JPH10286097A - プリンアラビノシドの酵素的製造法 - Google Patents
プリンアラビノシドの酵素的製造法Info
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- JPH10286097A JPH10286097A JP11334297A JP11334297A JPH10286097A JP H10286097 A JPH10286097 A JP H10286097A JP 11334297 A JP11334297 A JP 11334297A JP 11334297 A JP11334297 A JP 11334297A JP H10286097 A JPH10286097 A JP H10286097A
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- Japan
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- purine
- phosphorylase
- arabinoside
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 プリンアラビノシドの効率的な製造法を
提供する。 【解決手段】 ヌクレオシドホスホリラーゼを用いてプ
リンとウラシルアラビノシドとからプリンアラビノシド
を製造する方法において、ヌクレオシドホスホリラーゼ
としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼとウリジンホ
スホリラーゼを併用し、２つの酵素の使用割合が酵素単
位（ユニット）としてプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼをウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上使用するこ
とを特徴とするプリンアラビノシドの酵素的製造法に関
する。
提供する。 【解決手段】 ヌクレオシドホスホリラーゼを用いてプ
リンとウラシルアラビノシドとからプリンアラビノシド
を製造する方法において、ヌクレオシドホスホリラーゼ
としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼとウリジンホ
スホリラーゼを併用し、２つの酵素の使用割合が酵素単
位（ユニット）としてプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼをウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上使用するこ
とを特徴とするプリンアラビノシドの酵素的製造法に関
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プリンアラビノシ
ドの酵素的製造法に関するものである。
ドの酵素的製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ビダラビン（アデニンアラビノシド）お
よびフルダラビン（フルオロアデニンアラビノシド）に
代表されるプリンアラビノシドまたはその５’−リン酸
体は、抗ウイルス活性または抗ガン活性を有し、いくつ
かの化合物は医薬品として実際に臨床上使用されてい
る。プリンアラビノシドの酵素的製造法としては、ヌク
レオシドホスホリラーゼを用いた方法が既に報告されて
いる（特公昭６０−４１５９８、特公昭６１−３４８
０、特公昭６２−１０１５７、特公昭６２−１４２７
７、特公昭６２−１４２７８、特公昭６２−１４２７
９、特公昭６２−１５１９９、特公昭６２−１５２０
０、特開昭５６−８６９５、特開昭５６−８６９６、特
開昭５７−１１８７９７など参照）。
よびフルダラビン（フルオロアデニンアラビノシド）に
代表されるプリンアラビノシドまたはその５’−リン酸
体は、抗ウイルス活性または抗ガン活性を有し、いくつ
かの化合物は医薬品として実際に臨床上使用されてい
る。プリンアラビノシドの酵素的製造法としては、ヌク
レオシドホスホリラーゼを用いた方法が既に報告されて
いる（特公昭６０−４１５９８、特公昭６１−３４８
０、特公昭６２−１０１５７、特公昭６２−１４２７
７、特公昭６２−１４２７８、特公昭６２−１４２７
９、特公昭６２−１５１９９、特公昭６２−１５２０
０、特開昭５６−８６９５、特開昭５６−８６９６、特
開昭５７−１１８７９７など参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の酵素的製造法の
うち、ヌクレオシドホスホリラーゼとしてプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼとウリジンホスホリラーゼを併用
する方法も既に報告されているものの（特開昭５６−８
６９５）、この方法とても合成収率の点で必ずしも満足
する方法とはなり得なかった。したがって、本発明は、
プリンアラビノシドの効率的な製造法の提供を目的とす
るものである。
うち、ヌクレオシドホスホリラーゼとしてプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼとウリジンホスホリラーゼを併用
する方法も既に報告されているものの（特開昭５６−８
６９５）、この方法とても合成収率の点で必ずしも満足
する方法とはなり得なかった。したがって、本発明は、
プリンアラビノシドの効率的な製造法の提供を目的とす
るものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、上記従来法
（特開昭５６−８６９５）においてはプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼがウリジンホスホリラーゼと等量もし
くは若干多めに使用されている点に着目し、この２つの
酵素の使用割合を検討した結果、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上
使用することによりプリンアラビノシドの合成収率を有
意に向上させることができることを見いだし、本発明を
完成させた。すなわち、本発明は、ヌクレオシドホスホ
リラーゼを用いてプリンとウラシルアラビノシドとから
プリンアラビノシドを製造する方法において、ヌクレオ
シドホスホリラーゼとしてプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼとウリジンホスホリラーゼを併用し、２つの酵素
の使用割合が酵素単位（ユニット）としてプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの１．
５倍以上使用することを特徴とするプリンアラビノシド
の酵素的製造法に関するものである。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、上記従来法
（特開昭５６−８６９５）においてはプリンヌクレオシ
ドホスホリラーゼがウリジンホスホリラーゼと等量もし
くは若干多めに使用されている点に着目し、この２つの
酵素の使用割合を検討した結果、プリンヌクレオシドホ
スホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上
使用することによりプリンアラビノシドの合成収率を有
意に向上させることができることを見いだし、本発明を
完成させた。すなわち、本発明は、ヌクレオシドホスホ
リラーゼを用いてプリンとウラシルアラビノシドとから
プリンアラビノシドを製造する方法において、ヌクレオ
シドホスホリラーゼとしてプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼとウリジンホスホリラーゼを併用し、２つの酵素
の使用割合が酵素単位（ユニット）としてプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの１．
５倍以上使用することを特徴とするプリンアラビノシド
の酵素的製造法に関するものである。
【０００５】
（１）酵素の調製 本発明で使用するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
（Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）およびウリジンホスホリラ
ーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．３）は公知の酵素であり、
プリンアラビノシドの合成に使用できるものであれば特
別のものに制限されるものではない。具体的には、プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼとしてはプリン塩基とア
ラビノース−１−リン酸からプリンアラビノシドを合成
する反応を触媒するものであればよく、ウリジンホスホ
リラーゼとしてはウラシルアラビノシドをウラシルとア
ラビノース−１−リン酸に分解する反応を触媒するもの
であればよい。このような酵素は既に数多く報告されて
おり、そのいくつかは酵素をコードする遺伝子の塩基配
列まで報告されている（特開昭５６−８６９５、Proc.
Natil.Acad. Sci. U.S.A., 88, 7185-7189(1991)、Nucl
eic Acids Res., 17, 6741(1989)、Biosci. Biotech. B
iochem., 59, 1987-1990(1995)）。
（Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）およびウリジンホスホリラ
ーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．３）は公知の酵素であり、
プリンアラビノシドの合成に使用できるものであれば特
別のものに制限されるものではない。具体的には、プリ
ンヌクレオシドホスホリラーゼとしてはプリン塩基とア
ラビノース−１−リン酸からプリンアラビノシドを合成
する反応を触媒するものであればよく、ウリジンホスホ
リラーゼとしてはウラシルアラビノシドをウラシルとア
ラビノース−１−リン酸に分解する反応を触媒するもの
であればよい。このような酵素は既に数多く報告されて
おり、そのいくつかは酵素をコードする遺伝子の塩基配
列まで報告されている（特開昭５６−８６９５、Proc.
Natil.Acad. Sci. U.S.A., 88, 7185-7189(1991)、Nucl
eic Acids Res., 17, 6741(1989)、Biosci. Biotech. B
iochem., 59, 1987-1990(1995)）。
【０００６】したがって、本発明で使用する酵素の調製
は、通常の組換えＤＮＡ手法にて容易に行うことができ
る。すなわち、既に報告され、本発明の方法で使用可能
なプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはウリジンホ
スホリラーゼの構造遺伝子の一部に相当するオリゴヌク
レオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドをプローブと
して大腸菌などの微生物の遺伝子バンクよりプリンヌク
レオシドホスホリラーゼまたはウリジンホスホリラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を選出するれ
ばよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されない
が、操作性および簡便性から大腸菌を宿主とするのが適
当である。
は、通常の組換えＤＮＡ手法にて容易に行うことができ
る。すなわち、既に報告され、本発明の方法で使用可能
なプリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはウリジンホ
スホリラーゼの構造遺伝子の一部に相当するオリゴヌク
レオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドをプローブと
して大腸菌などの微生物の遺伝子バンクよりプリンヌク
レオシドホスホリラーゼまたはウリジンホスホリラーゼ
をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を選出するれ
ばよい。クローン化に用いる宿主は特に限定されない
が、操作性および簡便性から大腸菌を宿主とするのが適
当である。
【０００７】通常、選出したＤＮＡ断片をプラスミドベ
クターなどにクローン化しても、該ＤＮＡ断片はプロモ
ーターを有していないか、あるいはプロモーターを有し
ていても異種微生物内で効率的に機能できないことが多
く、コードされた遺伝子の高発現は通常起こらないとさ
れている。また、コーディング領域以外の余分なＤＮＡ
を有していると、たとえプラスミドベクター上に存在し
ている他の遺伝子のプロモーターからのリードスルー
（read through）転写によっても、その高発現が起こり
うることがあり、好ましいことではない。このため、目
的とする遺伝子の高発現を具体化するためには、クロー
ン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、該遺伝子のコ
ーディング領域を特定するとともに不要な配列を除去
し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で高発
現となるように発現制御シグナル（転写開始および翻訳
開始シグナル）をその５'上流に連結した組換え発現ベ
クターを構築する必要がある。ＤＮＡ塩基配列の決定
は、常法により行うことができ、たとえばマキサムーギ
ルバートの方法（Methods in Enzymology, 65, 499(198
0)）もしくはダイデオキシチェインターミネーター法
（Methods in Enzymology, 101, 20(1983)）などを応用
して行うことができる。
クターなどにクローン化しても、該ＤＮＡ断片はプロモ
ーターを有していないか、あるいはプロモーターを有し
ていても異種微生物内で効率的に機能できないことが多
く、コードされた遺伝子の高発現は通常起こらないとさ
れている。また、コーディング領域以外の余分なＤＮＡ
を有していると、たとえプラスミドベクター上に存在し
ている他の遺伝子のプロモーターからのリードスルー
（read through）転写によっても、その高発現が起こり
うることがあり、好ましいことではない。このため、目
的とする遺伝子の高発現を具体化するためには、クロー
ン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、該遺伝子のコ
ーディング領域を特定するとともに不要な配列を除去
し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で高発
現となるように発現制御シグナル（転写開始および翻訳
開始シグナル）をその５'上流に連結した組換え発現ベ
クターを構築する必要がある。ＤＮＡ塩基配列の決定
は、常法により行うことができ、たとえばマキサムーギ
ルバートの方法（Methods in Enzymology, 65, 499(198
0)）もしくはダイデオキシチェインターミネーター法
（Methods in Enzymology, 101, 20(1983)）などを応用
して行うことができる。
【０００８】目的とするプリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ遺伝子またはウリジンホスホリラーゼ遺伝子を異種
微生物内で大量発現させるために使用する発現制御シグ
ナルとしては、人為的制御が可能で、酵素遺伝子の発現
量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻
訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転
写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場
合は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター（Proc. Natl. Acsd. Sci. USA., 80, 2
1(1983)、Gene, 20, 231(1982)）、ｔｒｃプロモーター
（J. Biol. Chem., 260, 3539(1985)）などを、酵母を
宿主とする場合にはグリセルアルデヒドー３ーフォスフ
ェート・デハイドロゲナーゼ（J. Biol. Chem., 254, 2
078(1980)）や抑制性酸性フォスファターゼ（Nucl. Aci
ds. Res., 11, 1657(1983)）などの遺伝子の発現制御シ
グナルなどをそれぞれ例示することができる。
ーゼ遺伝子またはウリジンホスホリラーゼ遺伝子を異種
微生物内で大量発現させるために使用する発現制御シグ
ナルとしては、人為的制御が可能で、酵素遺伝子の発現
量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻
訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転
写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場
合は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター（Proc. Natl. Acsd. Sci. USA., 80, 2
1(1983)、Gene, 20, 231(1982)）、ｔｒｃプロモーター
（J. Biol. Chem., 260, 3539(1985)）などを、酵母を
宿主とする場合にはグリセルアルデヒドー３ーフォスフ
ェート・デハイドロゲナーゼ（J. Biol. Chem., 254, 2
078(1980)）や抑制性酸性フォスファターゼ（Nucl. Aci
ds. Res., 11, 1657(1983)）などの遺伝子の発現制御シ
グナルなどをそれぞれ例示することができる。
【０００９】ベクターとしては、種々のプラスミドベク
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生
物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用することが望ましい。具体
的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Gen
e, 2, 95(1975)）、ｐＵＣ１８，同１９（Gene, 33, 10
3(1985)）などを例示することができる。また、酵母を
宿主とする場合には、ＹＥｐ１３（ATCC 37115）、ＹＥ
ｐ２４（ATCC 37051）などを例示することができる。プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼまたはウリジンホスホ
リラーゼの各構造遺伝子の調製、クローニングした遺伝
子と発現調製シグナルとの連結などの方法は、一般の技
術者、特に分子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術
者にとっては周知の技術であり、具体的には、たとえば
「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring H
arbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うこ
とができる。
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生
物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用することが望ましい。具体
的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Gen
e, 2, 95(1975)）、ｐＵＣ１８，同１９（Gene, 33, 10
3(1985)）などを例示することができる。また、酵母を
宿主とする場合には、ＹＥｐ１３（ATCC 37115）、ＹＥ
ｐ２４（ATCC 37051）などを例示することができる。プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼまたはウリジンホスホ
リラーゼの各構造遺伝子の調製、クローニングした遺伝
子と発現調製シグナルとの連結などの方法は、一般の技
術者、特に分子生物学、遺伝子工学の分野に属する技術
者にとっては周知の技術であり、具体的には、たとえば
「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring H
arbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うこ
とができる。
【００１０】作製した組換えベクターを用いて宿主微生
物を形質転換する。宿主となる微生物は安全性は高く取
り扱いやすいものであれば特に限定されない。たとえ
ば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されてい
る微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌
が取り扱い上、およびプリンアラビノシド合成上有利で
あり、たとえば組換え実験に使用されるＫ−１２株、Ｃ
６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌などが使用可能
である。微生物を形質転換する方法は既に多くの方法が
報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適
宜選択すればよい。たとえば、大腸菌を宿主として使用
する場合、低温下、塩化カリシュウム処理して菌体にプ
ラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）により大腸菌を形質転換することができる。また、
酵母を宿主とする場合には、プロトプラスト法（Proc.
Natl. Acsd. Sci.USA., 75, 1929(1978)）、あるいはア
ルカリ金属処理法（J. Bacteriol., 153,163(1983)）な
どを採用することができる。
物を形質転換する。宿主となる微生物は安全性は高く取
り扱いやすいものであれば特に限定されない。たとえ
ば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されてい
る微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌
が取り扱い上、およびプリンアラビノシド合成上有利で
あり、たとえば組換え実験に使用されるＫ−１２株、Ｃ
６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌などが使用可能
である。微生物を形質転換する方法は既に多くの方法が
報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適
宜選択すればよい。たとえば、大腸菌を宿主として使用
する場合、低温下、塩化カリシュウム処理して菌体にプ
ラスミドを導入する方法（J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）により大腸菌を形質転換することができる。また、
酵母を宿主とする場合には、プロトプラスト法（Proc.
Natl. Acsd. Sci.USA., 75, 1929(1978)）、あるいはア
ルカリ金属処理法（J. Bacteriol., 153,163(1983)）な
どを採用することができる。
【００１１】得られた形質転換体は当該微生物が増殖可
能な培養中で増殖させ、さらにクローン化したプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ遺伝子またはウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に該酵素が大量
に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素
源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含
有する培地を用いて常法に従って行えばよい。たとえ
ば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘ
ＴＹ培地（Methods in Enzymology, 100, 20(1983)）、
ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molcular Cloning, 前述）な
どの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜
４０℃の培養温度で必要により通気、攪拌しながら培養
する。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合に
は、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当
な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、ア
ンピシリン、テトラサイクリンなど）の薬剤を適当量培
養液に加えて培養する。
能な培養中で増殖させ、さらにクローン化したプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ遺伝子またはウリジンホスホ
リラーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に該酵素が大量
に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素
源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含
有する培地を用いて常法に従って行えばよい。たとえ
ば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘ
ＴＹ培地（Methods in Enzymology, 100, 20(1983)）、
ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molcular Cloning, 前述）な
どの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜
４０℃の培養温度で必要により通気、攪拌しながら培養
する。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合に
は、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当
な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、ア
ンピシリン、テトラサイクリンなど）の薬剤を適当量培
養液に加えて培養する。
【００１２】培養中にプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ遺伝子またはウリジンホスホリラーゼ遺伝子の発現を
誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常
用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。たとえ
ば、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターを使用し
た場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル
−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適当量添
加する。ヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子の発現を誘
導した後、該遺伝子産物を菌体内に大量蓄積させるた
め、さらに数時間の培養を継続して酵素源としての培養
物を得る。
ゼ遺伝子またはウリジンホスホリラーゼ遺伝子の発現を
誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常
用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。たとえ
ば、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターを使用し
た場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル
−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適当量添
加する。ヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子の発現を誘
導した後、該遺伝子産物を菌体内に大量蓄積させるた
め、さらに数時間の培養を継続して酵素源としての培養
物を得る。
【００１３】本発明の方法に使用する酵素源としては、
上記培養物、培養菌体、菌体を処理して得られる菌体処
理物、または菌体から調製された粗酵素もしくは精製酵
素を例示することができる。たとえば、菌体を酵素源と
して使用する場合、培養物から膜分離あるいは遠心分離
などにより回収された菌体を適当な緩衝液に懸濁させた
ものを酵素源として使用すればよい。また、回収した菌
体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレ
ス処理などにより溶菌させ、菌体残渣を遠心分離により
除去して得られる無細胞抽出液を粗酵素液として使用す
ることができる。さらに精製が必要とされる場合でも、
熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶
媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に
通常使用されている処理を単独で、またはせいぜい２種
類の組み合わせただけの簡便な手段で高度に精製された
酵素標品を調製できる。
上記培養物、培養菌体、菌体を処理して得られる菌体処
理物、または菌体から調製された粗酵素もしくは精製酵
素を例示することができる。たとえば、菌体を酵素源と
して使用する場合、培養物から膜分離あるいは遠心分離
などにより回収された菌体を適当な緩衝液に懸濁させた
ものを酵素源として使用すればよい。また、回収した菌
体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレ
ス処理などにより溶菌させ、菌体残渣を遠心分離により
除去して得られる無細胞抽出液を粗酵素液として使用す
ることができる。さらに精製が必要とされる場合でも、
熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶
媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に
通常使用されている処理を単独で、またはせいぜい２種
類の組み合わせただけの簡便な手段で高度に精製された
酵素標品を調製できる。
【００１４】（２）プリンアラビノシドの酵素的製造法 本発明方法は、上記のようにして得られたプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラーゼを
併用するとともに、２つの酵素の使用割合が酵素単位
（ユニット）としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
をウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上使用し、プリ
ンとウラシルアラビノシドとからプリンアラビノシドを
製造しようとするものである。反応に使用するプリンお
よびウラシルアラビノシドはいずれも公知化合物であ
り、目的とするプリンアラビノシドに対応して適宜取捨
選択すればよい。
オシドホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラーゼを
併用するとともに、２つの酵素の使用割合が酵素単位
（ユニット）としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
をウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上使用し、プリ
ンとウラシルアラビノシドとからプリンアラビノシドを
製造しようとするものである。反応に使用するプリンお
よびウラシルアラビノシドはいずれも公知化合物であ
り、目的とするプリンアラビノシドに対応して適宜取捨
選択すればよい。
【００１５】反応条件は、使用した酵素の至適条件を適
宜決定して行えばよく、具体的には反応温度として２０
〜９５℃、反応ｐＨとして３〜１０の各範囲内から適宜
選定し得る。反応は、必要によりリン酸を１〜１００ｍ
Ｍ含む緩衝液中、１〜１０００ｍＭのプリン、１〜１０
００ｍＭのウラシルアラビノシドおよび０．１〜１００
（Ｕ／ｍｌ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びウリジンホスホリラーゼを用い、１〜１００時間程度
反応させることにより実施することができる。プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラー
ゼの使用割合は、酵素単位（ユニット）としてプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの
１．５倍以上、具体的には１．５〜１００倍、好ましく
は１．５〜１０倍、更に好ましく１．５〜５倍程度使用
する。反応後、得られたプリンアラビノシドは従来の方
法にて単離精製することができる。
宜決定して行えばよく、具体的には反応温度として２０
〜９５℃、反応ｐＨとして３〜１０の各範囲内から適宜
選定し得る。反応は、必要によりリン酸を１〜１００ｍ
Ｍ含む緩衝液中、１〜１０００ｍＭのプリン、１〜１０
００ｍＭのウラシルアラビノシドおよび０．１〜１００
（Ｕ／ｍｌ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼおよ
びウリジンホスホリラーゼを用い、１〜１００時間程度
反応させることにより実施することができる。プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼおよびウリジンホスホリラー
ゼの使用割合は、酵素単位（ユニット）としてプリンヌ
クレオシドホスホリラーゼをウリジンホスホリラーゼの
１．５倍以上、具体的には１．５〜１００倍、好ましく
は１．５〜１０倍、更に好ましく１．５〜５倍程度使用
する。反応後、得られたプリンアラビノシドは従来の方
法にて単離精製することができる。
【００１６】
【発明の効果】本発明方法は、後述の実施例に示されて
いるように、使用したプリン当たり６０％以上、化合物
によっては９０％以上の収率で目的とするプリンアラビ
ノシドを合成することが可能であり、極めて実用的な方
法である。
いるように、使用したプリン当たり６０％以上、化合物
によっては９０％以上の収率で目的とするプリンアラビ
ノシドを合成することが可能であり、極めて実用的な方
法である。
【００１７】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切
断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸
菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Maniati
sら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、制
限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、アルカ
リホスファターゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切
断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸
菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Maniati
sら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、制
限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、アルカ
リホスファターゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。
【００１８】実施例１：アデニンアラビノシド（アラ
Ａ）の合成 （１）大腸プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子の
クローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｄｅｏＤ）遺伝子を
増幅した。
Ａ）の合成 （１）大腸プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子の
クローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｄｅｏＤ）遺伝子を
増幅した。
【００１９】 プライマー（Ａ）：5'-ATGTTCTGATGGATTTGGGCGGAG-3' プライマー（Ｂ）：5'-GATACTAAAAAGCCGGAGCAGTCT-3'
【００２０】ＰＣＲによるｄｅｏＤ遺伝子の増幅は、反
応液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１ｍｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々
０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１
分）、アニーリング（５７℃、１．５分）、ポリメライ
ゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰
り返すことにより行った。
応液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１ｍｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々
０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１
分）、アニーリング（５７℃、１．５分）、ポリメライ
ゼーション（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰
り返すことにより行った。
【００２１】遺伝子増幅後、反応液をフェノール/クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、８５０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡをＢｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社より入手）で平滑処理を行
い、次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースで５’末端を
りん酸化した後、制限酵素ＳｍａＩ及びアルカリホスフ
ァターゼで処理したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＵＣ
−ＥＰｕＦを単離した。ｐＵＣ−ＥＰｕＦはｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部位に大腸菌
ｄｅｏＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が順方向で挿入さ
れたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、８５０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡをＢｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社より入手）で平滑処理を行
い、次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースで５’末端を
りん酸化した後、制限酵素ＳｍａＩ及びアルカリホスフ
ァターゼで処理したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＵＣ
−ＥＰｕＦを単離した。ｐＵＣ−ＥＰｕＦはｐＵＣ１８
のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部位に大腸菌
ｄｅｏＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が順方向で挿入さ
れたものである。
【００２２】次にプラスミドｐＵＣＥＰｕＦを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、得られる８６０ｂ相
当のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、
回収した。該ＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＥＰｕ
を単離した。ｐＴｒｃ−ＥＰｕは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔ
ｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断断片
に大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
ＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、得られる８６０ｂ相
当のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、
回収した。該ＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＥＰｕ
を単離した。ｐＴｒｃ−ＥＰｕは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔ
ｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断断片
に大腸菌ｄｅｏＤ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
ＩＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００２３】（２）大腸菌プリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ＥＰｕを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃
で３時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁した。３７℃で１
時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さ
らに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体
残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素標
品とした。酵素標品におけるプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸
菌ＪＭ１０９菌）と共に下記表に示す。なお、本発明に
おけるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性は、山内
の方法（特開平４−４８８２）に従い、５０℃における
イノシンの加リン酸分解活性を測定して算出した。
ラーゼの調製 プラスミドｐＴｒｃ−ＥＰｕを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃
で３時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁した。３７℃で１
時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、さ
らに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌体
残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素標
品とした。酵素標品におけるプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ活性を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸
菌ＪＭ１０９菌）と共に下記表に示す。なお、本発明に
おけるプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性は、山内
の方法（特開平４−４８８２）に従い、５０℃における
イノシンの加リン酸分解活性を測定して算出した。
【００２４】
【表１】
【００２５】（３）大腸ウリジンホスホリラーゼ遺伝子
のクローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｕｄｐ）遺伝子を増
幅した。
のクローニング 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造（株）より入手）
の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡ
をテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマー
ＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｕｄｐ）遺伝子を増
幅した。
【００２６】 プライマー（Ａ）：5'-AGTGTCTTTTTGCTTCTTCTGACT-3' プライマー（Ｂ）：5'-TACGCAAAAATACAAAAGGCCGAA-3'
【００２７】ＰＣＲによるｕｄｐ遺伝子の増幅は、反応
液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１
ｍｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２
ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５
ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション
（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこと
により行った。
液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウ
ム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１
ｍｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２
ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５
ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション
（７２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すこと
により行った。
【００２８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、８５０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡをＢｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社より入手）で平滑処理を行
い、次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースで５’末端を
りん酸化した後、制限酵素ＳｍａＩ及びアルカリホスフ
ァターゼで処理したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド ｐＵ
Ｃ−ＵｒｄＦを単離した。ｐＵＣ−ＵｒｄＦはｐＵＣ１
８のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部位に大腸
菌ｕｄｐ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が順方向で挿入さ
れたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、８５０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡをＢｌｕｎｔ
ｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社より入手）で平滑処理を行
い、次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースで５’末端を
りん酸化した後、制限酵素ＳｍａＩ及びアルカリホスフ
ァターゼで処理したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド ｐＵ
Ｃ−ＵｒｄＦを単離した。ｐＵＣ−ＵｒｄＦはｐＵＣ１
８のｌａｃプロモーター下流のＳｍａＩ切断部位に大腸
菌ｕｄｐ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が順方向で挿入さ
れたものである。
【００２９】次にプラスミドｐＵＣＥＰｕＦを制限酵素
ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、得られる８７０ｂ相当
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、回
収した。該ＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＳ
ａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。この連結反応液を用いて
大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリ
ン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−Ｕｒｄを単
離した。ｐＴｒｃ−Ｕｒｄは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃ
プロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断断片に大
腸菌ｕｄｐ遺伝子を含有するＫｐｎＩ−ＳａｌＩＤＮＡ
断片が挿入されたものである。
ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化し、得られる８７０ｂ相当
のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、回
収した。該ＤＮＡ断片と同じく制限酵素ＫｐｎＩ及びＳ
ａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社より入手）とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。この連結反応液を用いて
大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリ
ン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−Ｕｒｄを単
離した。ｐＴｒｃ−Ｕｒｄは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃ
プロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ切断断片に大
腸菌ｕｄｐ遺伝子を含有するＫｐｎＩ−ＳａｌＩＤＮＡ
断片が挿入されたものである。
【００３０】（４）大腸菌ウリジンホスホリラーゼの調
製 プラスミドｐＴｒｃ−Ｕｒｄを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃
で３時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素
標品とした。酵素標品におけるウリジンホスホリラーゼ
活性を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌）と共に下記表に示す。なお、本発明におけるウ
リジンホスホリラーゼ活性は、山内の方法（特開平４−
４８８２）に従い、５０℃におけるウリジンの加リン酸
分解活性を測定して算出した。
製 プラスミドｐＴｒｃ−Ｕｒｄを保持する大腸菌ＪＭ１０
９菌を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２
ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養し
た。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃
度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃
で３時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、６０
ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、
５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トライトンＸ−１００、
０．２ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）に懸濁した。３７℃で
１時間保温した後、超音波処理を行い、菌体を破砕し、
さらに遠心分離（２０，０００ｘｇ、１０分）により菌
体残さを除去した。このように得られた上清画分を酵素
標品とした。酵素標品におけるウリジンホスホリラーゼ
活性を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１
０９菌）と共に下記表に示す。なお、本発明におけるウ
リジンホスホリラーゼ活性は、山内の方法（特開平４−
４８８２）に従い、５０℃におけるウリジンの加リン酸
分解活性を測定して算出した。
【００３１】
【表２】
【００３２】（５）アデニンアラビノシド（アラＡ）の
合成 ６０ｍＭウラシルアラビノシド（アラＵ）、４０ｍＭア
デニン、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
５ｍｌに上記調製した大腸菌プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ５０ユニット（Ｕ）、大腸菌ウリジンホスホリ
ラーゼ２５Ｕを添加し、５０℃、４８時間反応した。高
速液体クロマトグラフィーで定性、定量した結果、３
７．４２ｍＭのアラＡが生成した（反応収率：９３．６
％ 対アデニン当り）。
合成 ６０ｍＭウラシルアラビノシド（アラＵ）、４０ｍＭア
デニン、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
５ｍｌに上記調製した大腸菌プリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ５０ユニット（Ｕ）、大腸菌ウリジンホスホリ
ラーゼ２５Ｕを添加し、５０℃、４８時間反応した。高
速液体クロマトグラフィーで定性、定量した結果、３
７．４２ｍＭのアラＡが生成した（反応収率：９３．６
％ 対アデニン当り）。
【００３３】実施例２；２，６−ジアミノプリンアラビ
ノシド（アラＤａｐ）およびグアニンアラビノシドの合
成 ６０ｍＭアラＵ、５０ｍＭ２，６−ジアミノプリン、２
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに実
施例１と同じ酵素を同じ単位で添加し、５０℃、６５時
間反応した。高速液体クロマトグラフィーで定性、定量
した結果、４８．１８ｍＭのアラＤａｐが生成した（反
応収率：９６．４％ 対２，６−ジアミノプリン当
り）。さらに、この反応液５ｍｌに大腸菌アデノシンデ
アミナーゼ５０Ｕ添加し、４０℃、５時間反応すること
により生成した全てのアラＤａｐがグアニンアラビノシ
ドに変換することも高速液体クロマトグラフィーにより
確認した。
ノシド（アラＤａｐ）およびグアニンアラビノシドの合
成 ６０ｍＭアラＵ、５０ｍＭ２，６−ジアミノプリン、２
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌに実
施例１と同じ酵素を同じ単位で添加し、５０℃、６５時
間反応した。高速液体クロマトグラフィーで定性、定量
した結果、４８．１８ｍＭのアラＤａｐが生成した（反
応収率：９６．４％ 対２，６−ジアミノプリン当
り）。さらに、この反応液５ｍｌに大腸菌アデノシンデ
アミナーゼ５０Ｕ添加し、４０℃、５時間反応すること
により生成した全てのアラＤａｐがグアニンアラビノシ
ドに変換することも高速液体クロマトグラフィーにより
確認した。
【００３４】実施例３；２−フルオロアデニンアラビノ
シド（フルダラビン） 米国特許５１８０８２４号を参考に２−フルオロアデニ
ンを調製した。すなわち、ジアミノプリン３ｇを４２％
ＨＢＦ４溶液中、氷冷下、亜硝酸ナトリウムを加えて攪
拌した。反応液を水で希釈し、吸着樹脂（溶出溶媒５％
エタノール）で精製し、溶媒を濃縮して析出する結晶を
ろ取して２−フルオロアデニン１ｇ（収率３３％）を得
た。次に、６０ｍＭアラＵ、５０ｍＭ２−フルオロアデ
ニン、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、
３０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルオキサイド５ｍｌに実施
例１と同じ酵素を同じ単位で添加し、５０℃、６５時間
反応した。高速液体クロマトグラフィーで定性、定量し
た結果、３２ｍＭのフルダラビンが生成した（反応収
率：６４％ 対２−フルオロアデニン当り）。反応液を
沸騰湯浴中でインキュベートして酵素反応を停止後、濃
縮することで析出してくる結晶をろ取してフルダラビン
を得た。
シド（フルダラビン） 米国特許５１８０８２４号を参考に２−フルオロアデニ
ンを調製した。すなわち、ジアミノプリン３ｇを４２％
ＨＢＦ４溶液中、氷冷下、亜硝酸ナトリウムを加えて攪
拌した。反応液を水で希釈し、吸着樹脂（溶出溶媒５％
エタノール）で精製し、溶媒を濃縮して析出する結晶を
ろ取して２−フルオロアデニン１ｇ（収率３３％）を得
た。次に、６０ｍＭアラＵ、５０ｍＭ２−フルオロアデ
ニン、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、
３０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルオキサイド５ｍｌに実施
例１と同じ酵素を同じ単位で添加し、５０℃、６５時間
反応した。高速液体クロマトグラフィーで定性、定量し
た結果、３２ｍＭのフルダラビンが生成した（反応収
率：６４％ 対２−フルオロアデニン当り）。反応液を
沸騰湯浴中でインキュベートして酵素反応を停止後、濃
縮することで析出してくる結晶をろ取してフルダラビン
を得た。
Claims (4)
- 【請求項１】 ヌクレオシドホスホリラーゼを用いてプ
リンとウラシルアラビノシドとからプリンアラビノシド
を製造する方法において、ヌクレオシドホスホリラーゼ
としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼとウリジンホ
スホリラーゼを併用し、２つの酵素の使用割合が酵素単
位（ユニット）としてプリンヌクレオシドホスホリラー
ゼをウリジンホスホリラーゼの１．５倍以上使用するこ
とを特徴とするプリンアラビノシドの酵素的製造法。 - 【請求項２】 ２つの酵素の使用割合が酵素単位（ユニ
ット）としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼをウリ
ジンホスホリラーゼの１．５〜１００倍使用する、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 ２つの酵素の使用割合が酵素単位（ユニ
ット）としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼをウリ
ジンホスホリラーゼの１．５〜１０倍使用する、請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】 ２つの酵素の使用割合が酵素単位（ユニ
ット）としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼをウリ
ジンホスホリラーゼの１．５〜５倍使用する、請求項１
記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11334297A JPH10286097A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | プリンアラビノシドの酵素的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11334297A JPH10286097A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | プリンアラビノシドの酵素的製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10286097A true JPH10286097A (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=14609823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11334297A Pending JPH10286097A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | プリンアラビノシドの酵素的製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10286097A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002533126A (ja) * | 1998-12-23 | 2002-10-08 | ノルファーマ エスピーエー | 天然ヌクレオシドおよびその改変類縁体を産生するための組換え細菌株 |
-
1997
- 1997-04-15 JP JP11334297A patent/JPH10286097A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002533126A (ja) * | 1998-12-23 | 2002-10-08 | ノルファーマ エスピーエー | 天然ヌクレオシドおよびその改変類縁体を産生するための組換え細菌株 |
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