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JPH085808B2 - 化合物標的化組成物 - Google Patents

化合物標的化組成物

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JPH085808B2
JPH085808B2 JP61236984A JP23698486A JPH085808B2 JP H085808 B2 JPH085808 B2 JP H085808B2 JP 61236984 A JP61236984 A JP 61236984A JP 23698486 A JP23698486 A JP 23698486A JP H085808 B2 JPH085808 B2 JP H085808B2
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binding protein
protein
binding
antibody
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JP61236984A
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ザ ボ−ド オブ トラステイズ オブ ザ リ−ランド スタンフオ−ド ジユニア ユニバ−シテイ
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Publication date
Application filed by ザ ボ−ド オブ トラステイズ オブ ザ リ−ランド スタンフオ−ド ジユニア ユニバ−シテイ filed Critical ザ ボ−ド オブ トラステイズ オブ ザ リ−ランド スタンフオ−ド ジユニア ユニバ−シテイ
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，薬剤の標的特異的な局在化を産み出すため
に，治療あるいは診断化合物，特に放射性核種を投与す
るための方法およびシステムまたは組成物に関する。
（参考文献） Chang,C.−H.,et al,Biochem,Biophys Res Commun 11
1（３）:959（1983）． De Riemer,L.H.,et al,J Med Chem 22:1019（197
9）． De Riemer,L.H.,et al,J Lab Comps &Radpharm18（1
0）:1617（1981）． Friguet,B.,et al,J Immunol Methods 77:305（198
5）． Fujii,A.J.,Antibiot 26:398（1973）． Goodwin,D.A.,et al,Nuclear Medizin 14:365（197
5）． Goodwin,D.A.,et al,Seminars in Nuc MedVI:3（197
6）． Goodwin,D.A.,et al,In Radiopharmaceuticals IIPro
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Rad,N.Y.,Sodd,V.J.,et al,eds,pp275−284（1979）． Goodwin,D.A.,et al,J Nuc Med 22：（９）:787（19
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therapy,Burchiel,S.W.,et al,eds,Elsevier,p 185（19
83）． （従来の技術） 固形腫瘍あるいは特定の臓器のような内臓の標的部位
に対して，薬剤の標的化を向上させることが，最近の薬
剤研究の主たる焦点である。薬剤の標的化の目的は，標
的部位で薬剤を濃縮しかつ非標的部位でその効果を最小
にすることにより，薬剤の効果を高めることにある。例
えば，固形腫瘍を処置するためのような治療上の目的の
ために薬剤を用いるところでは，薬剤の標的化によれ
ば，ほとんど非腫瘍に関する副作用なしで，標的部位で
のより効果的な投与をもたらず，同様に，放射性画像化
に用いるために薬剤が放射性核種であるところでは，標
的化は，標的領域とバックグラウンドとの間で高めにコ
ントラストを与える。というのは，放射性核種のバック
グラウンドのレベルが減少したためである。
放射性核種は，提唱されている種々の標的戦略のため
の製薬剤の重要なグループである。静脈投与やキレート
剤の系統的摂取により，内臓部位，特に固形腫瘍を映像
化するために用いる111In、67Ga、64Cu、99mTc、68Ga、
62Zn、67Cu、97Ru、57Coあるいは55Coの金属キレートの
ような放射性画像化化合物はこのグループに含まれる。
イオン化放射由来の局在化した細胞破壊に基づき，
90Y，197Hgあるいは67Cuの金属キレートのような，ある
いは処置中の腫瘍に用いられる131Iおよびそれに類似し
たような放射性治療剤も，このグループに含まれる。製
薬剤に関連のあるグループは，酸化還元機構を通じて細
胞障害性効果を産む鉄キレート，銅キレート，あるいは
ルテニウムのキレートのような非放射性の金属のキレー
トであり，細胞で放射線の細胞障害作用を強化すること
もできる。
以前に，本発明者らは，放射性核種を標的化しかつ内
臓部位，特に固形腫瘍に対して金属を放射性感作させる
のに有用ないくつかの新規のキレート化合物について述
べたことがある。一般的に，このような化合物は，第１
の官能基として金属イオンと強固な錯体を形成し得るキ
レート部分，そして第２の官能基としてニトロ基および
アミン基のような化学的に反応性のある部分（この部分
を介して，化合物は，標的化している分子あるいは他の
分子に連結し得る）を有する二官能性のキレート剤であ
る（Meares,1976:Coodwin et al,1975,1976,1979）。
本発明者らが発展させたキレート化合物のうちのある
新規なクラスは，ブレオマイシンの種々のエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）キレートであり，これらは多くの型
の腫瘍内に局在する抗腫瘍性抗生物質である（Umezawa,
Fujii）。このブレオマイシン/EDTA化合物は，固形腫瘍
内で，57Coや111Inを含む種々の放射性核種の選択的な
腫瘍の局在性を与えることが示されている。これらの化
合物の中で最も初期の化合物のうちの１つは，キレート
をスルホニウム基を介してブレオマイシンに結合させる
ために,p−ブロモアアセトアミドベンジル−EDTA（BABE
−EDTA）のような反応性のある二官能性の化合物を用い
て，精製ブレオマイシンA2をアルキル化することによ
り，調製した。単座配位のコバルト−硫黄の配位結合を
介して，二官能性のEDTA分子をブレオマイシン−Co錯体
に連結させることにより形成したより最近の化合物を，
共有している米国特許出願“ブレオマイシン結合物およ
び方法"No.712,377,（1985年３月15日出願）に述べてい
る。
固形腫瘍のような標的部位に対して，上記のブレオマ
イシン／金属キレート化合物のような標的化している小
さな放射性核種化合物で観察されている制約条件の１つ
は，標的部位での化合物の濃度が比較的低いことであ
る。標的部位における低い薬剤投与量は，腎臓による化
合物の迅速な除去による。この除去によれば，標的部位
での局在化に有効な血液中での化合物量が制限される。
投与される化合物の投与量を単に増やすことは実際的な
解決法ではない。ほとんどの放射性核種は有害であり，
それゆえ投与量限界があるからである。
投与量限界はあるが，迅速に除去される標識化合物の
濃度を増加させる１つの方法は，抗体と錯体化した形で
この化合物を共に投与することである。その比較的大き
なサイズのために，この錯体は腎臓では除去されない
が，その代わりに細網内皮系（RES）で数日間かけて血
液からゆっくりと除去される。この方法は本発明者らに
より，二官能性のインジウム／キレート化合物 Ｌ−ベ
ンジル−EDTA−111In（LBEDTA−In）に対して調製され
た２種のモノクロナール抗体（Mabs）を用いて，以前に
研究されている。結合の研究によれば，両抗体はこのイ
ンジウムキレートに特異的で，他の金属のキレートに対
するKb値の少なくとも約20倍の，インジウムキレートに
対するKb値を有することが示された。BLEDTA−111Inを
共に投与すると，この抗体は,24時間後に10−30倍の間
でBLEDTA−111Inの全身のレベルを増加させた。これ
は，おそらく血流からゆっくりと除去される強固に結合
した全身型でBLEDTA−In化合物を保持することによる。
しかし，抗化合物抗体を循環させて化合物の摂取を増
加させることは，比較的非特異的な効果である。という
のは111Inレベルに対して試験された種々の臓器も,24時
間後に顕著に増加した放射活性を示した。それゆえ，抗
体を共に投与することにより，腫瘍が化合物を高レベル
で摂取することで生じる利点は，（１）非腫瘍臓器での
放射活性（あるいは治療剤）の高いバックグランドレベ
ルがより高くなること，および（２）結合物に対して，
患者の全身におけるより長い接触時間，例えばキレート
化された放射性核種を有する結合物の場合ではより長い
接触時間，により部分的に相殺される。
本発明者らにより行われた研究は，無害，あるいは非
放射活性の競合抗体で患者の血流を流すことにより，こ
のような好ましくない副作用は低減し得ることを示して
いる。例えば，本研究は，全長の111Inレベルが，（抗
原に依存して）急激に流し入れるような投薬後３時間
で，約20−80％より減っていることを示している。しか
し，抗体で高めることによる方法では，丁度，顕著な標
的物の分布の効果を得るために，少なくとも数時間とい
う期間を要することが記述されている。それゆえ，この
方法は，約１時間から数時間の間の半減期を有する99Tc
や68Gaのような放射性核種には適していない。
（発明の目的） 本発明の１つの一般的な目的は，治療用あるいは放射
性診断用の化合物を標的組織に標的化するために，上記
で論じた問題や当業者に公知の制約条件を実質的に克服
するべく改良された方法およびシステムまたは組成物を
提供することにある。
本発明のより特定の目的は，固形腫瘍の領域に放射性
核種を選択的に標的化するための方法およびシステムま
たは組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は，高レベルの放射性核種あるいは
他の薬剤化合物への身体の接触がほんの短時間で行われ
るような方法およびシステムまたは組成物を提供するこ
とにある。
さらに，この方法の他の目的は，68Gaのような非常に
短命の放射性核種に適合するシステムまたは組成物や方
法を提供することにある。
（発明の要旨） 本発明の化合物標的方法は，腎臓によって迅速に除去
される性質を有する診断もしくは医療用のエピトープ性
化合物を被験体内部の標的部位へ局在化させる方法であ
って，該方法は，（ａ）該化合物に関連するエピトープ
に特異的にかつ高い親和性をもって効果的に結合し，そ
して（ｂ）被験体に非経口投与したときに標的組織へ選
択的に局在化する能力を有する，結合タンパクを供給す
ること；該結合タンパクを非経口的に投与し，そして該
タンパクを標的部位に選択的に局在化させること；非局
在化循環結合タンパクを，循環結合タンパクと反応し高
分子凝集体を形成し得；該高分子凝集体は該被験体の細
網内皮系より迅速に除去されうる除去剤を非経口投与す
ることによって，除去すること；そして，該循環タンパ
クの大部分を除去するのに充分な期間の後，該エピトー
プ性化合物を非経口投与し，該化合物を局在化した結合
タンパクに結合させ，非結合化合物を腎臓で迅速に除去
することにより該化合物の標的部位への選択的局在化を
達成すること；を包含する。
本発明の化合物標的化システムまたは組成物は，被験
体の内部の標的部位に診断または治療用薬剤を投与する
システムまたは組成物であって，薬剤およびそれに関連
するエピトープを含有するエピトープ性化合物；（ａ）
該化合物に関連したエピトープに特異的にそして高い親
和性をもって効果的に結合し，そして，（ｂ）被験体に
非経口投与された際標的組織に選択的に局在化しうる，
結合タンパク；および該被験体の血液中を循環している
前記結合タンパクと反応して，該被験体の細網内皮系に
より迅速に除去される高分子凝集体を形成し得る除去
剤；を含有する。
本発明は、ある局面では，被験体の内臓の標的部位
に，腎臓で迅速に除去されるサイズの診断用あるいは治
療用のエピトープ性化合物を局在化させる方法を包含す
る。方法を実践するに際し，（ａ）特異的に結合するの
に効果的で，化合物に関連したエピトープに高い親和性
を有し，そして（ｂ）被験体に非経口で投与すると，標
的部位で選択的に局在化し得る結合タンパクが供給され
る。この結合タンパクは，代表的には化合物に関連して
いる抗原性エピトープに特異的な抗体，または小さなエ
ピトープ部分（例えば，ビオチン）に高い結合親和性の
ある非免疫グロブリン結合タンパク（例えば，ストレプ
トアビジン）である。
この結合タンパクは，関連したエピトープ性化合物な
しで患者に非経口投与され，標的部位に選択的に局在化
される。局在化のための代表的には１日から４日後に，
局在化せずに循環している結合タンパクは，この循環し
ている結合タンパクと反応して高分子凝集体（これは被
験体の細網内皮系から迅速に除去され得る）を形成し得
る除去剤を非経口投与することにより，除去される。こ
の除去剤は，代表的には，担体高分子を含む。この担体
は高分子は，例えば，人の血清タンパクであり，これは
多くの共有結合性エピトープ基を含有している。この凝
集体のほとんどを除去するのに充分な期間，代表的には
約１日かそれ以内の後，このエピトープ性化合物が非経
口投与され，それによりこの局在化した結合タンパクに
化合物が結合される。そして未結合の化合物の腎臓によ
る迅速な除去により，標的部位での化合物の選択的な局
在化がなされる。
ある実施態様では，このエピトープ性化合物は金属イ
オンと錯体化して安定な金属キレート錯体（metal chel
ate complex）を形成するエピトープ−キレート化合物
である。この結合タンパクは化合物のエピトープ部分に
特異的な抗体である。代表的なキレート化合物は，パラ
位の置換したスペーサーアームを有する１−フェニルあ
るいは１−ベンジルEDTAの金属キレートである。この金
属は，111In，67Ga，64Cu，99mTc，68Ga，62Zn，67Cu，
97Ru，57Coあるいは55Coのような放射性画像に有用な放
射性核種であり得る。腫瘍の治療には90Y，197Hgあるい
は67Cuのような放射性核種が用いられる。あるいは，キ
レート化した鉄，キレート化した銅，またはキレート化
したルテニウムのような放射線感受性のキレート化した
金属が用いられる。
本発明のシステムはまたは組成物は，局在化され，関
連したエピトープ部分となり得る薬剤を含むエピトープ
性化合物や，（ａ）特異的に結合するのに効果的で，化
合物に関連したエピトープに高い親和性を有し，そして
（ｂ）被験体に非経口から投与すると標的部位で選択的
に局在化し得る，結合タンパクを含有している。この系
では，また，被験体の血流中で循環させて，この結合タ
ンパクと反応し，高分子凝集体（これは被験体の細網内
皮系から迅速に除去され得る）を形成し得る除去剤も含
む。
本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は，
以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と合わせて読む
と，より完全に明らかになるであろう。
I.系の化合物の調製 A.エピトープ性化合物 本発明は，固形腫瘍あるいは選択された臓器あるいは
組織部位のような特定の内臓部位で，治療用の薬剤また
は放射性画像用の試薬を標的化する際に用いるべく意図
されている。標的化される薬剤は，製薬的に活性のある
治療用部分あるいは放射性画像化される部分（活性部
分），および１つまたはそれ以上のエピトープ性の部分
またはエピトープ性の認識部分を有するエピトープ性化
合物である。この認識部分は，エピトープ特異的な結合
剤に特異的かつ高い親和性で結合し得る。
この化合物の活性部分は，薬剤，放射性核種，ホルモ
ン，毒素，代謝物，抗代謝物，ビタミン，酵素−補因子
のような製薬的に活性のある薬剤またはその類似物であ
る。この類似物は，天然のエピトープ部分を含むかある
いは，より通常の場合では，活性を失うことなしに必要
なエピトープ部分を含むべく修飾されまたは誘導され得
るかいずれかである。このような活性のある薬剤には，
ドキソルビシン，シスプラチン,DNAアルキル化剤または
架橋剤で例示されるような抗腫瘍剤，および抗代謝物；
アミノグリコシドやポリエンのような抗菌剤；およびア
ンホテリシンＢのようなマクロライド系抗生物質が含ま
れる。本発明で有用な治療用薬剤および診断用薬剤の一
つの主なクラスは，放射性画像化に有用なキレート化し
た放射性核種，腫瘍治療に有用なキレート化した放射性
核種，および放射性感受性のキレート化した金属であ
る。放射性画像化に有用なキレート化した放射性核種に
は，例えば,,111In，67Ga，64Cu，99mTc，68Ga，62Zn，
67Cu，97Ru，57Coまたは55Coがある。腫瘍治療に有用な
キレート化した放射性核種には，例えば，90Y，197Hgま
たは67Cuがある。放射性感受性のキレート化した金属に
は，例えば，キレート化した鉄，キレート化した銅ある
いはキレート化したルテニウムが挙げられる。
ここではエピトープとも言及しているエピトープ部分
は，抗エピトープ結合タンパクにより特異的に，高い結
合親和性で認識される化合物の構造部分である。抗体結
合タンパクにより特異的に結合されるハプテン性抗原す
なわち，ストレプトアビジンで特異的に結合されるビオ
チン，アビジンあるいはその類似物質（これ以降“スト
レプトアビジン”として言及する），および植物のレク
チン結合タンパクにより結合されるタイプの炭水化物
は，ここではエピトープの好ましいクラスである。
本発明の方法は，エピトープ性化合物を非経口投与し
たときに腎臓から迅速に除去され得るのに充分小さくか
つ可溶であることが必要である。代表的には，約50,000
ダルトン以下，好ましくは約10,000ダルトン以下の分子
量を有し，血清中において，親和性の形状かつ単一の分
子形状として主に存在する分子は，これらの必要条件を
満足する。
通常の場合では，このエピトープ性化合物は，ビオチ
ンのような１つまたはそれ以上の異なるエピトープ基あ
るいは所定の抗原を用いて活性のある薬剤を誘導するこ
とによるか，またはモノクローナル抗体を生じ得る抗原
性部分あるいはハプテン性部分を生成するような活性の
ある薬剤を修飾するかのいずれかにより調製される。修
飾および誘導の両反応は，一般的に，カルボキシル部
位，アミノ部位，ニトロ部位，ヒドロキシル部位，アル
デヒド部位およびスルフヒドリル部位のような反応性の
ある化学部位で化合物を誘導あるいは修飾したりするた
めの公知方法に従う。これらの反応は，直接的なアルキ
ル化反応，カルボジイミド，イソチオシアン酸エステル
あるいはＮ−ハイドロキシスクシンイミドのような活性
化剤を通じて進行するカップリング反応，またはグルタ
ルアルデヒドのような二官能性の架橋剤を通じてのカッ
プリングを包含し得る。適当な反応は当業者に公知であ
り，これは活性化剤中で用いられる反応基の性質，この
活性化剤の活性部位の必要条件に関する情報，および所
望の化学修飾あるいはエピトープ付加のタイプに基づい
ている。以下で述べる化学的な誘導反応または修飾反応
は例証となる。
本発明で有用な活性化剤のある重要なクラスは，二官
能性のキレート剤である。本発明者らが先に報告したこ
れらの化合物は，種々の製薬上有用な金属と強固な金属
錯体を含む。このキレート部分は，代表的には，ニトロ
基、アミン基またはブロモアセトアミド基のような官能
性の反応基とベンゼン環を介して結合している。この官
能性の反応基は，タンパク，ブレオマイシン，または誘
導した化合物や修飾した化合物中でハプテン部分を形成
し得るより小さい分子のような，他の分子に化合物をカ
ップリングさせるのに使用可能である。化合物Ａおよび
Ｂを生成するのに用いられる修飾反応は例証となる。
第１図の化合物Ａは，安定な単座配位のCo（III）−
Ｓ結合を介して二官能性のEDTAへと誘導されたコバルト
／ブレオマイシン（B1−Ｃ（III））化合物である。こ
の化合物の合成は，ここで挙げた参考文献にあり，“ブ
レオマイシン結合物および方法”の上記引用特許出願に
詳しく述べられている。簡単には,B1−Co（III）−H2O
が，以下の条件で1,4−ジチオールブタンとの反応に供
される。この条件とは，コバルトと結合した水の不可逆
的な置換がなされ，そしてB1−Co（III）−Ｓ−(CH2)4S
Hが形成される条件である。この合成は，ジチオ−ブレ
オマイシン化合物とｐ−ブロモアセトアミドベンジル−
Ｅ−DTA（BABE−EDTA）とを反応させ，誘導したブレオ
マイシン化合物を高速液体クロマクトグラフィー（HPL
C）生成することにより完結する。このチオブタンのス
ペーサーアームは，長さや組成が異なり，種々の遊離末
端の化学基（例えばチオール基，アミン基，カルホキシ
ル基またはヒドロキシル基）で終わる種々炭素含有鎖で
置換され得ることは，ここでは注目に値する。この置換
により，この炭素含有鎖は，二官能性のキレートに共有
結合的に連結され得る。同様に，この二官能性のキレー
トは，スペーサーアームの遊離末端に共有結合的に連結
するのに適当な種々の化学基のうちの１つを有し得る。
第１図のＢで示される化合物は，化合物Ａと同じジチ
オブタン−BABE−EDTA構造を含む。しかし,Coに結合し
たブレオマイシンはない。この化合物は，実施例１に記
述されているように,1,4−ジチオブタンをBABE−EDTAと
直接反応させることにより形成され得る。以下の節IBで
見られるように，チオブタン−BABE−EDTA−Co抗原に対
して調製されたモノクローナル抗体（Mabs）は，化合物
ＡとＢの両方の金属キレートと特異的な反応性がある。
それゆえ、各化合物は，薬剤的に活性のある薬剤（BABE
−EDTA−金属キレート）の代表例である。この薬剤は，
免疫化した動物中にて抗体の応答を引き起こし得るハプ
テンを形成するべく，（４つの炭素−硫黄で結合された
スペーサーを加えることにより）修飾される。この２つ
の修飾反応は，また，一般に薬剤やキレートカップリン
グ反応を例示している。この反応では，化合物の官能性
部分で修飾や付加の効果を最小にするべく，スペーサー
アームか用いられる。
エピトープ性の化合物を調製するのに用いられる誘導
反応を説明するために，上記の二官能性のキレートが，
ストレプトアビジンに対して特異的かつ高い親和性をも
って結合し得るエピトープ性のビオチンキレートを生成
するように，ビオチン部分に結合され得る。１つの結合
方法では，遊離末端のアミンを有する二官能性のキレー
トが，ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンアミド（NH
S）エステルとの反応に供され，アミド結合を介してキ
レートのアミンにビオチンが連結される。例えば，濃縮
されたアンモニア水中でのアミン化により,BABE−EDTA
からキレートアミンが形成され得る。このNHSビオチン
エステルは市販されている。得られたビオチン化したグ
リシンアミドベンジルEDTA（GABE−EDTA）は，ストレプ
トアビジンに対する高い親和性をもって結合することが
示されている。他の活性のある薬剤は，同様の方法によ
り，炭水化物またはハプテン性分子を用いてビオチン化
され，あるいは誘導され得る。
高められた抗体結合を与えるため,2つまたはそれ以上
のハプテンエピトープを含むエピトープ性化合物が，上
記で論じた方法と同じ一般的な方法により調製され得
る。多種のエピトープを用いて活性のある試薬を誘導す
る際に、この個々のエピトープは，活性のある薬剤上の
異なる部位に付着させ得る。あるいは，これは，活性の
ある薬剤に付いた単一のスペーサーアーム上の異なる位
置に付着されてもよい。活性のある薬剤がハプテン形に
化学的に修飾すると，二量体形で化合物がともに結合す
ることにより,2価の種を形成することが可能である。例
えば，第１図の化合物Ｂは,2価のハプテン種を形成する
ために，ジスルフィド結合を介して容易に二量体化され
得る。
B.結合タンパク 本発明のシステムまたは組成物の結合タンパクは，内
臓の標的部位に特異的に局在化させ得る標的化薬剤とし
て，および標的部位に対しエピトープ性化合物を結合さ
せるための結合薬剤としての両方の役割を果たす。
このタンパクの第１の結合特性を考慮すれば，この結
合タンパクおよびエピトープ性化合物のエピトープは，
特異的でかつ高い親和性をもって結合している対の反対
の部分であることが上記で注目される。この結合対は，
抗原−抗体，ビオチン−ストレプトアビジン，および炭
水化物−レクチンの対を包含し得る。これらの結合対の
各々において，このエピトープは，化学基の３次元配置
を呈する比較的小さな物質である。また，結合タンパク
は，親和性の高い結合で２つの種を結合させるべく，こ
のエピトープと強力な非共有結合性の相互作用をもたら
す表面特性を有する，比較的大きな種である。さらに，
一般的には，この結合タンパクは,2個かそれ以上の結合
部位，およびエピトープ性化合物,2個またはそれ以上の
エピトープを含んでいてもよい。より好ましい結合定数
は少なくとも約108M-1であり，さらに好ましい結合定数
は1010M-1と1015M-1との間である。結合親和力がより高
くなれば，それに応じて本発明を実施するのに使用され
る結合タンパクがより少なくなる。特に，結合タンパク
がMabであると，このことは著しく有利となり得る。例
えば，109の結合定数を有するミリグラム量の抗体が，
効果的な化合物の標的化に必要ならば，ミリグラム量や
ナノグラム量が，それぞれ1012と1015の結合親和性を有
する結合タンパクを用いて同程度の化合物の局在化を果
たすのに必要であろう。
モノクローナル抗体（Mab）の結合タンパクは，通常
のハイブリドーマ技術により，多量のハプテン性エピト
ープに対して調製され得る。それゆえ，この結合タンパ
クは，化学的に修飾または誘導したほとんどのエピトー
プ性化合物に対して，一般的に適している。選択された
エピトープに対するMabsを形成するため，このエピトー
プ性化合物，あるいはこのエピトープを含む同類の化合
物は，動物，望ましくはマウス（そのリンパ球はミエロ
ーマ融合技術により永久増殖化し得る）に注入する標準
的な免疫学的技術により調製される。代表的には，それ
自体が腎臓により迅速に除去される化合物が，腎臓によ
る迅速な除去を防ぐために，大きなタンパクかその類似
物に共有結合的に結合される。そして，この化合物は，
動物の免疫学的な応答を高めるべく，フロインドアジュ
バントのようなアジュバントと混合される。このアジュ
バント混合液は，この物質がゆっくりと血流に放出され
るように，通常の場合では，筋肉内あるいは皮下注射に
より投与される。２〜４週間後，脾細胞が動物より引出
される。この脾細胞は，培地で長期間成長し得る抗体産
生細胞を精製するために，マウスのミエローマ細胞のよ
うな永久増殖した細胞と融合される。この融合細胞は，
所望のエピトープに対して特異的な抗体を分泌する細胞
に対して選択性を有する。抗体産生ハイブリドーマ細胞
の生成法および選択性は公知である（コーラー）。実施
例２は，担体タンパクとして，キーホールリムペットの
ヘモシアニンに付けた上記のチオブタン−BABE−EDTA−
Coハプテンに対して特異的なMabsを生産するように用い
られる手順を詳しく述べている。WC3A11,WC4B7,およびW
C3F5と表している３つの抗体産生細胞系を選抜し,3種の
すべての系からの抗体は，ジチオブタン−BABE−EDTA−
Co（第１図の化合物ＢのCoキレート）やIn−BLEDTA−IV
（第１図の化合物ＡのInキレート）の両方に対して特異
的であった。
実施例２で与えられた結合のデータは，上記に述べた
３種の抗チオブタン−BABE−EDTA Mabsが，約１−６×1
0-9Ｍの間で選抜されたエピトープ性の金属キレートに
対して結合親和性を有する。より高い結合親和力は,2つ
の一般的な戦略のうちの１つにより得られる。その第１
の方法は，抗原特異的抗体が興味あるエピトープにより
強固に結合するハイブリドーマ細胞系を選抜することに
ある。第２の方法は，抗体と２価あるいは多価の抗原と
の間で観察される一般的により高い結合親和性に基づい
ている。この効果は，注目すべであるが，小さなエピト
ープ性化合物に対しては立体的に不可能な２つの抗体結
合部位と２つのエピトープとの同時結合によるものでは
ない。しかし,1つ以上のエピトープが存在する抗体に，
エピトープ結合の統計的に高まる機会に関係していると
思われる。
２価あるいは多価のエピトープ性化合物で認められる
結合の高まりの範囲は，また本発明の方法で標的部位に
局在化する抗体濃度に依存する。もし多価の抗体が表面
支持体に確保された２つの抗体に同時に結合し得るなら
は，高まった抗原／抗体結合が生じることはよく知られ
ている。それゆえ，そのような架橋した抗体の結合をさ
せる標的部位での抗体の濃度を仮定すると,2価あるいは
多価のエピトープ性化合物の供給は単価の化合物で見ら
れるものより10倍かそれ以上で標的での結合を高めるこ
とができるだろう。多価のエピトープ性化合物の調製法
は上記で論じている。
抗体が広範囲の種類のエピトープに対して調製されう
るという有利性を示すのに対して，ストレプトアビジン
は，このエピトープビオチンに対して非常に高い結合定
数（約1015M-1）を有するという有利な点がある。上記
のごとく，このことは，本発明が，注入された結合タン
パクの極めて少量の使用を実現し得ることを意味してい
る。ストレプトアビジンは細菌性タンパクであり，これ
は人の治療に適するように精製した形で市販されてい
る。ビオチンを用いたキレートや他の活性薬剤の誘導方
法は上記に論じている。
この結合タンパクの標的機能を考慮すれば，本発明
は，非経口投与の際，血流から選択的に標的部位を局在
化するためのタンパクの性能に依存している。効果的な
局在化のためには，このタンパクは，（ａ）血流中にて
相対的に長い半減期を有すること，および（ｂ）標的部
位で選択的に蓄積されうること，が必要である。大きさ
の必要条件に関して，この抗体は迅速な腎臓での除去を
防ぐには充分大きい。しかし,RESによる迅速な除去を促
進するほどは大きくないことが必要である。約50から50
0,000ダルトンの間の大きさの範囲で，以下で論じる種
々のタイプのハイブリッドタンパクを含む結合タンパク
が最も適している。
この結合タンパクの標的能力は，標的部位の抗原は特
異的に結合するタンパクの能力，あるいはタンパクサイ
ズまたは膜透過特性，あるいはこれらの因子の組合せに
基づいていてもよい。腫瘍標的部位を含むほとんどの標
的部位は，結合タンパクが誘導され得る組織特異的な表
面抗原を含む。また種々の正常な，そして悪性な組織に
対して特異的な抗体が報告されている。
この結合タンパクの組織特異的な結合特性は，このエ
ピトープ性化合物に結合するのに必要な結合特性を付加
的に備えていることが認識されるだろう。それゆえ，組
織抗原およびエピトープ性化合物の両者に対する１つま
たはそれ以上の結合部位を含む結合タンパクを構成する
ことが一般的に必要である。２つの異なる抗原に対して
特異性のあるハイブリッドの２価の抗体が今までに報告
されている。米国特許No.4,474,893号の読本に開示され
ている１つの調製方法では,1つの抗原に対して特異的な
抗体を分泌するハイブリドーマは,B−リンパ球，あるい
はハイブリドーマ（これは，第２の抗原に対する抗体を
分泌し得る）に融合される。三融合体あるいは四融合体
の融合産物のいくつかは，両抗原に対して特異的なハイ
ブリッド抗体を分泌することが見出されている。別の方
法では，完全な抗体の酵素分解により生じたＦ（ab′）
2断片あるいはFab断片が，異なる抗原に対して誘導され
る結合部分を有する抗体分子を産むために,1つの別の，
あるいは完全な抗体に化学的に連結されうる。代表的に
は，この方法では，標的部位の抗原に対して特異的な完
全な抗体が，エピトープ性化合物に対して特異的なMab
の酵素分解により形成されたFabあるいはＦ（ab′）2断
片で誘導される。この連結は，このタンパクにスルフヒ
ドリル基を付加するために，例えばトラウト試薬（実施
例２および３を参照）で完全なタンパクを最初に誘導す
ることにより，実行され得る。エピトープ特異的なタン
パク由来のこの抗体断片は，通常の二官能性試薬により
スルフヒドリル基に連結される。この二官能性試薬は，
抗体断片のアミンと連結するためのNHS末端基や誘導し
た完全な抗体中のスルフヒドリル基に連結するための反
対側の末端のマレイミド基を有している。他の連結方法
は，当業者に公知である。
必要に応じて，抗体あるいは抗体結合断片は，類似の
連結法によりストレプトアビジン（またはレクチン）に
化学的に連結され得る。ここでは，このハイブリッドタ
ンパク中の抗体断片は，組織標的化のために機能する。
これに対して，アビジン部分は，その部位に標的化され
るビオチンで標識された化合物に対する高い親和性のあ
る結合を提供するだろう。
腫瘍の標的化に適したある実施態様では，この腫瘍で
の選択的な局在化は抗原特異性に基づくものではなく，
より透過可能な，すなわち漏れやすい毛細管を選択的に
浸透させるタンパクの能力に基づいている。この毛細管
は，通常，固形腫瘍に関連している。この方法の利点
は，この結合タンパクを調製するのがより簡単なところ
にある。以下の実施例５や６は，この方法により達成し
得る非特異的な腫瘍の局在化の程度を説明している。
C.除去剤 本発明のシステムまたは組成物での除去剤は,RESによ
る結合タンパク凝集体の迅速な除去を促進するため，結
合タンパクと結合しかつこれと架橋するように機能す
る。この結合タンパクは，処置された個人の血流中で循
環している。この薬剤は，腎臓における迅速な除去を避
けるのに，好ましくは充分な大きさである。この薬剤
は，循環している結合タンパクを架橋しかつ凝集するた
めに，充分な多価性を含んでいる。それゆえ，このタン
パクは約50,000ダルトンかそれ以上の分子量を有するの
が好ましく，約1:4のタンパク：エピトープモル比かそ
れ以上のモル比のエピトープで誘導される。除去剤によ
るタンパクの凝集には，また各結合タンパクで少なくと
も２つのエピトープ結合部位を要することがここでは注
目されている。
人の使用に対し１つの好ましい除去剤は，この結合タ
ンパクにより特異的に認識される多くのエピトープで誘
導される人のタンパクである。以下の実施例３では,Mab
sを除去しかつ架橋するためのチオブタン−BABE−EDTA
−Coで誘導した人のトランフェリンからなる除去剤の調
製が述べられている。このMabsは，第１図中のＡやＢで
示されているタイプの化合物に対して特異的である。
II.治療および放射性診断の方法 A.結合タンパクの局在化 本発明の方法は，腫瘍領域，内臓器，あるいは他の特
異的な組織領域のような選抜された体内の部位への，治
療用あるいは放射性診断用の薬剤標的化を行うように意
図されている。
この方法の第一段階として，結合タンパクを非経口投
与で（すなわち血流中に），好ましくは，静脈内（IV）
投与により，投与される。しかし，皮下，腹腔内，およ
びリンパ腺内のような他の経路も，本出願の内容に包含
される。ここから，このタンパクはゆっくりと血液か
ら，組織液（ECF）を経て，標的部位を含む体組織へと
通っていく。このタンパクは，タンパクの標的の特徴の
ために，腫瘍部位にて好んで蓄積される。この最初の段
階は，第２図の上段に描いてあり，これはECFを通じて
血流（点線の欄）から腫瘍部位への抗体結合タンパクの
ゆっくりした通過を示している。
本発明の重要な利点によれば，この結合タンパクは錯
体化されない形すなわち結合したエピトープ性化合物な
しで供給され，その結果，処置された個人は最初はエピ
トープ性化合物に接触しない。注入された結合タンパク
の量は，最後の標的段階では，標的部位でのエピトープ
性化合物の選択された濃度となるように計算されてい
る。この量は種々の要因に依存している。この要因に
は，（ａ）体の標的領域および非標的領域における結合
タンパクの局在化の相対的な程度，（ｂ）血液中の結合
タンパクの持続性，および最も重要には，（ｃ）標的部
位に局在するときの，エピトープ性化合物に対する結合
タンパクの結合定数がある。
投薬される結合タンパクの最適な量は，動物モデル系
での実験的研究と公知の結合定数とを組合わせることに
より，およそ決定され得る。一般的な規則として，標的
化された化合物の一定の濃度を得るために投与しなけれ
ばならない結合タンパクの量は，このタンパク／化合物
の総合定数に逆の相関を示す。例えば，予備的な動物研
究が，109M-1の結合定数の抗体に対して約1mgの抗体投
与を示すならば，結合定数が1012M-1の抗体１μｇの抗
体投与により同じ濃度が達成されるだろう。上記のごと
く，結合定数は標的部位での結合しているタンパクの濃
度それ自体に依存するという考えにより，多価のエピト
ープ性化合物の場合には，この規則は調節される。
このタイプの研究は，エピトープ性キレートに結合し
ている放射性核種の効果的な標的化では,1価のエピトー
プ性化合物に関して約109M-1の結合定数を有する抗体に
対して，約10−100mgの最初の抗体が人の投与には必要
であることを示している。ビオチン化した金属キレート
に対して，約1015の結合定数と仮定すると，比較可能な
放射性核種のレベルは，約10ng−100ngの間の全投与に
おいて，ストレプトアビジン結合タンパクを用いて達成
され得る。
血液中で１日から数日の循環半減期を有する投与した
結合タンパクは，代表的には１−４日の期間以上も標的
臓器に局在することがある。この期間では，この結合タ
ンパクは，標的部位だけでなく他の組織も同様に，血流
からゆっくりと汲み取られる。腫瘍の場合では，標的部
位での結合タンパクの蓄積は，腫瘍に供給する毛管の比
較的大きな漏出性のために，高められる。以前に述べた
ように，腫瘍の局在化は，腫瘍の優先的な抗体の漏出に
単に基づいているにすぎない．この機能は実施例５で説
明される。この実施例５は，表2Aで血液，腫瘍，そして
種々の臓器に対する抗体の取込み値を示している。ここ
で，投薬後24時間で，抗体の集積した主な部位は血液お
よび腫瘍であるが，肺や肝臓のようないくつかの内臓も
抗体の集積を示したことが認められている。
B.結合剤の除去 本方法第２段階において，標的に蓄積した結合タンパ
クのレベルに多少とも影響を与えることなしに，タンパ
クの全血中レベルを数倍減じるべく，循環している抗体
が血液から迅速に除去される。第２図の中央枠に描かれ
ているこの段階は，血流中での結合タンパクと除去剤と
の凝集体の形成，およびRESによるこれら凝集体の迅速
な除去に基づいている。この図では，血流中に形成され
た会合体は，肝臓,RESによる取込みの中心部位，により
除去されることが示されている。その迅速な除去のため
に，この除去剤は血流の外側に多少とも蓄積せず，それ
ゆえに血流の外側にすでに局在化している結合タンパク
の配置には，ほとんど影響を与えていない。
投与される除去剤の量は，除去段階時に処置された個
人の血流にあるように計算した抗体の分量に関して，好
ましくは約1:5−5:1の間のモル比である。実施例５のデ
ータからわかるように,24時間後の血流中に保持されい
る抗体量は，代表的には投薬した全量の約15−25％の間
にある。
この結合タンパクの除去のための全時間，すなわちエ
ピトープ性化合物の投与前の時間は,15分ほどの短さで
もよい。しかし，代表的には約0.5−１時間の範囲であ
る。実施例５のデータからわかるように，除去段階前と
後とで，血液により取込まれた（24時間放射能でラベル
された）エピトープ性キレートの量で測定すると,1時間
の除去段階で抗体の血中レベルが減り，抗体注入後24時
間で約25倍減少し，同時におそらく血流中で遊離の型で
得られるより多くのキレートのために，より多くのキレ
ートが，除去された動物の標的腫瘍組織内にて濃縮して
いた。血流からのタンパク除去の範囲は，血流からの循
環している画像用タンパクの迅速な除去に対して特異的
な抗体を用いる点で，以前に本発明者により観察されて
いるものと同様である（Goodwin,1984）。
C.エピトープ性化合物の取込み 最終の標的化の段階において，エピトープ性化合物の
局在化結合タンパクによる選択的取込みのために，エピ
トープ性化合物は非経口的に，より好ましくは静脈中に
投与される。第２図の下部に説明されているに，この段
階には，腎臓による血流からの迅速な除去に拮抗する，
局在化した抗体によるこの化合物の迅速な取込みが包含
される。
投与したエピトープ性化合物の量は，化合物の注射後
短期間に，通常は注射後１〜４時間以内に，標的部位に
化合物が所望の濃度となるように計算される。結合タン
パクと同様，この化合物に対する結合タンパクの既知の
結合アフィニティーと組合わせた動物モデル系の研究か
ら，最適投与量をおおよそ計算することができる。
エピトープ性キレート放射性核種化合物の腫瘍局在性
に関するいくつかの研究が行われており本発明を根拠づ
けている。そのような研究の１つでは，実施例５に詳述
してあるが，第１図ＡのBLEDTA−IV−111In化合物を抗
体注射後25時間，そしてヒト−トランスフェリン ベン
ジル−EDTA−In除去剤による抗体除去段階１時間で投与
した。化合物投与後３時間における，放射性標識の血
液，腫瘍，そして種々の他の組織への分布，およびそれ
に対応する腫瘍／器官の放射性活性比率を，実施例５の
表2Cに示す。そこに見られるように，腫瘍中の放射性標
識の量は，血液中のそれのほぼ10倍，そして腎臓と肝臓
とを含む主要内臓器官中のそれの数倍であった。それと
比較して，抗体除去段階を除いて，抗体注射23時間後の
１時間での化合物の取込みを実施例５の表2Bに示す。こ
こに見られるように，血液，肺および腎臓，そして他の
内臓器官における腫瘍対器官の比率は，通常,1未満であ
る。
実施例６で記述するもう一つの研究では，上記WC3A11
抗体を投与し，それに続き20時間後にトランスフェリン
標識TBEDTA−Coによる追出しを行った。１時間後，111I
n−BLEDTA IVを加え,3時間にわたり局在化と腎臓での除
去をさせた．処理を行った動物の全身放射性画像化は，
第３図Ａに見られるように，腎臓（Ｋ），膀胱（Ｂ）お
よび脇腹の腫瘍（Ｔ）中の標識の局在を示す結果を与え
た。標識注射後３時間の腫瘍，血液，そして他の組織中
の標識の分布を実施例５の表３に示す。そのデータは，
血液および他の内臓器官における高い腫瘍対器官の比率
を示す表2C中のデータと一致する。この研究に見られる
ような，腎臓中のより高い放射性標識レベルは，たぶん
放射性標識化合物の腎臓からのより遅い除去によるもの
であろう。
第３図Ｂは第３図Ａに画像化した動物のものと同じで
はあるが，化合物投与24時間後の動物のものを示す。よ
り長期間の画像化における主要な相違は，膀胱中の標識
が無いことである。低いバックグラウンドの良好な腫瘍
の画像化が達成される。
前述のことから，本発明のいかに種々の目的と特徴と
が達成されるかが理解され得る。この方法は選択された
標的部位への標的特異的抗体の蓄積を基礎にした，治療
的もしくは放射性画像化の化合物の選択的局在性を提供
する。この特徴は，治療物質による副作用の減少という
改善された治療的効果，そしてバックグラウンドレベ
ル，特に循環する放射性核種によるバックグラウンドレ
ベルの減少という改善された画像化を可能とする。
前記化合物の局在化は該化合物注射後短期間，たとえ
ば１〜４時間で起こるので，約１〜６時間の半減期をも
つ放射性核種が放射性画像化に用いられ得る。特に，こ
の方法では，半減期６時間の99mTcおよび半減期68分の
68Gaの両方を腫瘍や他の内臓標的部位の放射性画像化の
ために比較的低い放射性活性量で用いることができる。
放射性画像化剤としての68Gaの特に有利な点は，局在化
放射性標識の絶対量定量と5mmまでの解像度が可能な映
像化技術であるポジトロン エミッショントモグラフィ
ー（PET）における使用である。従来はPETに必要な放射
性核種のほとんどは，据付けのサイクロトロンが必要で
あった。本発明により,1時間以内に大量の放射性核種を
局在化させる能力は，より安価な68Ga発生器により生成
することができる放射性核種の量と適合する。
非局在化化合物の腎臓による迅速な除去は，全身中で
の化合物に付随する毒性を実質的に除くことができるこ
とを意味する。例えば111In放射性画像化の場合，局在
化部位での放射性核種の高いレベルを得るために，従来
は循環タンパクに金属を結合させることが必要であっ
た。この方法は数日間にわたっての血液中の高レベルの
放射性核種のために，安全に投与できるタンパクに結合
した金属の量により制限される。本発明では，非局在化
放射性核種の大部分は数時間で除去される。この有利な
点は，標的部位で効果的な薬剤レベルを達成するために
は大量に投与しなければならない抗腫瘍薬剤のような治
療薬にも適用される。従来は，大量な投与量に伴う重大
な副作用のために，多くの抗腫瘍薬剤においては薬剤投
与が制限されている。本発明では，標的部位における高
濃度の結合タンパクの存在のために，その部位への薬剤
の特異的結合により，より少ない注射薬剤量で腫瘍部位
の治療に効果的な薬剤濃度を得ることが可能となる。
次に述べる実施例は，本発明の調製および使用法の特
別な実施態様を説明しているが，本発明の範囲を限定す
るものではない。
実施例１ TBEDTAの調製 1,4−ブタンジチオールはAldrich Chemical Co.（Mil
waukee,WI）から得;p−ブロモアセトアミドベンジルEDT
A（BABE−EDTA）は,DeRiemer（1981）に記されている方
法で調製した。キャリアーのない111InCl3は,Medi−Phy
sicsから得,DeRiemer（1981）の方法で精製した。
10倍モル過剰の1,4−ブタンジチオールを全水溶液量
を15ml中でBABE−EDTAに結合させた。そしてその溶液を
水酸化ナトリウムでpH8.2に調整した。反応は室温で進
行させ，薄層クロマトグラフィーでモニターした。メタ
ノール：酢酸アンモニウム水溶液（1:1）溶媒系でシリ
カゲル板で展開したときのRf値は約0.7だった。
反応液をエーテルで抽出し，過剰のジチオブタンを除
去し，ジチオブタンBABE−EDTA（TBEDTA）生成物を乾燥
させた。乾燥物を0.1M酢酸緩衝液に再溶解させた。
TBEDTAのCoまたはIn金属キレートを形成させるため
に，該金属イオンの入った0.01M塩酸約50μｌを，等モ
ル容量の0.5mM TBEDTAに加えた。ボルテックス混合後，
この溶液をNaHCO3で中和した。TBEDTA−InおよびTBEDTA
−Co化合物は，それぞれTLCで単一のRf値を示した。
実施例２ Anti−TBEDTA−Co Mabsの調製 キーホール リムペット ヘモシアニン（Keyhole li
mpet hemocyanin;KLH）は,Calbiochem Co（LaJolla,C
A）から得た。
タンパクをリン酸緩衝液に溶かし，トラウト試薬,2−
イミノチオレートと，モル比1:100（タンパク：試薬）
で標準条件下で反応させた。トラウト試薬は，タンパク
質のリジンのアミノ基と反応し,4−カーボンアミジンを
形成し，スルヒドリル基をなくす。分子ふるいクロマト
グラフィーで過剰のトラウト試薬を除去した後，タンパ
クを10倍モルの過剰のBABE−EDTA−Coと，実施例のよう
な条件で反応させた。得られたタンパク生成物は次式で
示される： KLH−−−NH−Ｃ(NH2)−CH2−CH2−CC2−Ｓ−BABE−EDT
A−Co ここで,KLH−−−NH2は,KLHのリジニルアミンである。
誘導されたタンパクを分子ふるいクロマトグラフィー
で未反応のTBEDTA−Coと分離し，約24mg/mlまで濃縮
し，マウスに注射するためにフロイント アジュバント
（Freund's adjuvant）と混合し，約５〜10μg/動物に
なるようにした。マウスのミエローマ細胞，ラインP3X6
3−Ag8.653は,American Type Culture Collection,Rock
Lawn,MDから得,ATCCのCRL 1580と同定される。マウス
のIgGイムノグロブリンに対する酵素ラベルしたヤギの
抗マウス抗体は,Sigma Chemical Co.（St.Louis.Mo）か
ら得，IgG1，IgG2a，IgG2bおよびIgG3イムノグロブリン
に対して特異的なサブクラス特異性ヤギ抗マウス抗体
は,TAGO,Inc,（Burlingame,CA）から得た。
雌のBalb/Cマウスを，ハプテン／アジュバントで免疫
し，免疫４週間後にこのマウスからの脾臓細胞を採取し
た。これをマウスのミエローマ細胞と細胞比で1:2の割
合で混合した。この細胞を，血清なしのRPMIで洗浄し，
ペレットを形成させた。このペレットを，あらかじめ37
℃に加温したRPMI1mlと45％（V/V）のポリエチレングリ
コール（分子量1430〜1570;BDH Chemicals,Poole,Engla
nd）との溶液に再懸濁した。２分後に，室温で細胞懸濁
液をRPMIで6mlに希釈し,500gで３分間遠心分離し融合を
開始して８分後，細胞のペレットを10％FCSで洗浄し
た。
融合細胞を20％FCSと100μＭとヒポキサンチンと19μ
Ｍチミジンとを含むRPMI（HT培地）に懸濁し，105細胞
／ウェルになるように,60ウェルトレイ，合計2000ウェ
ルのマイクロタイターウェルにプレートした。培養は６
％二酸化炭素中37℃の湿らせた培養器で行った。24時間
後，培地をHT培地に800nMのアミノプテリンを加えた選
択培地（HAT培地）に変えた。HAT選択培地はHT培地に変
えるまでの14日間使用した。このときに，融合していな
いマウスのミエローマ細胞および融合していない脾細胞
は100％死に至った。
マイクロタイターの各ウェルの細胞上澄液は，抗−TB
EDTA−Co抗体で，固相酵素イムノアッセイで測定した。
固相測定試薬は，マルチウェルプレートのマイクロタイ
ターウェルの底に，ヒト トランスフェリンが結合した
TBEDTA−Co（実施例３）を吸着させて調製した。アッセ
イにおいては，各ウェルの培養上澄液50μｌを，ウェル
に加え，吸収された抗原に室温で60分間反応させた。ウ
ェルを数回緩衝液で洗浄後,50μｌの酵素ラベルしたヤ
ギの抗マウスIgG抗体を加え，再び室温で60分インキュ
ベートした。さらに洗浄後，標準法により定性的呈色反
応によってウェルに結合した酵素を測定した。
８つのウェルの抗−TBEDTA抗体を同定し，これらの親
細胞系のうち３つを，クローナル抗体プロデューサーを
選択するためにマイクロタイターウェル中で，リミティ
ングダイリューションにより，クローニングした。細胞
上澄液は，上記のように抗−TBEDTA抗体でアッセイし
た。３つの親細胞系それぞれからのクローナル抗体を生
産する子孫を選択した。３つの細胞系を,WC3A11,WC4B7
およびWC3F5と同定した。３つの細胞系はすべて，数ヵ
月間安定な抗体生産がみられた。
IgGサブクラスと,TBEDTA−Co,TBEDTA−In（それぞれ
第１図の化合物ＢのCoおよびInのキレートである）およ
び,BLEDTA−IV−In（第１図の化合物ＡのInキレートで
ある）の抗体結合親和性とを表１に示す。３つの抗体の
抗体サブクラスは，それぞれサブクラス特異的な，特異
的ヤギの抗−マウスイムノグロブリンを用いた標準的な
イムノディフュージョン沈澱法によって決定した。３つ
のモノクローナル抗体の結合定数は，標準的なELISA法
（Friguet）によって決定した。結合定数は，M-1単位で
表現されている。結合定数値の下のかっこ内に示された
数値は，対応するCoまたはIn放射性核種を含む，抗体／
キレート複合体を投与24時間後の放射性核種金属の全身
での保持率を示している。
結合データは,3種の抗体すべてがCo−TBEDTAに高い親
和性をもつことを示す。これらのハプテンがマウスの抗
体を刺激するために使われた。対応するIn−TBEDTA化合
物に対する結合定数はさらに小さく，いくらか抗体に包
含される金属に特異性があることを示した。しかしなが
ら，抗体はすべてIn−BLEDTA−IV化合物に強く反応し
た。これは,TBEDTAの中にチオブタン/BABE/EDTA構造を
含んでおり，特異性は，主としてCo−TBEDTAハプテンの
非金属部分によることを示唆した。結合定数のデータ
は，すべての抗体の保持率のデータと一致し，これは，
（研究されたWC3A11抗体に対し）実質的に,Co−TBEDTA
およびIn−BLEDTA−IV化合物は，より強固に結合してい
ないIn−TBEDTA化合物よりも保持率が大きいことを示
す。
実施例３ TBEDTA誘導 ヒト トランスフェリンの調製 ヒト トランスフェリンをリン酸緩衝液に懸濁し，ま
ず最初に，約10倍過剰の実施例２のトラウト試薬と反応
させた。未反応のトラウト試薬を除去した後、誘導され
たタンパクを，種々の倍量過剰のBABE−EDTA−Coと，実
施例２のように反応させて，誘導タンパクを形成させ
た。このタンパクは,1モルのタンパクに対して約４モル
のBABE−EDTA−Coが結合している。過剰のキレートは，
分子ふるいクロマトグラフィーで除去され，タンパクが
濃縮された。
実施例４ 動物腫瘍に対するTBEDTA−111Inの標的化 実施例１で行ったようにして,EDTAおよびBABE−EDTA
を，111Inおよびブレオマイシン，そして57Coで複合体
化した。BLEDTA−II−111In，ブレオマイシン−EDTA−I
n化合物は，ブレオマイシンとEDTA部分との間にジチオ
ブタン結合を含んでいないもので,DeRiemer,1979に従っ
て調製された。BLEDTA−IV−111In，ブレオマイシン−E
DTA−In化合物は，ジチオブタンスペーサーを介してブ
レオマイシンと結合したEDTAを含んでおり，共同特許出
願している“ブレオマイシン結合物および方法”を適用
して調製した。TBEDTA−111Inは，実施例１のように調
製した。WC3A11抗体複合体は，実施例２で得られWC3A11
抗体と，選択した111In cpm量の，（ａ）111In−EDTA,
（ｂ）111In−BABE−EDTA,（ｃ）BLEDTA−II−111In，
（ｄ）BL−57Co，（ｅ）BLEDTA−IV−111In，または
（ｆ）TBEDTA−111Inとインキューベートして形成させ
た。
各抗体/EDTA−111Inまたは57Co複合体（ａ）〜（ｆ）
は約200〜800μg/動物になるような量を，各３匹のBalb
/Cマウスの静脈に注射した。注射して24時間後の動物体
全体の111Inの放射活性を，デュアル−プローブ シン
チレーションカウンターで測定した。その測定値を３匹
の動物で平均した。化合物（ａ）〜（ｄ）の抗体複合体
（これらはチオブタン−BABE−EDTA部分を含まない）で
は,24時間後の保持率はすべて約５％未満であった。対
照的に，化合物（ｅ）および（ｆ）の抗体複合体（両方
ともチオブタン−BABE−EDTA部分を含む）は,24時間後
に，最初の抗体量が約180μｇのとき30％を越える割合
で，そして約800μｇのとき約70％を越える割合で保持
されていた。
実施例５111 Inによる腫瘍標的化 本実施例では，本発明方法による動物腫瘍の111Inに
よる標的化を調べた。Balb/Cマウスの脇腹に,KHJJ腺状
組織悪性腫瘍の組織片を移植した。CHA255であると同定
された,L−ベンジル−EDTA−Inに対して特異的なハイブ
リドーマ 細胞系は，実施例２に述べた方法で,KLHから
誘導された免疫源,L−ベンジル−EDTA−In（パラ−ニト
ロフェノールベンジル−EDTA−In）グループを使って調
製された。
最初の実験では,3匹のマウスは,100μｇ（約0.7nモ
ル）のCHA255抗体がＬ−ベンジル−EDTA−111In化合物
と結合したものを注射した。24時間後，動物を殺し，血
液，腫瘍，および表2Aにあげたいくつかの組織の111In
レベルを調べた。放射活性レベルは，組織1gあたりの総
放射活性パーセントから算出した。３匹のマウスの平均
値と，標準偏差値とが表2Aの中央の欄に示されている。
腫瘍／組織（T/O）比は表の右欄に示されている。表か
らわかるように，腫瘍部分にも高割合の放射活性が残存
しているが，血液中に多くの放射活性が残存しているこ
とがわかる。
第２の実験では，まず抗体だけを３匹の動物にそれぞ
れ投与し,23時間局在化させた後,L−ベンジル−EDTA−
111In化合物を投与した。１時間後，動物を殺して再び
放射活性レベルを調べた。表2Bから，通常，抗体とIn化
合物とを同時に投与したときと比べて，低いレベルの腫
瘍の取り込みおよび低いレベルの腫瘍／組織取り込み
比，そして,In化合物の高い血中レベルが観察されるこ
とがわかる。
第３の実験では，本発明による抗体，抗体クリアラン
スおよび化合物の投与を実行することによって達成され
る腫瘍の局在化の割合を調べた。CHA255抗体を,3匹の動
物にそれぞれ投与し,24時間局在化させた後,L−ベンジ
ル−EDTA−In誘導のトランスフェリンから成る除去剤を
投与することで抗体を血液中から除去した。一時間後
に,L−ベンジル−EDTA−111In化合物を投与し，その３
時間後に，動物を殺した。表2Cのデータからわかるよう
に，腫瘍中の濃度にくらべて，血液中や，内部組織中の
Inレベルは，大幅に減少していた。
実施例６ 腫瘍の像 ３匹のA Balb/Cマウスの脇腹にKHJJ腺状組織悪性腫瘍
を移植した。このマウスに約100μｇのWC3A11抗体（実
施例２）を投与した。抗体を投与して20時間後、動物に
実施例３にあるトランスフェリン/BABE−EDTA−Co除去
剤を与えて追跡した。１時間後（抗体投与から21時間
後），動物にBLEDTA−IV−111Inを注射した。３時間
後，コンピューター ディジテイションを使って，動物
の全身画像を走査した。得られた動物の１匹の代表的な
画像を第３図Ａに示す。画像は放射活性が，腎臓
（ｋ），膀胱（Ｂ），および腫瘍領域（Ｔ）に集中して
いることを示している。３時間後に投与した111Inの約1
6％が残っていた。動物の２匹をこの時点で殺し，血
中，腫瘍，表３に示すそして他の組織中の，111Inレベ
ルを測定した。この表からわかるように，この方法は，
良好な腫瘍による取り込みを示し，腫瘍対血液比が高
く，腫瘍対腎臓比が低い。これは，（ａ）腫瘍中の放射
活性の局在化および（ｂ）腎臓による迅速な血液中の放
射活性の除去，と一致する。
同様の全身画像の走査を24時間後に行った（抗体投与
から48時間後）。得られた画像を第３図Ｂに示す。これ
は，最初のスキャンと同じようであるが，膀胱中の相対
値が比較的減少している。最初に注射した111In物質の
約14％が存在していた。
本発明は，特殊な実施態様および特徴について述べら
れているが，種々の変形および修飾，特にエピトープ性
化合物およびそれに関連した結合タンパクに関しての変
形および修飾が本発明の主旨から離れることなくなされ
ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
第１図は，（Ａ）プレオマイシン−EDTA金属キレートお
よび（Ｂ）ジチオブタン−EDTA−金属キレートの分子構
造を示す。これらは，本発明の方法により固形腫瘍に標
的化し得るエピトープ化合物の代表的な実施態様であ
る。 第２図は，本発明の方法により治療用あるいは放射性診
断用の化合物が組織内で局在化する段階を，図式により
示す。 第３図は，腫瘍を保持している動物における，本発明の
方法により放射性核種−キレート化合物の投与後３時間
（Ａ）および24時間（Ｂ）の全身の光励起走査を示す。
フロントページの続き (72)発明者 ミカエル マッコール アメリカ合衆国 カリフォルニア 95688 ヴェイカヴィル，リッジウッド ドライ ブ 513

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】薬剤成分が被験体に連続的に非経口投与さ
    れるとき、該被験体の内部の標的部位に診断用薬剤また
    は治療用薬剤を局在化させる薬剤成分を有する組成物で
    あって、該薬剤成分が、 該被験体に非経口投与された際、該標的部位に選択的に
    局在化し得るアビジン含有結合タンパク； ビオチン化タンパクを含有する除去剤であって、該ビオ
    チン化タンパクが、分子量が少なくとも50,000ダルトン
    であり、タンパク：ビオチン比が少なくとも1:4であ
    り、該被験体の血液中を循環している該結合タンパクと
    反応して、該被験体の特定の細網内皮系により除去され
    る高分子凝集体を形成し得る除去剤；および、 ビオチンで誘導された薬剤を含有するビオチン化化合
    物、 を含有する、組成物。
  2. 【請求項２】前記結合タンパクがアビジンまたはストレ
    プトアビジンである、特許請求の範囲第１項に記載の組
    成物。
  3. 【請求項３】前記結合タンパクがアビジンあるいはスト
    レプトアビジンに結合した抗体である、特許請求の範囲
    第１項に記載の組成物。
  4. 【請求項４】前記標的部位に放射性核種を運ぶために用
    いられ、前記ビオチン化化合物が、安定な金属キレート
    錯体を形成するために金属放射性核種イオンと錯体化し
    たビオチン化キレート化合物である、特許請求の範囲第
    １項ないし第３項のうちいずれか１つに記載の組成物。
  5. 【請求項５】前記キレート化合物が、１−フェニルまた
    は１−ベンジルEDTAの金属キレートである、特許請求の
    範囲第４項に記載の組成物。
  6. 【請求項６】前記キレート化合物が、前記ベンジル部分
    にチオブタンスペーサーアームにより結合した金属キレ
    ートである特許請求の範囲第５項に記載の組成物。
  7. 【請求項７】固形腫瘍の治療に用いられ、前記金属キレ
    ートが90Y、197Hgまたは67Cuのキレートであり、もしく
    は体内の腫瘍を放射線感作するのに用いられ、該金属キ
    レートが鉄、銅またはルテニウムである、特許請求の範
    囲第４項ないし第６項のうちいずれか１つに記載の組成
    物。
  8. 【請求項８】体内の腫瘍の放射性画像化に用いられ、前
    記金属キレートが111In、67Ga、64Cu、99mTc、68Ga、62
    Zn、67Cu、197Hg、97Ru、57Coまたは53Coのキレートで
    ある、特許請求の範囲第４項ないし第６項のうちいずれ
    か１つに記載の組成物。
  9. 【請求項９】前記結合タンパクが、腫瘍に血液を供給す
    る毛細管壁を通して選択的に透過性のある、特許請求の
    範囲第１項ないし第８項のうちいずれか１つに記載の組
    成物。
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