JPH03255095A - カゼインペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

「ｆ業上の利用分野」 本発明は、α−カゼインのペプシン分解物からｊＩＬｓ
された新規ペプチドおよびその薬学的に許容される塩に
関する。さらに詳しくは、下式（１）％式％ ） （式中、ＲはＯＨまたはＬｅｕ−Ｏｌｌを示す）で示さ
れるペプチドおよびその薬学的に許容される塩に関する
０式（１）のペプチドおよびその薬学的に許容される塩
は血小板凝集阻害作用を有し、血栓症の治療および予防
に有用である。 「従来の技術」 生体の血管または心臓の腔内で血液成分が局所的に凝固
したものを血栓といい、血栓は血管内腔の狭窄または間
奏を引き起こす、そして血栓形成とそれに伴う病的現象
を血栓症と言う。 血栓形成には血小板の凝集が関与しているので血小板凝
集阻害作用を有する化合物は、血栓症の治療および予防
に有用である。 血小板凝集阻害作用を有する化合物は種々知られている
が、血小板凝集阻害作用を有するペプチドの報告例は数
少ない。 血小板凝集阻害作用が認められているペプチドとしては
、例えばに−カゼインのフラグメントペプチドが報告さ
れている（　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅａ、１５８
巻、３７９頁、１９８６年参照）が、これは、木発明ペ
プチドと全く構造を異にしている。そして、ａ−カゼイ
ンからは血小板１１２集閉害作用を存するペプチドが単
側されたとの報告はない。 「発明が解決しようとする！！題」 本発明者は、ａ−カゼインから血小板凝集阻害作用を有
するペプチドを見い出すべく種々検詞した０本発明の目
的は血小板凝集阻害活性を有する新規ペプチドまたはそ
の薬学的に許容される塩を提供することにある。 ｒｉＢを解決するための手段」 α−カゼインをペプシンで加水分解し、得られる加水分
解物を分画して種々検削の結果、本発明者等は血小板凝
集阻害活性を有する下式（＋）Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＋１ｃｍＰｒｏ−Ｔｙｒ
−Ｖａｌ−＾ｒＨ−Ｔｙｒ−Ｒ・・・（１）（式中、Ｒ
は０１１またはＬｅｕ−０）１を示す）で示される新規
ペプチドまたはその薬学的に許容される塩の！＃動に成
功した。またこの合成にも成功して本発明を完成した。 ｆｊお、本Ｉ！１細書において、アミノ酸、アミノ酸残
基、ア泉ノ酸誘導体、ペプチド、保！ｉ基は１ｕＰＡｃ
−ＩＵＢ生化学命名委員会で１ｆｔ奨された記号（［１
ｉｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、ＩＩ！’、１７２６頁、１９
７２年、ＩＵＰＡＣＰｕｒｅ　Ａｐｐｌ、、４０４！、
３１７頁、１９７４年参照）ｔたは当該分野において慣
用される記号を用い、Ｌ−アミノ酸およびその残基のＬ
記号は省略する。かかる記号は例えば以下の通りである
。 Ｖａｌ：バリン、Ｔｙｒ　：チロシン、６１ｎ：グルタ
ミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｌ
ｙｓ　：リジン、＾ｌａアラニン、Ｍｅｔメヂオニン、
　Ｐｒｏニブロリン、Ｔｒｐトリプトファン、Ｉｌｅ：
イソロイシン、Ｔｈｒ　：スレオニン、＾「ｇ：アルギ
ニン、　Ｌｅｕ：ロイシン、Ｂｏｃ：　ｔ−ブチルオキ
シカルボニル、Ｂｒ−Ｚ：　Ｐ−ブロモベンジルオキシ
カルボニル、　ＣＩ−Ｚ：　ｐ−クロロベンジルオキシ
カルボニル、Ｂｚｌ：ベンジル、Ｍｔｓ　：メシチレン
ー２−スルホニル、Ｄｎｐ：２，４−ジニトロフェニル
、ＣＨＩＪ＝ホルミル。 最初に、ａ−カゼインからの製造法について説明する。 α−カゼインの加水分解は、α−カゼインを塩酸中、ペ
プシンで行う、塩酸には通常０．０５〜１．５規定、好
ましくは約０．１規定の塩酸を使用しその使用量は、通
常α−カゼインに対して７〜２０倍（Ｖ／ｗ）である。 ペプシンの使用量は、カゼイン１！！量部に対して通常
０．０１〜０．０５重量部であり、好ましくは００２〜
０．０３ｆｉ量部である。 加水分解反応は、通常３５〜３８℃で３０分〜３時間、
好ましくは３７℃で約１時間行う。 次に、上記加水分解反応液にアルカリ、好ましくは、ア
ンモニア水を添加し反応液のｐｌ＋を約４にユＸ１整し
、不溶物を除去して加水分解物の水溶１ｆｔ（以下、こ
れを加水分解液と呼ぶ）を得る。 次に、陽イオン交換体を充填したカラムクロマトグラフ
ィーにより加水分解液から塩基性ペプチド混合物を分画
する。 この操作は、加水分解液を弱酸性〜弱塩基性に７Ａ整し
た後、陽イオン交換体（緩衝液で平衡化済み）を充填し
たカラムに付して加水分解液中の塩基性ペプチドを＠着
させ、次いで溶出ｍ奴でこれを溶出させ分画することに
より行なう。 陽イオン交換体には、例えばＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　
＠Ｃ−２５、ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　＠Ｃ−５０（い
ずれもファルマシア社製）の如きカルボキシル基を有す
るイオン交換体（弱酸性陽イオン交換体と呼ぶ）を使用
する。 陽イオン交換体の平衡化は、弱酸性〜弱塩基性の緩衝液
、好ましくは、ｐＨ約８６の酢酸−アンモニア緩衝液を
使用する。 溶出溶媒には、例えば、酢酸−アンモニア緩衝液、炭酸
アンモニウム水溶液、アンモニア水ｔＢ液等の徴塩基性
〜塩基性の溶出溶媒を用い、このｐｌあるいは／および
濃度を上昇させｔｌがら溶出を行う。 塩基性ペプチド混合物は溶出溶媒のｐＨあるいは塩濃度
が高い時に溶出する０例えばイオン交換体としてＣＭ−
５ｅｐｈａｄｅｘ　＠　Ｃ−２５（ファルマシア社製）
を用い、熔出ｊ６　’）ｌとして炭酸アンモニウム水溶
液を用いた場合、炭酸アンモニウム濃度が約０．０２Ｍ
の時に熔出し妬め、約０．３Ｍの時に溶出し終る。 ｔｔ　ｊｊ、効率良い分画のために、加水分解液および
溶出液に０．０１〜５ｍｉ％の割合で例えば、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアル
キルフェニルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ソ
ルビタン脂肪酸エステル、シ日ｌｌｌｌ１１肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の
非イオン界面活性剤を添加するのが好ましい。 次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て、塩基性ペプチド混合物から本発明ペプチドまたはそ
の塩を単離する。 ＨＰＬＣのカラムには、逆相系カラム、好ましくはオク
タデシルシリル化シリカゲル（ＯＤ　Ｓ　）を充填した
カラムを使用する。溶出溶媒には例えばアセトニトリル
等の有ＩＩ　ｆ８　ｔｌＩＬと水およびトリフルオロ酢
酸との混合溶媒を使用し、Ｈましくは有機溶媒のｄＡｙ
Ｌ勾配をかけて溶出する。ペプチドの検出は、溶出溶媒
の２８（ｉｎｎ　、　２７５ｎｍ　、　２３Ｓｎｍある
いは２２０同付近の吸光度を測定することにより行う。 例えば、カラムにＹＭＣ５）１３４３−５００５　（２
０ｍｍ　ｘ１５０ｍｍ　、株式会社山村化学研究所製）
を用い、木−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（８５
：ｌ５Ｏ０ｌ）から水−アセトニトリル−トリフルオロ
酢酸（３０ニア０：（１，１）の直線的濃度勾配法で溶
出（ｔｌ速＋ｓ、ｏｍｌ／分）すると、式（りにおいて
ＲがＯＨの本発明ペプチド（１−１）のトリフルオロ酢
酸塩は保持時間的２３．１分で溶出し、式（１）におい
てＲがＬｅｕ−ＯＨの本発明ペプチド（１−２）のトリ
フルオロ酢酸塩は保持時間的２８．２分で溶出するので
、この四分をそれぞれ分取し、減圧ｄＩ縮、乾燥あるい
は凍結乾燥することにより本発明ペプチドのトリフルオ
ロ酢酸塩を得ることが出来る。 また、目的とする両分は、溶出液のカルモジュリン依存
ホスホジェステラーゼ阻害活性を指揮にして分取するこ
とも出来る。カルモジュリン依存ホスホジェステラーゼ
阻害活性の測定は、ウシ脳カルモジュリンおよびウシ脳
ホスホジェステラーゼを用い公知の方法（＾ｎａｌｙｔ
ｉｅａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。 ４５壱、２２２頁、１９７２年参照〉により測定する。 次に、合成による本発明ペプチドまたはその塩の製造方
法について説明する。 本発明のペプチドまたはその塩は１例えば固相法（ペプ
チド合成の基礎と実馳、泉屋信夫など、丸善株式会社、
１９８５年出版１ｌ９４頁参照）により逐次、保護アミ
ノ酸を縮合して合成することが出来る。固相担体には４
−（ヒドロキシメチル）フェニルアセトアミドメチルポ
リ（スチレンーコージビニルベンゼン）　（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ＾−ｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ
　５ｏｃｉｅｔｙ、９８壱、７３５７頁、ｌ５７６年参
照、以下、ＨＯＣＨ，−Ｐａｎ−８４ｆｆ１と略記）が
好適に用いられる。 アミノ酸のα−アミソ基の保臘には、トリフルオロ酢酸
あるいは塩酸で切断され易い保護基、例えばＢＯＣ基が
用いられる。アミノ酸の側鎖官能基にはこれら酸で切断
され難い保！ｉ基を用いる。すなわちＴｙｒの水酸基は
Ｂｒ−Ｚ基で、＾「８のグアニジノ基はＭｔｓ基で、Ｌ
ｙｓのε−アミノ基はＣ＋−Ｚ基で、Ｔｈｒの水酸基は
Ｂｘｌ　＆で、　Ｈｉｓのイミダゾリル基はＤｎｐ基で
モしてＴｒｐのインドール基はそｉｌぞれホルミル基で
保璋するのが好適である。 担体上でのペプチド鎖の延長は通常の固相法に従い行う
ことが出来る。すなわち、Ｎ端アミノ基の脱保護と保護
アミノ酸との縮合反応をくり返し担体上にＣ＃４から順
次ペプチド鎖を延長させ保護ペプチド−Ｐａｗ−樹脂を
得る。 縮合反応は、ジシクロへキシルカルボジイミド法を用い
ることも出来るが、活性エステル法、特に保護アミノ酸
の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いる
活性エステル法が副反応が少く好ましい。 担体からのペプチドの切断および保護基の除去は、フッ
化水素で除去できない保護基、例えば旧Ｓイミダゾリル
基のＤｎｐをチオリシスで除去した後、−クレゾール、
エタンジチオール、ジメチルスルフィド等の存在下にフ
ッ化水素で行うことが出来る。 担体からの切断および脱保護により得られた粗ペプチド
またはその塩は、カラムクロマトグラフィーあるいは前
記と同様高速液体クロマトグラフィー等により精製する
ことが出来る。 ０ 「発明の効果」 本発明のペプチドおよびその薬学的に許容される塩はア
デノシン−５°　−ジホスフェート（＾ＤＩ’）誘発血
小板凝集に対する阻害活性およびコラーゲン誘発血小板
凝集に対する阻害活性を有する（後記試験例１参照〉、
従って、血栓症の治療および予防に有用である。また、
生化学的試薬としても有用である。 以下、本発明ペプチドの血小板凝集作用について試験例
を挙げて説明する。

【試験例１］ Ｎａｔｕｒｅ、　１９４　＠、　９２７〜９２９頁（１
１６２年）に記載の方法に従って、以下の通り、アデノ
シン−５’％−ジホスフェート（＾Ｄｒ）誘発血小板凝
集に対する阻害活性およびコラーゲン誘発血小板凝集に
対する阻害活性を測定した。 １検体 本発明ペプチド（１−１）のトリフルオロ酢酸塩・・・
Ｈ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−＾Ｉａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−目ｅ−Ｇ
ｌｎ−ｒ’ｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１
１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ
・トリフルオロ酢酸塩［実施例１で得たペプチド（１−
１）　　・トリフルオロ酢酸塩］本発明ペプチド（１−
２）のトリフルオロ酢酸塩・・・Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ｇｉｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾ｌａ−Ｍｅｔ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−＋１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙ
ｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ
−シａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−０）１・）リフル
オロ酢酸塩［実施例１で得たペプチド（１−２）　　・
トリフルオロ酢酸塩］２、試験方法 （２−１１血小板ｍｆｆ１（ｐ＋ｕ＋）　ト乏血小板血
漿（ＰＰｆ’）の調整： モルモット（４７０〜６ｏ０ｇ）より採取された血液に
１１１Ｏ容の３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を加え
て１１０（ｌｒ、ｐ、ｓ、　（１３０ｘ　ｇ）で１０分
間遠心分離し、血小板濃度の高い上澄を得た。残漬を更
に３０００ｒ、ｐ、ｍ、　（１７００ｘ　ｇ）で１５分
間遠心分離して上澄部分を採取して乏血小板血漿（以下
ＰＰＰと略す）を得た。前記の血小板濃度の高い上澄中
の血小板数をコールタ−カウンター（コールタ１ ２ 一エレクトロニクス社）により計算し、ＰＰＰで５　ｘ
　ＩＯ’ｃｅｌｌｓ／ｃｍ’に希釈して多血小板血Ｉ！
！（以下ＰＩＩＰと略す）を調製した。 ＋２−２１八〇Ｐ誘発ｌＩ＆阻害試験 回転子を入れた血小板凝集ｆｌｌｉ！芝用セルにｒｎｒ
１６０μＱおよび検体溶液（生理食塩水溶液に溶解して
調製）２０μＯを加え、攪拌した。このセルをヘマトレ
ーサー（三光バイオサイエンス社製）中、３７℃で１分
間インキュベーションした。 その後、５０μＨアデノシン−５°−ジホスフェート（
＾Ｄｒ）溶液［＾Ｄｒ　　（シグマ社製）を２５１１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋７．４１に熔解して調製３２
０１口を加え、血小板の凝集を５分間モニタリングした
。 血小板の８１集が最大とｔｊった時点（光の透過度が最
大となった時点）の凝！ｆ！（Ｂ）を下記の式により算
出した。 ａ　：　ＰＲＰの光の透過度 ｂ　：　ＰＰＰの光の透過度 Ｃ：上記の方法で血小板凝集を起こさせ血小板凝集が最
大となったときの光の透過度一方、検体溶液の代わりに
生理食塩水を加え同１！ｅ血小板を凝集させ、コントロ
ールの凝集率（Ａ）を求め、下式により凝集阻害率（％
）を算出した。 凝集阻害！Ｉ！（％）＝１−ＸＩＯ［＋種々の濃度の検
体溶液について上記と同様に試験し、検体が５０％の凝
集阻害率を示す濃度（ＩＣ５ｏ値）を、用量反応１ＩＩ
ｌ線のＩｉＩ線回帰によって求めた。 （２−３）コラーゲン誘発凝集阻害試験凝集剤として＾
ＤＰ　ｆ８液を用いるかわりにコラーゲン溶ｉ［コラー
ゲンのアイソトニックグルコース悲濁液ｐＨ２，７〜２
．９（ホルム社製）をアイソ］・ニックグルコースｍ　
？＆で１０倍に希釈して調製、濃度１００μｇ／ｍｌ　
］　２０μＱを加え、血小板のｇｌｉ２を１０分間モニ
タリングする以外は上４ Ｒｔ２−２）　　と同様にして、ｒ　ｃ　、　ｏ　ｉｂ
を求めた。 ３．試験結果 第１表に示す。 第１表 °）検体は、それぞれのペプチドのトリフルオロ酢酸塩
である。 以下、実施例を挙げて本発明を説明する。 なお、本発明ペプチドわよびその塩の各種分析は、下記
の方法で実施した。 ペプチドのＣアミノ　　　：　　０．２Ｍ　Ｎ−二チル
モルホリンー酢＠ｌｌｋｍｆｌｔ　（ｐＨ８，５）　Ｏ
，Ｓｍｌ　ニ溶解したペプチド約８ｎｍｏｌに対し、ジ
イソプロピルフルオロリン酸で釦理したカルボキシペプ
チダーゼＡ（シグマ社製タイプＩ）の８ｐ■Ｏ１を加え
、２５℃で反応を行い、１ｌｌＩ的に遊間のアミノ酸を
アミノ酸分析機で定量することにより行？ｊった。 アミノ　　１１　　：気相プロティンシーケンサ−（ア
プライドバイオシステムズ社４７１＾）で行なった。 のアミノ　　　：４％グリコール酸 を含む６Ｎ　ＭＣＩで加水分解（１１０℃、２２時間）
して得た加水分解物をアミノ酸分析機（日立８３５型）
で行ｆｌった。 体クロマトグラフィー　　　　　Ｒｔ　’、Ｒｔ　’土
、トに生」エニ」−二東ソー株式会社製高速液体クロマ
トグラフを使用し、下記条件で測定した。 Ｒｔ’の測定条件 カラム：　ＹＭＣ＾コ１２０ＤＳ　（８ｍｓ　ｘ　ＩＳ
Ｄｍｍ、株式会社山村化学研究所製） 溶出：水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸（ＩＩｓ
：Ｉｓ：０．１）から水−アセトニトリル−トリフルオ
ロ酢酸（３０ニア０：０．１）のｉ純的濃度勾配 流速：ｌ、５量ｌ／分 ５ ６ 検出：　２７５　ｎ■における吸光度 Ｒｔ’の測定条件 溶出に水−アセトニトリル−トリフルオロ酸＠　（７９
：２１：０．１）を使用する（濃度勾配をかけない）以
外は、Ｒｔ’の測定の場合に同じ。 Ｒｔ”の測定条件 溶出に水−アセトニトリル−トリフルオロ酸Ｍ　（７５
：２５：０．１）を使用する（濃度勾配をかけない〉以
外は、Ｒｔ’の測定の場合に同じ。 実施例１　カゼイン加水分解物からのｊＩＬＩＩｌα−
カゼイン（シグマ社製）　１０ｇを（１，ＩＮ塩酸２０
０■１に３７℃で懸濁し、これにペプシン（バイオザイ
ムラボラトリー製）２５ｏ■ｇを加え、同温で１＆８間
攪拌した０反応液のｐＨをアンモニア水の添加によって
４，２に調整した後、遠心分＠　（８０００ｒｐｍ）　
して不溶物を除去した。 得られた上清にＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００［ポリオキシ
エチレン（ｌＯ）オクチルフェニルエーテルの商品名〕
を０１％の割合に加え、アンモニア水を添加してそのｐ
ｌ＋を８６にＦＡ整した。このｍ　ｔ＆を、０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む０．１Ｍ酢酸−アンモニ
ア１１衝液（ｐＨ８，６）で予め平衡化したＣＭ−５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　＠Ｃ−２５（ファルマシア製）カラム（
２，６ｅｓｘ　２５ｃｍ）に通し０．１％Ｔｒｌｔｏｎ
　Ｘ−１００を含む０．１Ｍ酢酸−アンモニア１１衝液
（ｐＨ６，６）　６０ｍ１でカラムを洗浄した０次いで
吸着したペプチドを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００
および０．１Ｍ＃酸−アンモニアＩＩ衝液を含む炭酸ア
ンモニウム水溶液を用いて、直線的濃度勾配法（炭酸ア
ンモニウムのＯＩｌ！かう０．５Ｍまでの直線的濃度勾
配、４００婁１）で溶出させた。　２１１Ｏｎ口におけ
る吸光度を有する両分（炭酸アンモニウム濃度（１，０
２Ｍ〜０，３Ｍで溶出）を集め、減圧濃縮した。濃縮液
を１６分割し、その１７１６ずつを下記条件の高速液体
クロマトグラフィー（ウォーターズ社製、高速液体クロ
マトグラフ使用）に付し、保持時間約２３．１分の画分
（画分Ａ）および保持時間約２８．２分の画分く画分Ｂ
〉をそれぞれ分取した。 カラム：　ＹＭＣ５）１３４３−５０ＤＳ　（２０ｇｍ
　ｘ　１５０ＩＩｍ　、株式会社山村化学研究所製） 溶出　水−アセトニトリル−トリフルオロ酢酸７ 　Ｂ （８５：１５：０．１）から水−アセトニトリル−トリ
フルオロ０１酸（３０ニア０：０．１）の凸線的濃度勾
配 流速・１５．０ｔｌ／分 検出　２３５ｎ＋ｎにおける吸光度 得られた画分を減圧濃縮後、凍結乾燥して画分Ａから式
（１）においてＲが０１１のペプチド［ペプチド（１−
１）　］のトリフルオロ酢酸塩２７．１ｍｇ、画分Ｂか
ら式（１）おいてＲがＬ　ｅ　ｕ　−ＯＮのペプチド［
ペプチド（Ｉ−２）　］のトリフルオロ酢酸塩６９−８
を得た。夫々の分析結果は以下の通りである。 ペプチド（１−１・トリフルオロ ペプチドのＣｔ４アミノ酸分析結果：　Ｔｙｒアミノ酸
配列配列分析結果１ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｈｌ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ−＋１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ 酸加水分解物のアミノ酸分析４ｍ　（モル比）：Ｔｈｒ
、０．９５；Ｇｌｕ、３．４２；＾Ｉａ、１．３０；Ｖ
ａｌ、２．６４；Ｍｅｔ、０．９２；ｌｌｅ、１．５３
；Ｔｙｒ、２．８５；Ｌｙｓ、４．２９；１０ｓ、１．
００：＾ｒｇ、１．０６；Ｐｒｏ）、２４；Ｔｒｐ、０
．８１液体クロマトグラフィー保持時間 Ｒｔ、’、約１２，１分、Ｒｔ”、約１５．１分ペプチ
ド　１−２　・トリフルオロ Ｃ端アミノ酸分析結果：　Ｌｅｕ アミノ酸配列分析結果：　ＩＩ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｉ
ｎ−旧５−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＋１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｉ＾ｒＨ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ 酸加水分解物のアミノ酸分析値（そル比〉Ｔｈｒ、１．
０１；Ｇｌｕ、３．４２；＾ｌａ、１．４４；Ｖａｌ、
２．６０；Ｍｅｔ、０．９１；Ｉｌｅ、１．６９；Ｌｅ
ｕ、１．３５；Ｔｙｒ、２．９８Ｌｙｓ、４．１３：Ｈ
ｉｓ、０．９４；＾ｒｇ、１．１０；Ｐｒｏ、２．７３
；Ｔｒｐ、０．７１ 液体クロマトグラフィー保持時間 Ｒｔ　ｌ、約１４．７分、Ｒｔ’、約７７分実施例２ Ｈ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−）１ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ
−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−
＋１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−０
）１　［式（１）においてＲが０■９ ０ のベブチドコトリフルオロ酢酸塩の合成アプライド・バ
イオシステム社製モデル４３０＾ペプチド合成装置を使
用し、固相法にて室温で合成した。 １ｔｃｃ−Ｔｙｒ　（ｆｉｒ−２）−Ｐａａｌｌ脂０．
５ｍｍｏｌを出発原料とし、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−
Ｔｙｒ（Ｂｒ−２）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、　Ｂｏｃ−Ｈｉ
ｓ（Ｄｎｐ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）、Ｂｏｃ−
＾１ａ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、　Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）
、　　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、　　Ｂｏｃ−＋１ｅ、　Ｂｏｃ
−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｒｏｃ−ＡｒｇｆｌＪｔｓ）の各
保護アミノ酸を使用し、■Ｎｔ４？ｏｃの脱保護■洗浄
０中和■洗浄■縮合反応■洗浄■未反応Ｎｆ４アミノ基
のアセチル化■洗浄、の各工程をくり返してＣｆｉ部か
ら逐次、樹脂上にペプチド釦を延長させた。 ■Ｎ端の脱保護は２０ｉ＋１のトリフルオロ酢酸−ジク
ロロメタン混合液（４０・６０）で１０分間３８埋する
ことにより行なった。 ■のｔ′ＩＣ浄はＮ−メチルピロリドン−ジメチルスル
ホキシド（９５：５）混合ｍ　！１１２０ｍ　ｌで行な
った。 Ｓ、の中和はジイソプロピルエチルアミンｌ＋＋ｉｏ＋
を合方するジクロロメタン２０ｍ１で行ｔｊつた。 ■の洗浄はジクロロメタン２０ｓ１、次いでジメチルス
ルホキシド２０−１で行なった。 ■の縮合反応は、保護アミノ酸より調製した４当量の保
脛アミノ酸の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステ
ル（活性エステル）？８液を加え、まず３０分間、次い
で０．２５容量のジメチルスルホキシドを加えて１６分
間、さらに当量のジイソプロビルエチルアよンを加えて
７分間行った。 なお、活性エステル溶液は、Ｎ−メチルピロリドン４　
ｍｌにそれぞれ２ｍｍｏｌの保護アミノ酸、ジシクロへ
キシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールを加え、室温で４０分間攪拌の後、生成するジシク
ロへキシルウレアを濾別することにより調製した。 ■のｔ先ｔｔはジクロロメタン２０ｍ１で行なった。 ■のアセチル化は、無水酢酸１０％とジイソプロピルエ
チルアミン５％とを含むジクロロメタン２０１１で２０
分間行なった。 Φ）の１先！争はジクロロメタン２０の１で行なった。 最後のＢｏｃ−Ｌｅｕの縮合反応紅了後、塩化メチレ２ ンで洗痒、◆′を蜂し保躇ペプチドーＰ−−−銅断を１
９た。 これを、チオフ鼻ノールーＮ、Ｎ−ジメチル本ルムアミ
ド（２５ニア５１況合ｆｋ１００園１に加え、１特間撹
拌し、Ｄｎｐ　＆を１ｉｌｕｔＩシめた後、不溶物を濾
取し、エーテル、ジクロロメタンで洗浄して減圧・２燥
した。 次ニ、　４Ｇ　’）　１１　ｔ：ｒｌＩＵｕ　ｋｍ−１
しＶ　−ル０．７５Ｉ１．　Ｌタンジチオールａ　２　
Ｓａ　Ｉ　１３よびジメチルスルフィド＠、Ｓｓｌの混
合物に加えた１＆、−２０℃でフッ化水素２」・１を加
え３０分間、さらに０℃で２時間撹拌した。＃＆正圧下
反応混合物をｉｓ縮し、残喘に再度フッ化水素１ｎｌを
加え０℃で４０分間攪拌し、城圧下にフッ化水素を除去
した。残ｉ；をエーテル、ジクロロメタンでｔ先棒した
後、酢錬−木（３０：１０）の混合ｆ８奴で抽出し、抽
出液を凍結乾燥した。 得られた和ペプチドを下記条件の高速液体クロマトグラ
フィーで鎖側した。 カラム：センノエー（１１１５−５２５Ｈｂμｍ０Ｄ＾
２０＊ｍｘ　２ＳＯｓｓ　Ｃ１ａ　　（センシａ−１ａ
１字社劃） 溶出；水−アセトニトリルートリフルオ０＃験（７１：
Ｈａｌｌ）から水−アセトニトリル−トリフルオロ酢瞭
（７０；　３・；・、０のａａｍ約１ｌｌＩＦ！１勾配 梳４７０ｍ１／分 検出：■Ｏロー＆：おける吸光度 ｆｆｌ＠＠閤約■、−分の一分を分取し、標記ペプチド
・トリフルオロ酢瞭龜２■−ｇを得た。 このペプチド・トリフルオロ＃ＩＩＩｋ塩の高速液体ク
ロマトグラフィーｆｆｌ特時ＩＩＩＲｔ’＊よびＲｔ”
は、実施例１で得たペプチド（夏−ｔ）・トリフルオロ
酢ａｉ＊ｏそれとそれぞれ一敗した。 瞭加水分解物のア竜ノ皺分析４１（モル比）：Ｔｈｒ、
ＩＪ）；Ｃ１ｍ、３．Ｂ；＾Ｉａ、１．ｌＨ：Ｖａ１．
ＬＨ；Ｍ＠ｔ、１０３Ｈ１１ｅ、１．？３ＨτＦＦ、３
．０＠：Ｌｙｓ、４．１２；旧ｓ、１．０４；＾ｒｇ、
１．＠！ＢＰｒｏ、３．Ｏｌ；丁ｒｐ、ＩＪ１゜実施例
３ 訃νｍ１−Ｔｙｒ−（ｉｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ
−＾１ａ−Ｍ＊Ｌ−Ｌｙｓ−Ｆｒｏ−３ ４ 丁ｒｐ−ｉ　Ｉｔ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−ν・１−夏１ｅ−ｆ’ｒｏ−ｔｙｒ−ｖＮ−
＾ｒｌ−Ｔｙｒ−Ｌ＊ｕ４Ｈ（式（１）にわいてＲがＬ
ｅｕ−Ｏ射のベブチドコトリフルオロカ阪塩の合成 ＠ｏｃ−Ｌａｕ−Ｆｉ＠　１ｌｌｌ１１．５ｓｓｏｌを
出発フ料とし、実施例２の場合と同様にして固相法にて
合成した。 得られた粗ペプチドを１５ｍ例２の場合と同様、高速核
体クロマトグラフィー【但し、熔出は＊−アセトニトリ
ルート９７　Ａ／オロｒｈｌｌ（７ＬＨ（１，１）　Ｔ
ｈら水−アセトニトリル−トリフルオロ酢瞭（＠３：Ｂ
：ｔ１．ｌ）のＷＬ＃Ｒ的横度勾配】で精粒した。保持
時ｍｌ約３１１分の１ｍ分を分取し、「記ペプチドのト
リフルオＯｆｉＬ　ｅ：ｉ　１１１２３４ｔｚ　ｆ（４
１；　ｔ：　。 このペプチド・１リフ・〉オワ酢鮭塩の高ｉ！　喰１４
りＯマドクラ７４−１４ｉ１ｉ！；　ｎ！ｊ　７．　ｔ
　’　ｊｊ　２びＩＩＬ’：＝、実Ｌ＝り：；！てｉ″
！Ｉ：ぺ−゛チ；′！−２）・トリフルメ１　ロわ＾　
ム：場Ｃノそ　ｚ−、！：　＋Ｐ”’−−で二　Ｌ　す
ご。 れｔ加水分％ｔｌ　：Ｉ、○アζノ鮫分析イへ（そル比
）：１１＋ｒ、１．ＤＳ；（ｉｌしＪ、Ｄ！ｌ；Ａｌｇ
、１．０６：Ｖａｌ、２．＆ａ；Ｍｅ１．０．９４；ｌ
ｌ（，１，７０；Ｌｅｕ、１．（Ｉｌｌ；丁ｙｒ、コ、
０９ｔｙｓ、４．１（１；ｍ１ｍ、１．・３：＾ｒｇ＋
ＬＩｉ；Ｆｒｅ、Ｌ１１１；ｉｒ）、＄、１＄ Ｓ ６ 手続補正書（０劃 平成２年５月１８日 事件の表示 平成・２年特許願第５２５５４号 ２、発明の名称 カゼインペプチド ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号〒５３４　　
大阪市部島区友渕町１丁目鑓紡株式会社特許部 電話（０６）　９２１−１２５１ ５番■号 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書籍８頁４行目の「直線的濃度勾配法」の後
に、ｒ（ｔｏｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入
する。 （２）明細書第■頁１９行目の「直線的濃度勾配」の後
に、ｒ（５０分間かけて濃度勾配をかける）Ｊを挿入す
る。 （３）明細書′５ＩＩＩ頁５行目ｆ）　ｒ６０ｍｌ」ヲ
、ｒ　２０Ｇｍｌ　Ｊと訂正する。 （４）明細書第１９頁３行目の「濃度勾配」の後に’（
ｌｏｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入する。 （５）明細書籍２４頁６行目の「濃度勾配」の後にｒ（
ｇｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入する。 （６）明細書第２５頁１１行目の「直線的濃度勾配」の
後に、ｒ（ａｏ分間かけて濃度勾配をかける）１を挿入
する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下式（ I ） 【遺伝子配列があります】・・・（ I ） （式中、ＲはＯＨまたはＬｅｕ−ＯＨを示す）で表わさ
   れるペプチドまたはその薬学的に許容される塩。