発明を実施例により詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるもの
ではない。 実施例 １ ｃＤＮＡクローニングと同定 （１）ヒトＨｔｋＬ遺伝子（国際公開番号 ＷＯ９６／
１１２１２）をＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動を行い約０．２５ｋｂのＤＮＡ断片（配列表の配
列番号１３）を含むゲル断片を切りだした。ゲル断片か
ら、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ II （ＢＩＯ１０１社製）を用
いて添付のプロトコールに従いＤＮＡを抽出し、得られ
たＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒ
ｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて放射性同位元素³²Ｐにて
標識してｃＤＮＡスクリーニング用プローブとした。

【００６９】すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液
５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸
騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝
液１０μｌ、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮ
Ａポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７
℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラ
ム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−５０：ベーリンガーマンハイム社製）で精
製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用し
た。

【００７０】（２）ヒトリンパ節組織のλファージｃＤ
ＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のファージ
液の一部をとりＳＭバッファー（０．１Ｍ ＮａＣｌ、
８ｍＭＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）で数
種の希釈度で希釈したものを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５１
４から作製したファージプレーティングセルに感染さ
せ、Ｌ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、
０．５％ＮａＣｌ）の寒天プレートにプラークを形成さ
せることによりタイトレーションした結果、タイターは
２×１０⁵ ｐｆｕ／ｍｌであった。

【００７１】上記ライブラリーのλｇｔ１０組換え体約
４０万クローンを、（１）で調製したＤＮＡプローブを
用いてプラークハイブリダイゼーションによりスクリー
ニングし、４８個のポジティブクローンを得た。即ち、
上記ライブラリーのファージ液２ｍｌをＥ．ｃｏｌｉ
ＮＭ５１４に感染させてＬ培地の寒天プレート上に形成
させた４×１０⁵ 個のプラークを、ナイロンフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写
し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．
５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませた濾
紙上に７分間放置）し、次いで、中和処理（１．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませた濾紙上に３分間
放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．
７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう
後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染
み込ませた濾紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰ
Ｅ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。

【００７２】次いで（１）で作製したＤＮＡプローブと
以下に述べる条件でハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションは各々の成分の最終濃度が５倍
濃度の（以下５×と示す）ＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデ
ンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）、及び２０μｇ／ｍｌの沸騰水浴に
より変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブリダイゼ
ーション液中に浸し、５０℃にて２時間振とうしたの
ち、前述の方法で³²Ｐ標識されたプローブを含むプレハ
イブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼー
ション液に浸し、５０℃にて１６時間振とうして行っ
た。

【００７３】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む
２×ＳＳＰＥ溶液に浸し、室温にて１５分間振とうして
洗浄し、それを４回行った。洗浄を終了したフィルター
を増感スクリーンを使用して、２４時間オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、強く露光された部分に相
応する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工程
に従ってプラークハイブリダイゼーションを行い４８種
の純化λｇｔ１０組換え体を得た。これら４８種の組換
え体からグロスバーガーらの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ（１９８７）１５，６７３７）に従って
λｇｔ１０組換え体ＤＮＡを抽出した。

【００７４】（３）上記（２）で得られたλｇｔ１０組
換え体ＤＮＡのひとつをＥｃｏＲＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動を行ったところ約２ｋｂのインサートｃ
ＤＮＡが認められ、このｃＤＮＡ断片を含むゲル断片を
切りだした。次に、ゲル断片からＧｅｎｅｃｌｅａｎ I
I （ＢＩＯ１０１社製）を用いて添付のプロトコールに
従いＤＮＡを抽出した。得られた約２ｋｂのＤＮＡ断片
をｐｕｃ１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブク
ローニングしてプラスミドｐ＃５３−４とした。塩基配
列決定のためにディレーションミュータント（ｄｅｌｅ
ｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）を作製した。

【００７５】ミュータントの作製には、キロシーケンス
用ディレーションキット（宝酒造社製）を用いた。各ミ
ュータントの塩基配列をサンガーらの方法（Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３）によって決
定し、２ｋｂｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。決
定した塩基配列を配列表の配列番号４に示した。塩基配
列の決定はＤＮＡ蛍光シーケンサー（アプライドバイオ
システム社製：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）
を用い、添付のマニュアルに従って行なった。

【００７６】本ＤＮＡ配列には９８番目に始まる開始コ
ドン（ＡＴＧ）から１６９６番目で終わる終止コドン
（ＴＧＡ）まで、５３２個のアミノ酸配列をコードし得
るオープンリーディングフレームが存在した。該オープ
ンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配
列表の配列番号２に示した。プラスミドｐ＃５３−４の
遺伝子の方向は、ｐｕｃ１８ベクターのｌａｃＺ遺伝子
と逆方向、即ち、配列表の配列番号４に示した５’側が
ｐｕｃ１８ベクターのマルチクローニングサイトのＨｉ
ｎｄIII 側に存在した。

【００７７】実施例 ２ ノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現 本発明の免疫関連因子のｍＲＮＡの発現を調べるため、
あらかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターである
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社 Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ、Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒ
ｎ Ｂｌｏｔ II 、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ III、Ｈｕｍ
ａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔを用い、
プラスミドｐ＃５３−４を制限酵素ＰｓｔＩにて消化し
て、１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、５８８ｂ
ｐの断片（配列表の配列番号４の６１４番目から１２０
１番目）を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ II （ＢＩＯ
１０１社製）を用いて精製した遺伝子断片を前掲のＤＮ
Ａラベリングキット（ＭｅｇａＰｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌ
ａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）にて前述の方法で³²Ｐ標識し発現を調べた。

【００７８】その結果、ヒト組織のうちでリンパ節、虫
垂で顕著な発現が認められた。また、小腸においても発
現が認められ、さらに胃、腎臓、胸腺、脾臓で極めて微
弱な発現が認められた。しかしながら、心臓、脳、胎
盤、肺、肝臓、骨格筋、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、大
腸、末梢血白血球、甲状腺、脊髄、気管、副腎、骨髄、
そして、胎児肝においては全く発現が認められなかっ
た。以上のことから、本免疫関連因子は免疫担当組織に
特異的に発現されており、特にリンパ節に特異的に著明
な発現が認められ、また末梢血白血球に発現が認められ
ないことから二次免疫応答に関連し、また、リンパ球自
身ではなくリンパ節の組織細胞に特異的な因子であるこ
とが考えられた。さらに小腸における発現は腸管におけ
る免疫組織であるパイエル板に由来すると推察される。

【００７９】実施例 ３ 免疫関連因子の全長遺伝子発現プラスミドの作製 実施例１に記載した方法によって得られる該ポリペプチ
ド全長の遺伝子を動物細胞に導入するため、配列表の配
列番号４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、お
よびコダック社製ＩＢＩ ＦＬＡＧを用いて、配列表の
配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端に８アミノ酸、すな
わちアミノ酸配列としてＡｓｐ ＴｙｒＬｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓを持つポリペプチド
（以下ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１２）を付加したポ
リペプチドをコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）のｄｈｆｒ遺伝子部
位に各々別々につなぎ、それぞれ免疫関連因子の全長発
現プラスミドｐＳＶ２Ｆｕ、ｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧを作
製した。

【００８０】配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有
するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたっ
て、配列表の配列番号４の５’非転写領域を除き制限酵
素ＨｉｎｄIII サイトを付加するため、５’−ＡＣＡＡ
ＧＣＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡ−
３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー１、配列表
の配列番号５）、５’−ＧＧＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡ
ＧＡＴＧＡＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライ
マー２、配列表の配列番号６）をプライマーとして用い
て、ｐ＃５３−４をテンプレートとして用いてＰＣＲを
行った。およそ３１０ｂｐのＤＮＡが増幅されているこ
とをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産物
を実施例１（３）記載の方法にて精製して制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII及びＨｉｎｃIIにて処理し、同様に処理したｐ
ｕｃ１８ベクター（宝酒造社製）にサブクローニングし
た。

【００８１】その後、４クローンのコロニーからプラス
ミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列
を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、
すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９８番から
３６７番の配列を持ったフラグメントであることを確認
した。以下、本フラグメントを有するプラスミドをｐＬ
ＩＣ−１とする。

【００８２】次に、配列表の配列番号４の新規ポリペプ
チド遺伝子の３’非転写領域を除き制限酵素ＢａｍＨＩ
サイトを付加するため、５’−ＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣ
ＣＴＴＡＡＴＴＣＡＧＡＴ−３’の配列であるオリゴＤ
ＮＡ（プライマー３、配列表の配列番号７）、５’−Ｔ
ＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴ
ＣＴＣ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー
４、配列表の配列番号８）をプライマーとして用いて、
プラスミドｐ＃５３−４をテンプートとして用いてＰＣ
Ｒを行った。およそ１５０ｂｐのＤＮＡが増幅されてい
ることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ
産物を実施例１（３）記載の方法にて精製し、ｐＴ７Ｂ
ｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニ
ングした。

【００８３】その後、３クローンのコロニーからプラス
ミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列
を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、
すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１５５２番
から１６９６番の配列を持ったフラグメントであること
を確認した。以下、本フラグメントを有するプラスミド
をｐＬＩＣ−２とする。

【００８４】更に、配列表の配列番号２の新規ポリペプ
チド全長アミノ酸配列のＣ末端に８アミノ酸、すなわち
アミノ酸配列としてＡｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓを持つポリペプチド
（ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１２）を付加したポリペ
プチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターの作
製にあたって、同様な方法で上記のプライマー３、５’
−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣ
ＴＣＴＣＴＧＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プラ
イマー５、配列表の配列番号９）をプライマーとしてＰ
ＣＲを行い、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニン
グして、４クローンをシークエンスし、遺伝子配列を確
認して、目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号
４のＤＮＡ配列の１５５２番から１６９３番の配列の
３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴ
ＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（ＦＬＡＧ：配列表の配列番
号１２）がつながった配列を有するフラグメントである
ことを確認した。以下、本フラグメントを有するベクタ
ーをｐＬＩＣ−３とする。

【００８５】次に、ｐ＃５３−４を制限酵素ＨｉｎｄII
I 及び、ＨｉｎｃIIで消化し、実施例１（３）と同様な
方法で精製したおよそ４．２ｋｂｐの遺伝子断片に、上
記と同様にｐＬＩＣ−１を制限酵素ＨｉｎｄIII 及び、
ＨｉｎｃIIで消化して得た３１０ｂｐの断片をＤＮＡ
Ｌｉｇａｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を
用いて連結してプラスミドｐＬＩＣ−４とした。さら
に、ｐＬＩＣ−４を制限酵素ＨｉｎｄIII 及び、Ｅｃｏ
ＲＩで消化して、実施例１（３）と同様の方法にて精製
して得た約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔII ＫＳ＋ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
社製）のＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニ
ングしてプラスミドｐＬＩＣ−５を得た。

【００８６】このようにして作製されたｐＬＩＣ−５を
制限酵素ＢｓｔＰＩとＢａｍＨＩにて消化し、アガロー
スゲル電気泳動にておよそ４．４ｋｂｐのフラグメン
ト、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９８番
から１５５７番の配列の５’末端の先にｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔIIの制限酵素サイトのＨｉｎｄIII からＢａｍ
ＨＩまでの部分がつながったフラグメントを切り出し、
前述の方法で精製した。この遺伝子断片をＦ１とする。
同様に、ｐＬＩＣ−２及びｐＬＩＣ−３について制限酵
素ＢｓｔＰＩ及びＢａｍＨＩ消化を行い、それぞれ約１
５０ｂｐ、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

【００８７】これらの遺伝子断片を各々Ｆ２、Ｆ３とす
る。そして、Ｆ１とＦ２、Ｆ１とＦ３をおのおの前述の
方法でつなぎ、制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで
配列表の配列番号２のポリペプチドをコードする部分の
遺伝子断片が切り出されるベクターｐＢＳＦｕ１及び制
限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで配列表の配列番号
２のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする部分に対応する遺伝子断
片が切り出されるベクターｐＢＳＦｕ２を作製した。

【００８８】このようにして作製されたベクターｐＢＳ
Ｆｕ１、ｐＢＳＦｕ２を制限酵素ＨｉｎｄIII 、Ｂａｍ
ＨＩにて消化し、電気泳動にておよそ１．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片、すなわち新規ポリペプチドのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ断片部分を含むＤＮＡ断片を分離、精
製した。この２種のＤＮＡ断片を前掲のｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒを制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで処理して、
ｄｈｆｒ遺伝子を除いたものにＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）にて連結し、新規ポリペプチドの発現ベ
クターを構築した。以上のように作製されたＦＬＡＧ配
列を含まないベクターをｐＳＶ２Ｆｕ、ＦＬＡＧ配列を
含むベクターをｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧとする。

【００８９】実施例 ４ 免疫関連因子の細胞外部分遺伝子発現プラスミドの作製 実施例１に記載した方法によって得られる遺伝子がコー
ドするポリペプチドの細胞外部分、つまり配列表の配列
番号１に記載のポリペプチドを含有するポリペプチドを
動物細胞に産生させる発現プラスミドｐＳＶ２ＥＣＦＬ
ＡＧを構築した。すなわち、配列表の配列番号１のポリ
ペプチド細胞外部分アミノ酸配列のポリペプチドのＣ末
端に８アミノ酸、すなわちアミノ酸配列としてＡｓｐ
ＴｙｒＬｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓを持つポリペプチド（ＦＬＡＧ：配列表の配列番号１
２）を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列を
持つ発現ベクターの作製にあたって、全長の場合と同様
な方法で、５’−ＡＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡ
ＴＴＧＧＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマ
ー６、配列番号１０）、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡ
ＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴ
ＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧ−３’の
配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー７、配列表の配列
番号１１）をプライマーとして、配列表の配列番号４の
遺伝子を含むｐ＃５３−４をテンプレートとして用いて
ＰＣＲを行った。

【００９０】およそ３６０ｂｐのＤＮＡが増幅されてい
ることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ
産物を実施例１（３）記載の方法にて精製して、ｐＴ７
Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングした。その後、５
クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製して、
シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列に
誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番
号４のＤＮＡ配列の１０７８番から１４２９番の配列の
３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴ
ＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（配列表の配列番号１２）が
つながった配列を有するフラグメントであることを確認
し、プラスミドｐＬＩＣ−６とした。

【００９１】前述のプラスミドｐＬＩＣ−５を制限酵素
ＢｌｎＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）にて消化し、配
列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１０８３番以降の配列
のＤＮＡ断片を除去した約４ｋｂｐのＤＮＡ断片に、同
様に、ｐＬＩＣ−６を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢａｍＨＩ
で消化して得た約３６０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼで連結してプラスミドｐＢＳＥＣを得た。こ
のようにして作製されたベクターｐＢＳＥＣを制限酵素
ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩにて消化し、電気泳動にてお
よそ１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち新規ポリペプ
チドの細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を含むＤＮＡ断片を分離し精製した。

【００９２】このＤＮＡ断片を、前掲のプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒを制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで
処理してｄｈｆｒ遺伝子を除いたものにＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製）にて連結し、新規ポリペプチド
（配列表の配列番号１）のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬ
ＡＧ配列を有するポリペプチドを産生しうるプラスミド
を作製した。以上のように作製された発現プラスミドを
ｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧとする。

【００９３】実施例 ５ プラスミドによるＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の形質転換 マウス繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３ ｃｌｏｎｅ Ａ３
１（理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．
ＲＣＢ０００５）を実施例３に記載した方法で得た発現
プラスミドｐＳＶ２Ｆｕ、並びにｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧ
を用いて形質転換させた。即ち、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッ
コ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％Ｆ
ＣＳにて培養した上記の細胞を、形質転換前日に培地を
交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュ
あたり５×１０⁶ 個にして１０ｍｌの上記培地を加え一
晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢ
Ｓ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、Ｐ
ＢＳ（−）に１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように
して細胞を調製した。

【００９４】遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製の遺伝子
導入装置を用いたエレクトロポレーション法で行った。
上記の細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポレーション
専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターｐＳＶ２
ＦｕまたはｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧ及び、ｐＳＶ２−ｎｅ
ｏ（ＡＴＣＣ ３７１５０）を各々２０μｇ加え、氷中
で５分間放置する。その後、間を１分間室温で放置し
て、２回の３μＦ、４５０Ｖの電圧をかけた。その後、
氷中で５分間放置後、直径１０ｃｍ細胞培養用ディッシ
ュで上記の培地１０ｍｌで３日間培養を行った。

【００９５】３日後、上記の培地にＧ４１８（Ｓｉｇｍ
ａ社製）を４００μｇ／ｍｌとなるように加えた培地に
交換し、その後、２日おきに培地の１／３を交換して１
０日間ほど培養を続けた。１０日後、ディッシュ上に形
成されたコロニーをトリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ社製）を使ってはがし、クローン化された遺伝子の安
定発現細胞株を得た。以降は、このようにして作製され
たＢａｌｂ／３Ｔ３の配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢ
ａｌｂ／ＦＵＬＬと示し、配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡ
Ｇアミノ酸配列を有するポリペプチドの安定発現細胞株
をＢａｌｂ／ＦＵＬＬＦＬＡＧと示す。また、同時に同
じ方法でｐＳＶ２−ｎｅｏのみを遺伝子導入したコント
ロールの形質転換細胞株を作製しこれをＢａｌｂ／ＣＯ
Ｎと示す。

【００９６】実施例 ６ プラスミドによるＣＯＳ−７細胞の形質転換 ＣＯＳ−７（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可
能、ＲＣＢ０５３９）を実施例４に記載の方法で得たプ
ラスミドｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧを用いて、実施例５に記
載の方法と同様の方法にて形質転換させた。即ち、Ｄ−
ＭＥＭ（ダルベッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ社製）１０％ＦＣＳにて培養した上記細胞を、形質転
換前日に培地を交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培
養用ディッシュあたり５×１０⁶ 個にして１０ｍｌの上
記培地を加え一晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を
沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、ＰＢＳ（−）に１×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉ
ｏ−Ｒａｄ社製の遺伝子導入装置を用いたエレクトロポ
レーション法で行った。

【００９７】上記細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポ
レーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクタ
ーｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧを２０μｇ加え、氷中で５分間
放置する。その後、間を１分間室温で放置して、２回の
３μＦ、４５０Ｖの電圧をかけた。その後、氷中で５分
間放置後、直径１０ｃｍ細胞培養用ディッシュで上記の
培地１０ｍｌで培養を行った。遺伝子導入の翌日、培地
を無血清のＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に置
換し、以後４日間おきに交換し、２週間にわたって培養
上清を分取した。分取した培養上清を各々セントリコン
３０（アミコン社製）にてバッファーを培地からＰＢＳ
（−）に交換及び１０倍に濃縮した。

【００９８】実施例 ７ 組換え型新規ポリペプチドのウェスタンブロットを用い
た検出 実施例６に記載の方法で作製した形質転換細胞上清中に
配列表の配列番号１に示すポリペプチドを含有するポリ
ペプチドが産生されていることを確認するため、以下の
ようにウエスタンブロットにて確認した。すなわち、濃
縮した培養上清をＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルア
ミドゲル（グラディエントゲル５〜２０％）を用い、添
付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加
え加熱処理した還元条件下のサンプルと、その処理を行
わなかった非還元条件下のサンプルについて行い、マー
カーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー
（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッ
ファーについては添付の取扱い説明書に従って作製し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰ
ＶＤＦメンブランフィルター（ＢｉｏＲａｄ社製）にＢ
ｉｏＲａｄ社製ミニトランスブロットセルにより転写し
た。

【００９９】このように作製されたフィルターを５％Ｂ
ＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％
Ｔｗｅｅｎ ２０）に４℃一晩揺すりながらブロッキン
グした。一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎ
ｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２（コダック社製）、二次抗体とし
てペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社製）を反応させた。抗体の反応時間は各々室
温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分
間室温で揺すり洗浄する操作を３回づつ繰り返した。

【０１００】最後の洗浄後、フィルターをＡｍｅｒｓｈ
ａｍ社製ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
の反応液に五分間浸し、サランラップに包んでＸ線フィ
ルムに感光させた。その結果、還元条件、非還元条件の
サンプルともおよそ５０ｋダルトン程度の蛋白が検出で
きた。以上の結果から、目的の配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリ
ペプチドの産生細胞を得ることができた。

【０１０１】実施例 ８ 新規ポリペプチド細胞外部分蛋白の精製 実施例６に記載した方法で得たＣＯＳ−７形質転換細胞
の培養上清を５リットル作製した。これらの培養上清を
コダック社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ Ｇｅｌカラムに通して、組換えポリペプチドをカ
ラムに吸着させた。カラムのサイズは１ｃｍ×３ｃｍで
容積はおよそ２ｍｌであり、流速は全て１ｍｌ／ｍｉ
ｎ．で行った。吸着後、カラムをＰＢＳ（−）２０ｍｌ
で洗浄し、その後、０．５ＭＴｒｉｓーグリシン（ｐＨ
３．０）で溶出した。溶出画分を２ｍｌずつ分取し、
０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）２００μｌづ
つ加えて、各々の画分を上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行った。

【０１０２】泳動が終わった後、和光純薬社製銀染キッ
トワコーIIで添付の説明書に従い染色した。その結果、
実施例７に記載したウエスタンブロットの結果と同様の
大きさのバンドに精製タンパクが得られていることが確
認できた。この結果から、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプ
チドを純品で得ることが出来た。より高純度なポリペプ
チドを得るために、上記の方法で精製された組換えポリ
ペプチドをゲル濾過にて精製を行った。

【０１０３】アフィニティーカラムからの溶離液をアミ
コン社製セントリコン３０にて濃縮及びＰＢＳ（−）へ
のバッファー交換を行い、ゲル濾過はファルマシア社製
ＦＰＬＣシステムを用い、同社のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２
カラムにて行った。実施例７のウエスタンブロット結果
と同様の分子量の位置に溶離されるメインピークを分取
した。以下、このように精製された配列表の配列番号１
に記載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する
ポリペプチドをＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮと示す。

【０１０４】実施例 ９ 新規ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体の樹立 精製されたＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原として、成書
の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。即
ち、実施例８で作製した精製組換えポリペプチドＥＸＦ
ＬＡＧ−ＰＴＮをＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシ
ー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫し
た。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上
昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓
細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール
法にて細胞融合を行った。

【０１０５】ＨＡＴ培地（日本免疫生物研究所製）にて
ハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にて該ポリペプチ
ドの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生している
ハイブリドーマ株を分離し、該ポリペプチドを特異的に
認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ株が樹立された。このようにして樹立されたハイ
ブリドーマの培養上清をファルマシア社製Ｍａｂ Ｔｒ
ａｐＧ II を用いて、添付のプロトコールに従って抗該
ポリペプチドモノクローナル抗体を精製し作製した。

【０１０６】本モノクローナル抗体を用いて実施例８で
精製されたポリペプチドを実施例７に記載の条件でウェ
スタンブロットを行った。その結果、実施例７で示した
ウェスタンブロット結果と同様の分子量の単一バンドが
検出でき、本モノクローナル抗体は該ポリペプチドを特
異的に認識できることが明らかになった。

【０１０７】実施例 １０ 実施例８に記載の方法で得た本新規免疫関連因子の細胞
外部分蛋白であるＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを用いて、ヒト
抗体との結合性を確認した。即ち、９６穴のイムノプレ
ート（ヌンク社製）にＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮ（１００ｎ
ｇ／ｍｌ）を１００μｌ分注した。室温で１時間以上静
置した後、溶液をすて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を
含むＰＢＳ（−）（以下ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎと略す）で
２回洗浄した。次に、１倍濃度のＢｌｏｃｋ Ａｃｅ
（大日本製薬社製）を１００μｌずつ分注し、室温で１
時間静置した。溶液をすて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回
洗浄後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１０００倍に希釈したＨ
ＵＭＡＮＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ ＳＴＡＮＤＡ
ＲＤ（ＣＡＰＰＥＬ社製）を１００μｌずつ分注し、室
温で１時間静置した。

【０１０８】次いで、溶液をすてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで
２回洗浄後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５００倍に希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体
（Ｅ．Ｙラボラトリーズ社製）を１００μｌずつ分注
し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回
洗浄した後、０．１Ｍ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、０．０５Ｍク
エン酸からなる緩衝液５ｍｌに１ｍｇのテトラメチルベ
ンジジン（シグマ社製）、５０μｌの３０％過酸化水素
水（和光純薬社製）を加えて作製した発色液を５０μｌ
ずつ分注し、室温で５分から１０分静置した。２Ｎ硫酸
を５０μｌずつ分注して反応を止めた。対象実験１とし
てＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮの替わりに牛血清アルブミン
（１００ｎｇ／ｍｇ）１００μｌを用い、他は上記の方
法に従って操作を行った。また、対照実験２としてＨＵ
ＭＡＮ ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＳＴＡＮＤＡＲ
Ｄの替わりに牛血清アルブミン（１００ｎｇ／ｍｌ）１
００μｌを用い、他は上記の方法に従って操作を行っ
た。

【０１０９】対照実験２種を含む上記サンプルについ
て、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４５０
ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ＥＸＦＬＡＧ−Ｐ
ＴＮ、対照１、対照２についてそれぞれ１．２、０．
９、１．０となり、ＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮは対照に比べ
有意に高い吸光度を示した。即ち、本発明の新規免疫関
連因子はヒト免疫グロブリンと結合することが示され
た。

【０１１０】

【発明の効果】本発明の免疫関連因子は、リンパ節に特
異的に発現することから免疫応答に関連する免疫疾患及
び感染症に関わる研究や治療に有用に用いることができ
る。

【０１１１】配列表 配列番号：１ 配列の長さ：４２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Pro Gln Lys Arg Pro His Pro Arg Trp Leu Trp Glu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ser Arg Thr His Leu Arg Ala Met Gly Thr Leu Arg Pro Ser Ser 20 25 30 Pro Leu Cys Trp Arg Glu Glu Ser Ser Phe Ala Ala Pro Asn Ser Leu 35 40 45 Lys Gly Ser Arg Leu Val Ser Gly Glu Pro Gly Gly Ala Val Thr Ile 50 55 60 Gln Cys His Tyr Ala Pro Ser Ser Val Asn Arg His Gln Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Trp Cys Arg Leu Gly Pro Pro Arg Trp Ile Cys Gln Thr Ile Val Ser 85 90 95 Thr Asn Gln Tyr Thr His His Arg Tyr Arg Asp Arg Val Ala Leu Thr 100 105 110 Asp Phe Pro Gln Arg Gly Leu Phe Val Val Arg Leu Ser Gln Leu Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Ile Gly Cys Tyr Leu Cys Gly Ile Gly Ser Glu Asn Asn 130 135 140 Met Leu Phe Leu Ser Met Asn Leu Thr Ile Ser Ala Gly Pro Ala Ser 145 150 155 160 Thr Leu Pro Thr Ala Thr Pro Ala Ala Gly Glu Leu Thr Met Arg Ser 165 170 175 Tyr Gly Thr Ala Ser Pro Val Ala Asn Arg Trp Thr Pro Gly Thr Thr 180 185 190 Gln Thr Leu Gly Gln Gly Thr Ala Trp Asp Thr Val Ala Ser Thr Pro 195 200 205 Gly Thr Ser Lys Thr Thr Ala Ser Ala Glu Gly Arg Arg Thr Pro Gly 210 215 220 Ala Thr Arg Pro Ala Ala Pro Gly Thr Gly Ser Trp Ala Glu Gly Ser 225 230 235 240 Val Lys Ala Pro Ala Pro Ile Pro Glu Ser Pro Pro Ser Lys Ser Arg 245 250 255 Ser Met Ser Asn Thr Thr Glu Gly Val Trp Glu Gly Thr Arg Ser Ser 260 265 270 Val Thr Asn Arg Ala Arg Ala Ser Lys Asp Arg Arg Glu Met Thr Thr 275 280 285 Thr Lys Ala Asp Arg Pro Arg Glu Asp Ile Glu Gly Val Arg Ile Ala 290 295 300 Leu Asp Ala Ala Lys Lys Val Leu Gly Thr Ile Gly Pro Pro Ala Leu 305 310 315 320 Val Ser Glu Thr Leu Ala Trp Glu Ile Leu Pro Gln Ala Thr Pro Val 325 330 335 Ser Lys Gln Gln Ser Gln Gly Ser Ile Gly Glu Thr Thr Pro Ala Ala 340 345 350 Gly Met Trp Thr Leu Gly Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Ile Leu Gly 355 360 365 Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Thr Ser Met Glu Ala Ala Ser Gly Glu 370 375 380 Gly Ser Ala Ala Gly Asp Leu Asp Ala Ala Thr Gly Asp Arg Gly Pro 385 390 395 400 Gln Ala Thr Leu Ser Gln Thr Pro Ala Val Gly Pro Trp Gly Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Glu Ser Ser Val Lys Arg Thr Phe Pro Glu 420 425

【０１１２】配列番号：２ 配列の長さ：５３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Leu Phe Leu Ile Leu Cys Leu Leu Gln Gly Ser Ser Phe Ala -15 -10 -5 Leu Pro Gln Lys Arg Pro His Pro Arg Trp Leu Trp Glu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ser Arg Thr His Leu Arg Ala Met Gly Thr Leu Arg Pro Ser Ser 20 25 30 Pro Leu Cys Trp Arg Glu Glu Ser Ser Phe Ala Ala Pro Asn Ser Leu 35 40 45 Lys Gly Ser Arg Leu Val Ser Gly Glu Pro Gly Gly Ala Val Thr Ile 50 55 60 Gln Cys His Tyr Ala Pro Ser Ser Val Asn Arg His Gln Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Trp Cys Arg Leu Gly Pro Pro Arg Trp Ile Cys Gln Thr Ile Val Ser 85 90 95 Thr Asn Gln Tyr Thr His His Arg Tyr Arg Asp Arg Val Ala Leu Thr 100 105 110 Asp Phe Pro Gln Arg Gly Leu Phe Val Val Arg Leu Ser Gln Leu Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Ile Gly Cys Tyr Leu Cys Gly Ile Gly Ser Glu Asn Asn 130 135 140 Met Leu Phe Leu Ser Met Asn Leu Thr Ile Ser Ala Gly Pro Ala Ser 145 150 155 160 Thr Leu Pro Thr Ala Thr Pro Ala Ala Gly Glu Leu Thr Met Arg Ser 165 170 175 Tyr Gly Thr Ala Ser Pro Val Ala Asn Arg Trp Thr Pro Gly Thr Thr 180 185 190 Gln Thr Leu Gly Gln Gly Thr Ala Trp Asp Thr Val Ala Ser Thr Pro 195 200 205 Gly Thr Ser Lys Thr Thr Ala Ser Ala Glu Gly Arg Arg Thr Pro Gly 210 215 220 Ala Thr Arg Pro Ala Ala Pro Gly Thr Gly Ser Trp Ala Glu Gly Ser 225 230 235 240 Val Lys Ala Pro Ala Pro Ile Pro Glu Ser Pro Pro Ser Lys Ser Arg 245 250 255 Ser Met Ser Asn Thr Thr Glu Gly Val Trp Glu Gly Thr Arg Ser Ser 260 265 270 Val Thr Asn Arg Ala Arg Ala Ser Lys Asp Arg Arg Glu Met Thr Thr 275 280 285 Thr Lys Ala Asp Arg Pro Arg Glu Asp Ile Glu Gly Val Arg Ile Ala 290 295 300 Leu Asp Ala Ala Lys Lys Val Leu Gly Thr Ile Gly Pro Pro Ala Leu 305 310 315 320 Val Ser Glu Thr Leu Ala Trp Glu Ile Leu Pro Gln Ala Thr Pro Val 325 330 335 Ser Lys Gln Gln Ser Gln Gly Ser Ile Gly Glu Thr Thr Pro Ala Ala 340 345 350 Gly Met Trp Thr Leu Gly Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Ile Leu Gly 355 360 365 Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Thr Ser Met Glu Ala Ala Ser Gly Glu 370 375 380 Gly Ser Ala Ala Gly Asp Leu Asp Ala Ala Thr Gly Asp Arg Gly Pro 385 390 395 400 Gln Ala Thr Leu Ser Gln Thr Pro Ala Val Gly Pro Trp Gly Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Glu Ser Ser Val Lys Arg Thr Phe Pro Glu Asp Glu Ser Ser 420 425 430 Ser Arg Thr Leu Ala Pro Val Ser Thr Met Leu Ala Leu Phe Met Leu 435 440 445 Met Ala Leu Val Leu Leu Gln Arg Lys Leu Trp Arg Arg Arg Thr Ser 450 455 460 Gln Glu Ala Glu Arg Val Thr Leu Ile Gln Met Thr His Phe Leu Glu 465 470 475 480 Val Asn Pro Gln Ala Asp Gln Leu Pro His Val Glu Arg Lys Met Leu 485 490 495 Gln Asp Asp Ser Leu Pro Ala Gly Ala Ser Leu Thr Ala Pro Glu Arg 500 505 510 Asn Pro Gly Pro 515

【０１１３】配列番号：３ 配列の長さ：１１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ser Arg Leu Val Ser Gly Glu Pro Gly Gly Ala Val Thr Ile Gln 1 5 10 15 Cys His Tyr Ala Pro Ser Ser Val Asn Arg His Gln Arg Lys Tyr Trp 20 25 30 Cys Arg Leu Gly Pro Pro Arg Trp Ile Cys Gln Thr Ile Val Ser Thr 35 40 45 Asn Gln Tyr Thr His His Arg Tyr Arg Asp Arg Val Ala Leu Thr Asp 50 55 60 Phe Pro Gln Arg Gly Leu Phe Val Val Arg Leu Ser Gln Leu Ser Pro 65 70 75 80 Asp Asp Ile Gly Cys Tyr Leu Cys Gly Ile Gly Ser Glu Asn Asn Met 85 90 95 Leu Phe Leu Ser Met Asn Leu Thr Ile Ser Ala Gly Pro Ala 100 105 110

【０１１４】配列番号：４ 配列の長さ：１９１１ 配列の型：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 組織の種類：Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：９８．．１６９３ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：９８．．１４５ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１４６．．１６９３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGAAGTG GTGAGGAGAG GAAGAGAAGT GGACTACTCC 37 AGGCTCATTG CTGGCACTTT ACCACAATCT CACGTCACCA GCAGGAGGGC AGGATGGAAA 97 ATG CCC CTC TTC CTC ATA CTG TGC CTG CTA CAA GGT TCT TCT TTC GCC 145 Met Pro Leu Phe Leu Ile Leu Cys Leu Leu Gln Gly Ser Ser Phe Ala -15 -10 -5 CTT CCA CAA AAA AGA CCC CAT CCG AGA TGG CTG TGG GAG GGC TCT CTC 193 Leu Pro Gln Lys Arg Pro His Pro Arg Trp Leu Trp Glu Gly Ser Leu 1 5 10 15 CCC TCC AGG ACC CAT CTC CGG GCC ATG GGA ACA CTC AGG CCT TCC TCG 241 Pro Ser Arg Thr His Leu Arg Ala Met Gly Thr Leu Arg Pro Ser Ser 20 25 30 CCC CTC TGC TGG CGG GAG GAG AGC TCC TTT GCA GCT CCA AAT TCA TTG 289 Pro Leu Cys Trp Arg Glu Glu Ser Ser Phe Ala Ala Pro Asn Ser Leu 35 40 45 AAG GGC TCA AGG CTG GTG TCA GGG GAG CCT GGA GGA GCT GTC ACC ATC 337 Lys Gly Ser Arg Leu Val Ser Gly Glu Pro Gly Gly Ala Val Thr Ile 50 55 60 CAG TGC CAT TAT GCC CCC TCA TCT GTC AAC AGG CAC CAG AGG AAG TAC 385 Gln Cys His Tyr Ala Pro Ser Ser Val Asn Arg His Gln Arg Lys Tyr 65 70 75 80 TGG TGC CGT CTG GGG CCC CCA AGA TGG ATC TGC CAG ACC ATT GTG TCC 433 Trp Cys Arg Leu Gly Pro Pro Arg Trp Ile Cys Gln Thr Ile Val Ser 85 90 95 ACC AAC CAG TAT ACT CAC CAT CGC TAT CGT GAC CGT GTG GCC CTC ACA 481 Thr Asn Gln Tyr Thr His His Arg Tyr Arg Asp Arg Val Ala Leu Thr 100 105 110 GAC TTT CCA CAG AGA GGC TTG TTT GTG GTG AGG CTG TCC CAA CTG TCC 529 Asp Phe Pro Gln Arg Gly Leu Phe Val Val Arg Leu Ser Gln Leu Ser 115 120 125 CCG GAT GAC ATC GGA TGC TAC CTC TGC GGC ATT GGA AGT GAA AAC AAC 577 Pro Asp Asp Ile Gly Cys Tyr Leu Cys Gly Ile Gly Ser Glu Asn Asn 130 135 140 ATG CTG TTC TTA AGC ATG AAT CTG ACC ATC TCT GCA GGT CCC GCC AGC 625 Met Leu Phe Leu Ser Met Asn Leu Thr Ile Ser Ala Gly Pro Ala Ser 145 150 155 160 ACC CTC CCC ACA GCC ACT CCA GCT GCT GGG GAG CTC ACC ATG AGA TCC 673 Thr Leu Pro Thr Ala Thr Pro Ala Ala Gly Glu Leu Thr Met Arg Ser 165 170 175 TAT GGA ACA GCG TCT CCA GTG GCC AAC AGA TGG ACC CCA GGA ACC ACC 721 Tyr Gly Thr Ala Ser Pro Val Ala Asn Arg Trp Thr Pro Gly Thr Thr 180 185 190 CAG ACC TTA GGA CAG GGG ACA GCA TGG GAC ACA GTT GCT TCC ACT CCA 769 Gln Thr Leu Gly Gln Gly Thr Ala Trp Asp Thr Val Ala Ser Thr Pro 195 200 205 GGA ACC AGC AAG ACT ACA GCT TCA GCT GAG GGA AGA CGA ACC CCA GGA 817 Gly Thr Ser Lys Thr Thr Ala Ser Ala Glu Gly Arg Arg Thr Pro Gly 210 215 220 GCA ACC AGG CCA GCA GCT CCA GGG ACA GGC AGC TGG GCA GAG GGT TCT 865 Ala Thr Arg Pro Ala Ala Pro Gly Thr Gly Ser Trp Ala Glu Gly Ser 225 230 235 240 GTC AAA GCA CCT GCT CCG ATT CCA GAG AGT CCA CCT TCA AAG AGC AGA 913 Val Lys Ala Pro Ala Pro Ile Pro Glu Ser Pro Pro Ser Lys Ser Arg 245 250 255 AGC ATG TCC AAT ACA ACA GAA GGT GTT TGG GAG GGC ACC AGA AGC TCG 961 Ser Met Ser Asn Thr Thr Glu Gly Val Trp Glu Gly Thr Arg Ser Ser 260 265 270 GTG ACA AAC AGG GCT AGA GCC AGC AAG GAC AGG AGG GAG ATG ACA ACT 1009 Val Thr Asn Arg Ala Arg Ala Ser Lys Asp Arg Arg Glu Met Thr Thr 275 280 285 ACC AAG GCT GAT AGG CCA AGG GAG GAC ATA GAG GGG GTC AGG ATA GCT 1057 Thr Lys Ala Asp Arg Pro Arg Glu Asp Ile Glu Gly Val Arg Ile Ala 290 295 300 CTT GAT GCA GCC AAA AAG GTC CTA GGA ACC ATT GGG CCA CCA GCT CTG 1105 Leu Asp Ala Ala Lys Lys Val Leu Gly Thr Ile Gly Pro Pro Ala Leu 305 310 315 320 GTC TCA GAA ACT TTG GCC TGG GAA ATC CTC CCA CAA GCA ACG CCA GTT 1153 Val Ser Glu Thr Leu Ala Trp Glu Ile Leu Pro Gln Ala Thr Pro Val 325 330 335 TCT AAG CAA CAA TCT CAG GGT TCC ATT GGA GAA ACA ACT CCA GCT GCA 1201 Ser Lys Gln Gln Ser Gln Gly Ser Ile Gly Glu Thr Thr Pro Ala Ala 340 345 350 GGC ATG TGG ACC TTG GGA ACT CCA GCT GCA GAT GTG TGG ATC TTG GGA 1249 Gly Met Trp Thr Leu Gly Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Ile Leu Gly 355 360 365 ACT CCA GCT GCA GAT GTG TGG ACC AGC ATG GAG GCA GCA TCT GGG GAA 1297 Thr Pro Ala Ala Asp Val Trp Thr Ser Met Glu Ala Ala Ser Gly Glu 370 375 380 GGA AGC GCT GCA GGG GAC CTA GAT GCT GCC ACT GGA GAC AGA GGT CCC 1345 Gly Ser Ala Ala Gly Asp Leu Asp Ala Ala Thr Gly Asp Arg Gly Pro 385 390 395 400 CAA GCA ACA CTG AGC CAG ACC CCG GCA GTA GGA CCC TGG GGA CCC CCT 1393 Gln Ala Thr Leu Ser Gln Thr Pro Ala Val Gly Pro Trp Gly Pro Pro 405 410 415 GGC AAG GAG TCC TCC GTG AAG CGT ACT TTT CCA GAA GAT GAA AGC AGC 1441 Gly Lys Glu Ser Ser Val Lys Arg Thr Phe Pro Glu Asp Glu Ser Ser 420 425 430 TCT CGG ACC CTG GCT CCT GTC TCT ACC ATG CTG GCC CTG TTT ATG CTT 1489 Ser Arg Thr Leu Ala Pro Val Ser Thr Met Leu Ala Leu Phe Met Leu 435 440 445 ATG GCT CTG GTT CTA TTG CAA AGG AAG CTC TGG AGA AGG AGG ACC TCT 1537 Met Ala Leu Val Leu Leu Gln Arg Lys Leu Trp Arg Arg Arg Thr Ser 450 455 460 CAG GAG GCA GAA AGG GTC ACC TTA ATT CAG ATG ACA CAT TTT CTG GAA 1585 Gln Glu Ala Glu Arg Val Thr Leu Ile Gln Met Thr His Phe Leu Glu 465 470 475 480 GTG AAC CCC CAA GCA GAC CAG CTG CCC CAT GTG GAA AGA AAG ATG CTC 1633 Val Asn Pro Gln Ala Asp Gln Leu Pro His Val Glu Arg Lys Met Leu 485 490 495 CAG GAT GAC TCT CTT CCT GCT GGG GCC AGC CTG ACT GCC CCA GAG AGA 1681 Gln Asp Asp Ser Leu Pro Ala Gly Ala Ser Leu Thr Ala Pro Glu Arg 500 505 510 AAT CCA GGA CCC 1693 Asn Pro Gly Pro 515 TGAGGGACAG AGAGATGAAC TGCTCAGTTA CCATGGGAGA AGGACCAAGA TCAAAGGCCT 1753 TCAGGACCCC AGCCTCTTTC CATCATCCTT CCTCCACCTG TGGGAAGAGA AGCTGATGCA 1813 GCCGGTGCTC CACCCATGGA AGAAAGGCTG GCTGTCCTTG GGCCCAAGAA AGTCAAGCAT 1873 TATCCACGTC CAAAGGTGAC AAGATGACTC AAAGGAAA 1911

【０１１５】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-ACAAGCTTACGTCACCAGCAGGAGGGCA-3'

【０１１６】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-GGTGCCTGTTGACAGATGAG-3'

【０１１７】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-GAAAGGGTCACCTTAATTCAGAT-3'

【０１１８】配列番号：８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-TCGGATCCTCAGGGTCCTGGATTTCTCTC-3'

【０１１９】配列番号：９ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-AAGGATCCTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGGGTCCTGGATTTCTCTCTGG-3'

【０１２０】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-AAAGGTCCTAGGAACCATTGGG-3'

【０１２１】配列番号：１１ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド 配列 5'-AAGGATCCTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCTTCTGGAAAAGTACGCTTCACG-3'

【０１２２】配列番号：１２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド

【０１２３】配列番号：１３ 配列の長さ：２４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 AATTCCTCGA ACTCCAAATT TCTACCTGGA CAAGGACTGG TACTATACCC ACAGATAGGA 60 GACAAATTGG ATATTATTTG CCCCAAAGTG GACTCTAAAA CTGTTGGCCA GTATGAATAT 120 TATAAAGTTT ATATGGTTGA TAAAGACCAA GCAGACAGAT GCACTATTAA GAAGGAAAAT 180 ACCCCTCTCC TCAACTGTGC CAAACCAGAC CAAGATATCA AATTCACCAT CAAGTTTCAA 240 GAATT 245

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＡ 9282−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   むポリペプチド。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが配列番号１で表されるア
   ミノ酸配列よりなる請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する請求項
   １に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号３で表されるアミノ酸配列を含
   むポリペプチド。
5. 【請求項５】 糖鎖が結合してなる配列番号１で表され
   るアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドとの複合体
   の形態を有するポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中
   で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤ
   ＮＡ体。
10. 【請求項１０】 配列番号２で表されるアミノ酸配列を
    含有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞
    中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換え
    ＤＮＡ体。
11. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載した組換え
    ＤＮＡ体により形質転換された細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のポリペプチドを産生
    し得る細胞を培地に培養し、産生されたポリペプチドを
    採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
13. 【請求項１３】 細胞が請求項１１に記載の細胞である
    請求項１２に記載のポリペプチドの製造方法。
14. 【請求項１４】 請求項３に記載のポリペプチドと特異
    的に結合することを特徴とする抗体。
15. 【請求項１５】 配列番号４の塩基配列の少なくとも１
    ８個の連続した塩基配列を含有するセンスＤＮＡ、該セ
    ンスＤＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡからなる群よ
    り選ばれる単離されたＤＮＡ断片、及び該センスＤＮＡ
    及び該アンチセンスＤＮＡを、それぞれメチル化、メチ
    ルフォスフェート化、チオフォスフェート化または脱ア
    ミノ化することにより得られる、該センスＤＮＡ及び該
    アンチセンスＤＮＡの誘導体からなる群より選ばれる単
    離されたＤＮＡ断片。
16. 【請求項１６】 配列番号４の塩基配列に相補的な少な
    くとも１８個の連続した塩基配列を含有するアンチセン
    スＲＮＡ、該アンチセンスＲＮＡに相補的なセンスＲＮ
    Ａからなる群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片、及び
    該アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡを、それぞ
    れ、メチル化、メチルフォスフェート化、チオフォスフ
    ェート化または脱アミノ化することにより得られる、該
    アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡの誘導体からな
    る群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片。