JPH03292892A - 動物細胞による脂肪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞による脂肪酸の製造法に関し、詳しく
は動物細胞を用いた脂肪酸の変換反応によりＴ−リノレ
ン酸またはオクタデカテトラエン酸を効率よく製造する
方法に関する。

〔従来の技術２発明が解決しようとする課題〕糸状菌を
用いて有用な脂肪酸を製造するにあたり、セサミンはジ
ホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換反応を
抑制することが知られている（Ｈ，Ｙａｍａｄａ、ｅｔ
　ａｌ、＋日本農芸化学会誌、６３巻。

ｐ６７６、１９８９年）。さらに、クルクミンも同様な
効果を有していることが知られている（特願平１−１８
３７８９号明細書）。

しかしながら、このような脂肪酸の変換反応の抑制が動
物細胞においても行われるか否かは明らかにされていな
い。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は動物細胞における脂肪酸の変換反応抑制物質
について探索すべく検討を重ねた。その結果、クルクミ
ンを添加することにより脂肪酸の鎖長延長反応が抑制さ
れることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成し
た。ここでいう脂肪酸の鎖長延長反応とは、例えば、△
６．９．１２−オクタデカトリエン酸（Ｔ−リノレン酸
）から△８．１１゜１４−エイコサトリエン酸（ジホモ
−γ−リノレン酸）への反応、Δ６．９．１２．１５−
オクタデカテトラエン酸から△８．１１．１４．１７−
エイコサテトラエン酸への反応等の炭素数１８の脂肪酸
から炭素数２０の脂肪酸への変換反応を意味する。

本発明は、Ｔ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン
酸生産能を有する動物細胞を下記の一般式で表されるク
ルクミンあるいはその誘導体を添加した培地で培養し、
培養物からγ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン
酸を採取することを特徴とする動物細胞による脂肪酸の
製造法（式中、Ｒ１は低級アルキル基を示し、Ｒ２は水
酸基、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基。

オキシアルキル基を示す。Ｒ”が複数である場合には、
複数のＲ２は同一であっても異なっていてもよい。ｎは
０〜５の整数を示す。）に関する。

本発明で用いる動物細胞としては、炭素数１８の脂肪酸
から炭素数２０の脂肪酸へ変換する能力のあるものであ
ればよい。一般に動物細胞はこの反応系を有することが
知られているので、すべての動物細胞に適用できるもの
と考えられる。具体的には、ラット初代培養肝細胞やヒ
ト肝ガン由来ＨｅｐＧｚ細胞等が用いられる。

また、クルクミンはウコンおよび他の同属数種の根茎に
含まれる黄色色素の主成分であり、入手が容易である上
に純品も安価に手に入れることができる。ウコンはカレ
ー粉、たくあん、漬物等の着色料として使用されており
、安全性の点で全ビ問題がない。クルクミンは純品を用
いる必要はなく、ウコンそのものやウコンからアセトン
等の溶剤により抽出して得た抽出物等を使用することが
できる。

本発明によりラット初代培養肝細胞などの動物細胞を用
いてγ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン酸を製
造する場合、基質としてリノール酸またはα−リノレン
酸を培地に加えるが、その際にクルクミンまたはその誘
導体も添加する。クルクミンまたはその誘導体はエタノ
ールなどの溶媒に溶解して用いることが好ましく、その
添加量は５ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／　ｔｄｌの細胞に対
して０．０１〜０．３■／蛇溶媒が適当である。

°このように、適量のクルクミンまたはその誘導体を添
加しておくことにより、動物細胞における基質である前
記脂肪酸の代謝経路の一部が阻害され、目的とする脂肪
酸、Ｔ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン酸を効
率的に蓄積させることができるのである。すなわち、ク
ルクミンまたはその誘導体は、Ｔ−リノレン酸がちジホ
モ−Ｔ−リノレン酸への変換反応またはオクタデカテト
ラエン酸からエイコサテトラエン酸への変換反応を抑制
し、目的とする脂肪酸を効率的に蓄積させるのである。

さらに、γ−リノレン酸等の多価不飽和脂肪酸がコレス
テロールの生成を抑制することが知られているが、本発
明のようにクルクミンまたはその誘導体が共存すると、
この抑制作用が向上するという興味ある結果も得られて
いる。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ ２００ｇの−ｉｓ　ｔｅｒ系雄ラットの腹腔にネンブタ
ールを（１■／ｄ）を体重１ｋｇ当たりｌＩｎ１注射し
て麻酔をかけ、麻酔が十分にかかった後、開腹して門脈
を露出した。門脈よりカニコーレを挿入し１５〜２０〆
／分の流速で３７°Ｃに保温したＣａ２“（−）　Ｈａ
ｎｋ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒを流し、肝臓を潅流した。

潅流液を約２００１１１流した後、潅流液をコラゲナー
ゼｂｕｆｆｅｒに交換し、肝臓を消化した。ここで用い
たＣａ”　（）　Ｈａｎｋ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒとコラゲ
ナーゼｂｕｆｆｅｒの組成を第１表および第２表に示す
。

１　　　　Ｃａ” ＮａＣｊ！ Ｃｆ ＮａｚＨＰＯｓ　・２ＨｚＯ Ｋ）Ｉ！ＰＯ。

ＧＴＡ ＭｇＳＯａ・４Ｈ２０ Ｇｌｕｃｏｓｅ ＭｇＣ１ｚ・６Ｈ２０ ＥＰＥＳ Ｐｈｅｎｏｌ　　ｒｅｄ Ｒａｎｋ’ｓ　　ｂｕｆｆｅｒ ８．０００　　［／Ｉ！。

００ ０ ０ ９０ ００ １　、０００ ００ ２、４００ （ｐＨ７，５） ３　　　　ＤＭＥ 塩化ナトリウム 塩化カリウム 塩化カルシウム（無水） 硫酸マグネシウム（無水） リシ酸二水素ナトリウム（無水） 硫酸第二鉄（９水塩） ブドウ糖 ピルビン酸ナトリウム コへり酸 コへり酸ナトリウム（６水塩） Ｌ−フルギニン塩酸塩 Ｌ−システィン塩酸塩（１水塩） し−イソロイシン Ｌ−ロイシン Ｌ−リシン塩酸塩 Ｌ−メチオニン Ｌ−フェニルアラニン Ｌ−セリン Ｌ−スレオニン ｂｕｆｆｅｒの ６．４００ ００ ００ ９７．７ ０８ ０．１ １．０００ １０ ０６ ７ ４ ２ １０４．８ １０４．８ １４６．２ ０ ６ ２ ９５．２ １） ＮａＣＩｌ　　　　　　　　　　　８，０００　１１ｇ
／　ＩＫＣｆ　　　　　　　　　　　　　　　４０ＯＮ
ａＪＰＯｉ　’　２Ｈｚ０　　　　　　　４ＢＫＨｚＰ
Ｏ４６０ Ｇｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　１＋０ＯＯＣａ
Ｃｊ！　ｚ　’　２８ｇ０　　　　　　７００ＨＥＰＥ
Ｓ　　　　　　　　　　　　２，４００Ｐｈｅｎｏｌ　
　ｒｅｄ　　　　　　　　　　　　６Ｃｏｌｌａｇｅｎ
ａｓｅ　　　　　　　　　５００Ｔｒｉｐｓｉｎ　　１
ｎｈｉｂｉｔｏｒ　　　　　　５０（ｐＨ７，５） 軟化した肝臓をシャーレに移し、氷で冷しながらＤ　Ｍ
　Ｅ　ｂｕｆｆｅｒ中でメスで細かく切り、６０メツシ
ユまたは１５０メツシユのステンレスフィルター（池本
理科製）で濾過した。得られた細胞浮遊液をＤＭＥ　ｂ
ｕｆｆｅｒで洗い、６００ｘｇで１分間遠心分離、洗浄
を３回繰り返して遊離肝細胞を得た。なお、ＤＭＥ　ｂ
ｕｆｆｅｒの組成を第３表に示した。

Ｌ−）リブトファン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１６Ｌ−チロシンニナトリウム（無水）　　　　　
　　　８９．５Ｌ−バリン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　９３．６重酒石酸コリン　　　　　　　
　７８２葉酸　　　　　　　　　　　４ ニコチン酸アミＦ４ パントテン酸方ルシウム　　　　　　　　　　　　　　
４塩酸ピリドキサール　　　　　　　　　　　　　　　
　　４リネ７ラビン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．４塩酸チアミン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４１−イノシトール　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　７．２フエノールレフト　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５次いで、この細
胞をトリパンブルーで染め、その数を数えて６０騰φメ
ツシユ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、６０　ａｍ／ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｄｉｓｈ）に１．５ｘｌＯ６／
ｄｉｓｈ濃度となるように細胞をまき、５％ＣＯ□−９
５％＾ｉｒ下で培養し、５時間後に培地を変えて付着し
なかった細胞を取り除いた。なお、培地としてＤｕｌｂ
ｅｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ　（ＤＭＥ、田水製薬■製）　　３ｍ！を使用し、
これに１０χＦｅｔａｌ　ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ　（
ＦＢＳ）と１０１０／ｍｅ　　のペニシリンを加えて使
用した培地を交換してから１時間後細胞が完全に付着し
てから実験に使用した。

実験に用いる脂肪酸溶液の調製は、メタノールに溶解し
たＴ−リノレン酸を一定量とり、メタノールを窒素ガス
で飛ばし、１０％Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｂｏｖｉｎｅ　５ｅｒ
ｕａ＋Ａｌｂｕ＋ｍｉｎ／ＰＢＳ（）ｂｕｆｆｅｒ）に
溶解することにより行なった。なお、ＰＢＳ（−）ｂｕ
ｆｆｅｒの組成は第４表に示した通りである。また、ク
ルクミンは０〜１５■／１１１エタノール溶液として用
いた。

４　　ＰＢＳ（ｂｕｆｆｅｒの　　　）塩化ナトリウム
　　　　　　　　　　　　　　ｓ、ｏｏ。

塩化カリケム　　　　　　　　　　　　　　　２００リ
ン酸−水素ナトリウム（無水）　　　１，１５０リン酸
二水素カリウム（無水）　　　　２００蒸留水　　　　
　　　　　１！ 前記細胞にγ−リノレンＭ溶液を培地中の濃度が０．５
ｍＭとなるように加えた。さらに、クルクミン溶液を培
地中の濃度がＯ〜０．２■／ｄとなるように加え、２４
時間培養した。

培養終了後、吸引濾過により培地を除き、ＰＢＳ（−）
ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した０次いで、ＰＢＳ（−）　
ｂｕｆｆｅｒを５Ｉ１１加え、ｒｕｂｂｅｒ　ｐｏｌｉ
ｃｅｍａｎで細胞を掻き集めた。

さらに、３．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上
層を吸引濾過により除き、これにＰＢＳ（）　ｂｕｆｆ
ｅｒ２ｄを加えた。この細胞懸濁液を５秒間超音波処理
した（ＢＲＡＮＳＯＮ　５ＯＮＩＦＩＥＲ２５０を使用
）。しかる後、その１００μｌを分取し、蛋白質定量用
に供した。蛋白質の定量はｌｏｗｒｙ法により行った。

残りの超音波処理液は８Ｉ１１のクロロホルム・メタノ
ール溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）中に入
れ、−夜装置した。その後、下層を分取し、エバポレー
ターで溶媒を除去し、ここにベンゼンｌｊｄ！を加え、
８０°ｃで２時間加温した。２時間後、ヘキサン５ｄを
加えて十分に攪拌し、上層を採取し、２％ＫＨＣ０，４
−で洗浄後、３、００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して上
層を採取した。

上層からエバポレーターでヘキサンを除去し、定量のへ
キサンを加えてガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組
成を分析した。なお、ガスクロマトグラフィーはカラム
Ｒａ５ｃｏｌ　５ｉｌａ　２〜５ＣＰ　０．２５ｍｍ　
ｘ　５０ｍのものを使用し、ＦＩＤ検出器により検出し
た。γリルン酸とジホモ−γ−リノレン酸の絶対量を第
５表に示した。なお、表中の単位はｎ　ｍｏｌ／ｍｇ　
　蛋白質である。

葛−一」Ｌ−一表 クルクミン添加量　　Ｔ−リノレン酸量　　ジ本モーＴ
−リノレン　酸量０　　　　　　　　　　　１１７　　
　　　　　　１１１０．０２５　　　　　　　　１３０
　　　　　　　　１４３０．０５　　　　　　　　１８
７　　　　　　　　　９４０．０７５　　　　　　　　
４７０　　　　　　　　　８５０、１　　　　　　　　
　　２１６　　　　　　　　　２２実施例２ 実施例１においてＴ−リノレン酸の代わりにオクタデカ
テトラエン酸を使用したこと以外は実施例１と同様に行
った。結果を第６表に示す。

男ニーー旦−−−表 クルクミン添カロ量　　オクタデカテトラエン酸量　　
１旬すテトラエン酸量０　　　　　　　　　　　２２９
　　　　　　　　１４４０．０２５　　　　　　　　２
５９　　　　　　　　１３７０．０５　　　　　　　　
　４６７　　　　　　　　１４３０．０７５　　　　　
　　　５６２　　　　　　　　　８３０．１　　　　　
　　　　　４６７　　　　　　　　　１６比較例１ 実施例１においてクルクミンの代わりにセサミンを用い
たこと以外は実施例１と同様に行った。結果を第７表に
示す。

里−−１−一表 Ｔ−リノレン　酸量　　シネモー　Ｔ−リノレン　酸量
セサミン添加量 ０．０５ ０．１ ０．１５ ０．２ ４２　　　　　　　　７７ ６７　　　　　　　　　８６ １４８　　　　　　　　　８５ １４１　　　　　　　　　５０ １３３　　　　　　　　　２８ 比較例２ 実施例２においてクルクミンの代わりにセサミンを用い
たこと以外は実施例１と同様に行った。結果を第８表に
示す。

メー−」Ｌ−一表 セサミン添加量　　オクタデカテトラエン酸量　　エイ
コサテトラエン酸量威 ０　　　　　　　　　　６８　　　　　　　　６８０．
０５　　　　　　　　９８　　　　　　　　９００．１
　　　　　　　　１４３　　　　　　　　９００、１５
　　　　　　　２１７　　　　　　　１２８０．２　　
　　　　　　２１２　　　　　　　１０８試験例Ｉ Ｗｉｓｔｅｒ系雄ラット（体重２００ｇ）を用い、初め
に腹部大動脈から脱血したラットの胸部大動脈を無菌的
に摘出し、ＤＭＥ　（−）液に浸しながら付着している
脂肪を取り除き血管壁外膜と中膜の１７３をビンセット
で除いた。内皮細胞を含む２／３の中膜を拡げ、カミソ
リで２ＩＩＩ１１角の組織片を作成した０次いで、ＤＭ
Ｅ−１０％ＦＢＳ　Ｉｄで壁面を濡らしたフラスコの中
央部分に前記２１角の組織片を置き、フラスコを立てた
まま１０〜２０分間放置し、該組織片をフラスコ壁面に
粘着させた。この組織片を静かに培養液で浸し、５％Ｃ
ｏｄ−９５％Ａｉｒ中で１週間乃至１０日間培養した後
、週３回の割合で培養液のＤＭＥ−１０％ＦＢＳ　（２
ｄ）を交換して培養を続け、２〜３週目の細胞を２次培
養に使用した。

２次培養に使用するにあたり細胞をＤＭＥで１回洗い、
これに０．２５％トリプシン−０，０１％ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７，０）混合液を加えた。これをシャーレ１枚あたり
２〜３ｄの割合でまき、３７°Ｃで１０〜２０分培養し
た。その後、トリプシンの反応を止め、培地から細胞を
遠心分離およびデカンテーションにより分離した。

次いで、この細胞を５　ｘ　１０　’〜１０５ｃｅｌｌ
／ｐｌａｔｅになるように懸濁し、速やかに攪拌して均
一に分散させた。２４時間後、シャーレに吸着されなか
った細胞を除き、新しいＤＭＥ　（＋）を加え、培養を
開始し、前記のように週３回の割合で培地を交換して７
〜１０日間培養を続けた。

このようにして得た細胞にγ−リノレン酸を培地中濃度
が０．５ｄとなるように、またクルクミンを培地中濃度
が０〜０．０６２５＋＋＋ｇ／ａｆｆｉとなるように添
加し、さらにＩ４０−アセテートを０　、　１　ｕ　Ｃ
ｉ／ｐｌａｔｅになるように加えた。なお、Ｔ−リノレ
ン酸とクルクミンの調製は実施例１と同様にして行った
。また、培地はＤＭＥを用い、その量は１．Ｏｌｄであ
る。ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養後、培地を
除きＰＢＳ　（）　ｂｕｆｆｅｒで洗い、細胞を分離し
た。この細胞からクロロホルム：メタノール（２：１）
溶液で脂質成分を抽出し、得られた抽出物を窒素ガスで
乾燥した。次に、薄層クロマトグラフィーでコレステロ
ール画分を分離し、液体シンチレーションカウンターで
ラジオアクティビイティーを測定し、コレステロールの
定量を行った。

結果をクルクミンのみを使用した対照と共に第９表に示
す。

比較例３ クルクミンの代わりにセサミンを使用したこと以外は試
験例１と同様に行った。結果を第１０表に示す。

９　　コレステロール　　ｘｌｏｏｏ　ｄ　ｍ）クルク
ミン添加量（■／ｄ） ０　　　　０．０２５　　０．０３７５　　０．０５０
　　０．０６２５対照　４．５　３．０　３．２　１．
８　２．０試験例　　　１．５　　０．５　　０．３　
　０．２　　０．１５１０　　　コレステロール　　ｘ
ｌｏｏｏ　ｄ　ｍ）セサミン添加量（■／−） ０　　　　０．０５　　　　０．０７５　　０．１０　
　　０．１２５対照　４．５　３．０　２．５　２．５
　３．０比較例　　　１．５　　０．７　　０．６　　
０．６　　０．４〔発明の効果〕 本発明によれば、動物細胞を用いて脂肪酸の変換反応に
おける特定の鎖長延長反応を抑制することによって目的
とする脂肪酸であるＴ−リノレン酸またはオクタデカテ
トラエン酸を効率よく製造することができる。

これらの脂肪酸は健康食品、医薬品等の素材として利用
されるほか、飼料に添加することにより有用な食品素材
を得ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）γ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン酸生
   産能を有する動物細胞を下記の一般式で表されるクルク
   ミンあるいはその誘導体を添加した培地で培養し、培養
   物からγ−リノレン酸またはオクタデカテトラエン酸を
   採取することを特徴とする動物細胞による脂肪酸の製造
   法。 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１は低級アルキル基を示し、Ｒ＾２は水酸
   基、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、オキシ
   アルキル基を示す。Ｒ＾２が複数である場合には、複数
   のＲ＾２は同一であっても異なっていてもよい。ｎは０
   〜５の整数を示す。）