JPH01163198A

JPH01163198A - Ｈｉｖ−２感染検出用合成ペプチド抗原、その組成物およびその使用方法

Info

Publication number: JPH01163198A
Application number: JP62330323A
Authority: JP
Inventors: Anders Vahlne; アンデルス　ヴァールネ; Bo Svennerholm; ボ　スヴェンネルホルム; Lars Rymo; ラルス　リモ; Stig Jeansson; ステイーグ　イエアンソオン; Peter Horal; ペテル　ホラル
Original assignee: BIROBAARU SA
Current assignee: BIROBAARU SA
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1987-12-28
Publication date: 1989-06-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＨＩＶの免疫学的に重要なタンパク領域に対応
する配列を有する合成ペプチド抗原に関するものである
。このペプチドは抗ＨＩＶ−２抗体の検出用診断試薬と
して有用で、またこのペプチドは人間を含む動物におい
てＨＩＶ−２に対する抗体産生を誘発する組成の免疫原
（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）としても有用である。従って本
発明は抗ＨＩＶ−２抗体感染検出方法、該ペプチドを含
有するＨＩＶ−２抗体産生誘発組成物及びＨＩＶ−２抗
体産生誘発方法に関するものでもある。

（産業上の利用分野）後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；エイズ）は凹界的に
好康上の大問題となっている。ＡＩＤＳの病原体はＨＩ
Ｖ　（ヒト免疫不全ウィルス；ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎ
ｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ）として分離され
ている。このＨＩＶは、従来ＨＴＬＶ−Ｉｎ　（ヒトＴ
細胞親和性ウィルス）、ＬＡＶ　（リンパ節症関連ウィ
ルス）およびＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）などと呼ば
れた高度に密接な１群のウィルスに笑えられた名前であ
る（現在ではＨＩＶ−１と直されて呼ばれている）。

ＡＩＤＳ感染者から分離されたＨＩＶと、北アメリカ、
西ヨーロッパや中央アフリカから採取されたＡＲＣ（エ
イズ関連症候群；　ＡＩＤＳ−ＲｅｌａｔｅｄＣｏｍｐ
ｌｅｘ　）とは生物学的性質が同じであり、抗原性的に
も交叉反応を行なう蛋白質である。しかし、遺伝子レベ
ルの研究では、北アメリカとアフリカとで分離採取され
たＨＩＶはその遺伝子のヌクレオチド配列に違いがある
ことが明らかになっている（Ｂｅｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、
　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）　２３９：９４９−９５
１）。また同じアメリカ合衆国内で採取されたＨＩＶで
も、分離物によりヌクレオチド配列に小さな差異が有る
ことも文献上用らかにされている。

ＨＩＶに遺伝学的にも構造的にも関連するその他のウィ
ルスもまた幾つか最近分離されている。

遺伝学的にも構造的にもＨＩＶに類似するこれらのウィ
ルスは、ＡＩＤＳ様の病気の症状を示す捕離された（Ｋ
ａｎｋｉ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８
５）　２３０：９５１−９５４）、ＳＴＬＶ−ｍ＾ＧＭ
　（７７’Ｊカミトリザル由来）やＳＴＬＶ−ｍに＾Ｃ
（アカゲザル由来）と従来名付けられていたこれらのウ
ィルスは現在では、Ｓ　Ｉ　Ｖ　（ｓｉｍｏｎ　ｉｍｍ
ｕｎｏｄｅＮｃｉｅｒ＋ｃｙ　ｖｉｒｕｓ；サル免疫不
全ウィルス）として知られている。

ＨＴＬＶ−ｒＶと称される新規ヒトウィルスも西アフリ
カの外見上廿康な人より分離採取されている（Ｋａｎｋ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｇ）　
２３２：　２３８−２４３）。このウィルスは感染細胞
内でレトロウィルス型の粒子を産生し、ＨＴＬＶ−ｍ／
ＬＡＶやＳＴＶ−ｍのものと類似する特徴的な増殖パタ
ーンと主要ウィルスタンパクを有している。血清学的デ
ータによれば、ＨＴＬＶ−ＩＶはヨーロッパや合衆国の
患者から分離されたプロトタイプＨＴＬＶ−Ｉ１１／Ｌ
ＡＶＪ：りもＳＴＬＶ−ＩＩＬＧＭｋｌ、Ｊ：り近縁す
るものであることが示されている。

最近では、西アフリカでもＡＩＤＳが確認されている。

この患者は典型的なＡＩＤＳの症状を示すが、患者血清
中には既知ＨＩＶ抗原に対する抗体力価は検出できない
、しかし、構造的にまた生物学的にＨＩＶに近縁する、
当初ＬＡＶ−２と呼ばれたレトロウィルスがこの西アフ
リカの患者から分離採取された（Ｃ１ａｖｅｌ　ｅｔ　
ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）　２３３：　３
４３−３４６　）　、今では多数のＡＩＤＳ、ＡＲＣ思
者や無症状患者から分離されているこの西アフリカのウ
ィルスは、ヨーロッパ、北アメリカ及び中央アフリカで
のＡＩＤＳ病原体として既に同定されているＨＩＶ　（
現在ではＨＩＶ−１と呼ばれている）分離物とは区別さ
れ、現在ＨＩＶ−２として知られている（Ｃ１ａｖｅｌ
　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　（１９８？）　３１６：
１１８０−１１８５；　Ｇｕｙａｄｅｒｅｔ　ａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２６：　６２２−６
６９　）ＨＴＬＶ−ＩＶとｒｉ？１様、ＨＩＶ−２４１
ＨＩＶ−１よりもＳＩＶの方により近縁している。しか
しながらＨＩＶ−２はインビトロ感染したヒトヘルパー
Ｔ細胞を殺すのに対し、ＨＴＬＶ−ＩＶはこのような作
用がないから、ＨＩＶ−２とＨＴＬＶ−■とは同じウィ
ルスではない。

最近報告されたＨＩＶ−２の完全ヌクレオチド配列（Ｇ
ｕｙａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、上記引例）によると、Ｈ
ＩＶ−１との間での遺伝子配列の相同性（ｈｏｍｏ−１
ｏｇｙ）は僅か４２％であツタ。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−
２との間には重要な差異がウイルスタンノくりの多くに
見られ、特にｅｎｖ遺伝子でコードされる糖タンパクで
顕著であった。実際、ＨＩＶ−２エンベロープ糖タンパ
クはＨＩＶ−１のものよりもＳＩＶのものにより一層近
似して（、するよう番こ思われる。

ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間で血清学的な交叉反応性
が無いという事実は、ＨＩＶ−２感染番と対する検出用
の診断検査やワクチンの開発にとって非常に重要な問題
である。種々の研究によれば、ＨＩＶ−２感染患者はＨ
ＩＶ−１検出用の血清学的テストでは同定できないこと
が示されてｌ、Ｎる。この２つのウィルスに交叉反応性
があるとしたら、両ウィルスのｇａｇ遺伝子によりコー
ド゛された主要コアタンパク上の共通エピトープ（ｅｐ
ｉ−ｔｏｐｅｓ）があって、これらと反応する抗体によ
って交叉反応が媒介されることになる。しかしＨＩＶ−
１のウィルスエンベロープ糖タンパクｇｐ１２０及びｇ
ｐ４２やそれらの前駆体ｇｐ１６０はＨＩＶ−２のエン
ベロープ糖タンパクとは交叉反応していない（Ｃ１ａｖ
ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｇ）２
３３：　３４３−３４６；　　Ｇｌａｖｅｌ　ｅｔ　ａ
ｔ、、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ。

（１９８７）　３１６：　１１８０−１１８５）　、　
ＨＩ　Ｖ　−１検出用として現在広く行なわれている検
査（この検査は、主として）（ＩＶ−１糖タンパク、例
えばｇｐ１６０、ｇｐ１２０．ｇｐ４１やこれらの一部
分に対する抗体の検出を基本としている）は診断やスク
リーニングの目的のために試料中のＨＩＶ−２の抗体検
出に使用することはできない。このようにＨＩＶ−２抗
原は特異性があるので、診断法や治療法をより効果的に
するには試薬中にＨＩＶ−１抗原と共にＨＩＶ−２抗原
をも含ませなければならない。

ＨＩＶ−２感染検出用に開発される方法は、通常、血液
、血清や血液製剤中のＨＩＶ−２抗原に対する抗体を検
出および定量することによってウィルス被曝を測ること
になろう。このようなアッセイによって、ＡＩＤＳやＡ
ＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）の診断、またＨＩＶ−２に
被曝した血液や血液製剤のスクリーニングを容易にする
ことができる。

）ＩＩＶ−２感染を診断したりＨＩＶ−２被曝血液をス
クリーニングしようとする最近の試みとして、検査試料
中のＨＩＶ−２の免疫学的成分に対する抗体の有無を検
出する酵素結合免疫吸収測定法（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　
；　Ｅｎｚｙ＋ｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ　）がある、他の方法として、検
査試料中のＨＩＶ−２特異抗体を検出するウェスタンブ
ロッティング法を使ってもよいだろう０通常、ラジオイ
ムノアッセイのような既存のイムノアッセイは殆どどれ
でも適用でき、特異試薬を用いさえすれば、）ＩＩＶ−
２及びその抗体の検出することができる。

これらのアッセイに使用する抗原供給源には、ＨＩＶ−
２感染Ｔ細胞から得られるＨＩＶ−２タンパクや組換Ｄ
ＮＡ技術により生産される抗原がある。しかしこれらの
供給源から得られた抗原を使用しようとするには重大な
障害が有る。

まず継代セルラインにおける１（ＩＶ−２産生自体が、
不運にもウィルスに曝されることになるかもしれない研
究者の危険を考慮して、ハイリスクな（Ｐ３レベル）実
験室内で行なわなければならないものである。さらに、
セルラインから得られるウィルスＨＩＶ−１抗原全体を
使ったＥＬＩＳＡテストでは数値が誤って高くでて偽陽
性を示したり、低くでて偽陰性を示したりすることが報
告されてきているから、細胞由来のＨＩＶ−２抗原を用
いて得られる結果は同じように信頼できないものになる
可能性がある。エレクトロプロットしたウィルス抗原全
体を用いてＨＩＶ−２を検出するウェスタンプロット分
析は、特異性が大きいが、ＥＬＩＳＡテストよりも実験
室的な手法でありまた時間がかかる。さらにまたＨＩＶ
−２産生細胞はヒト起原であるから、これらのセルライ
ンから得られるウィルス抗原調製物は、完全に精製しな
ければ、例えばＨＬＡ抗原のような正常細胞の抗原を夾
雑して含むことになり、ＥＬＩＳＡテストでは偽陰性反
応を引き起こすことになる。

セルラインからのウィルス抗原を完全に精製すればまた
、免疫学的に重要なタンパクの免疫原性が破壊されたり
、さもなくば抗原が不活化され、これらから作られた試
薬は偽陰性反応を示すことになると考えられる。また生
きたウィルス由来の抗原を用いた場合には、反応混合物
中の他の抗原や抗体の存在が反応をブロー、りするため
、抗体がその特異抗原と反応できないという立体障害が
生じ、このため偽陰性反応を示す可能性がある。

ＨＩＶ−２感染検出用のＥＬＩＳＡテストではまた、Ｈ
ＩＶ−２ゲノム部分のクローニングによりバクテリア内
で産生させた免疫学的に重要なウィルスタンパクを使用
することができよう、ＨＩＶ−２の完全ヌクレオチド配
列は現在報告されており（Ｇｕｙａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９Ｂ？）　３２６：６６２
−６６９　）　、同類体のＨＩＶ−１遺伝子との比較に
より種々のＨＩＶ−２タンパクをコードする逍仏子が同
定されている。ＨＩＶ−２のｅｎｖ遺伝子及びｇａｇ３
ｆｉ伝子によりそれぞれコードされているウィルスエン
ベロープ糖タンパク及びコアタンパクは、ＨＩＶ−２感
染患者血清中の抗体により認識できるもので、明らかな
抗原である。

ｇｐ１６０のような免疫学的に重要なＨＩＶ−２抗原及
びその分解産物であるｇＰ１２０とｇｐ４１は、ウィル
スのエンベロープに存在するものであり、細菌、酵母ま
たはワクチニアウィルスのような種々の発現系内でＨＩ
Ｖ−２ゲノム部分をクローニングすることにより調製す
ることができる。このような組換抗原は診断用として、
またＨＩＶ−１タンパク用になされてきているように有
効なワクチン混合物として用いることができよう（例え
ば、Ｇａｂｒａｄｉｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８Ｇ）４：１２８−１３３；
　Ｇｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（１９８５）　４：　９０５−９０９；　Ｐｕｔ
ｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）
　２３４：　１３９２−１３９５；　Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８６
）　４：　７９０−７９５を参照）しかじながら、組換
ＤＮＡ技術により生産されるＨＩＶ−２抗原は、ＨＩＶ
−２抗原調製物に夾雑する発現系の抗原と反応するいず
れかの抗体によりＥＬＩＳＡテストで誤って偽陽性反応
を示すことがないように、なお完全な精製をしなければ
ならない。

また精製過程でＨＩＶ−２抗原が変性すれば重要な抗原
活性は消失するかもしれない。

組換技術により生産されるＨＩＶ−２抗原はウィルス感
染細胞培養より得られる抗原よりも一層進歩したもので
あるが、この組換タンパクはできるだけ正確な診断を可
能にする試薬とは未だなっていない。このＡＩＤＳとい
う病気の特殊性を考慮すると、正確な診断結果が必要で
あるから、ＨＩＶ−２の診断が１００％正確に近く行な
える他の試薬を開発しなければならない。

タンパク抗原には、特異抗体の結合サイトを構成するタ
ンパク領域であるエピトープすなわち抗原決定基が多数
存在する。一般に、タンパク抗原は５〜１０個のエピト
ープを有し、そのそれぞれは６個から８個のアミノ酸の
配列を有している。

エピトープは、６〜８個のアミノ酸が線形配列で存在し
ている連続的なものでも、或いはこれらのアミノ酸がタ
ンパク質の３次元折畳み構造形成によってエピトープを
形成するような不連続なものでもどちらでも存在し得る
。たとえ一つのエピトープが比較的僅かのアミノ酸から
構成されているとしても、抗体への反応性はそのエピト
ープを取り囲むタンパクのアミノ酸によって影響を受け
ている。

タンパクの抗原部位すなわちエピトープの地図作製（マ
ツピング）を目的とする研究は、目的タンパクの多種多
様な領域に対応する合成ペプチドを用いることにより助
けられている（例えばＬｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　
ｒＴｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎａｌｏｇ
ｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅ：　Ａ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ　ＢｏｏｋＪ　（１９８３）Ｄｉｘｏｎ
、Ｆｉｓｈｅｒ共著、、ｐｐ、　３３１−３３８；　Ｌ
ｅｒｎｅｒ、＾ｄｖ。

１■ｕｎｏ１．　（１９８４）　３６：　１）。合成ペ
プチドはエピトープ地図作成の研究に有用なものである
が、これにもまして重要なことは、その合成ペプチドが
タンパク中の主たる抗原決定基を含むものであるなら、
その合成ペプチドは免疫原としての有効な組成物であり
ワクチンや診断試薬とできることである。合成ペプチド
抗原は特異抗体の産生及びその反応性に関して幾つかの
利点がある０合成ペプチドの実際の配列は、タンパクの
アミノ酸配列を実際に決定して得られたアミノ酸配列か
、またはタンパクをコードしているＤＮＡ配列から推定
したアミノ酸配列から選択することが出来る。このよう
にして特異的な合成ペプチドを用いれば、特異抗体の生
産や特異抗体のアッセイにおいて全長タンパクを使う必
要がない。さらにまたＭｅｒｒｉｆｉｅＩｄらの固相ペ
プチド合成法を用いれば、本質的に無限大量の目的合成
ペプチドを化学合成することができるようになる（参照
例；　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ　ａｎｄＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
　ｒＴｈｅ　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪ第３版（１９７６）第
２巻、第３章、Ａｃａｄｅｒｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、自動ペプチド合成装置を利用すれ
ばこのような技術はさらに進歩することになる。

ＨＩＶ−２の免疫学的重要なタンパクの領域に対応する
合成ペプチド抗原が有れば、診断やＨＩＶ−２に対する
有効なワクチンとして直ちに使用されるよう。

（発明の目的）本発明はこのような状況下なされたものであり、抗原性
ＨＩＶ−２タンパクに対応する新規合成ペプチドであっ
て、ＨＩＶ−２感染の診断、スクリーニング及びそのワ
クチン製造に高い信頼性、特異性で使用できるＩ（ＩＶ
−２感染検出用合成ペプチド抗原を提供することを第１
の目的とする。

また本発明はこの新規合成ペプチドを直接使用するＨＩ
Ｖ−２抗体検出方法を提供することを第２の目的とする
。

さらに本発明は、この新規合成ペプチドを含有するＨＩ
Ｖ−２抗体産生誘発組成物を提供することを第３の目的
とする。

さらにまた本発明はこの新規合成ペプチドを直接使用し
てＨＩＶ−２抗体産生誘発を可能にするＨＩＶ−２抗体
産生誘発方法を提供することを第４の目的とする。

（発明の構成）本発明のこのような第１の目的は、式％式％（式中、Ｘはペプチドの７ミノ末端ＮＨ２、ＸのＨ原子
、あるいはペプチドのアミン末端に結合する付加アミノ
酸であって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進す
るために選択された付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；
ＺはＯＨまたはＮｌ２である）で表わされる抗原性ペプ
チドにより達成される。

本発明の第２の目的は、該ペプチドに、試料中に存在す
るＨＩＶ−２抗体と前記ペプチドの間で免疫学的結合物
が形成される条件下で、試料を接触させ、抗原抗体結合
物の形成を測定して試料中のＨＩＶ−２抗体の存在を確
認するＨＩＶ−２抗体検出方法により達成される。

本発明の第３の目的は、免疫学的有効量の該ペプチドと
、生理学的許容量のキャリアとからなり、ヒトを含む動
物でのＨＩＶ−２抗体産生を誘発するＨＩＶ−２抗体産
生誘発組成物により達成される。

本発明の第４の目的は、免疫学的有効量の該ペプチドと
、生理学的許容量のキャリアとを投与して、ヒトを含む
動物体内でＨＩＶ−２抗体産生を誘発するＨＩＶ−２抗
体産生誘発方法により達成される。

すなわち本発明は、ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子でコードさ
れた糖タンパクｇｐ４１の一部分に対応する新規合成ペ
プチド抗原をここに見いだしたという知見に基づくもの
であり、このペプチドはＨＩＶ−２感染により潜伏患者
に引き起されるＡＩＤＳの診断や、血液や血液製剤のス
クリーニグについても信頼性、特異性の高いものとして
有用である。

本ペプチドは試料中の抗ＨＩＶ−２抗体検出法にも使用
することが出来る。まず試料を本ペプチド抗原と接触さ
せ、本ペプチドと試料中のＨＩＶ−２特異抗体との間で
抗原抗体複合物を形成させる。次いで適当な検出装置を
用いてこの複合物形成を測定すれば、試料中のＨＩＶ−
２抗体の有無がわかる。

本新規ペプチドはまた。ＨＩＶ−２感染を防ぐための免
疫ワクチン組成物の免疫原としても用いることができ、
ＨＩＶ−２抗原に対するＨＩＶ−２特異抗体の動物内で
の生産にも用いることができる。

（実施態様の説明）本発明はＨＩＶ−２の膜エンベロープ糖タンパクのｇｐ
４１領域に対応するペプチドであって。

ＨＩＶ−２陽性血清試料の対する免疫反応試験に用いら
れる合成ペプチドを提供するものである。

この新規ペプチドはＨＩＶ−２感染の診断や、ウィルス
被曝経験の有無を診断するテストに有用である。本発明
に含まれるペプチドはＨＩＶ−２特異抗体と反応する少
くとも１つの連続（線形）エピトープを含むアミノ酸配
列により構成されている。

このように本発明は、免疫学的反応性を有するペプチド
及びＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子でコードされたｇｐ４１領
域に対応するこのペプチドの抗原性に悪影響を与えるこ
となく機能的に同等な変異体（マａｒ　１ａｎｔｓ）を
含むものである。このペプチドは公知の固相ペプチド合
成法により合成された（例；　　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
　ａｎｄ　Ｂａ１ａｒ＋ｙ、　ｒＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ：Ａｎａ１７ｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙＪ　（１９８０）第１巻、第１章、　Ｇｒ
ｏｓｓ、Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ共著、　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　、元のタン
パクの配列に対応しない１〜２個のアミノ酸を本ペプチ
ドのアミノ末端あるいはカルボ午シ末端に付加して合成
を行なってもよい。このようなアミノ酸の付加により、
タンパクのペプチド、大きなキャリアタンパクや支持体
と、本ペプチドとを結合させることができる。こうした
目的のために有用なアミノ酸には、千ロジン、リジン、
グルタミン酸、アスパラギン酸、システィン及びこれら
の誘導体がある。

さらにタンパク修飾法により、例えばＮＨ２末端のアセ
チル化や、Ｃ０ＯＨ末端のアミド化などにより、本ペプ
チドが他のタンパクやペプチド分子あるいは支持体とカ
ップリングする手段を付加することも可能である。

新規ペプチド配列は下記の通りである。

Ｈ２−４１Ａ５Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｖａｌ−ＰｒＯ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｙ−
Ｚ。

式中、Ｘはペプチドのアミノ末端ＮＨ２基のＨ原子、あ
るいはペプチドの７ミノ末端に結合する付加アミノ酸で
あって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進するた
めに選択された付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；Ｚは
ＯＨまたはＮｌ２である。

ペプチドＨ２−４１Ａ５は、ｇｐ４１をコードするｅｎ
ｖ遺伝子領域にある塩基対（ｂｐ）７９０８〜７９７８
　（Ｇｕｙａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の番号による；Ｎａ
ｔｕｒｅ　（１９８７）　３２６：　６Ｇ２−６６９　
）を含むＨＩＶ−２ゲノムのヌクレオチド配列によりコ
ードされている。ペプチド）１２−４２Ａ５中のＸは水
素原子、ＹはＣｙＳ、そしてＺはＯＨであるのが特に好
ましい。

本ペプチドはＨＩＶ−２抗原あるいはＨＩＶ−２と会合
・結合している抗原に対する抗体検出方法に用いること
が出来る。試料中のＨＩＶ−２特異抗体の存在を検出す
るために本ペプチドを用いるこの方法では、本ペプチド
抗原と試料中のＨＩＶ−２抗体との間で抗原抗体結合物
（免疫学的結合物）を形成し得る条件下で、本ペプチド
を試料と接触させるのが望ましい、抗原抗体結合物がた
とえ僅かでも形成されれば、試料中にＨＩＶ−２抗体が
存在することがわかり、適当な手段によって検出・測定
できる。

このような方法として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）、ＥＬＩＳＡやウェスタンプロット分析法等のような
ホモジニアス（均一）あるいはへテロジニアス（不均一
）パインディングイムノアッセイがある。さらにこの新
規ペプチドを用いるアッセイプロトコルは競争的又は非
競争的結合方法によっても出来る。

本ペプチドはアッセイ方法に応じて標識物でラベルして
もよい、ペプチドに結合するラベルは公知のものを用い
ることができ、例えば、酵素、放射性アイソトープ、蛍
光色素、発色色素基質、コツアクタ、ビオチン／アビジ
ン、金コロイド、磁性粒子などがある。また本新規ペプ
チドを化学修飾すれば、公知手段によって、キャリアタ
ンパクやキャリアペプチドあるいは公知の支持体に結合
することができる。このような支持体としては例えば、
ポリスチレンやポリビニル製のマイクロタイタープレー
ト、ガラス管やガラスピーズ、また紙、セルロース、セ
ルロース誘導体やシリカのようなりロマトグラフィ用支
持体がある。

これら公知アッセイ法の内、特に患者血清や血液或いは
血液製剤などを大規模に臨床スクリーニングするには、
ＥＬＩＳＡまたはウェスタンプロット法が好適である。

上述のＨ２−４１Ａ５を用いたＥＬＩＳＡテストは、ヒ
ト細胞由来の、或いは組換ＤＮＡ由来のＨＩＶ−１タン
パク又はその抗原部位を用いて行なう最近の方法である
。これらのアッセイで試薬として使うためには、ペプチ
ドＨ２−４１Ａ５をマイクロタイターのウェルの内壁に
結合しておくのが便利である。このペプチドはマイクロ
タイターのウェルに直接結合することができるが、ウェ
ルにペプチドを最大に結合させるにはペプチド添加前に
ウェルをポリリジンで前処理しておくのがよいことがわ
かっている。

さらにペプチドＨ２−４１Ａ５をＢＳＡ　（牛血清アル
ブミン）などのキャリアタンパクに既知方法で共有結合
させ、得られた結合物をウェルのコートに用いてもよい
。通常、本ペプチドはｌＯ〜１０１００ＪＬ／ｍｌの濃
度でコーティングする。

次にＨＩＶ−２抗体検査用に供される試料が、このペプ
チドをコートしたウェルに滴下される。

試料内にＨＩＶ−２抗体が有れば、このウェル内で抗原
抗体結合物が形成されることになる。この際、信号発生
手段（ラベル）を加えて、結合物形成を検出しやすくし
ておいてもよい、試料がＨＩＶ−２特異抗体を含んでい
れば、ラベルの信号が出て検出できる。

本発明は以下の実施例によりより詳細に説明されるが、
このような実施例によって本発明の範囲は何等限定され
るものではない。

（実施例１）ペプチドＮ２−４１Ａ５バイオシステムズ社製ペプチドシンセサイザ、モデル４
３ＯＡを使用した．また合成にはＰ−メチルベンジルヒ
ドロアミン固相支持レジン（米国ケンタラキー州ルイズ
ビル、ペプタイズ拳インターナショナル社製）を用いた
．ペプチドＨ２−４　１Ａ５はｒＴｈｅ　Ｕｓｅｒｓ　
Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ　Ｊ　　（アプライ
ド・バイオシステムズ社１９８６）に従って合成した０
合成に使用したアミノ酸は全て、α−７ミノ基を保護マ
スクするｔ−ブチル−カルボニル基（ｔ−Ｂｏｃ）を有
するもので、スイス、ノババイオケムＡＧ社より得た。

アミノ酸の反応性側鎖は別の保ｙＪ基でマスクして不必
要で望ましくない側鎖反応が起きるのを防止した．ペプ
チドＮ２−４１Ａ５護基を有する各アミノ酸は、第１表に掲げられるものよ
り選んで使用した．なおりｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−
０）１，　Ｂｏａ−ＩＩｓ−ＯＨ　１／２Ｈ２０，　　
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣＩ−Ｚ）−０Ｈ（結晶）　、Ｂ
ｏｃ−Ｎｅｔ−ＯＨおよびＢｏａ−Ｔｙｒ−（２−Ｂｒ
−Ｚ）−０ＨはペプチドＮ２−４１Ａ５た。

第１表ペプチド合成に使用したアミノ酸Ｂｏｃ−Ａ　Ｉａ−ＯＨＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−０ＨＢｏｃ−Ａｓｎ−ＤＨＢｏｃ−Ｇ　Ｉｎ−０ＨＢＯＣ−１１［！−０Ｈ−　１／２Ｈ２０Ｂｏｃ−Ｎｅ
ｔ−ＯＨＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨＢｏｃ−Ｖａ　ｌ−０Ｈ２−Ｂｒ−Ｚ　　＝カルポベンゾキシブロミド合成完了
後、スカベンジャとして１０％アニソールと１０％ジメ
チルイオウとを混合した無水フッ化水素酸（Ｈ　Ｆ）で
０℃下処理することにより、合成ペプチドから保護基を
除去し、固相支持体レジンからこのペプチドを脱離させ
た．Ｎ２−４１Ａ５はシスティンを含むペプチドなので
、スカベンジャ（ＳＨ保護剤）として２％チオクレゾー
ルをさらに添加した。脱離後，試料中のＨＦをＮ２気流
下で除去し、ざらに０℃真空下に置いて残存ＨＦを完全
に除去した。このレジンをトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）処
理してペプチドを抽出した。ここで用いたＴＦＡは室温
下蒸発させて取り除いた。この後ペプチドを無水エーテ
ルで沈澱させ、さらに無水エーテルで洗浄した。

目的とするアッセイに用いる前に、必要なら、逆相高速
液体クロマトグラフィ（Ｈ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）により、この
ペプチドはさらに精製純化することができる．このよう
な精製に特に好適なカラムには、逆相Ｖｙｄｅｋ　　Ｃ
−１８　（商品名）カラムがあり、溶出液には水（ＴＦ
Ａ）−アセトニトリル（ＴＦＡ）グラデイエンドを用い
る。

（実施例２）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１ｓｎ−５
ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａ　１ａ−Ｐｈｅ−Ａ
　ｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａ　Ｉ　−Ｃｙｓ−Ｈ１ｓ−Ｔｈ
　ｒ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｐ　ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ
−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−ＯＨのアミノ酸配列のペプチドＨ２
−４１Ａ５を実施例１により合成し、ＥＬＩＳＡテスト
に使用してその免疫学反応性を′測定した。

１ｍｇ／ｍ１５度のポリリジンをマイクロタイタープレ
ートに滴下して、３０分間インキュベートした。ポリリ
ジンを捨て、１０〜１１００ｆｉＬ／ｍｌ濃度のペプチ
ドＨ２−４１Ａ５をプレートの各ウェルに加えて、コー
ティングした。ペプチドがウェルに結合するのに十分な
時間でウェル内でペプチドをインキュベートした後、ペ
プチド溶液を除去し、グルタルアルデヒド溶液を１５分
間添加してウェルに対するペプチドの付着を安定化させ
た。グルタルアルデヒド溶液を取り除き、各ウェルを緩
衝液で洗浄した。その後、グリシンと牛血清アルブミン
（Ｂ　Ｓ　Ａ）との混合溶液を各ウェルに加えてウェル
の非結合部位をブロックし、ＥＬＩＳＡアッセイ中に生
じる抗体の非特異的結合が最少限となるようにした。最
後の洗浄を行なった後、このマイクロタイタープレート
を使用に供した。

上記のように作製されたマイクロタイタープレートを用
いて公知ＥＬＩＳＡの簡便法を行なった。被検者より採
取した血清試料を、０．０５％ポリオキシエチレン−ソ
ルビタンモノラウリル酸（Ｔｗｅｅｎ２０）と１％ＢＳ
Ａとを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で１：５０
に希釈し、各ウェルに滴下して、３７℃、加湿雰囲気中
で９０分間インキュベートした。その後プレートより希
釈血清試料を取り除き、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。共役（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｄ）抗ヒトＩｇ抗体を各ウェルに加え、９０分間
インキュベートした。この共役抗ヒトＩｇ抗体はヤギま
たは家兎で産生されたもので、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、イ
ムノグロブリン短鎖あるいはこれらの混合物に対する特
異性を有するものである。望ましくは、アルカリフォス
ファターゼと共役（結合）した抗ヒトＩ　ｇＧ　（Ｄａ
ｋｏｐａｔｔｓより入手）を、使用時に０．０５％Ｔｗ
ｅ　ｅ　ｎ２０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：５００に
希釈したものをＥＬＩ　ＳＡに用いるのがよい。この共
役抗体をヒト抗体と結合反応するに十分な時間インキュ
ベートした後、プレートを上記と同様３回洗浄した。抗
原として用いられたペプチドＨ２−４１Ａ５と反応する
（すなわち陽性反応する）ヒト血清中の抗ＨＩＶ−２抗
体を検出するため、炭酸ナトリウム／ＭｇＣｌ２緩衝液
で溶解してｌｐＬｇ／ｍｌｅ度に調整した発色色素基質
たるアルカリフォスファターゼ基質（シグマ社製、カタ
ログ番号１０４、錠剤）を添加した。このアルカリフォ
スファターゼ基質は、抗ヒトＩｇＧに結合している酵素
によって開裂して、呈色物質を生じる。室温下約４０分
間インキュベート後、陽性反応を示し、試料中に抗原と
反応する抗体が存在することを示した。各ウェルが陽性
反応を示す黄色から　色、赤茶色は、分光光度計で４０
５ｎｍで読取り、その反応量を測定した０分光光度計の
読みはバックグラウンド反応の値を差引いて修正した。

ペプチドＨ２−４１Ａ５は、ＨＩＶ−２抗体陽性血清試
料６検体（スエーデン、ストックホルム、Ｓ　Ｂ　Ｌ　
、　　Ｇ、Ｂｉｂｅｒｆｅｌｔ博士より入手）、ＨＩＶ
−１抗体陽性血清試料１０検体、及びＨＩＶ−１、ＨＩ
Ｖ−２双方に陰性の血清試料６検体について、それぞれ
平行してＥＬＩＳＡテストが行なわれた。第２表に示す
ように、ＨＩＶ−２陽性確認済の血清試料６検体中６検
体とも（１００％）ペプチドＨ２−４１Ａ５と反応した
。また第２表で示されるように、ＨＩＶ−１陽性血清の
中にも及び陰性血清の中にもＨ２−４１Ａ５と反応する
ものはなかった。

第２表２３５８　　　　２．５０３Ｎ−３１，８７２Ｎ−１５２，３１１Ｎ−２０２，１３９Ｎ−２１２，１７０３０、６８４４０，０８４６０，０８９１００，０７９１１０，０９０１２０、０７６１７０，０７９１８０，１０９１９０，０８９３９４７８０，０８０３９４７９０、１０４３９４８１０，０７０３９４８２０，０３９３９４８３０，０７５＊ペプチドＨ２−４１Ａ５は１０ｇｇ／ｍｌＷ度でコー
トした。

以上の結論から明らかなように、ここて説明してきた新
規合成ペプチドＨ２−４１Ａ５は、ｅｎＶ遺伝子てコー
トされたＨＩＶ−２糖タンパクのｇｐ４１領域に対応す
るものであり、ＨＩＶ−２抗体の存在を検出する高感度
かつ特異的なアッセイに用いることかできる類の無い試
薬を提供するものである。

特許出願人　アンデルス　ヴアールネ（ばか４名）代　理　人　弁理士　山　　１）　文　雄（ほか１名）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の式の抗原性ペプチド；【遺伝子配列があります。】（式中、Ｘはペプチドのアミノ末端ＮＨ＿２基のＨ原子
、あるいはペプチドのアミノ末端に結合する付加アミノ
酸であって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進す
るために選択された付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；
ＺはＯＨまたはＮＨ＿２である）。
（２）前記抗原性ペプチドが、【遺伝子配列があります。】である特許請求の範囲第１項記載の抗原性ペプチド。
（３）式、【遺伝子配列があります。】（式中、Ｘはペプチドのアミノ末端ＮＨ＿２基のＨ原子
、あるいはペプチドのアミノ末端に結合する付加アミノ
酸であって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進す
るために選択された付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；
ＺはＯＨまたはＮＨ＿２である）で表わされる抗原性ペ
プチドに、試料中に存在するＨＩＶ−２抗体と前記ペプチドの間で
免疫学的結合物が形成される条件下で、試料を接触させ
、抗原抗体結合物の形成を測定して試料中のＨＩＶ−２抗
体の存在を確認するＨＩＶ−２抗体検出方法。
（４）前記抗原性ペプチドが、【遺伝子配列があります。】である特許請求の範囲第３項記載のＨＩＶ−２抗体検出
方法。
（５）式、【遺伝子配列があります。】（ここでＸはペプチドのアミノ末端ＮＨ＿２基のＨ原子
、あるいはペプチドのアミノ末端に結合する付加アミノ
酸であって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進す
る付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；ＺはＯＨまたはＮ
Ｈ＿２である）で表わされる免疫学的有効量の抗原性ペ
プチドと、生理学的許容量のキャリアとからなり、ヒト
を含む動物でのＨＩＶ−２抗体産生を誘発するＨＩＶ−
２抗体産生誘発組成物。
（６）前記抗原性ペプチドが、【遺伝子配列があります。】である特許請求の範囲第５項記載のＨＩＶ−２抗体産生
誘発組成物。
（７）式、【遺伝子配列があります。】（ここでＸはペプチドのアミノ末端ＮＨ＿２基のＨ原子
、あるいはペプチドのアミノ末端に結合する付加アミノ
酸であって、キャリア蛋白へのペプチドの結合を促進す
る付加アミノ酸；Ｙは無しかＣｙｓ；ＺはＯＨまたはＮ
Ｈ＿２である）で表わされる免疫学的有効量の抗原性ペ
プチドと、生理学的許容量のキャリアとを投与して、ヒ
トを含む動物体内でＨＩＶ−２抗体産生を誘発するＨＩ
Ｖ−２抗体産生誘発方法。
（８）前記抗原性ペプチドが、【遺伝子配列があります。】である特許請求の範囲第７項記載のＨＩＶ−２抗体産生
誘発方法。