JPH01262795A - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、脂質分解酵素（リパーゼ、ホスホリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ等、以後酵素と総称する）
を用いた、主にエステル結合の合成及び交換反応に適し
た固定化酵素及びその製造方法に関するものである。

エステル類の合成反応は、脂肪族１価アルコールと脂肪
酸によるワックスエステルの合成、モノグリセリド、ポ
リグリセリン脂肪酸エステル、糖エステルといった多価
アルコールと脂肪酸によるエステル合成、コレステリル
パルミテート等のステロイドエステル類、ゲラニルブチ
レート等のテルペンアルコールエステル類の製造方法と
して重要な技術である。

油脂類のエステル交換反応は、マーガリン・ショートニ
ング等の食用加工油脂の改質等に水素添加と並ぶ重要な
技術である。

リン脂質についても通常トランスホスファチシレージョ
ンとして知られる塩基交換反応は有用な生理活性物質等
の製造方法として重要な技術である。

〔従来の技術〕

脂質分解酵素の１種であるリパーゼは温和な条件下で反
応すること、位置選択性、アルキル選択性等の特異性を
有することを利用して油脂及びエステル類の合成・交換
反応に利用されている。しかし、これらの反応はリパー
ゼ本来の加水分解反応と異なり水分の限定された系での
み進みうる反応である。一方すバーゼのエステル合成活
性や交換活性を増大せしめるためには、酵素として水分
を特徴とする特開昭５５−７１７９７号公報に開示され
た低水分系の反応では、充分な反応速度が得られず、ま
た反応速度を増大させるために必要以上の水分を与える
と、エステルの分解反応が優先的に進行するという問題
点がある。また特開昭６０−１９４９５号公報及び特開
昭６０−２０３１９６号公報に開示された、反応を多水
分系の分解工程と水分を除去する合成工程の二段階に分
けて行う方法の提案もあるが、後者の合成反応速度は通
常のエステル交換速度に比して充分であるとは言えず、
工程操作の複雑化も避けられない。

以上の問題点を解決し、かつリパーゼを効率的に使用す
る目的で、リパーゼを固定化する試みが行われてきた。

リパーゼの固定化により期待される利点は次の通りであ
る。従来リパーゼを水溶液の状態で使用すると油中に均
一に混合・分散することが困難であったが、リパーゼを
不溶性担体表面に固定化する事により油中に容易に分散
可能となり、かつ担体に適当量の水分を保持できるため
、低水分下でのエステル合成・交換反応が行いやすくな
る。また触媒としてコストの高いリパーゼの回収再使用
がしやすく、エステル合成反応または交換反応の工業的
実施においても反応装置の連続化が容易となる点等であ
る。

しかし、以上のような利点を有する固定化酵素において
も、リパーゼの合成活性増大のために必要な水分量を保
持する事と、逆反応である加水分解の抑制とを両立する
には至っていない。

例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’５Ｓｏｃｉｅｔｙ、第６０巻、
　２９１−２９４（１９８３）にも微量な水分を与えた
場合、加水分解反応が進行することが指摘されている。

また、水に代えてグリセリンのような多価アルコールを
添加した場合では加水分解反応はある程度抑制されるが
、エステル合成・交換反応は遅くなる。また、酵素水分
の保持を狙い多孔質担体、高吸水性樹脂をキトサンで包
括結合後、粉砕した担体を用いる方法（特開昭５９−２
１３３９０号公報）によっても固定化酵素のエステル合
成・交換反応と分解反応を両立させるため、二段階反応
法（特開昭６０＝２０３１９６号公報）を採用している
。また特開昭６０−９８９８４号公報および特開昭６１
−２０２６８８号公報には耐熱性を持ち８０°Ｃまでの
反応が可能なエステル交換、エステル合成を目的とした
固定化酵素についての開示もあるが、その特徴とする６
０°Ｃ〜８０°Ｃという温度では、ジグリセリドの１．
２位から１，３位への酵素的および非酵素的転移が速（
、カカオ脂に類似したグリセリドの２位にオレイン酸を
多く含有する対称型油脂の製造を目的とする場合には、
よりエステル交換反応速度の速い固定化酵素の開発が望
まれる。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のようにエステル合成及び交換反応においては反応
系内の水分を確実にコントロールするか、またはよりエ
ステル合成及び交換活性の高い固定化酵素の開発が望ま
れる。

エステル交換反応についてみると、水分コントロールに
ついては先に述べた二段階反応（特開昭６０−２０３１
９６号公報）においても行われているが、装置的にも煩
雑であること、また第１段の分解工程において１．２−
ジグリセリドを選択的、高収率で得ることと、更に第２
段で１．２−ジグリセリドから１．３−ジグリセリドへ
の転移をさせることなく、選択的にトリグリセリドを合
成することは難しく、特に温度が高くなるほどこの転移
の悪影響を抑える事は難しくなり、溶剤の使用等が必要
となる制約された条件に限られる。

またエステル合成反応についてみると、従来の方法では
ほとんどの例がリパーゼを水溶液として使用しており、
分解と合成の平衡関係が大きく分解にかたよっており、
目的とするエステルの収量は低いものにとどまっている
（特開昭５１−７７５４号公報、特開昭６１−１８７７
９５号公報）。

しかし固定化酵素によって反応を行えば、より低水分条
件下においてもエステル合成が行われ、酵素の回収も容
易であるが、この場合においても通常の化学的方法と同
等の反応速度を得るためには、より高活性な固定化酵素
の開発が望まれる。

リパーゼのエステル合成及びエステル交換活性を増加さ
せる方法として、特開昭６０−２５１８８４号公報に開
示されたリパーゼに油脂を加え加水分解反応をさせるこ
とにより、油脂と脂肪酸の共存下で固定化を行う方法や
、特開昭６２−１３４０９０号公報に開示された脂肪酸
誘導体の共存下に乾燥する方法があるが、こうした方法
により得られた固定化リパーゼのエステル合成活性およ
びエステル交換活性は前述の工業的実施にあたっては実
質的には未だ十分であるとは言えない。

一方酵素固定化における、活性収率の面から見ると、特
開昭５２−８７２９３号公報に開示されたイオン交換樹
脂の有機金属誘導体を担体としてリパーゼを固定化する
方法や、特開昭５３−２７７８７号公報に開示された多
Ｉｌ！類の高級脂肪酸エステルを担体としてリパーゼを
固定化する方法、あるいはＥｕｒ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、＋に
記載されたＹ、　Ｋｉｍｕｒａ等のイオン交換樹脂にリ
パーゼを単にイオン結合により固定化する方法等の従来
の方法ではいずれも低収率にとどまり、他の夾雑物の共
存下でリパーゼのみを選択的に固定化することは極めて
困難であると考えられていた。

〔課題を解決するための手段〕 そこで、本発明者らは脂質分解酵素のエステル合成及び
エステル交換活性を増大させる因子について鋭意研究を
重ねた結果、従来金属イオンの吸着、除去に用いられて
きたキレート樹脂を担体に用いると固定化後の活性発現
が良いことを発見した。更にそれらキレート樹脂に脂質
分解酵素を固定化する際に、脂肪酸、脂肪酸誘導体、リ
ン脂質、アルコール類、エーテル類、ハロゲン化アルキ
ル類並びにカルボニル化合物からなる群から選ばれた１
種又は２種以上を共存させることによりエステル合成及
びエステル交換活性の増大が見られる事実を発見した。

更に本発明者らはこれらの事実をもとに、脂肪酸、脂肪
酸誘導体、リン脂質、アルコール類、エーテル類、ハロ
ゲン化アルキル類並びにカルボニル化合物からなる群か
ら選ばれた１種又は２種以上をキレート担体上に吸着さ
せる事により更に良好な結果が得られることを見出し、
本発明に応用したのである。

従来、リパーゼと、脂肪酸や脂肪酸誘導体との関係につ
いては、発酵生産において誘導基質として添加されたり
、ある種の不飽和脂肪酸または脂肪酸誘導体がある種の
リパーゼの分解活性を活性化することが報告がされてい
るにすぎない。詳細には、サツカロマイセス・リポリテ
ィカのリパーゼの分解活性をオレイン酸（Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　４６．２８８５（１９８２）
やヒドロキシ脂肪酸（３，５−ジヒド１コキシー７−テ
トラデセン酸）が活性化すること（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋５０、２５２３（１９８６））　
、ヒマ種子中のリパーゼがヒドロキシ脂肪酸誘導体（リ
シルレート・テトラマー（Ｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ　ｔ
ｅｔｒａｍｅｒ））の分解活性発現に必要なことが報告
されているにすぎない。

また、リパーゼとリン脂質との関係についても、岩井ら
により１９６９年の日本生死学会において報告されて以
来、多くの報告がなされたが、加水分解反応での基質特
異性の変化についてか、または発酵生産の安定化、誘導
についてのみであり、エステル合成及びエステル交換反
応での活性化についての報告はほとんど見られない。

これに対し本発明おいては、具体的には脂質分解酵素を
含む溶液にキレート樹脂を担体として用いること、更に
該担体上に酵素を固定化する際に、予め不溶性担体に脂
肪酸、肪脂肪酸誘導体、リン脂質、アルコール類、エー
テル類、ハロゲン化アルキル類並びにカルボニル化合物
゛からなる群から選ばれた１種又は２種以上を吸着させ
た後、乾燥もしくは乾燥せずそのまま固定化に用いる事
により、酵素の選択的吸着とエステル合成活性及びエス
テル交換活性の著しい上昇が見られたのである。

本発明の方法の最も好ましい点としては、第一に酵素を
含む培養液など他の夾雑蛋白質や他の物質の中から酵素
を短時間かつ高収率に固定化できる点である。

第二にリパーゼ等の脂質分解酵素においては、当然のこ
とながら水と油脂の界面で働くため、水溶液で使用した
場合には、界面と水溶液中にリパーゼの分散する平衡が
存在すると考えられ、水溶液中の酵素を全て有効に使用
できない。しかし固定化により担体表面上に並べること
ができれば、用いた酵素を効率良く利用する事が可能と
なる。

第三に担体に前記化合物を吸着させておくことにより脂
質分解酵素を活性化して固定化できる事がわかった。こ
れは、前述した様に界面で働（脂質分解酵素は、界面に
配向した時に活性を発現する高次構造をとる。このため
、界面に配向しかつ活性化した状態で酵素を固定化する
事が重要である。この高活性な状態を作り出すのに必要
な水不溶性の物質として脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂
質、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類、
ハロゲン化アルキル類が非常に良好であることが分かっ
た。

すでに本発明者らはこれらの知見を応用して、少量の水
と油脂の共存下でリパーゼと不溶性担体を接触させ、界
面に配向させると同時に固定化を行うという発明を完成
し特許出願した（特開昭６０−２５１８８４号公報）。

今回本発明者らは、さらにこれらの事実を解明し、担体
にキレート樹脂を使用することと、前記化合物を予めキ
レート樹脂に吸着させることに応用し、該担体と酵素を
接触固定化する際に、酵素を活性化すると同時に短時間
でかつ高濃度に該担体上に固定化が可能となり、高活性
な固定化酵素を製造できるという本発明の完成に至った
ものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においては、脂質分解酵素を固定化するにあたり
、担体としてキレート樹脂を用いる。

そして更に該担体に、脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質
、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類並び
にハロゲン化アルキル類から選ばれた１種または２種以
上を水溶液中で接触させる事により該担体上に吸着処理
し、必要に応じて該溶液から濾過した後、乾燥するか、
またはそのまま酵素水溶液もしくは酵素を含む培養液と
接触させる。接触時間としては１分〜２０時間、好まし
くは３０分〜２時間がよい。次いで該溶液より不溶性担
体を濾過し水または緩衝液により洗浄する。こうして得
られた固定化酵素を乾燥させ本発明の固定化酵素を得る
。

本発明に用いる脂質分解酵素としては、リパーゼ、ホス
ホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴ
ミエリエーゼおよび各種のエステラーゼが挙げられる。

これらのうちリパーゼとしては、グリセリドの１．３位
にのみ反応し、位置選択性に優れたリゾプス（Ｒｈｉｚ
ｏｐｕｓ　）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｕｒ　）属、脂肪酸特異
性を有するジオトリケム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、
特異性を示さないキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、
シュードモナス（Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニ
シリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロモバクテ
リウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生
物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物リパーゼが
挙げられる。これらのうち、特に合成活性の増加し易い
リパーゼとしては中鎖以上のアルキル基に活性位の強い
リゾプス属、ムコール属、クロモバクテリウム属起源の
リパーゼが一層好ましい。コレステロールエステラーゼ
の例としては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の
微生物起源のものが挙げられる。また、ホスホリパーゼ
の例としては、キャベツ、ビーナツツ、ニンジン、大豆
、菜種等の植物やコケ植物由来のホスホリパーゼＤ１ス
トレプトマイセス属等の微生物起源のホスホリパーゼＤ
、さらには酵母由来のホスホリパーゼＡ１蛇毒由来のホ
スホリパーゼＡ２などが挙げられる。

本発明に用いられるキレート樹脂としては、水およびア
ルコール、各種有機溶剤、油脂類に不溶性の担体なら何
れでも良く、配位原子がＯ９Ｎ、　Ｓ、　Ｐ、　Ａｓ＋
　Ｓｅの何れかを含むものであれば特に限定はない。特
に配位基が、アミドオキシム、チオール、ジチオカルバ
ミン酸、イミノジ酢酸、アミンリン酸、カルボン酸、メ
チルスルホン酸、スルホン酸並びにアミンからなる群か
ら選ばれた何れか１種又は２種以上を含むものである物
理的・化学的に安定なものであれば何れも使用できる。

特に、不溶性担体内に疎水性の部分を持つもの、例えば
樹脂中の−ＣＨ２一部分の多いもの、官能基にアルキル
基の入ったものが、脂質分解酵素の吸着性や基質として
の脂質との相性からも好ましい。また担体の形状として
は、粉末状、果粒状、繊維状、スポンジ状等、種々ある
が、そのいずれでも使用できる。

特に工程操作上の面からは４００〜１０００μｍの粒径
を有し、細孔径１００〜１５００人の多孔性の担体を用
いることが好適である。特にこの種の固定化担体として
、マクロ多孔性（マクロポーラス型）のキレート樹脂が
挙げられる。

本発明に用いられる脂肪酸としては特に規定はないが、
通常自然界に存在する炭素数２〜２４の直鎖脂肪酸、例
としてはカプリン酸、ラウリン酸、ステアリン酸等の飽
和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、
リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステ
アリン酸等の化学的に合成した分岐状脂肪酸等が挙げら
れる。又、本発明で用いられる脂肪酸誘導体としては、
モノグリセリド、ジグリセリド及びそれらの誘導体、あ
るいはプロピレングリコール、ポリグリセリン等の多価
アルコールの脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、蔗糖脂肪酸エステル等の界面活性を有するエステル
類も効果的である。

更に本発明においてリン脂質としては、市販大豆レシチ
ン、卵黄レシチン等の粗製及び又は精製混合レシチン等
を用いても良く、またこれらを分画して得たホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスフ
ァチジン酸、カルシオリピン等を単独又は混合して用い
ても良い、また各種合成法により得た合成リン脂質及び
これらの誘導体も用いることができる。

また本発明において用いられるアルコール類としては特
に規定はないが、炭素数４〜２４の直鎖脂肪族１価アル
コール、例としてはオクタツール、ラウリルアルコール
等の飽和アルコール、オレイルアルコール等の不飽和ア
ルコール、もしくは５−デカノール、イソステアリルア
ルコール等の分岐状アルコールが挙げられる。さらにヘ
キサメチレングリコール等の２価アルコールや多価アル
コールも有効である。このほかに、アルキル置換フェノ
ール等のフェノール化合物や、コレステロール、スチグ
マステロール、ブラシカステロール、カンペステロール
等のステロール類も用いることができる。又、フィトー
ル、ゲラニオール、ファルネソール、リナロール等のテ
ルペンアルコール類、レチノール、トコフェロール等の
脂溶性ビタミン類も有効である。

本発明に用いられるエーテル類の例としては、ジオクチ
ルエーテル等の長鎖のエーテル類、チミルアルコール、
バチルアルコール等のグリセリルエーテル類、またはグ
リシジルエーテル等のグリセリド類似化合物、トリエチ
レングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリ
コール等のポリオキシ化合物、前記アルコールのトリメ
チルシリルエーテル誘導体、ポリメチルシロキサン等の
シリコン化合物も用いることができる。

本発明に用いられるカルボニル化合物類の例としては、
２，４−デカジェナール、デカナール、ヘキサデカナー
ル等の脂肪族アルデヒド類、レチナール等のテルペン系
アルデヒド類、２−オクタノン、２−デカノン、オクチ
ルデシルケトン等の脂肪族ケトン類等が挙げられる。　
　　゛本発明に用いられるハロゲン化アルキル類の例と
しては、オレイルクロライド、オクチルクロライド、オ
クチルブロマイドのような長鎖アルキルハライド等が挙
げられる。

上記の脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質、アルコール類
、エーテル類、ハロゲン化アルキル類、カルボニル化合
物類はいずれも常温で液状であることが工程操作上好ま
しいがこれに限定されるものではない。またこれらは単
独で用いてもよいが、適当な組み合せにより一層の効果
が発揮される。

本発明において、脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質、ア
ルコール類、エーテル類、ハロゲン化アルキル類或いは
カルボニル化合物類と水不溶性担体との接触方法として
は、水溶液中にこれらの物質をそのまま加えても良いが
、分散性を良くするため溶剤に一旦分散・溶解させた後
に加えることもよい。適当な溶剤としてはクロロホルム
、ｎ−ヘキサン等があげられる。これらの物質と不溶性
担体の比率は、不溶性担体１重量部（乾燥重量）に対し
０．０１〜１重量部が適当であるが、これに限定される
ものではない。

適当な接触温度としては０〜１００°Ｃ１好ましくは２
０〜６０°Ｃがよい。適当な処理時間としては５分〜５
時間程度で良く、これらの接触処理した後の担体は必要
に応じて該溶液より濾別した後−旦乾燥する。適当な乾
燥温度としては室温〜１００°Ｃが良（、減圧下での乾
燥が乾燥速度の点から好ましいが、これに限定されるも
のではない。

本発明において固定化を行う温度としては、酵素の失活
の起きない温度であればよく、０〜６０’Ｃ，好ましく
は２０〜４０°Ｃがよい。また酵素溶液のｐＨは酵素の
変性が起きないような範囲であればよく、ｐＨ３〜９で
あればよい。特に至適ｐＨが酸性とされている酵素を用
いる場合に最大の活性を得るには、ｐＨ４〜６とするこ
とがよい。

特に従来、弱塩基性イオン交換樹脂で固定化する場合ｐ
Ｈ６以下でないと緩衝能の点から使用しにくかったが、
キレート樹脂ではｐＨ８〜９でも使用できるのでアルカ
リ性に至適ｐＨをもつシュウトモナス属のリパーゼにも
使用できる。また酵素溶液に用いる緩衝液の種類は特に
規定しないが、−船釣な酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液等を用いることができる。

本発明における固定化方法において、水溶液中の酵素濃
度は特に規定しないが、固定化効率の点から前記酵素の
溶解度以下でかつ充分な濃度であることが望ましい。ま
た必要に応じて不溶部を遠心分離により除去し、上澄を
使用しても良い。また酵素と固定化担体の使用割合（重
量比）は固定化担体１部に対して、酵素０．０１〜１０
部が好ましいが、特にこれに限定されるものではない。

本発明において、固定化前の担体に、多官能性試薬を用
いて架橋することにより、固定化酵素の繰り返し使用に
おける耐久性向上をはかることができる。多官能性の架
橋試薬としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒドなどのポリ
アルデヒド類が好ましく、ヘキサメチレンジチオイソシ
アネート、Ｎ、Ｎ’−エチレンビスマレイミド、塩化シ
アニルなども使用可能である。また、カルボジイミド類
も使用できる。

〔発明の効果〕

本発明の固定化酵素は、リパーゼ等の脂質分解酵素の固
定化に於て、今まで金属イオンの吸着、除去等に用いら
れてきたキレート樹脂を用いることにより脂質分解酵素
の持つ合成活性を十分に発揮させる為のものである。更
に、脂質分解酵素を、脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質
、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類並び
にハロゲン化アルキル類から選ばれた１種または２種以
上の存在下でキレート樹脂に固定化すること、さらに好
ましくは樹脂上に予め脂肪酸、脂肪酸誘導体、リン脂質
、アルコール類、エーテル類、カルボニル化合物類並び
にハロゲン化アルキル類から選ばれた１種または２種以
上を吸着させておくことにより、酵素の選択的吸着固定
化が可能となり、同時にエステル交換活性、合成活性の
増大が起こる事の発見を応用したものである。

本発明の固定化酵素を用いた合成反応の例としては、通
常のメタノール、エタノール、プロパツール、オレイル
アルコール等の１価アルコール、ないしはプロピレング
リコール、グリセリン、ソルビトールおよびポリグリセ
リン等の多価アルコール、またはゲラニオール、シトロ
ネロール、メントール等のテルペンアルコール、あるい
はコレステロール等のステロールと炭素数２〜２４の脂
肪酸とのエステル化反応があげられる。またエステル交
換反応の例としては、エステルと脂肪酸によるアシドリ
シス反応、エステルとアルコールによるアルコリシス反
応、エステルどうしによるインターエステル化反応、リ
ン脂質と各種アルコールとのトランスホスファチシレー
ジョン等の反応が挙げられる。また、医薬品の中間体と
してのホスファチジン酸等の製造にも使用できる。

本発明の効果として、特に位置選択性リパーゼを本発明
の方法で固定化して得た固定化リパーゼは著しい活性を
有し、グリセリドの２位にオレイン酸を多く含有する油
脂と、、飽和の脂肪酸とのアシドリシス反応により、天
然のカカオ脂に類似した構造を有する対称型の油脂の製
造を目的とした場合に、ジグリセリドの副生および非対
称型への転移とそれに伴う三飽和グリセリドの副生の低
減が可能となる。

またエステル類の合成においては、従来の酵素法では反
応の進行に伴って生成する水分により反応が平衡に到達
するため、エステル化が進行しなくなる。そこで反応系
を減圧にする等の脱水操作によってエステル化をさらに
進めようとするが、こうした操作により酵素のエステル
合成活性の低下は避けられない。

こうした場合に本発明の固定化酵素を用いると、低水分
条件下においても十分なエステル合成活性を保持してい
るため、短時間の間に高いエステル化率が達成され、反
応の長時間化による着色および異臭の生成等、品質の低
下が見られないという利点を有する。

以上のように本発明により、脂質分解酵素を界面での活
性型にした状態で固定化することによりエステル合成お
よびエステル交換活性が増大することを発見し、工業的
実施にあたって簡便かつ廉価に固定化酵素を製造するこ
とができる。

〔実施例〕

以下に本発明をエステル交換反応とエステル合成反応に
ついてそれぞれ実施例、比較例をもって説明する。

実施例１ 表１に示した市販のキレート樹脂を５０ｍＭの酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）で平衡化し減圧乾燥後、おのおのＬｏ
ｇを担体として用いた。この担体にリパーゼ水溶液１０
０　ｍｌを加え３０°Ｃで２時間撹拌した。

リパーゼ水溶液はリパーゼ［リゾプス・ジャポニカス（
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ−ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）起源のリパー
ゼ製剤、商品名〈リパーゼ・サイケン１０ｏ〉大阪細菌
研究所株式会社製、１９０００ＬＩｎｉｔ／　ｇ　］　
１０　ｇをｐ）１５．０の５０ｍＭの酢酸緩衝液９Ｂ＋
ｎ７に溶解し作成した。該懸濁液より樹脂を濾別し、緩
衝液で洗浄した後、水分２％となるように常温にて減圧
乾燥を行い１０．２ｇの固定化リパーゼを得た。

こうして得られた固定化リパーゼ１ｇを、グリセリン２
３ｇ（水分含量０．８％、花王株式会社製）及びオレイ
ン酸（商品名ルナツク０−ＬＬ、花王株式会社製）７０
．５ｇと混合し、６５°Ｃにて撹拌しながらエステル化
反応を行った。２時間後に反応液の一部を試料として取
り出し、基準油脂分析試験法に従って試料の酸価を測定
した。試料の酸価より次式によりエステル化率を求めた
。

結果を表１に示す。

ここで　ＡＶｔ　　：　を時間後の試料の酸価ＡＶｏ　
　：反応前の混合試料の酸価を表す。

表　　　　　　１ 尚、ＤｕｏｌｉＬｅ　、　ＩＭＡＣはデュオライト・イ
ンターナショナル社、Ｓｕｍｉｃｈｅｌａｔｅは住友化
学工業（株）の製品である。

比較例１ 酵素粉体そのまま１ｇを用い、水分を５．１０゜２０％
となるように添加して実施例１と同様の反応を行い、同
様にエステル化率を求めた。

結果を表２に示す。

比較例２ 実施例１の担体をセライトにかえて同様の操作を行い固
定化酵素を得た。

得られた固定化酵素を用い、実施例１と同様の反応を行
い、同様にエステル化率を求めた。

結果を表２に示す。

表　　　２ 実施例　２ 実施例１において使用したキレート樹脂Ｌｏｇに、リシ
ノール酸２％含有の１ＯＯ−ヘキサン中でリシノール酸
を吸着させ、その後乾燥し、実施例１と同様な処理を行
って固定化酵素をｉＪトた。

得られた固定化酵素を用い、実施４＋１１と同様の反応
を行い、同様にエステル化率を求めた。

その結果を表３に示した。

表３から明らかなように、実施例１に比べ、Ｓｕｍｉｃ
ｈｅｌａｔｅ−ＣＲ−２を除く何れの樹脂・も酵素吸着
率、活性とも増加した。

表　　　　　　　３ 実施例　３ 実施例２で得られた固定化リパーゼの中から、担体がＤ
ｕｏｌｉｔｅ　ＥＳ−４６５，Ｄｕｏｌｉｔｅ　ＥＳ−
４６７であるものをそれぞれ１ｇ用いて、パーム油中融
点部（沃素価３２．５、ジグリセリド含量４．６％）１
０ｇと市販のステアリン酸［商品名ルナツク５−９０゜
ステアリン酸純度９３％、花王株式会社製］１０ｇを加
え７０″Ｃで２時間反応を行った。反応後カラムクロマ
トグラフィー（固定相フロリジル、フロリジン社製、展
開溶剤：ヘキサン／エチルエーテル−２／３）によりグ
リセリド画分を分離し、グリセリド中に含まれるステア
リン酸含量をガスクロマトグラフィーにより分析し、次
式で示される平衡値を１００％とした反応率を算出した
。

ｏｏ−３Ｏ 上の式において、 Ｓｔ：を時間後の油脂中のステアリン酸含量ＳＯ：原料
油脂中のステアリン酸含量 ５ＣＩ）　：　Ｌ３ランダム平衡時のステアリン酸含量
を意味する。

結果は表４にまとめて示した。いずれの実施例の場合も
６時間以内に反応が平衡に到達し、副生物の生成も比較
例に比べ少なかった。

表　　　　４ 実施例　４ 実施例２で使用したリシノール酸に変えて、オレイン酸
、リノール酸、ラウリン酸、ステアリン酸（以上何れも
試薬、東京化成製）、イソステアリン酸（商品名：ダイ
ヤドール１０−　ＧＡ、三菱化成工業製）を用いた以外
は同様の操作を担体にＤｕｏｌｉｔｅ　ＥＳ−４６５を
使用して行ない固定化酵素を得た。ここで得られた固定
化酵素を用いて実施例３と同様にエステル交換反応を行
なった。

これらの結果は表５にまとめて示した。

表　　　　５ 実施例５ 実施例２で用いたリシノール酸に変えて、脂肪酸誘導体
としてソルビタンモノオレエート（商品名：エマゾール
０−１０、花王株式会社製）、リン脂質として大豆レシ
チン、水性のテルペンアルコールとしてフィトール（試
薬：東京化成株式会社製）、疎水性アルコールとしてオ
レイルアルコール、またオレイルアルコールのトリメチ
ルシリル（ＴＭＳ）誘導体、各々２ｇをヘキサンに懸濁
させて用いた以外は同様の操作を担体にＤｕｏｌｉｔｅ
　ＥＳ−４６５を使用して行ない固定化酵素を得た。こ
こで得られた固定化酵素を用いて実施例３と同様にエス
テル交換反応を行なった。

これらの結果は表６に示した。

表　　　６ 実施例　６ Ｓｕｍｉｃｈｅｌａｔｅ　Ｑ−１ＯＲを塩化シアニル２
０％含有アセトン中で処理しその後塩化カルシウム１０
０１含有トリス塩酸緩衝液ｐＨ８，０で平衡化を行った
。ホスホリパーゼ（ストレプト・マイセス起源、商品名
ホスホリパーゼＤ、東洋醸造（株）製）を、塩化カルシ
ウム１０ｍＭを含むトリス塩酸緩衝液１００　ｍｊに１
０００　Ｕ溶解しこの水溶液に前記処理樹脂１ｇを添加
しｐＨを維持しながら固定化を行った。

ホスホリパーゼの評価としてはフォスファチジルコリン
を基質としてその分解率によった。

分解率は、反応溶液を経時でサンプリングし生成したホ
スファチジン酸を高速液体クロマトグラフィーによって
定量した。

即ち、固定化ホスホリパーゼ５０■をホスファチジルコ
リン１０％のヘキサン溶液１００　ｍｊ中に添加し、ト
リス塩酸緩衝液を１０ｍＺ加え反応を行った。サンプリ
ングは２時間後に行った。結果を表７に示した。

表　　　　　　７ 出願人代理人　　古　谷　　　馨

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脂質分解酵素を、固定化担体としてキレート樹脂を
   使用し、酵素水溶液と接触させることにより固定化して
   なることを特徴とする固定化酵素。 ２、キレート樹脂の配位基が、アミドオキシム、チオー
   ル、ジチオカルバミン酸、イミノジ酢酸、アミノリン酸
   、カルボン酸、メチルスルホン酸、スルホン酸並びにア
   ミンからなる群から選ばれた何れか１種又は２種以上を
   含むものである請求項１記載の固定化酵素。３、キレー
   ト樹脂がマクロポーラス型樹脂である請求項１又は２記
   載の固定化酵素。 ４、脂質分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼ、並びに
   コレステロールエステラーゼより選ばれたものである請
   求項１〜３のいずれかに記載の固定化酵素 ５、脂質分解酵素を固定化担体に固定化して固定化酵素
   を得る方法において、固定化担体としてキレート樹脂を
   使用し、酵素水溶液と接触させることを特徴とする固定
   化酵素の製造方法。 ６、脂質分解酵素を固定化するにあたり、脂肪酸、脂肪
   酸誘導体、並びにリン脂質から選ばれた１種もしくは２
   種以上の存在下で固定化する事を特徴とする請求項５記
   載の固定化酵素の製造方法。 ７、脂質分解酵素を固定化するにあたり、アルコール類
   、エーテル類、カルボニル化合物類並びにハロゲン化ア
   ルキル類から選ばれた１種もしくは２種以上の存在下で
   固定化する事を特徴とする請求項５又は６記載の固定化
   酵素の製造方法。