JPH01156998A - 血清担体タンパク質との結合力が減少しているヒトインスリン様成長因子類以体及び酵母におけるそれらの産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン分子断片のＩＧＦ−Ｉへの組み込みは、２
本鎖ジスルフィド結合インシュリン様構造体として、既
に試みがなされている。これらの分子はＩＧＦ−１に関
しては、その生物学的活性がかなり減少しているが、ｉ
ｎ　ｖｉｖｏにおける有効性はほとんど示さないその様
な化合物でも、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける活性を有意に
示している。血清担体タンパク質との結合能はまだ持っ
ている。ジョシイ（Ｊｏｓｈｉ）等、バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）　、第２４巻：第
４２０８−４２頁、（１９８５）；デブローデ（ＤｅＶ
ｒｏｅｄｅ）等、ブロク、ナトアカド、サイ、ニー、ニ
ス、ニー、　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
。

Ｕ、Ｓ、＾、）、第８２巻：第３０１０−１４頁（１９
８５）　；及びジョシイ　（Ｊｏｓｈｉ）等、バイオケ
ム、アンド。

バイオフィシ、レス、コム、　　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａ
ｎｄ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ５＋、）、第１３３巻
：第４２３頁−第４２９頁（１９８５）を参照。本発明
中に記載されているＩＧＦ−１類似体は一本鎖ＩＧＦ−
１様分子として産生され■型のＩＧＦレセプターにおい
てＩＧＦ−■と同等のポテンシーを持ち、ｉｎ　ｖｉν
０有効性に対する十分なポテンシャルをその様な類似体
は示しているが血清タンパク結合能力はもはやほとんど
有していない。

ヒトインシュリン様成長因子Ｉ　　（ｈＩＧＦ−１、ソ
マトメジンＣとも呼ばれている）はヒト血清中より精製
されてくる７０個のアミノ酸より成るタンパク質である
。この物質は成長ホルモンの多数の効果を仲介する物と
して知られている。特に下垂体切除したラットにおける
成長刺激が実証されている。更に、ＩＧＦ−１は種々の
細胞タイプにおける細胞増殖及び分化を増進させる事も
示されている。

ヒトＩＧＦ−Ｉはそのアミノ酸配列において、インシュ
リンとすぐれたホモロジーのある事を示している。この
ホモロジーはｈＩＧＦ−１に対するコンピューターによ
る立体構造モデルを基礎にしている。

〔ブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌ　１）等、ブロク、ナト
ル。

アカド、サイ、ニー、ニス、ニー、　　（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　）　、第７５巻：第
１８０頁−第１８４頁（１９７８）及びプランデル（Ｂ
ｌｕｎｄｅ８）等、フェト、ブロク、ツム。ツク、エク
スプ、パイオル、　　（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、Ａｍ、Ｓｏ
ｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、）、第４２巻：第２５９２頁−
第２５９７頁（１９８３）］。

このモデルより、インシュリンレセプターに結合するｈ
ＩＧＦ−１の能力として説明されるインシュリンレセプ
ター結合領域の一部分がＩＧＦ−Ｉ分子の中に保存され
ている事が予測される。また、血清担体タンパク質の結
合に対応する、ｈＩＧＦ−１分子中の領域も示唆してい
る。

ｈＩＧＦ４とインシュリンの大きな違いの一つは、正常
ヒト血液中において、９９％以上のＩＧＦ−１が血清担
体タンパク質と結合し、毛細管障壁を容易には通過でき
なくなってしまうことである。そして血清中のＩＧＦの
大部分が不活性な物になってしまう。ＩＧＦと担体タン
パク質との複合物質の生理学的な重要性というものは不
明である。血清結合タンパク質の存在は、外来性因子と
して投与されたＩＧＦ−Ｉの生物活性あるいは生物学的
利用能力に対する妨げとなるものである。

ＩＧＦ−Ｉの生物活性における血清結合タンパク質の研
究は、重要な生物活性物質の発見という可能性に導びく
ものである。我々は、Ｉ型レセプターに対する有効的な
結合力を保ち、血清担体タンパク質に対する結合力を減
少したＩＧＦ−Ｉ類似体の一つを考案する事より始めた
。インシュリンは血清担体タンパク質には結合しないと
いう所見を基にしてこの類似体をデザインした。合成イ
ンシュリン様２本鎖類似体の実験結果は、担体タンパク
質結合に対応するＩＧＦ−Ｉのアミノ酸はＩＧＦ−Ｉの
Ｂ　ｉｎ域にある事を示唆している。それにより、ｈＩ
ＧＦ−１の最初の１６個のアミノ酸をヒトインシュリン
Ｂ鎖の最初の１７個のアミノ酸に置き換えたところのＩ
ＧＦ−１類似体としてコードするヒトＩＧＦ−１につい
ての合成遺伝子を作成した。この合成遺伝子を酵母組み
換えＤＮＡ発現システムの中で操作し、この改良酵母細
胞により産生じてくるペプチド類似体をそこより抽出し
、精製する。更に、それ以上の類似体誘導の為にＩＧＦ
−Ｉ分子に改良を加え、本質的なＩＧＦ−１と夏型レセ
プター結合能を持ち血清担体タンパク質との結合の減少
した物質を得る。

よって、本発明の目的の一つは、ＩＧＦ−Ｉ　［（Ｕ体
をコードしている合成遺伝子の製造を記載し、及び微生
物にその様な遺伝子の組み込みを記載することにある。

他の目的は遺伝子的に改良された微生物の培養よりＩＧ
Ｆ−Ｉ　ＷＪ似体を製造することを記載することである
。本発明のさらに他の目的はその様に製造されたＩＧＦ
−１の性質及び有用性を記載することである。更に他の
目的は以下の説明書を読むことによって明らかになるで
あろう。

我々はヒトＩＧＦ−１の７１個のアミノ６１類似体をコ
ードしている合成遺伝子を発現した。この類似体、ＩＧ
Ｆ　１３２はｈＩＧＦ−Ｉの最初の１６個のアミノ酸に
代わりにヒトインシュリンＢ鎖の最初の１７個のアミノ
酸を保有するものである。この類似体は正常ヒトＩＧＦ
−Ｉに比較してＩ型ＩＧＦ　レセプターに対してほとん
ど同等の親和性を示すものである（第６図）。しかし、
類似体ＩＧＦ　１３２はヒト及びラットの両血清担体タ
ンパク質に対する結合力が非常に減少していた（第７図
及び第８図）。よってこの新規タンパク質は■型ＩＧＰ
レセプクーにおける、はとんど完全なる活性を持ち、血
清中コンポーネントには結合しないものであるとされる
。

そして、正常ＩＧＦ−Ｉに比らべてもｉｎ　ｖｉｖｏに
おける能力がより高いと、この類似体は期待されるもの
である。３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成刺激においても
この類似体は正常ＩＧＦ−１より１０倍以上の能力を示
した（第９図）。

本発明の合成遺伝子はヒトインシュリン様成長因子（ｈ
ＩＧＦ−１）の類似体であり以下に定義されてている構
成アミノ酸の文字表記で示されている構造をもつ、一つ
のペプチドをコードしている：へ＋−Ａｚ−Ａ３−Ａ４
−ＬＣＧ−Ａｓ−Ａｉ−ＬＶ−Ａｔ−ＡＬ−Ａｓ−Ａｑ
−Ｒ式中： Ａ１はＧ、Ｖ、あるいはＦＶ； Ａ２はＰあるいはＮ； Ａ、はＥあるいはＱ； Ａ４はＴＳＨあるいはＡ； Ａ５はＡあるいはＳ； Ａ、はＥあるいはＨ； Ａ７はＤあるいはＥ； Ａ７はＱあるいはＹ； Ａ５はＦあるいはＬ；及び ＲはｈＩＧＦ−１ペプチドの残りの５４個のアミノ酸よ
りなり、 ＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ
ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＩＩＬ聞ＹＣＡＰＩＪＰ
ＡＫＳＡと示されそして以下の遺伝子は除外しである： ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦ−Ｒ、：、れは野生
型ｈＩＧＦ−Ｉテあり前述の定義より除外されている。

明快さをきすために、−船釣に当業者において知られて
いる、アミノ酸文字表記を使用し、ここにおいて使用し
ている定義を以下に示す：Ａ−アラニン Ｃ−システィン Ｄ−アスパラギン酸 Ｅ−グルタミン酸 Ｆ−フェニルアラニン Ｇ−グリシン Ｈ−ヒスチジン ■−イソロイシン に−リジン Ｌ−ロイシン Ｍ−メチオニン Ｎ−アスパラギン Ｐ−プロリン Ｑ−グルタミン Ｒ−アルギニン Ｓ−セリン Ｔ−スレオニン ■−バリン Ｙ−チロシン 前述ペプチド類似体としての好ましいノくリエーション
として以下に示す： ＡＩはＧ、Ｖ、あるいはＦＶ； Ａ２はＰあるいはＮ； Ａ７はＱ； Ａ４はＡ； Ａ、はＡあるいはＳ； Ａ６はＥあるいはＨ； Ａ７はＤあるいはＥ； Ａ、はＹ；及び Ａ５はし。

更に、その様な合成物質の特別な例を以下に示す： ＦＶＮＱＩＩＬＣＧＳＩＩＬＶＥＡＬＹＬ−Ｒ（合成物
質ＡあるいはＩＧＦ　１３２） ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬ−Ｒ（合成物質Ｂあ
るいはＩＧＦ　１２２） ＧＰＱＡＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬ叶−Ｒ（合成物質Ｃある
いはＩＧＦ　１３０） Ｇｌ’ＱＡＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬ−Ｒ（合成物質り
あるいはＩＧＦ　２５２） ＶＮ口ＩＩＬｃＧｓＨＬＶＧＡＬＹＬ−Ｒペプチド類似
体は、天然、ｈＩＧＦ−１ペプチド製造に用いられる同
様の方法及び当業者にとって公知の方法でそれらを改良
した方法により産生されうる物である。特にヒトＩＧＦ
−１において使用される過程により、これら類似体が化
学的に合成されるであろう。サー（Ｌｉ）等、ブロク、
ナトル、アカド、サイ、ニー、ニス、ニー、　　（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）　、第８０巻：第２２１６頁−
第２２２０頁（１９８３）の実施例を参照。本発明に従
かいＩＧＦ−Ｉ類似体は以下の方法によっても産生され
るものである。つまりＩＧＦ−Ｔ類似体を直接的に発現
しうるＤＮＡ配列を含む組み換えプラスミドで適切な細
菌、酵母あるいは組織培養細胞などの宿主へのトランス
ホーメーションによる。Ｄ　Ｎ　Ａ　配列は合成的、染
色体的に組み換えＤＮＡ技術あるいはそれらの併用によ
り調製させる。ＩＧＦ−Ｉ　類似体を直接的に発現しう
るＤＮＡ配列は内在性の物としてＩＧＦ−Ｉ　類似体を
産生ずるトランスジェニックな動物を作り出すものとし
て、生殖細胞系動物あるいは染色体外的に誘導される事
もある。

本発明の合成遺伝子は当業者において公知の技術とされ
ている組み換えＤＮＡバイオテクノロジーの使用により
製造されている。第１図はプラスミドｐα２と本発明の
合成遺伝子を含むｐｈＩＧＦとの結合の段階を概説する
ものである。

本合成遺伝子は本質的な活性をもち、しかも明らかに血
清タンパク質と結合しないという事より、モルあるいは
質量を基にした取り込みに関して野生型ｒＧＦ−Ｉより
もかなり高い活性を示すところの活性レベルをもったｈ
ＩＧＦ−１類似体を産生ずる。よって本合成物は動物に
おける、特に牛の様な反力動物におけるミルクの産生を
増大し、効率をよくする為の因子として高い活性を持つ
ものである。

更に本合成物は、食肉用動物において、体重の増加を促
進し、飼料の効率を良くし、及び生肉としての品質を高
める為の成長増進因子としても有効に利用しうるちので
ある。更にその他の有効的利用として本合成物は負傷か
らの回復、及び赤血球造血（赤血球を産生ずる）を刺激
するという因子として利用される。

ミルクの産生増大あるいは動物成長増進として使用する
場合は、本合成物を皮下、筋肉あるいは静脈内注射また
は、継続的皮下注入法など非経口的ルートにより投与す
る。皮下、筋肉及び静脈内注射の場合には、本活性成分
を水溶性担体剤中に溶解あるいは分散する。非経口投与
において、活性物質は許容賦形剤、好ましくは植物油た
とえばビーナツツ油、綿実油あるいは類似の油など、と
適当に混合されるものである。その他の賦形剤としては
有機的に製造されるものとして、ソルケクール、グリセ
ロール、ホルマール及び水性非経口的調剤となるものな
ども使用される。活性合成物及びそれらの合成物などは
投与に際して非経口的調剤として溶解あるいは懸濁され
、それら調剤は一般的に活性合成物の重量においてＯ，
ＯＯ５から５％含むものである。

本合成物は動物体重１　ｋｇにつき０．１から１００■
のレベルで投与した時、ミルク産生のレベル増大あるい
は体重増加率あるいは飼料効率などに十分の効果がみら
れ、しかも１から１０■／ｋｇが好ましい。本合成物を
皮下注入としての形態をとって投与する時には、合成物
を当業者において知られている様にゆっ（りと懸濁ある
いは溶解させて分散物質とし、あるいは浸透圧ポンプの
ような一定推進力を用いたゆっくりと活性物質を注入す
る装置を使用して投与する。その場合、活性物質の注入
量は０．１から１０ａｖ／ｋｇ／日で、２０日から１２
０日以上の期間に及び一定した投与が可能となる。

ｈＩＧＦ−１ｍ似体は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
あるいは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などの他の受容
能力因子と共同的に作用し、ＤＮＡ合成及びヒト線維芽
細胞の細胞複製を刺激するので、この様な類似体は、特
に内在性ｈＩＧＦレベルの低下している場合などの傷病
回復の促進にも効果的である。

よって本発明のＩＧＦ−１類似体はＰＤＧＦあるいはＦ
ＧＦなどと併用投与されることもある。この混合物もや
はり上記記載の様な薬理的に許容されうる非経口的調剤
成分使用により皮下、筋肉あるいは静脈内による非経口
的ルートで投与される。この混合物はＯ，ｌから１００
■／ｋｇの容量で投与されるものであり、好ましくは１
から１０■／　ｋｇである。

しかしながら、傷病回復促進の為に使用するのならば、
この混合物は局所的に投与されるのが好ましい。局所投
与として代表的な形態としては、水溶液、ペースト、軟
膏及びスプレー剤などがある。

これらの調剤は傷口に適用する外傷用医薬材料中に組み
入れられたりもする。外傷用医薬材料とは治療の必要の
ある部分にその様な合成物をゆっくりとかつ直接的に放
出する物のことである。

本合成物は大部分の調剤において０．３から３％を必要
としているがＯ，ＯＯ３から１０重量％の間の濃度で局
所的調剤中に組み入れられるものである。濃度は特定の
日における複数投与に対して許容されうる量として活性
合成物の一日の投与量を０．０６から２■として富周整
される。

本発明の合成物は、後期赤血球前駆体分化を刺激すると
いう能力のあることから、おそらく赤血球造血因子とし
ても有効利用されるであろう。その様な場合、合成物は
上記記載と同様に非経口的に投与される。そして、赤血
球産生促進の為に、その合成物は華独あるいは、エリト
ロポエチンとの併用によって投与されるであろう。そし
て使用に際しては、その合成物の投与量を０．１から１
００ｍｇ／　ｋｇ、好ましくは１から１０■／ｋｇとす
る。投与量は一日における量をもとにしてあり、必要が
あれば、その投与量を小分けして一日に数回投与しても
よい。

ここに本発明を更に記述し説明する為の図を添えておく
。

第１図はプラスミドｐα２及びプラスミドρｈＩＧＦの
選択的開裂及び組み換えによる、組み換え体プラスミド
ｐα２１ＧＰ　１３２の調製を示したものである。この
プラスミドはヒトＩＧＦ−１の７１個のアミノ酸類似体
をコードしているものである。

第２Ａ図はプラスミドｐＪＹ１のＮｄｅｌ　／　Ｂｓ　
ｔＥ　１１部位における置換遺伝子断片を示したちので
る。置換断片は４つのオリゴヌクレオチド、ＩＧＦ　１
３２、ＩＧＦ　１３３　、ＩＧＦ　１３４及びＴＧＦ　
１３５をライゲーションにより順次形成されたものであ
る。

第３Ａ図はライゲーションによりプラスミドｐα２１Ｇ
Ｆ　１３２に組み込まれたＤＮＡ遺伝子配列及びそれが
コードしているアナログを示すものである。

第３Ｂ図、第３Ｃ図及び第３Ｄ図も同様にそれぞれＩＧ
Ｆ　１２２　、ＩＧＦ　１３０及びＩＧＦ　２５２に対
するＤＮＡ遺伝子配列及びそのアナログを示すものであ
る。

第４図はアナログＩＧＦ　１３２のバイオゲルＰＩＯゲ
ル濾過カラムにおける溶出様式を示すものである。

第５図はＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ　１２２
）、ｃ（ｒｃｐ　＋３０）及びＤ　（ＴＧＦ　２５２）
のバイオゲルＰＩＯによる活性ピークの精製を高速液体
クロマトグラフィーで行なったことを示すものである。

第６図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ
　１２２）、Ｃ（ＩＧＦ　１３０）及びＤ　（ＩＧＦ　
２５２）の■型ＩＧＦレセプターに対する結合力を野生
型組み換え体ｈＩＧＦ−１を対照に示したものである。

図中、アナログＡは“○″Ｂは“◇”Ｃは“◆”、及び
Ｄは“ム”、また野生型ＩＧＦ−Ｉは“・２としてそれ
ぞれ表示されている。

第７図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ
　１２２）、Ｃ（ＩＧ；＋　１３０）及びＤ　（ＩＧＦ
　２５２）のヒト血清担体タンパク質に対する結合力を
野生型ｈＩＧＦ−１を対照に示したものである。ｈＩＧ
Ｆ−１は血清担体タンパク質に強く結合するがアナログ
ＩＧＦ　１３２及びＩＧＦ　２５２の結合は非常に弱い
。この図中においても、第６図と同様の表示が用いられ
ている。

第８図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）及びｈＩＧＦ−
１のラット血清中における本来の結合タンパク質に対す
る結合力を示したものである。ｈ−ＩＧＦ−１は飽和的
に結合しているが、アナログＡ　（ＴＧＦ　１３２）の
結合は観察されなかった。

第９図はＩＧＦ−Ｉ　、アナログＡ（ＩＧＦ　１３２）
及びＤ　（ＩＧＦ　２５２）の生物学的活性を３７３細
胞中におけるＤＮＡ合成の刺激に対する能力で比較した
ことを示すものである。アナログ人及びＤは野生型ｒＧ
Ｆ−１よりも１０倍以上高い能力を持っていた。

第１０図はＩＧＦ−■及びＩＧＦ　２５２のｉｎ　ｖｉ
ｖｏにおけるラット横隔膜でのグリコーゲン合成の刺激
あるいはラット脂肪ｍ織での脂質合成の刺激に対する能
力を比較し示したものである。　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけ
るグリコーゲン合成刺激はＩＧＦ　２５２のほうがｒＧ
Ｆ−Ｔよりも、少なくとも２倍以上その能力が高かった
嗜　用いた容量においては、ＩＣＦ−Ｉ及びＩＧＦ　２
５２　、両者とも脂質合成に対する刺激が見られなかっ
た。

ｈＩＧＦ−１の７０個のアミノ酸をコードしている合成
遺伝子を組み立てｐＢＲ３２２でクローン化してプラス
ミドｐｈＩＧＦを作製した。第１図に示されている様に
プラスミドｐｈＩＧＦを改良してプラスミドｐＪＹ１を
作製。４つのオリゴヌクレオチド：ＩＧＦ　　１３２　
−５　’　　ＴＡＴＧ　　ＣＣＧＣＡＴＣＣＴＴ　　Ｔ
ＣＣＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡＡＧＡ　　ＴＴＴ　　
ＧＴＡ　　ＡＡＣＣＡＡ　　ＧＡＴ３　’　　；　　Ｉ
ＧＦ１３３−５　’　　ＡＣＡ　　ＣＡＡＡＴＧ　　Ｔ
ＴＧ　　ＧＴＴ　　ＴＡＣＡＡＡ　　ＴＣＴ　　ＴＴＴ
　　ＡＴＣＣＡＡ　　ＧＧＡ　　ＡＡＧＧＡＴ　　ＣＣ
Ｇ　　ＧＣＡ３　’　　ｉ　　　ＩＧＦ１３４−５　’
　　ＴＴＧ　　ＴＧＴ　　ＧＧＣＴＣＣＣＡＴ　　ＣＴ
Ｇ　　ＧＴＴ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　ＴＴＧ　　ＴＡ
ＣＴＴＧ　　ＧＴＴ　　ＴＧＣＧ３　　’　　；及びＩ
ＧＦ　１３５−５　’　ＧＴＣＡＣＣＧＣＡ　ＡＡＣＣ
ＡＡ　ＧＴＡ　ＣＡＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＡＴ
Ｇ　ＧＧＡ　ＣＣＧ３　’をライゲーションしてＮｄｅ
　Ｉ　／　Ｂｓ　ｔｆ！　ＩＩ置換断片とする（第２図
）。

この断片をエンドヌクレアーゼＮｄｅ　Ｉ及び／Ｂｓｔ
ＥＩｒで切断した、ｐＪＹｌへ挿入する。このライゲー
ション混合液で大腸菌をトランスホームしプラスミドｐ
ＪＹ　１３２を持った細菌を産生ずる。ＤＮＡ配列及び
それがコードしているアナログＩＧＦを第３Ａ図中に示
した。

アナログＴＧＦ　１３２の プラスミドｐＪＹ　１３２由来のＢａ８１８ｌによるｒ
’ＧＦ１３２遺伝子力セン遺伝筆力セントされている様
にｐα２のＢａｍ１１１部位でライゲーションする。

ｐα２において正方向にＩＧＦ　１３２を含むプラスミ
ドはｐα２１ＧＦ　１３２として表示される。このプラ
スミドを酵母のＢＪ１９９５株に導入する。ｐα２１Ｇ
Ｆ１３２プラスミドを有する酵母株はタンパク質ＩＧＦ
１３２をその培養液中に分泌する。

゛異株によるｈＩＧＦ　Ｉペプチドの発　　び精製サツ
カロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＪ１９９５　（α接合型、Ｉ
ｅｕ２、ｔｒｐｌ、ｕｒａ３、ｐｒｂｌ−１１２２、ｐ
ｅｐ４−３、ａｉｒ）を適切な発現用プラスミドでトラ
ンスホームし、ロイシンマイナスのプレートを用いて選
択する。細胞は５Ｘｌｅｕ（−）培地、ｐ１１４．８、
アミノ酸及び硫酸アンモニウムではなく、０．８５％の
イーストニトロジェンベースヲ含み、４％グルコース、
１％硫酸アンモニウム、０．６％水酸化ナトリウム、０
．０３％Ｌ−イソロイシン、０．０３％し一フェニルア
ラニン、０．０２５％Ｌ−チロシン、０．０２％Ｌ−リ
ジン、０．０２％Ｌ−トリプトファン、０．０２％ウラ
シル、０．０２％アデニン、０．０１％Ｌ−アルギニン
、０．０５％メチオニン、ｏ、　ｏ　ｏ　ｓ％Ｌ−ヒス
チジン、２９μＭ塩化鉄、２５μＭ硫酸亜鉛、及び１％
コハク酸を更に追加した１１培地中で飽和増殖させる。

細胞を３０００ｘｇの遠心により除去し上清を１％コハ
ク酸、ｐＨ４，８で平衡しておいたＬｏｇのバイオレッ
クス（ＢｉｏＲｅｘ）　　７０と混ぜる。４℃で３時間
攪拌した後、レジンを２．５３のカラムに充填する。そ
して１％コハク酸、ｐｌ＋　４．８．１１で洗浄する。

ペプチドは１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８で溶出して（
る。レセプター活性物質を集め、４ｍ１ｌにまで濃縮し
、更にＩＮ酢酸で平衡しておいた２、５Ｘ９０Ｃ１１バ
イオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ　１０（２００−４００
メツシユ）カラムにかける。ゲル濾過は１時間に３０ｍ
ｊ！の割合で行なう。１２ｍ１ｌの分画液に対してラジ
オレセプターアッセイによりＩＧＦ様活性を測定した。

活性分画部分を集め凍結乾燥した。活性物質を０．２ｍ
ｌ！の０．０５％トリフルオロ酢酸、１５％アセトニト
リルに再溶解させ、Ｃｌ１ｌ　μボンダバック（ｐ　Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ）（０，４６Ｘ　２５ｃｍ、１０ミクロ
ン、ウォターズ）逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムにかける
。ペプチドを０．０５％トリフルオロ酢酸中において１
ｓ−ｓｏ％のアセトニトリル濃度勾配を用いてカラムよ
り溶出させる。

流速は１分間で１　ｔｅｌ、１分間ごとに分画していき
それぞれレセプターアッセイにより測定する。

活性分画部分を集め、凍結乾燥した。精製ペプチドをア
ミノ酸分析により定量し、０．　Ｉ　Ｎ酢酸で０．１ｍ
Ｍの濃度に調製し、−２０℃に保存する。

匹り皿里体少竺立 定量的アミノ酸分析を行ない精製アナログの濃度を測定
する。アミノ酸組成はアナログとして期待しているもの
と一致している。アナログの■型ＩＧＦレセプターに対
する結合力を第６図に示した。

”５ｌ−ＩＧＦ−１のヒト胎盤膜に対する結合阻止は野
生型組み換えｈｌＧ＋’−１がＩＣ５ｏ、５．６ｏＭに
対してアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ　
１２２）　、Ｃ（ＩＧＦ　１３０）、及びＤ　（ＩＧＦ
　２５２）ではそれぞれ、ＩＣ５，で１２ｎＭ。

４．５ｏＭ、５．３ｏＭ、及び５．０ｏＭであった。ア
ナログ１３２のヒト血清担体タンパク質に対する結合力
を第７図に示した。組み換え野生型ｈＩＧＦ−ＩはＩＣ
５ｏが０．４２ｎＭで’　”Ｉ−ｈＩＧＦ−１の酸安定
性ヒト担体タンパク質に対する結合を阻止したがアナロ
グＩＧＦ　１３２ではＩＣ５ｏが１１０００ｏ以上にお
いても、この結合を阻止する能力のほとんどない事を示
している。又、ＩＧＦ　１３０　、ＩＧＦ　１２２及び
ＩＧＦ２５２では、それぞれ、ＩＣ５ｏで１．８ｏＭ、
２．１ｏＭ及び３００ｏＭで結合を阻止した。

１２５■標識したアナログＩＧＦ　１３２の正常ラット
血清中の物質に対する結合能力を追跡調査した。

”’Ｉ−ＩＧＦあるいは”’Ｉ−ＩＧＦ　１３２を血清
とのブレインキュベーションなしにクロマトグラフィー
にかけると、放射活性物質は？、　５　Ｋ　Ｄペプチド
と期待しうる位置に幅広く溶出されてくる（第８Ａ図）
。

ラット血清とＩｔ’Ｉ−ＩＧＦとのインキュベーション
後における放射活性物質の溶出ピークは１５０ＫＤタン
パク質と期待しうる位置に出現してきており、遊離Ｉ　
Ｚ　！Ｉ　■−αＴＧＦピークとしての放射活性物質は
減少している（第８Ｂ図（・））。１５０ＫＤ物質に結
合した１２５■−αＩＧＦはインキュベーションした［
８”’Ｉ−ＩＧＦ−１１の３６％±５％に相当する。

１μｇの非標識ＩＧＦの存在下でインキュベーションを
行なうと、ただ一つの放射性活性物質のピークが見られ
るのみで、これは非結合Ｉ２’Ｉ−ＴＧＦに相当する（
第８図（○））。よってこのアッセイの条件下において
は、ラット血清からの１５０ＫＤ物質に対する＋２’Ｉ
−ＩＧＦの結合は飽和されている。

ラット血清と”’Ｉ−ＩＧＦ　１３２とのインキュベー
ション後においては、唯一遊離放射活性ペプチドが溶出
されただけである（第８Ｃ図（・））。インキュベーシ
ョン中に１μｇの非標識ＴＧＦ　１３２を加えたとして
も、放射活性物質の溶出様式にはこれといった意味のあ
る変化はみうけられなかった（第８Ｃ図（○））。

ＩＧＦ−Ｉはマウス３Ｔ３細胞中でＤＮＡ合成を刺激す
る。第９図において示しである様に、野生型ＩＧＦ−Ｉ
よりも、約１０倍以上の高い能力をもって、ＩＧＦ　２
５２及びＩＧＦ　１３２はそれら細胞中でのＤＮＡ合成
を刺激する。ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるラット横隔膜での
グリコーゲンに対するｌ４Ｃ−グルコースの取り込みを
ＩＧＦ−１は刺激する。この過程は■型ＩＧＦレセプタ
ーにより仲介される。第１０図に示されている様に、Ａ
部分においてＩＧＦ　２５２は、野生型ＩＧＦ−Ｉより
も少なくとも２倍以上能力が高い。期待していた通り、
脂肪組織の脂質に対する１４ｃｍグルコースの取り込み
は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ　２５２の両者によっては刺
激されなかった。脂肪組織は■型ＩＧＦレセプターを保
有していない。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐα２及びプラスミドｐｈＩｃＦの
選択的開裂及び組み換えによる、組み換え体プラスミド
ｐα２１ＧＦ　１３２の調製を示した図である。 第２Ａ図はプラスミドｐＪＹ１のＮｄｅ　Ｉ　／　Ｂｓ
　ｔＥ　１１部位における置換遺伝子断片を示した図で
ある。 第３Ａ図はライゲーションによりプラスミドｐα２１Ｇ
Ｆ　１３２に組み込まれたＤＮＡ遺伝子配列及びそれが
コードしているアナログを示す図である。 第３Ｂ図、第３Ｃ図及び第３Ｄ図も同様にそれぞれＩＧ
Ｆ　１２２　、ＴＧＦ　１３０及びＩＧＦ　２５２に対
するＤＮＡ遺伝子配列及びそのアナログを示す図である
。 第４図はアナログＩＧＦ　１３２のバイオゲルＰＩＯゲ
ル濾過カラムにおける溶出様式を示す図である。 第５図はＡ　（ｒＧＦ　１３２）、Ｂ　（ＩＧＦ　１２
２）、ｃｏｃｐ　ｔ３０）及び［３（ＩＧＦ　２５２）
　（ＤバイオゲルＰｌＯによる活性ピークの精製を高速
液体クロマトグラフィーで行なったことを示す図である
。 第６図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ
　１２２）、Ｃ（ＩＧＦ　１３０）及びＤ　（ＩＧＦ　
２５２）の■型ＩＧＦレセプターに対する結合力を野生
型組み換え体ｈＩＧＦ−１を対照に示した図である。 第７図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）　、Ｂ（ＩＧＦ
　１２２）、Ｃ（ＩＧＦ　１３０）　、及びＤ　（ＩＧ
Ｆ、、、、ｌ！５２）のヒト血清担体タンパク質に対す
る結合力を野生型ｈＩＧＦ−１を対照に示した図である
。 第８図はアナログＡ（ＩＧＦ　１３２）及びｈＩＧＦ−
１のラット血清中における本来の結合タンパク質に対す
る結合力を示した図である。 第９図はＩＧＦ−Ｉ　、アナログＡ（ＩＧＦ　１３２）
及びＤ　（ＩＧＦ　２５２）の生物学的活性を３７３細
胞中におけるＤＮＡ合成の刺激に対する能力で比較した
ことを示す図である。 第１Ｏ図はＩＧＦ−１及びＩＧＦ　２５２のｉｎ　ｖｉ
ｖｏにおけるラット横隔膜でのグリコーゲン合成の刺激
あるいはう７）脂肪ｍ織での脂質合成の刺激に対する能
力を比較し示した図である。 Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＧＬｎ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｃ
ｙｓ　Ｇｌｙ　。 ＴｒＴ　ＧＴＡ　ＡＡＣＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＴＧ
Ｔ　ＧＧＣ′ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＴｒＧ　ＧＴｒ　ＧＴＡ
　ＡＡＣＡＣＡ　ＣＣＧ　。 Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｅ’ｈｅ　Ｔｙｒ　
Ｐｈｅ　ＡｓｎＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＣＧＧＴ　ＴｒＣＴ
ＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣ：Ａ　ＣＴＣＧＣＧ　ＣＣＡ　Ａ
ＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　’ｎ’ＧＩＧＦ−１３２ ＡＴＣＣＴｒ　ＴＣＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ
ＴＡＧ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＡＡＣＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣ
ＴＳｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＣｙｓＴＣＣＣＡＴ
　ＣＴＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＴＡＣＴＴ
Ｇ　ＧＴＴ　ＴＧＣＡＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　
ＣＴＴ　ＣＧＡ　ＡＡＣＡＴＧ　ＡＡＣＣＡＡ　ＡＣＧ
Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡＡＡ　ＣＣＧ
　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡＣ：　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ
　ＴＣＴΔＧＡ　ＣＧＴＴｎ’　ＧＧＣＴＧＡ　ＣＣＡ
　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　
ＧＣＡＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｃ
ｅ　Ｖａｌ　ＡｓｐＧＣＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　
ＧＧＴ　ＡＴＣ：　ＧＴＴ　ＧＡＴＣＧＡ　ＧＯＯＧＴ
ＣＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡＬｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅ
ｕＣＴＣＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＡＣ：　ＴＧＣＧＣＡ　Ｃ
ＣＧ　ＣＴＧＧＡＧ　ＣＴＣＴＡＣＡＴＧ　ＡＣＧ　Ｃ
ＧＴ　ＧＧＣＧＡＣＧｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　
Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｒｇＧＡＡ　ＴＧＣＴＧＣＴｒＣＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧ
Ｔ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＧＴ　ＣＧＴＣＴｒ　ＡＣＧ　Ａ
ＣＧ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＧＡ
ＣＧＣＡ　ＧＣＡＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　　☆　★ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＧＣＴＣＴＣ
Ｔ　にＣＴ　ＴＧＡ　Ｔ晶ＧＴＣＧＴＴｒ　ＧＧＣＣＣ
：Ａ　ｍ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＡＣＴ　ＡＴｒ　ＣＡＧＣ
ＣＴＡに＜　　虻−（）　　（）　　（− ３　口　５　　０００ ＜　　ｒ鴫　　　　　　　（）　　（）　　（）＜Ｕリ
　−リリ ＩＧＦ１３２（Ｂ−鎖交異体）の バイオゲルＰＩＯによる精製 Ｂ−鎖交異体（Ａ）、　（Ｔｙｒ　Ｉｓ、Ｌｅｕ　１６
　）　ＩＧＦＩ（Ｂ）、　（Ｇｉｎ　３゜ＩＧＦＩ（Ｄ
）の）ＩＰＬｃによる精製保持時間（分） ペプチド（Ｍ） ＦＩＧ、６ ペプチド（闇 １２５■−αＩＧＦ及び１２５■−α［ＧＦ　１３２の
ラット血清に対する結合−ＴＳＫ　：ｌ０００による分
析 保持時間（分） マウス３Ｔ３細胞におけルＩＧＦＴ　（・）、ＩＧＦ　
１３２（ｆ）−！ｌ）及びＩＧＦ　２５２（！ｌ・・・
ＩＩ）によるＤＮＡ合成刺激ペプチド　（Ｍ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の構造をもつｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド
   類似体： Ａ＿１−Ａ＿２−Ａ＿３−Ａ＿４−ＬＣＧ−Ａ＿５−Ａ
   ＿６−ＬＶ−Ａ＿７−ＡＬ−Ａ＿８−Ａ＿９−Ｒ式中： Ａ＿１はＧ、Ｖ、あるいはＦＶ； Ａ＿２はＰあるいはＮ； Ａ＿３はＥあるいはＱ； Ａ＿４はＴ、ＨあるいはＡ； Ａ＿５はＡあるいはＳ； Ａ＿６はＥあるいはＨ； Ａ＿７はＤあるいはＥ； Ａ＿８はＱあるいはＹ； Ａ＿９はＦあるいはＬ；及び ＲはｈＩＧＦ−Ｉペプチドの残りのアミノ酸であり、し
   かもＡ＿１からＡ＿９のグループ及びその他のアミノ酸
   はＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬ−ＶＤＡＬＱＦ−Ｒとして構成
   はされないものとする。 ２、式中： Ａ＿１はＧ、Ｖ、あるいはＦＶ； Ａ＿２はＰあるいはＮ； Ａ＿３はＱ； Ａ＿４はＡ； Ａ＿５はＡあるいはＳ； Ａ＿６はＥあるいはＨ； Ａ＿７はＤあるいはＥ； Ａ＿８はＹ；及び Ａ＿９はＬである請求項１記載のペプチド。 ３、構造がＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ−Ｒで
   ある請求項１記載のペプチド。 ４、構造がＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬ−Ｒであ
   る請求項１記載のペプチド。 ５、構造がＧＰＱＡＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦ−Ｒであ
   る請求項１記載のペプチド。 ６、構造がＧＰＱＡＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬ−Ｒであ
   る請求項１記載のペプチド。 ７、構造がＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ−Ｒであ
   る請求項１記載のペプチド。 ８、請求項１記載のポリペプチドをコードしている合成
   遺伝子。 ９、請求項３記載のポリペプチドをコードしている合成
   遺伝子。 １０、以下に示される請求項９記載の合成遺伝子：【遺
   伝子配列があります。】 １１、請求項４記載のポリペプチドをコードしている合
   成遺伝子。 １２、以下に示される請求項１１記載の合成遺伝子： 【遺伝子配列があります。】 １３、請求項５記載のポリペプチドをコードしている合
   成遺伝子。 １４、以下に示される請求項１３記載の合成遺伝子：【
   遺伝子配列があります。】 １５、請求項６記載のポリペプチドをコードしている合
   成遺伝子。 １６、以下に示される請求項１５記載の合成遺伝子： 【遺伝子配列があります。】 １７、ａ）適切な構成要素であるオリゴヌクレオチドの
   合成； ｂ）遺伝子断片とする当該オリゴヌクレオ チドのアニーリングとライゲーション； 及び ｃ）組換えＤＮＡプラスミド中における合 成遺伝子のクローニングより成る請求項 ７記載の合成遺伝子の製造方法。 １８、ａ）発現カセット形成の為の適切な合成遺伝子を
   発現ベクターへ挿入； ｂ）発現カセットを細菌、酵母あるいは組 織培養細胞宿主へ導入； ｃ）トランスホームされた発現宿主の増殖；及び ｄ）当該宿主より希望どおりのポリペプチ ド類似体を精製 より成る細菌、酵母あるいは組織培養細胞宿主における
   組換えＤＮＡ発現系を用いた請求項１記載のポリペプチ
   ド類似体の製造方法。 １９、乳汁分泌動物に請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合
   成ポリペプチド類似体を投与することより成る動物にお
   ける乳汁分泌増進の方法。 ２０、不活性担体及び請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合
   成ポリペプチド類似体より成る動物における乳汁分泌増
   進に対して有効使用しうる合成物質。 ２１、動物の成長や飼料効率を増進する為の当該動物に
   請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体
   を投与することより成る方法。 ２２、動物の成長及び飼料効率を増進させる為の不活性
   担体及び請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチ
   ド類似体より成る有効使用しうる合成物質。 ２３、食肉用動物において脂肪のない肉を増大させ、脂
   肪肉を減少させる為の当該動物に請求項１記載のｈＩＧ
   Ｆ−Ｉの合成ポリペプチド類似体を投与することより成
   る方法。 ２４、食肉用動物において脂肪のない肉を増大させ、脂
   肪肉を減少させる為の不活性担体及び請求項１記載のｈ
   ＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体より成る有効使用
   しうる合成物質。 ２５、動物の傷病回復を増進させる為の負傷した動物に
   請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体
   を投与することより成る方法。 ２６、動物の傷病回復を増進させる為の不活性担体及び
   請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体
   より成る有効使用しうる合成物質。 ２７、動物の赤血球造血を刺激する為の赤血球造血を必
   要としている動物に請求項１記載の ｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体を投与すること
   より成る方法。 ２８、動物の赤血球造血を刺激する為の不活性担体及び
   請求項１記載のｈＩＧＦ−Ｉの合成ポリペプチド類似体
   より成る有効使用しうる合成物質。