JPH0390037A - リポソーム製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、有効成分として少なくともリンホトキシン（
以下ＬＴと略すことがある）を含有するリポソームとモ
ノクローナル抗体との結合物からなる抗腫瘍剤に関する
。

〔従来の技術〕

ＬＴはリンパ球及びリンパ球系株化細胞から抗原刺激、
またはマイトジェン刺激によって生産されるリンホカイ
ンの１種であり種々の癌細胞に対して障害性を有するこ
とから抗腫瘍剤（Ｅｖａｎｓ　Ｃ。

■、らＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　　３７　、　　ｐ　８
９８　　（１９７７）　）として、ウィルスに対して障
害性を有することから抗ウィルス剤（Ｇ、Ｈ，Ｗ、Ｗｏ
ｎｇ　＆　Ｄ、Ｖ、ＧｏｅｄｄｅｌらＮａｔｕｒｅ３２
３．ｐ８１９．（１９８６））として、更にマクロファ
ージ活性化剤〔特開昭６４−４２４４１号〕として医薬
への応用が期待されている。しかしながら、それらの効
果を発現させるため、多量のＬＴを投与すると副作用が
認められることから、より少量で効果のある工夫、また
は副作用が少ない技術手段の提供が望まれている。

一方、従来、そのような工夫としては、ＬＴをリポソー
ム内に封入する試みもあるが、データはなく効果は全く
示されていない（特開昭６ｌ−５６１９７）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者は、少量の使用で前述した効果を発揮する製剤
を得ることを目的として、鋭意検討した結果、ＬＴをリ
ポソーム内に含有させた後、得られたＬＴ含有リポソー
ムをモノクローナル抗体と結合させればよいことを見出
して本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、リンホトキシンを含有するリポソ
ームとモノクローナル抗体との結合物からなる抗腫瘍剤
を提供する。

以下に本発明について詳しく説明する。

この発明において使用するＬＴは、次の一般式：％式％ で表わされるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配
列を有するものであって、ある種の腫瘍細胞系統に対す
る細胞抑制作用を持つリンホカインの１つである。その
ようなＬＴは、天然型、遺伝子組換え型のいずれでもよ
いが、好ましくは、遺伝子組換え型である。その具体例
をあげれば特開昭６４−６２９８号公報、特開昭６３−
８６９８号公報、特開昭６３−８３９９号公報、特開昭
６２−１５１１８２号公報で示された蛋白質があげられ
る。

またモノクローナル抗体としては標的とする部位、病巣
、細胞が有する抗原に対するものがあげられる。癌に対
して集積させようとするなら適用しようとしている癌細
胞が有している抗原、例えばＣＥＡ、　　トランスフェ
リンレセプター（Ｔ　ｆ　−Ｒ）、ＡＦＰ、などといっ
た蛋白質とか癌特異的なｍ鎖などに対するモノクローナ
ル抗体があげられる。病巣の組織に集積させようとすれ
ば、その組繊細胞に特異的な抗原に対するモノクローナ
ル抗体が良い適用例であり、免疫担当細胞に作用させよ
うとすれば目的とする免疫担当細胞が有するマーカー抗
原に対するモノクローナル抗体があげられる。実際ＣＥ
Ａ、Ｔｆ−Ｒ等を有する癌細胞に対しては、インビボで
、モノクローナル抗体を投与するとその癌組織にモノク
ローナル抗体が集積することが確かめられており、本発
明の実施例中で使用しているヒト黒色腫細胞株Ａ−３７
５に対するマウスモノクローナル抗体（ＡＭ−４Ｅ３）
も、ヌードマウスを用いた実験で腫瘍部位に抗体が集積
することが確かめられている（ＷａｔａｎａｂｅＹ、ら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｎｏｄ、　　６
　　（５）　、　　５５６゜（１９８７））。上記のこ
とよりモノクローナル抗体とリポソームを結合させたモ
ノクローナル抗体修飾リポソームも目的の部位に集積す
ることが推察できる。またこれらのモノクローナル抗体
は、ヒト抗体、ヒト−マウスキメラ抗体、マウス抗体等
にいずれでもよく、抗体そのもの以外に抗体の１部であ
るＦ（ａｂ’　）ｇ　、　Ｆ（ａｂ’　）でもよい。

本発明においてリポソームとはリン脂質を塩類溶液中に
分散せしめて得られる脂質多重構造の閉鎖小胞であり、
リポソーム化は、薄膜法、溶液注入法、界面活性剤処理
法、超音波法、凍結融解法、逆相蒸発法等の公知の方法
によることが出来る。

材料としてはリン脂質、例えばホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、リゾレシチン、スフィンゴ逅ニリン、ジセチルリン
酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール或はこ
れらを改質したもの、及びその混合物を挙げることがで
きるが、特にこれらに限定されない。また、リポソーム
２分子膜の補強剤として中性脂質であるコレステロール
等を安定剤として、糖脂質、糖蛋白質等を加えてもよい
。要はリポソームを形成することの出来るリン脂質であ
ればよくレシチンのごときホスファチジルコリンは、リ
ポソーム基本構成リン脂質として好ましい材料である。

モノクローナル抗体／脂質のモル比は１〜１０−１０で
ある。また、リポソームとモノクローナル抗体を結合さ
せる方法としては、■リポソーム表面へ抗体を吸着させ
る方法、■リポソーム膜上べ抗体を取り込ませる方法、
■５ＰＤＰ等のスペーサーを介して、抗体とリポソーム
の膜脂質と結合させる方法、■抗体を修飾し疎水基を導
入することでリポソーム膜上に抗体を組み込む方法、■
疎水基を有し反応性に冨むポリマーをリポソーム膜上に
組み込みそのポリマーと抗体を結合させる方法（Ｔｏｒ
ｃｈｉｌｉｎ　Ｖ。

Ｐ、、　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉ
ｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒ
　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｖｏｌ、　２＋　ｌ５ｓｕｅ　ｌ　
）等、公知の方法のいずれでもよいが特に■、■、■の
方法が抗体を積極的に膜上に結合させるので好ましい。

その中で一例を挙げ、■５ＰＤＰ等のスペーサーを介し
て結合させる方法を説明する。モノクローナル抗体をＮ
　−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　３　　（２−ｐｙｒｔ
ｄｙｉｄＨｈｉｏ　）　ｐｒｏｐｉｎａｔｅ　　（Ｓ　
Ｐ　Ｄ　Ｐ　）を用いて５ＰＤＰ化した後、ジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）を添加、ＳＨ化しＳＨ−抗体を得る
。一方ＳＨ−抗体に結合させる脂質としてホスファチジ
ルエタノールアミン（ＰＥ）と５ＰＤＰよりＮ−（３−
（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ　）　ｐｒｏｐｙｎ
ｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ　ｅｔｈａｎｏｌ　ａ
ａ＋ｉｎｅ　（Ｐ　Ｄ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　）を台底する（
Ｍａｒｔｉｎ、　Ｆ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｓ＋１ｓｔｒｙ童立、４２２９．（１９８１））。次に
ＦＤＰ−ＰＥを組み込んだＬＴ含有リポソームを作製し
、ＳＨ−抗体と反応させることでモノクローナル抗体修
飾ＬＴ含有リポソームを得ることが出来る。

モノクローナル抗体修飾ＬＴ含有リポソームは懸濁剤と
して注射剤、エアロゾルとして吸入剤、また凍結乾燥し
て粉末として用いる等、利用法が考えられるが、抗体の
選択により目的の標的部位に高濃度で集積させることが
可能のため、ＬＴの直接投与に比べより少量で効果を期
待することが出来、また不必要な部位でのＬＴが少なく
なるため副作用も軽減することが可能である。

〔実施例〕

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

モノクローナル抗体産生株は、特開昭６２−１１１９３
４で示したように、Ｂａ１ｂ／ｃマウス（５週令、雌）
にヒト黒色腫細胞株Ａ−３７５を免疫し、その肺臓細胞
とマウスミエローマｍ胞株５ｐ−２を融合し、固定した
Ａ−３７５との結合能を指標として取得した。この株の
産生ずるヒト黒色腫細胞株Ａ−３７５に対するモノクロ
ーナル抗体（ＡＭ−４２３）をマウス腹水にて大量取得
後、硫安塩析、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフ
ィーを用いて精製した。この抗体をＮ−ＳｕｃＮ−５ｕ
ｃｃｉｎｔ　３　　（２ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ　
）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ　（Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　）と混合
して反応させ、５ＰＤＰ化した後、未反応の５ＰＤＰを
ゲル濾過で除去し、さらにジチオスレイトール（ＤＴＴ
）　を添加し、ＳＨ化してＳＨ−抗体を得た。一方ＳＨ
抗体に結合させる脂質としてホスファチジルエタノ−ル
アごン（ＰＥ）と５ＰＤＰよりＮ−（３（２ｐｙｒｉｄ
ｙｌｄｉｔｈｉｏ　）　ｐｒｏｐｙｎｙｌ）ｐｈｏｓｐ
ｌｉａｔｉｄｙｌ　ｅｔｈａｎｏｌ　ａｍｉｎｅ　（Ｐ
　Ｄ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ　）を合成した。合或は、Ｍａｒｔ
ｉｎらの方法（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｆ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０　
、　４２２９　。

（１９８１））に従い、メタノール３成とトリエチルア
ミン１８．４μｌに５ＰＤＰ２５■を溶解、ＰＥ１００
ｄを添加して遮光下室温で５時間反応させ、未反応の５
ＰＤＰをシリカゲルカラムで除去することで得た。

卵黄レシチン、ＦＤＰ−ＰＥ、コレステロール計１０■
をモル比が９：ｌ：ｔｏになるように混合し、エーテル
３００μｌに溶解し、特開昭６４−６２９８号公報で示
した遺伝子組換え型ＬＴ溶液（５，５Ｘ　１０’　μ／
ｄ）ＬＯＯμｌを加え、超音波処理（２分間）によりエ
マルジョン化した。

エーテルを減圧除去し、ＰＢＳ　（塩化ナトリウム７．
５％含有５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，２）　４．７　
ｗｉｔを加え、混合後、遠心分離（５０，０ＯＯＧ、１
時間）し、上清（封入されなかったＬＴ？Ｖ液）を除去
、沈澱にＳＨ−抗体溶液（１■／絨）を５００μｌ加え
混合し、４　’Ｃで１夜反応させた。反応後遠心分離機
を用いＰＢＳで２回洗浄し、沈澱を５００μＡのＰＢＳ
に懸濁させ、０．４μｍのポリカーボネート膜にュクリ
ボアー製）を通過させることで無菌化した。３Ｈでラベ
ルしたフコースを用いてＬＴとり込み率を調べたところ
８．４％の収率を示した。よって作製したモノクローナ
ル抗体修飾ＬＴ含有リポソームは２．５Ｘ１０３μ／−
と推定された。

Ｂａ１ｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス４週令雄を退会てヒト
メラノーマＡ−３７５に対するモノクローナル抗体修飾
ＬＴ含有リポソームとＬＴ温溶液腫瘍増殖抑制効果をイ
ンビボで検討した。Ｂａ１ｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの
右そけい部皮下にＡ−３７５！［１胞をｌＸｌ０’個移
植し、移植日より２．５．９．１２．１６．１９及び２
３日目に１回／日計７回、実施例１で作成したモノクロ
ーナル抗体修飾ＬＴ含有リポソームと比較のためモノク
ローナル抗体修飾ＬＴ不含リポソーム（比較例１）、モ
ノクローナル抗体修飾ＬＴ不合リポソームとＬＴの混合
液（比較例２）、ＬＴ温溶液比較例３）を２００μｌ／
匹投与した。

尚、網内系にモノクローナル抗体修飾ＬＴ含有リポソー
ムが賞食されるのを防ぐ目的で、各試料投与１時間前に
ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレス
テロールからなるリポソームを２■／匹投与した。

２５日目の腫瘍面積（短径×長径）を調べ、生理食塩水
投与群と比較することで増殖抑制率（％）を次式により
算出した。

増殖抑制率（％）＝ 結果を第１表に示す。尚、生理食塩水投与群の腫瘍面積
は３９ｍ”であった。

驚くべきことに、モノクローナル抗体修飾ＬＴ含有すポ
ソーム投与群は、ＬＴ単独ではほとんど効果を示さない
投与量にもかかわらず著しい腫瘍増殖抑制効果を示した
。

〔発明の効果〕

モノクローナル抗体修飾ＬＴ含有リポソームは、ＬＴを
単独で用いる場合に比べより強力な腫瘍増殖抑制効果を
示した。上記のことより同等の効果を期待するのに必要
なＬＴＯ量を軽減することができ、かつ副作用も軽減す
ることが可能であることから優れた抗腫瘍剤としての用
途が期待できる。

特 許 出 願 人 電気化学工業株式会社 手 続 補 正 書 平＄、１年１０月 ４日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リンホトキシンを含有するリポソームとモノクローナル
   抗体との結合物からなる抗腫瘍剤。