JPS63112694A

JPS63112694A - アラキドン酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法

Info

Publication number: JPS63112694A
Application number: JP61256951A
Authority: JP
Inventors: 野口　泰久; 梶　美保子; 船田　正
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1986-10-30
Publication date: 1988-05-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、コニディオボラスａ　（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏ
ｌｕｓｓｐ、）糸状菌を培養して得られる脂質からアラ
キドン酸、イソミリスチン酸又はそれらの低級アルコー
ルエステルを分離し濃縮する方法に関する。

（従来の技術）アラキドン酸は現在、最重要な生理活性物質の一つであ
るプロスタグランジンの前駆体物質としてよく知られて
おり、生体内ではリン脂質の形で蓄積されている。この
リン脂質は細胞膜などの生体膜の重要な構成成分であり
、アラキドン酸は生体の必要に応じ、あるいは何らかの
刺激を受けるとホスホリパーゼの作用でリン脂質から切
り出され、プロスタグランジンへ変換され、各種の生理
機能を発揮する。従って、アラキドン酸は生体にとって
非常に重要な高度不飽和脂肪酸である。

また、イソミリスチン酸はミリスチン酸よりも融点が低
く、安定性の高い飽和脂肪酸で、生物の脂質に少量見出
され、化粧品等としての利用が期待される脂肪酸である
。

アラキドン酸およびミリスチン酸は重要な脂質であり、
その利用も医薬、試薬、健康食品等として、いろいろ考
えられ、その工業的展開が期待されている。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、いずれの用途においても現在のところ、
化学合成が掻めて困難なため、原料は天り（；′１勿か
ら得られている。

”アラキドン酸は、その原料が非常に特殊な原料、例え
ば哺乳動物の肝臓、腎臓、心臓、血液、あるいは魚類の
肝臓であり、工業的に応用するには至っていない。現在
、工業的に応用できると思われるものは、卵黄レシチン
から得られるアラキドン酸であるが、これもその他の脂
肪酸１１が多いため、分取にかなりの技術を要する。

又、イソミリスチン酸は従来、バターのような脂質中に
少量しか含まれていないもので、工業的に得るには困難
であった。

工業的に応用するのが困難な理由として、エム・ケーラ
（Ｍ、　Ｋａｔｅｓ著、山川ら訳、脂質研究法、６５頁
、１９７５、東京化学同人）が示すように、高度不飽和
酸を含有する動物組織、細胞画分、血球および血美から
の脂質抽出が非常に？＝ｋｆｆｉな規模で行われる場合
にも、繁雑な工程を要するからである。

そして得られた脂質からアラキドン酸を単ｇｆｆするの
も各種の高度不飽和酸が混在するために、操作が繁雑で
あり、アラキドン酸の二重結合の移動やポリマー化のた
めに蒸留が困難である。それに加えて含有アラキドン酸
■が多（ないという問題点と、卵黄レシチンを除くその
他の天然原料は保存、輸送等に多くの費用がかかるとい
う欠点があった。

イソミリスチン酸は、上述のように天然にはバター中に
少量しか含まれていないため、その物性が良く、安定で
融点が低い特徴から、化粧品基材、石鹸、界面活性剤な
どに用いることが可能であるにもかかわらず、その工業
的展開が全く図られていない。

（問題点を解決するための手段）本発明は上記問題点を解決するためのもので、工業的応
用として微生物を利用し、安価で入手しやすい原料から
簡単な操作によってアラキドン酸およびイソミリスチン
酸を分離濃縮する方法を提供することを目的としている
。

本発明は、コニディオボラス属（効ユ１ｄｉｏｂｏｌｕ
ｓＳρ、）糸状菌を培養して得られる脂質を加水分解又
は低級アルコールとアルコーリシスし、得られた脂ＩＪ
ｊ酸又はその低級アルコールエステルからアラキドン酸
、イソミリスチン酸又はそれらの低級アルコールエステ
ルを尿素付加反応および非極性多孔性樹脂による精製に
より分離濃縮することを特徴とする。

本発明に使用するコニディオボラス属（Ｃｏｎ１ｄｉｏｂｏｌｕｓ　ｓｐ、）糸状菌は、すで
にアラキドン酸を蓄積することが知られている〔カナデ
ィアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオ口ジイ（Ｃ
ａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　　　１３．　７５５（１９６７）、同１
７．　１１１５　（１９７１）　　、同２２．　１０５
８　（１９７６）　　、ジャーナル・オブ・アプライド
・バタテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　５４＋　８５（
１９８３）　）。しかし、これらの論文に示されたもの
はすべて分析を主としたもので、苗の特徴を示すもので
しかない。

本発明者らは、先にコニディオボラス屈（Ｃｏｎ１ｄｉ
ｏｂｏｌｕｓ　ｓｐ、）糸状菌を有機体窒素と炭水化物
を基質として培養したときに、菌体内脂質が乾燥菌体中
に３０〜５０％蓄積し、脂質脂肪酸中のアラキドン酸が
２５〜４０％に達することを見出した。

そのときのイソミリスチン酸は２５〜４０％を占めてい
た。アラキドン酸の含有値は上記論文にあるどの値より
も高いものであった。

本発明はこのアラキドン酸およびイソミリスチン酸含有
菌を使用したものである。前記培養液から濾過等によっ
て取り出された菌体を溶剤抽出し、得られた脂質を加水
分解又は低級アルコールとアルコーリシスした後、尿素
付加反応させると、イソミリスチン酸またはその低級ア
ルコールエステルの尿素付加物が得られ、効率よ（アラ
キドン酸とイソミリスチン酸が分離できる。次いで、ス
チレン−ジビニルベンゼン樹脂のような非極性多孔性樹
脂をカラムにつめ、アセトン−水系又は低級アルコール
−水系等の溶出剤を用いて非尿素付加物を溶出すること
により、アラキドン酸又はその低級アルコールエステル
が純度よく精製される。

この場合、アクリル系、メタクリル系多孔性樹脂、ある
いはシリカゲル、シリカゲル誘導体等を用いても精製で
きるが、処理能力が少し低い。

本発明における原料である脂質はコニディオボラス属（
Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　ｓｐ、）の糸状菌を培養し
て得られる菌体を溶剤抽出して得られるものであるが、
この菌体としては、コニディオボラス・ヘテロスポラス
（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　　１ｌｅＬｅｒｏｓ　ｏ
ｒｕｓ）　、コニディオボラス・ランプロウゲス　（Ｃ
ｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓＬａｍ川Ｉ至）　、コニディオ
ボラス用オイリミクス（Ｃｏｎ１ｄｆｏｂｏｌｕｓ　　
ム■虹旦註、コニディオボラス・種があげられる。

培養はグルコース、マルトエキストラクト、蔗糖、糖蜜
、コーンステイープリカー、フラクトース、澱粉等を炭
素源とし、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、大豆粉等の有機体窒素を用い、その地鉄、マグネシ
ウム、リン酸、カリウム等の無機物質および必要に応じ
てビタミン等の１故璧要素を加えた培地で行う。

ｐ　Ｈは４〜７の微酸性でよ（、通常は振盪培養等の通
気液体培養で培養する。培養日数は２〜７日でよく、培
養終了後、遠心分＾１１又は減圧濾過により菌体を取り
出す。この菌体にはアラキドン酸、イソミリスチン酸が
多量に含まれているので、できるだけ酸素にふれない様
に抽出することが必要であるが、菌体は特に乾燥させる
必要はない。

抽出はメタノール、エタノール、プロパツール、イソプ
ロパツール等の低級アルコール、アセトン、メチルエチ
ルケトン、クロロホルム等が好ましいが、ヘキサン、石
油エーテル、石油ベンジン、エーテル、ベンゼン等を加
えて用いてもよい。これら溶剤を単一又は混合し、菌体
に加え、攪拌しつつ脂質を抽出し、菌体を濾過する。こ
れを数回繰り返し、完全に脂質を抽出する。抽出液を全
部集めン］縮し、原料脂質とする。

原料脂質をメタノール、エタノール、プロパツール等の
低級アルコールに溶解し、水酸化ナトリウム又は水酸化
カリウム等で常法通すケン化し、塩酸等で酸に戻し、脂
肪酸を得るか、又は原料脂質をメタノール、エタノール
、プロパツール等の１氏１１反アルコール水酸化カリウム等を触媒として２０〜６０’Ｃでアルコ
ーリシスし、脂肪酸低級アルコーリシステルヲｆする。

脂肪酸又は脂肪酸低級アルコールエステルは、各々ヘキ
サン等で抽出、水洗を行い、脱溶剤し、精製する。

尿素付加反応は、脂肪酸又は脂肪酸低級アルコールエス
テルを、その各々の１〜８倍量の尿素を含んだメタノー
ル−尿素飽１０溶液に加えて、攪拌しつつ冷却し、付加
体の結晶を析出させることによって行われる。この結晶
を濾別し、濾液と結晶に分離する。

分離した濾液を濃縮し、塩酸水溶液を加え、ヘキサンで
抽出、水洗すると、アラキドン酸を多く含む脂肪酸又は
脂肪酸低級アルコールエステルが得られる。

又、分離した付加体の結晶を塩酸水溶液で溶解し、ヘキ
サンで抽出、水洗し、イソミリスチン酸を多く含む脂肪
酸又は脂肪酸低級アルコールエステルを得ろことができ
る。その際、ヘキサンで抽出、次いで水洗した後、脂肪
酸の場合はヘキサン中で０〜５°Ｃで再結晶することに
より、イソミリスチン酸を９０％以上に濃縮でき、脂肪
酸低級アルコールエステルの場合は減圧下積留すること
により、イソミリスチン酸低級アルコールエステルを９
０％以上に濃縮できる。低級アルコールエステルの場合
は再結晶と精密を組み合わせてもよい。

なお、使用尿素量は脂質量、処理温度、メタノール量に
よって異なるが、好ましくは脂質量の２〜４倍である。

又、付加反応は５０〜６０℃の尿素飽和メタノール溶液
に原料脂質を加え、５〜１０℃まで徐冷して反応させる
のが好ましく、そのときのメタノール量は、濾過操作等
を考慮すると、脂質量の１０〜２０倍量が好ましい。

又、尿素付加反応は尿素をヘキサン、イソオクタン等に
懸濁し、少量のメタノールを触媒的に用いろ固相尿素付
加反応でも行うことができる。

次いで、尿素付加反応により粗精製されたアラキドン酸
を多く含む脂肪酸、又はアラキドン酸低級アルコールエ
ステルを多く含む脂肪酸低級アルコールエステルを、非
極性多孔性樹脂の入ったカラムで、アセトン−水又は低
級アルコール−水等を溶出剤として精製する。例えば、
スチレン−ジビニルベンゼン樹脂（ＨＰ−２０、三菱化
成製）５００　ｍｌをカラムにつめ、尿素付加後の粗精
製アラキドン酸低級アルコールエステル１０ｇをカラム
上部に吸着させ、次いでアセトン／水＝８０／２０（ｖ
／ｖ）の溶出液を流すことにより、アラキドン酸又はア
ラキドン酸低級アルコールエステルをガスクロマトグラ
フィー等でチェックしつつ精製することができる。

以上の操作の結果、アラキドン酸又はアラキドン酸低級
アルコールエステルは尿素付加で７０〜８０％に濃縮で
き、樹脂カラムで９５〜９９％にまで濃縮できる。

（発明の効果）本発明によれば、大量生産のできる微生物菌体よりアラ
キドン酸、イソミリスチン酸又はそれらの低級アルコー
ルエステルを簡単な方法で得ることができるので、医薬
品、健康食品、化粧品などの原料として、安価に効果的
に用いることができる。

（実施例）以下実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。

実施例１グルコース３０ｇ１マルトエキス３０ｇ、イーストエキ
ス１２ｇ１硫酸第一鉄０．７ｇ、硫酸マグネシウム　０
．５ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、塩化カリウム０．
５ｇを１１の水道水に溶解したものを、培地とした。こ
の培地をＩＯＭづつ５００ｍｘ容の広口ごｌルベン５木
にとり、１２０°Ｃ１１５分オートクレーブで殺菌した
。培地のｐ　Ｈは５．６であった。

ごこに、ポテト寒天培地で培養しておいたコニディオボ
ラス・ヘテロスポラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ販（
肛」上ｍ巨）訂ＣＣ１２９４１の胞子を殺菌水で）へ；
罰して植菌した。２８℃、１３０ｒｐｍで３日間振とう
培養したものを菌種として使用し、３０Ｉ！のジャーフ
ァメンターで本培養した。

本培養は以下のようにして行った。

すなわち、種培養で用いたものと同一組成の培地２０１
を３０６容のジャーファメンターに仕込み、藤気殺菌し
た後、上記種菌５木を植菌し、５日間’Ｅ’ｉａした。

攪拌羽はタービン式のものを用い、温度２８℃、通気量
ＩＶＶＭ、回転数５００ｒｐｍで培養した。

培養５日間で培養を終え、菌体を波圧；慮過した。

このときの乾燥菌体量は３５ｇ／　（ｌであった。

減圧濾過後の菌体を湿閏体のままクロロホルム／メタノ
ール＝２／１の混合溶媒５７！につけ、攪拌機で２時間
（１゛ｌ拌した。抽出液を濾別し、残渣を３１の同溶剤
で同様に抽出し、２回繰り返した。

抽出液を合わせて、フォルテ（Ｆｏｌｃｈ）の方法で水
溶性物質を除き、クロロホルム層を濃縮し、総脂質を得
た。

この脂質はＴＬＣ（展開剤：クロロホルム／メタノール
／水＝６５／２５／　４　）でほとんどが中性脂質であ
り、そのほとんどはトリグリセリドであり、極性脂質は
少なかった。酸価は３．６であった。得られた総脂質量
は２４５ｇであった。

この２４５ｇの総脂質をメタノール２１に溶解し、１０
０ｍ１のメタノールに溶解した水酸化カリウム３ｇを加
え、５０°Ｃで２時間メタツリシスした。反応終了後、
酢酸により水酸化カリウムを中和し、次いでエバボレー
トし、メタノールを除いた。得られたメチルエステルに
ヘキサンを５０Ｍ加え、水洗した。ヘキサンをエバボレ
ートしてメチルエステル２２５ｇを得た。このメチルエ
ステルの組成は次のようであった。

イソＣ１４，。；２９．６％、Ｃ１４１６；　　５．１
％、イソＣ＋Ｓ＋。；　１０．１％、Ｃ１３，。；３．
６％、Ｃ１６，。；８．７　　％、Ｃ＋ｓ＋ｏ；　　２
．０％、Ｃ１８＋＋；　　３．３％、ＣＩ１１＋２　；
　　２．２％−Ｃｌ１１＋３　ｉ　　１．２％％　　Ｃ
ｚｏ＋ｔｉ　　ｏ、ｆｔ％、アラキドン酸；３２．５％
、その他１．３％尿素６７５ｇを５０°Ｃでメタノール
３．５７！に？８止し、そこにメチルエステル２２５ｇ
を加えた。攪拌しながら徐々に冷却し、２０℃まで冷却
した。析出した１１１１品を濾別し、濾液からエバボレ
ートしてメタノール１１を除いた。このとき結晶側にほ
とんどの飽和酸とＣ，８，、酸および一部のイソ酸が付
加された。濃縮濾液をｊ辺拌しながら１０℃まで徐冷し
、析出した結晶を濾別した。次いで′６１．液に塩酸酸
性水を加え、ヘキサンで抽出し、８３．６ｇのメチルエ
ステルを得た。

この組成は、イソＣ４４，。（イソミリスチン酸）；５
．５％、イア　Ｃ１５：ｏ　；　　４．５％、Ｃｒ、ｚ
ｙ：　　３．７９叙Ｃｚｏ＋＋　；１．０％、アラキド
ンｕ　；　７４．９％、その池１０．４％であった。

又、結晶側を塩酸酸性水溶液で分解し、ヘキサン抽出し
て４７．９ｇのメチルエステルを得た。この３且或は、
イソＣ＋ａｒｏ　（イソミリスチン酸）　　ｉ６４．２
％、イソＣ＋ｓ＋ｏ　；　２５．１％、Ｃｌ１１＋□；
２．４％、アラキドン酸：３．５％、その他４．７％で
あった。

次いで７４．９％のアラキドン酸を含むメチルエステル
８３．６ｇを、）ｌｒ’−２０（三菱化成製）４Ｊの入
った内径Ｉ　Ｑ　ｃｍのカラム上部に吸着させた。カラ
ム上部よりアセトン／水−８／２の混合溶剤を通過させ
、カラム下部よりアラキドン酸含量をガスクロマトグラ
フィーでモニターしながら分取した。アラキドン酸含１
９８％以上のものを集め、？農縮し、アラキドン酸メチ
ルエステル９９％含有品４５．７ｇを得た。

次いで９９％アラキドン酸メチルエステルを水酸化カリ
ウム−メタノール溶液で加水分解し、９９ン６アラキド
ン酸メチルエステルを３９．９ｇ得た。

実施例２実施例１と同様にして得た聡脂！２４５ｇを含水メタノ
ール−水酸化カリウム溶液で常法通り加水分解し、塩酸
水により脂肪酸に戻し、ヘキサンで抽出し、脂肪酸混合
物１９１３　ｇ；ｔ−得た。実施例１と同様に尿素付加
反応を行い、濾液側よりイソＣ１４１０（イソミリスチ
ンｉり　　；　　６．１％、イソＣ１３，。；４．３　
　％、Ｃ＋ａ＋ｓ　；　　３．５％、Ｃ２゜＋：＋ｉ　
　１．０％、アラキドン酸；　７２．７％、その他１２
．４％のＩｌｌ　＋＋ツ製脂肪故７７．４ｇを得た。結
晶側より実施例１と同１１シこ処理し、イソＣｌ４１０
　（イソミリスチン酸）；６６．２％、イソＣ＋ｓ＋ｏ
　ｉ　２３．５％、Ｃ１ｎ＋ｚ　ｉ　　２．３％、アラ
キドン酸；４．０％、その他４．０％の高濃度イソミリ
スチン酸含有脂肪酸４２．５ｇを得た。

次いで７２．７％のアラキドン酸を含む脂肪酸７７．４
ｔ：をＩｌＦ’−２０（三菱化成製）４βの入った内径
１０　ｃａｎのカラム上部に吸着させた。カラム上部よ
りチー１．トン／水＝７／３の混合溶剤を通過させ、カ
ラム下部よりアラキドン酸含量９９％以上のものを集め
、ｊノＴ痛し、３７．４．のアラキドン酸９９％脂肪酸
を１７だ。

実施例３実施例１と同様にしてメチルエステル２１８ｇを得た。

このメチルエステルを実施例１と同様に尿素付加反応を
行い、濾液よりイソＣＩ　４　＋。：５．３％、・イ　
ソ　Ｃ＋ｓ＋ｏ；　　　４．９　％、　　Ｃ＋ｎ＋＊　
　ｉ　　　３．０　％、　　Ｃｚｏ＋ｚ；１．０％、ア
ラキドン酸；７６．１％、その＋ｌ！１９．７９石のｔ
ｌｌｊｎ製メチルエステル８１．３　ｇを得た。結晶側
より実施例１と同様に処理し、イソＣ１４，。；　６５
．６％、イソＣ＋ｓ＋ｏ　ｉ　２２．２％、ＣＩ８＋Ｚ
　ｉ　２．４％、アラキドン酸；３．３％、その他６．
５％の高濃度インミリスチン酸含有メチルエステル４８
．８ｇを得た。

次いで７６．１％のアラキドン酸を含むメチルエステル
８１．３　ｇをＴ（Ｐ−２０（三菱化成製）４１の入っ
た内径１０ｃｍ０力ラム上部に吸着させた。カラム上部
よりメタノール／水＝９／１の混合溶剤を通過させ、カ
ラム下部よりアラキドン酸含量９９％以上のものを集め
、濃縮し、２８．８　ｇのアラキドン酸９９％メチルエ
ステルを得た。

又、高濃度イソミリスチン酸含有メチルエステル４８．
８　ｇを減圧下精留することにより、イソミリスチン酸
９１．２％、イソＣ１２，。；８．８％のメチルエステ
ル２２．８ｇを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コニディオボラス属（￥Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕ
ｓ￥　ｓｐ．）糸状菌を培養して得られるアラキドン酸
およびイソミリスチン酸含有脂質を、加水分解し、得ら
れた脂肪酸を尿素付加反応させ、一方では非尿素付加物
より粗精製されたアラキドン酸を回収し、次いで非極性
多孔性樹脂により精製してアラキドン酸を得、他方では
尿素付加物よりイソミリスチン酸を得ることを特徴とす
るアラキドン酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法
。
（２）非極性多孔性樹脂がスチレン−ジビニルベンゼン
共重合体である特許請求の範囲第１項記載のアラキドン
酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法。
（３）非極性多孔性樹脂による精製において、溶出剤と
して、アセトン−水系溶剤又は低級アルコール−水系溶
剤を用いる特許請求の範囲第１項又は第２項記載のアラ
キドン酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法。
（４）コニディオボラス属（￥Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕ
ｓ￥　ｓｐ．）糸状菌を培養して得られるアラキドン酸
およびイソミリスチン酸含有脂質を、低級アルコールと
アルコーリシスし、得られた脂肪酸低級アルコールエス
テルを尿素付加反応させ、一方では非尿素付加物より粗
精製されたアラキドン酸低級アルコールエステルを回収
し、次いで非極性多孔性樹脂により精製してアラキドン
酸低級アルコールエステルを得、他方では尿素付加物よ
りイソミリスチン酸低級アルコールエステルを得ること
を特徴とするアラキドン酸およびイソミリスチン酸の分
離濃縮方法。
（５）非極性多孔性樹脂がスチレン−ジビニルベンゼン
共重合体である特許請求の範囲第４項記載のアラキドン
酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法。
（６）非極性多孔性樹脂による精製において、溶出剤と
して、アセトン−水系溶剤又は低級アルコール−水系溶
剤を用いる特許請求の範囲第４項又は第５項記載のアラ
キドン酸およびイソミリスチン酸の分離濃縮方法。