DE3781946T2

DE3781946T2 - Therapeutische oder radiodiagnostische substanz.

Info

Publication number: DE3781946T2
Application number: DE8787304796T
Authority: DE
Inventors: David A Goodwin; Michael Mccall; Claude Meares
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1986-06-23
Filing date: 1987-05-29
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2007-05-30
Also published as: JPH085808B2; US4863713A; EP0251494B1; EP0251494A3; JPS635033A; ATE81018T1; EP0251494A2; DE3781946D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine therapeutische oder diagnostische Substanz und insbesondere ein Radionuclid, um eine ortsspezifische Lokalisierung des Wirkstoffes zu erzeugen.

Referenzen

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Ein Hauptgebiet der gegenwärtigen Arzneimittelforschung ist die Verbesserung der Arzneimittelzielsteuerung zu Zielorten im Körper, wie etwa festen Tumoren oder spezifischen Organen.
Die Aufgabe der Arzneimittelzielsteuerung ist es, die Wirksamkeit des Arzneimittels zu verbessern, indem es am Zielort konzentriert wird, und seine Wirkungen an Nicht-Zielorten zu verringern. Wo das Arzneimittel beispielsweise für therapeutische Zwecke, wie etwa zur Behandlung eines festen Tumors verwendet wird, erlaubt eine Arzneimittelzielsteuerung eine wirksamere Dosierung am Zielort mit weniger nicht den Tumor betreffenden Nebenwirkungen. Ist das Arzneimittel ein Radionuclid zur Anwendung bei der Radioabbildung bzw. Radiodiagnose, bewirkt die Zielsteuerung entsprechend einen erhöhten Kontrast zwischen dem Ziel und Hintergrundbereichen aufgrund verringerter Hintergrundkonzentrationen des Radionuclids.
Radionuclide sind eine wichtige Gruppe von pharmazeutischen Wirkstoffen, für die eine Reihe von Zielsteuerungsstrategien vorgeschlagen worden ist. Diese Gruppe umfaßt radiodiagnostische Substanzen, wie etwa Metallchelate von ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup4;Cu, 99mTc, &sup6;&sup8;Ga, &sup6;²Zn, &sup5;&sup7;Cu, ¹&sup9;&sup7;Hg, &sup9;&sup7;Ru, &sup5;&sup7;Co oder &sup5;³Co, die zur Abbildung von Orten im Körper, insbesondere festen Tumoren durch intravenöse Verabreichung und systemische Aufnahme der Chelate verwendet werden. Ebenfalls umfaßt sind radiotherapeutische Mittel, wie etwa die Metallchelate von &sup9;&sup0;Y, ¹&sup9;&sup7;Hg oder &sup6;&sup7;Cu oder Konjugate anderer radioaktiver Elemente, wie etwa ¹³¹I, die zur Behandlung von Tumoren und dgl., basierend auflokalisierter Zellzerstörung durch ionisierende Strahlung verwendet werden. Eine verwandte Gruppe pharmazeutischer Mittel sind nicht radioaktive Metallchelate, wie etwa Eisen-, Kupfer- oder Rutheniumchelate, die zytotoxische Wirkungen durch Redoxmechanismen erzeugen und auch die zytotoxische Wirkung von Strahlung auf Zellen vergrößern können.
Zuvor haben die Erfinder mehrere neue Chelatverbindungen beschrieben, die sich zur Zielsteuerung von Radionucliden und radiosensibilisierenden Metallen zu Stellen im Körper, insbesondere festen Tumoren, eignen. Im allgemeinen sind diese Verbindungen bifunktionelle Chelatoren, die als eine funktionelle Gruppe eine Chelatgruppierung enthalten, die einen festen Komplex mit einem Metallion bilden kann, und als zweite funktionelle Gruppe eine chemische reaktive Gruppierung, wie etwa eine Nitro- oder Amingruppe, enthalten, durch die die Substanz an ein Zielsteuerungsmolekül oder ein anderes Molekül gebunden werden kann (Meares, 1976; Goodwin et al., 1975, 1976, 1979).
Eine neue Klasse von Chelatverbindungen, die von den Erfindern entwickelt worden ist, sind verschiedene Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Chelate von Bleomycin, das ein Antitumorantibiotikum ist, welches sich innerhalb vieler Tumortypen lokalisiert (Umezawa, Fujii). Es wurde gezeigt, daß die Bleomycin/EDTA-Substanzen eine selektive Tumorlokalisierung einer Reihe von Radionucliden einschließlich &sup5;&sup7;Co und ¹¹¹In in festen Tumoren bewirken. Eine der frühesten dieser Substanzen wurde durch Alkylierung von gereinigtem Bleomycin A&sub2; mit einer reaktiven bifunktionellen Verbindung, wie etwa p-Bromacetamidobenzyl-EDTA (BABE-EDTA) hergestellt, um das Chelat über eine Sulfoniumgruppe an Bleomycin zu koppeln (DeRiemer; Goodwin, 1979, 1981; Chang).
Eine der Beschränkungen, die bei der Zielsteuerung kleiner Radionuclidsubstanzen, wie etwa den obigen Bleomycin/Metallchelat-Substanzen, zu einem Zielort, wie etwa einem festen Tumor, beobachtet wurde, ist die relativ geringe Konzentration der Verbindung am Zielort. Die geringe Wirkstoffdosis am Zielort wird durch die schnelle Ausscheidung der Substanz durch die Nieren verursacht, wodurch die Menge der Substanz im Blutstrom, die für die Lokalisierung am Zielort verfügbar ist, begrenzt wird. Eine einfache Erhöhung der Dosis der verabreichten Verbindung ist keine praktische Lösung, da die meisten Radionuclide toxisch und daher begrenzt dosierbar sind.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration einer begrenzt dosierbaren, aber schnell ausgeschiedenen Zielsubstanz besteht darin, die Substanz in einer Antikörper-komplexierten Form zu verabreichen. Aufgrund seiner relativ großen Ausmaße wird der Komplex nicht von den Nieren ausgeschieden, sondern er wird stattdessen langsam über eine Dauer von mehreren Tagen durch das retikuloendotheliale System (RES) aus dem Blutstrom entfernt. Diese Methode wurde zuvor von den Erfindern untersucht, wobei zwei monoklonale Antikörper (MAKs) verwendet wurden, die gegen die bifunktionelle Indium/Chelat- Verbindung L-Benzyl-EDTA-¹¹¹In (LBEDTA-In) hergestellt wurden. Bindungsuntersuchungen zeigten, daß beide Antikörper spezifisch für das Indiumchelat waren und Kb-Werte für das Indiumchelat ergaben, die mindestens 20 mal höher als solche der Chelate von anderen Metallen waren. Die Antikörper vergrößerten bei gemeinsamer Verabreichung mit BLEDTA-¹¹¹In die Gesamtkörper-Konzentration von BLEDTA-¹¹¹In nach 24 Stunden zwischen 10 bis 30 mal, vermutlich indem die BLEDTA-In-Verbindung in festgebundener systemischer Form gehalten wurde, die langsam aus dem Blutstrom entfernt wird.
Die erhöhte Aufnahme der Verbindung in Gegenwart zirkulierender Anti-Substanz-Antikörper ist jedoch ein relativ unspezifischer Effekt, da eine Reihe von Organen, die auf ¹¹¹In- Konzentrationen getestet wurden, ebenfalls nach 24 Stunden eine deutlich erhöhte Radioaktivität zeigten. Daher wird der durch gemeinsame Verabreichung eines Antikörpers bewirkte Vorteil einer gesteigerten Tumoraufnahme der Verbindung durch (1) höhere Hintergrundkonzentrationen an Radioaktivität (oder eines therapeutischen Mittels) in Nicht-Tumororganen und (2) eine größere Gesamtexponierung des Patienten gegenüber dem Konjugat, d.h. größere Strahlungsexponierung im Falle eines Konjugats mit einem chelatierten Radionuclid teilweise beseitigt.
Obwohl es möglich sein könnte, diese unerwünschten Nebeneffekte durch Spülung des Blutstroms des Patienten mit einem nicht toxischen oder nicht radioaktiven kompetierenden Antigen zu verringern, ist die Verbesserung bezüglich einer verringerten Exponierung gegenüber der Substanz nicht dramatisch. Führere Studien, die von den Erfindern durchgeführt wurden, zeigten beispielsweise, daß Ganzkörper-BLEDTA-¹¹¹In- Konzentrationen nur um etwa 20 % 3 Stunden nach Verabreichung einer Spülungsdosis von Fe-EDTA verringert waren. Weiterhin erfordert die gerade beschriebene Antikörper-Steigerungsmethode Zeiten von mindestens einigen Stunden für signifikante Zielverteilungseffekte, daher eignet sich die Methode nicht für Radionuclide, wie etwa 99mTc und &sup6;&sup8;Ga, die Halbwertszeiten zwischen 1 und wenigen Stunden aufweisen.
Das erfindungsgemäße System umfaßt (a) eine biotinylierte Substanz, die das zu lokalisierende Mittel enthält, (b) ein Avidin enthaltendes Protein, das, wenn man es einem Patienten parenteral verabreicht, zur selektiven Lokalisierung an einem Zielort in der Lage ist, und (c) ein Reinigungsmittel, das, wenn es im Blutstrom des Patienten zirkuliert, mit dem Bindeprotein reagieren kann, um ein makromolekulares Aggregat zu bilden, welches durch das retikuloendotheliale System des Patienten beseitigt werden kann.
Die einzelnen Komponenten des Systems zur Anwendung bei der Diagnose oder Therapie unter Verwendung des obigen Systems sind in der Erfindung enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin nur beispielhaft bezüglich der beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
Figur 1 die molekulare Struktur einer biotinylierten EDTA- Metallchelat-Substanz zeigt, die zur Anwendung in der Erfindung vorgesehen ist;
Figur 2 schematisch die Schritte zeigt, durch die eine therapeutische oder diagnostische Substanz nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Gewebe lokalisiert wird, wobei in der Figur "Li" die Leber und "K" die Nieren bezeichnet und
Figur 3 Ganzkörper-Emissionsaufnahmen eines Tumor-tragenden Tieres 3 Stunden (A) und 24 Stunden (B) nach Verabreichung einer Radionuclid-Chelatverbindung zeigt.

I. Herstellung der Systemkomponenten

A. Biotinylierte Verbindungen

Die Erfindung ist für den Einsatz bei der Zielsteuerung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels zu einer spezifischen Stelle innerhalb des Körpers, wie etwa einem festen Tumor oder einem bestimmten Organ- oder Gewebeort vorgesehen. Das zielgesteuerte Mittel ist eine biotinylierte Substanz mit einer pharmazeutisch aktiven, therapeutischen oder diagnostischen, insbesondere radiodiagnostischen Gruppierung (der aktiven Gruppierung) und einer oder mehreren Biotingruppierungen, die spezifisch mit hoher Affinität an ein Avidin enthaltendes Bindeprotein binden können.
Die aktive Gruppierung der Verbindung ist ein pharmazeutisch aktives Mittel, wie etwa ein Arzneimittel, Radionuclid, Hormon, Toxin, Metabolit, Antimetabolit, Vitamin, Enzym-Cofaktor oder dgl., das ohne Verlust der Aktivität mit einer oder mehreren Biotingruppen derivatisiert werden kann. Solche Wirkstoffe umfassen Antitumormittel, beispielsweise Doxorubicin, Cisplatin, DNA-alkylierende oder quervernetzende Mittel und Antimetaboliten; und antimikrobielle Wirkstoffe, wie etwa Aminoglykoside und Polyen- und Makrolidantibiotika, wie etwa Amphotericin B. Eine Hauptklasse von in der Erfindung geeigneten therapeutischen und diagnostischen Mitteln sind chelatierte Metalle, einschließlich chelatierter Radionuclide, die sich zur Radiodiagnostik eignen, wie etwa ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup4;Cu, 99mTc, &sup6;&sup8;Ga, &sup6;²Zn, &sup6;&sup7;Cu, ¹&sup9;&sup7;Hg, &sup9;&sup7;Ru, &sup5;&sup7;Co oder &sup5;³Co, chelatierte Radionuclide, die sich zur Tumortherapie eignen, wie etwa &sup9;&sup0;Y, ¹&sup9;&sup7;Hg oder &sup6;&sup7;Cu und radiosensibilisierende chelatierte Metalle, wie etwa chelatiertes Eisen, Kupfer oder Ruthenium.
Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert, daß die biotinylierte Verbindung ausreichend klein und löslich ist, daß sie bei parenteraler Verabreichung rasch von den Nieren ausgeschieden werden kann. Typischerweise erfüllen Moleküle mit Molekulargewichten von weniger als 50.000 Da und vorzugsweise weniger als 10.000 Da, die im Serum überwiegend in monomolekularer Form vorliegen, im allgemeinen diese Erfordernisse.
Verfahren zur Derivatisierung kleiner Zielmoleküle mit einer oder mehreren Biotingruppen erfolgen nach wohlbekannten Kupplungsprozeduren zur Biotinylierung von Substanzen an chemisch reaktiven Gruppen, wie etwa Carboxyl-, Amino-, Nitro-, Hydroxyl-, Aldehyd- und Sulfhydrylgruppen. In einem bevorzugten Verfahren wird der N-Hydroxysuccinimidester von Biotin (Biotin-NHS), eine kommerziell erhältliche Verbindung, zur Kupplung über eine Amidbindung direkt mit einer Amingruppe in der Zielsteuerungssubstanz umgesetzt. Die Amingruppe kann selbst an die Zielsteuerungssubstanz als Spacerarm angefügt werden, der ebenfalls durch Standardkupplungstechniken an die Zielsteuerungsverbindung gekuppelt wird. Die in Figur 1 gezeigte biotinylierte EDTA-Verbindung wurde beispielsweise durch Reaktion von Putrescein (1,4-Butandiamin) mit p-Isothiocyanatobenzyl-EDTA gebildet, um den Putresceinspacerarm an die bifunktionelle EDTA-Verbindung zu kuppeln. Eine Derivatisierung mit Biotin-NHS ergab dann die gewünschte biotinylierte Verbindung. Andere Kupplungsmethoden, die sich zur Herstellung biotinylierter Zielsteuerungsmoleküle eignen, sind verfügbar und dem Fachmann bekannt.
Biotinylierte Verbindungen, die zwei oder mehrere Biotingruppen enthalten, um eine verbesserte Bindung an Avidin oder Streptavidin zu ergeben, können nach denselben allgemeinen Methoden hergestellt werden, wie oben diskutiert. Bei der Derivatisierung eines Wirkstoffes mit mehreren Biotingruppen können die einzelnen Gruppen an unterschiedliche Stellen auf einem Wirkstoff angeheftet werden oder an unterschiedlichen Positionen auf einem einzigen Spacerarm an den Wirkstoff angeheftet werden.

B. Avidin-enthaltende Bindeproteine

Das Avidin enthaltende Bindeprotein in dem erfindungsgemäßen System dient sowohl als Zielsteuerungsmittel, das zur spezifischen Lokalisierung an einem Zielort innerhalb des Körpers in der Lage ist, als auch als Bindemittel zur Bindung der biotinylierten Substanz am Zielort.
Die Erfinder haben zuvor ein Zielsteuerungssystem beschrieben, bei dem das Bindeprotein ein Antikörper ist, der spezifisch an eine Hapten-derivatisierte Substanz binden kann. Während Antikörper den Vorteil zeigen, daß sie gegen eine weite Reihe von Epitopen hergestellt werden können, hat Avidin den Vorteil einer sehr hohen Bindeaffinität (etwa 10¹&sup5; M&supmin;¹) für das Epitop Biotin im Vergleich zu Bindeaffinitäten zwischen 10&sup9; und 10¹² für Hapten/Antikörper-Paare. Der Vorteil der hohen Bindungskonstante in der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Erfindung unter Verwendung erheblich geringerer Mengen an injiziertem Bindeprotein ausgeführt werden kann. Speziell die Menge an Avidin, die injiziert werden muß, kann um mehrere Größenordnungen geringer als die Menge an Antikörper sein, die zur Erzeugung gleicher Konzentrationen an gebundener Zielsubstanz am Zielort benötigt wird. Demnach werden Probleme der Immunreaktion, die durch parenterale Verabreichung relativ großer Dosen an fremdem Protein verursacht werden können, stark vermindert.
Avidin, ein Eiprotein, und Streptavidin sind in gereinigter Form, die für die Anwendung zur Behandlung am Menschen geeignet ist, kommerziell verfügbar. Diese Proteine können mit Antikörper- oder Antikörperfragment-Moleküle nach bekannten Kupplungsmethoden, die Kondensations- und Quervernetzungsreaktionen umfassen, derivatisiert werden. Das im Beispiel 2 beschriebene Konjugat monoklonaler Antikörper/Streptavidin wurde unter Verwendung der Quervernetzungsreagenzien 2-Imminothiolan und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1- carboxylat nach bekannten Methoden hergestellt. Auch andere Kupplungsmittel, wie etwa lösliche Carbodiimide und Di-N- hydroxysuccinimid-Verbindungen können verwendet werden.
In Anbetracht der Zielsteuerungsfunktion des Bindeproteins beruht die Erfindung auf der Fähigkeit des Proteins bei parenteraler Verabreichung zur selektiven Lokalisation aus dem Blutstrom zum Zielort. Für eine wirksame Lokalisation ist erforderlich, daß das Protein (a) eine relativ lange Zirkulationshalbwertszeit im Blutstrom aufweist und (b) sich im Zielorgan akkumulieren kann. Bezüglich der Größenerfordernisse sind Avidin, Streptavidin und damit derivatisierte Antikörper oder Antikörperfragmente groß genug, um eine schnelle Ausscheidung durch die Nieren zu vermeiden, aber nicht so groß, um eine schnelle Ausscheidung durch das RES zu bewirken. Besonders geeignet sind Bindeproteine einschließlich verschiedener Arten von im folgenden diskutierten Hybridproteinen im Größenbereich zwischen 50-500.000 Da.
Die Zielsteuerungsfähigkeit des Bindeproteins kann auf der Fähigkeit des Proteins zur spezifischen Bindung an Zielort- Antigene oder auf Eigenschaften der Proteingröße oder Permeabilität oder auf einer Kombination dieser Faktoren beruhen. Die meisten Zielorte einschließlich Tumorzielorten enthalten gewebespezifische Oberflächenantigene, gegen die das Bindeprotein gerichtet werden kann, und es wurde von Antikörpern, wie etwa in Beispiel 2 verwendet, berichtet, die spezifisch gegen eine Reihe normaler und bösartiger Gewebe sind. Der Antikörper kann ein vollständiger Serum- oder vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der gegen Zielgewebe-Antigene spezifisch ist, oder ein Antikörperfragment sein, wie etwa das durch enzymatische Spaltung eines vollständigen Antikörpers erzeugte F(ab')&sub2;- oder Fab-Fragment. Im Antikörper- Avidin-Konjugat ist die angestrebte Funktion der Antikörper oder Antikörperfragmente im Hybridprotein die Gewebesteuerung, während die Avidingruppe für die Hochaffinitätsbindung mit Biotin-markierten Substanzen, die an den Ort gesteuert werden, sorgt.
In einer anderen Ausführungsform, die zur Tumorzielsteuerung geeignet ist, beruht eine selektive Proteinlokalisation im Tumor auf der Fähigkeit des Proteins zur selektiven Penetration der permeableren, d.h. durchlässigen Kapillaren, die normalerweise bei festen Tumoren auftreten. Der Vorteil dieser Methode ist die größere Einfachheit bei der Herstellung des Bindeproteins.
Die folgenden Beispiele 1 und 2 veranschaulichen Tumorzielsteuerung mit Streptavidin alleine (Beispiel 1) und Streptavidin, konjugiert mit einem monoklonalen Antitumor- Antikörper.

C. Reinigungsmittel

Im erfindungsgemäßen System ist die Funktion des Reinigungsmittels eine Bindung an und die Quervernetzung von Bindeproteinen, die im Blutstrom des behandelten Individuums zirkulieren, so daß eine rasche Ausscheidung der Bindeprotein-Aggregate durch das RES bewirkt wird. Das Mittel ist vorzugsweise groß genug, um schnelle Ausscheidung durch die Nieren zu vermeiden, und enthält eine ausreichende Zahl von Valenzen, um zirkulierende Bindeproteine querzuvernetzen und zu aggregieren. Daher hat das Protein vorzugsweise ein Molekulargewicht von 50.000 Da oder mehr und wird mit Biotin in einem Molverhältnis von etwa 1:4 Protein:Biotin oder mehr derivatisiert. Hier ist festzustellen, daß Proteinaggregation durch das Reinigungsmittel auch mindestens 2 Avidinmoleküle auf jedem Bindeprotein erfordert.
Ein zur Verwendung beim Menschen bevorzugtes Reinigungsmittel ist ein humanes Protein, das mit mehreren Biotingruppen derivatisiert ist. Beispielsweise kann humanes Transferrin durch Reaktion mit Biotin in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels, wie etwa einem löslichen Carbodiimid oder durch Reaktion mit dem oben genannten Biotin-NHS-Reagenz biotinyliert werden.

II. Therapeutische und radiodiagnostische Methoden

A. Lokalisation des Bindeproteins

Die erfindungsgemäße Methode sieht vor, daß ein therapeutisches oder radiodiagnostisches Mittel an einen ausgewählten Ort im Körperinneren, wie etwa einen Tumorbereich, ein inneres Organ oder einen anderen spezifischen Gewebebereich geleitet wird.
Als erster Schritt in dem Verfahren wird das Bindeprotein parenteral, d.h. in den Blutstrom, vorzugsweise durch intravenöse (IV) Verabreichung verabreicht. Von hier wandert das Protein langsam aus dem Blut, durch die extrazelluläre Flüssigkeit (ECF) und in das Körpergewebe, einschließlich den Zielort, wobei es sich aufgrund der Zielsteuerungseigenschaft des Proteins vorzugsweise am Tumorort anreichert. Dieser Anfangsschritt ist im oberen Teil von Figur 2 veranschaulicht, worin die langsame Wanderung eines Avidin-markierten Antikörper-Bindeproteins aus dem Blutstrom (Säule mit gestrichelter Linie) durch das ECF an einen Tumorort gezeigt wird.
Gemäß einem bedeutenden Vorteil des Verfahrens wird das Bindeprotein in unkomplexierter Form transportiert, d.h. ohne gebundene biotinylierte Substanz, so daß das behandelte Individuum nicht der Substanz während der längeren Periode der Proteinlokalisierung am Tumorort ausgesetzt ist. Die injizierte Menge an Bindeprotein wird berechnet, um eine vorbestimmte Konzentration der biotinylierten Substanz am Zielort im letzten Zielsteuerungsschritt zu ergeben. Diese Menge hängt von mehreren Faktoren ab, umfassend: (a) den relativen Grad der Lokalisierung des Bindeproteins in Ziel- und Nicht- Zielbereichen des Körpers, (b) die Verweildauer des Bindeproteins im Blut und am wichtigsten (c) die Bindekonstante des Bindeproteins für die Epitopsubstanz bei Lokalisation am Zielort.
Die optimale Menge an Bindeprotein, die verabreicht wird, kann annähernd durch Kombination bekannter Daten über die Bindungskonstante mit empirischen Untersuchungen an Tiermodellsystemen ermittelt werden. Untersuchungen, die im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, daß die wirksame Zielsteuerung einer biotinylierten EDTA-Substanz eine anfängliche Avidin- oder Streptavidindosis erforderte, die erheblich geringer als die Dosis von 10 bis 100 mg ist, die zum Erreichen der gleichen Konzentration an lokalisiertem Chelat unter Verwendung eines Antichelat-Antikörpers als Vorlokalisierungsmittel erforderlich ist.
Das verabreichte Bindeprotein, das eine Zirkulationshalbwertszeit im Blut von 1 bis mehreren Tagen hat, wird im Zielorgan über eine Dauer von typischerweise etwa 1 bis 4 Tagen lokalisieren gelassen. Während dieser Periode wird das Bindeprotein langsam durch das Zielgewebe sowie von anderen Geweben aus dem Blut aufgenommen. Im Falle von Tumoren ist die Anreicherung des Bindeproteins am Zielort aufgrund der relativ größeren Durchlässigkeit der den Tumor versorgenden Kapillaren erhöht. Wie oben erwähnt, kann die Tumorlokalisierung alleine auf dem bevorzugten Eintritt des Proteins (z.B. Avidin oder Streptavidin) in den Tumor beruhen. Dieser Mechanismus wird in den Zielsteuerungsverfahren, die in den Beispielen 1 und 2 gezeigt sind, veranschaulicht, die beide die Anreicherung eines Avidin-Bindeproteins in Tumorbereichen 24 Stunden nach intravenöser Verabreichung zeigen.

B. Ausscheidung des Bindemittels

Im zweiten Schritt des Verfahrens wird das zirkulierende Bindeprotein schnell aus dem Blutstrom ausgeschieden, um die Gesamtblutkonzentrationen des Proteins mehrfach zu verringern, ohne die Konzentrationen von Bindeprotein, die sich am Ziel angereichert haben, merkbar zu beeinflussen. Dieser Schritt, der im Mittelbereich von Figur 2 dargestellt ist, beruht auf der Bildung von Aggregaten aus Bindeproteinen und Reinigungsmittel im Blutstrom und der raschen Ausscheidung dieser Aggregate durch das RES. In der Figur wird gezeigt, daß die im Blutstrom gebildeten Aggregate durch die Leber entfernt werden, dem Hauptort der Aufnahme durch das RES. Aufgrund seiner raschen Entfernung reichert sich das Reinigungsmittel nicht merklich außerhalb des Blutstroms an und hat daher einen geringen Effekt auf die Ablagerung an Bindeprotein, die bereits außerhalb des Blutstroms lokalisiert ist.
Die verabreichte Menge an Reinigungsmittel liegt vorzugsweise in einem molaren Verhältnis zwischen etwa 1:5 bis 5:1 bezüglich der Menge an Bindeprotein, die zur Zeit des Reinigungsschrittes als im Blutstrom des behandelten Individuums befindlich berechnet wird. Experimente, die im Zusammenhang mit der Anmeldung durchgeführt wurden, zeigen, daß die 24 Stunden nach IV-Verabreichung im Blutstrom vorhandene Menge an Bindeprotein typischerweise zwischen 15 bis 25 % der gesamten verabreichten Menge ist.
Die gesamte, zur Ausscheidung des Bindeproteins vorgesehene Zeit, d.h. bevor die Epitopsubstanz verabreicht wird, kann nur 15 Minuten sein, reicht aber typischerweise von 1 bis 4 Stunden. Bei der in Beispiel 2 wiedergegebenen Untersuchung wurden mit dem Chase die Blutkonzentrationen etwa über das 40-fache verringert, wie durch die aufgenommene Menge an radiomarkiertem biotinyliertem Chelat durch das Blut vor und nach dem Reinigungsschritt gemessen wurde.

C. Aufnahme der biotinylierten Substanz

Im letzten Zielsteuerungsschritt wird die biotinylierte Substanz zur selektiven Aufnahme durch das lokalisierte Bindeprotein parenteral und vorzugsweise intravenös verabreicht. Dieser Schritt, der in Figur 2 unten dargestellt ist, umfaßt eine rasche Aufnahme der Substanz durch das lokalisierte Bindeprotein in Konkurrenz zu einer raschen Ausscheidung aus dem Blutstrom durch die Nieren.
Die verabreichte Menge an biotinylierter Verbindung wird so berechnet, daß eine gewünschte Konzentration der Verbindung am Zielort kurz nach Injektion der Substanz, üblicherweise innerhalb 1 bis 4 Stunden nach Injektion, erzeugt wird. Wie bei dem Bindeprotein kann die optimale Dosierung aus Untersuchungen mit einem Tiermodellsystem in Kombination mit der bekannten Bindeaffinität des Bindeproteins für die Substanz annähernd berechnet werden.
Es wurde eine Reihe von Untersuchungen über die Tumorlokalisierung von biotinylierten Chelat-Radionuclid-Verbindungen im Zusammenhang mit der Erfindung durchgeführt und einige dieser Untersuchungen sind in den Beispielen 1 und 2 erläutert. Sowohl mit Streptavidin als auch mit Antikörper-Streptavidin- Konjugat Bindeproteinen erhöhten sich die Tumor/Blut-Verhältnisse mehrfach bei Verabreichung des Chase.
In einer verwandten Untersuchung, die in Beispiel 3 erläutert ist, wurde ein monoklonaler Antikörper (nicht an Avidin konjugiert), der für ein nicht-biotinyliertes EDTA-Chelat spezifisch war, verabreicht, gefolgt von einem Chase nach 20 Stunden mit einem Transferrin-markierten Chelat. Eine Stunde später wurde Chelat-&sup5;&sup7;Co gegeben und 3 Stunden lokalisieren gelassen. Eine Ganzkörper-Radiountersuchung des behandelten Tieres ergab die in Figur 3A ersichtlichen Ergebnisse, die eine Lokalisierung der Markierung in den Nieren (K), der Blase (B) und dem Flankentumor zeigen. Die Verteilung der Markierung im Tumor, Blut und anderem Gewebe 3 Stunden nach Injektion der Markierung ist in Tabelle 1 in Beispiel 3 gezeigt. Die Daten zeigen hohe Tumor/Organ-Verhältnisse für Blut und andere innere Organe. Die höheren Konzentrationen an Radiomarkierung in der Niere, die aus der vorliegenden Untersuchung ersichtlich sind, werden vermutlich von einer langsameren Ausscheidung der radiomarkierten Substanz aus den Nieren verursacht.
Figur 3B zeigt dasselbe, in Figur 3A abgebildete Tier, wobei die Abbildung jedoch 24 Stunden nach Verabreichung der Substanz erfolgte. Der Hauptunterschied in der späteren Abbildung ist ein Fehlen der Markierung in der Blase. Es wird noch eine gute Abbildung des Tumors mit geringem Hintergrund erreicht. Die Untersuchung von Beispiel 3 zeigt die Verbesserung in der Tumorabbildung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielt werden kann, unterscheidet sich aber von der Erfindung dadurch, daß die Konzentrationen an Antikörper (Bindeprotein), die verabreicht werden müssen, erheblich höher als die in der vorliegenden Erfindung erforderlichen sind, um eine ausreichende Konzentration der Zielsteuerungssubstanz am Zielort zu erreichen.
Aus dem Voranstehenden ist zu erkennen, wie verschiedene Aufgaben und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Das Verfahren sorgt für eine selektive Lokalisierung einer therapeutischen oder radiodiagnostischen Substanz aufgrund der Anreicherung eines zielspezifischen Bindeproteins am ausgewählten Zielort. Dieses Merkmal sorgt für eine verbesserte therapeutische Wirkung mit verringerten Nebenwirkungen für therapeutische Mittel und eine verbesserte Abbildung mit verringerten Hintergrundkonzentrationen, insbesondere Hintergrundkonzentrationen aufgrund von zirkulierendem Radionuclid.
Da die Lokalisierung der Substanz kurz nach Injektion der Substanz, z.B. 1 bis 4 Stunden, erfolgt, können Radionuclide mit Halbwertszeiten von etwa 1 bis 6 Stunden zur Radiodiagnostik bzw. Radioabbildung verwendet werden. Insbesondere erlaubt das Verfahren sowohl die Verwendung von 99mTc, dessen Halbwertszeit etwa 6 Stunden ist, als auch von &sup6;&sup8;Ga, dessen Halbwertszeit 68 Minuten ist, mit relativ geringen Mengen an Radioaktivität zur Radioabbildung von Tumoren oder anderen Zielorten im Körper. Der besondere Vorteil von &sup6;&sup8;Ga als radiodiagnostisches Mittel ist seine Verwendung in der Photonenemissionstomographie, einer Abbildungstechnik, die eine Quantifizierung von lokalisierter Radiomarkierung und Auflösung bis herab auf 5 mm erlaubt. Bisher erforderte die große Menge an Radionuclid, die zur Abbildung benötigt wurde, ein Cyclotron vor Ort. Durch die vorliegende Erfindung sorgt die Fähigkeit zur Lokalisierung großer Mengen des Radionuclids in 1 Stunde oder weniger dafür, daß Radionuclidmengen ausreichen, die mit einem wesentlich preiswerteren &sup6;&sup8;Ga-Generator erzeugt werden können.
Die rasche Ausscheidung nicht lokalisierter Substanz durch die Nieren bedeutet, daß die mit der Substanz in systemischer Form verbundene Toxizität erheblich verringert werden kann. Im Falle einer Radioabbildung mit ¹¹¹In war es beispielsweise bisher erforderlich, das Metall an ein zirkulierendes Protein anzuheften, um hohe Konzentrationen des Radionuclids an einem lokalisierten Ort zu erreichen. Diese Methode wird durch die Menge an Protein-konjugiertem Metall eingeschränkt, die wegen der hohen Konzentrationen des Radionuclids im Blutstrom über eine Dauer von mehreren Tagen sicher verabreicht werden kann. In der vorliegenden Erfindung wird der Hauptteil des nicht- lokalisierten Radionuclids in wenigen Stunden ausgeschieden. Dieser Vorteil tritt auch bei therapeutischen Mitteln, wie etwa Antitumormitteln, ein, die in hohen Dosen gegeben werden müssen, um eine wirksame Konzentration des Mittels am Zielort zu erreichen. Für viele Antitumormittel war daher die Behandlung durch die mit hohen Dosiskonzentrationen verbundenen großen Nebenwirkungen eingeschränkt. In der vorliegenden Erfindung erlaubt die spezifische Bindung des Mittels an die Zielorte aufgrund des dortigen Vorhandenseins von konzentriertem Bindeprotein, daß therapeutisch wirksame Konzentrationen des Mittels am Tumorort bei geringeren Dosen des injizierten Mittels erreicht werden.
Gemäß einem anderen wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung kann das Avidin enthaltende Bindeprotein in relativ geringen Dosen aufgrund seiner hohen Bindeaffinität für die biotinylierte Zielverbindung verabreicht werden. Daher ist das Risiko einer Immunreaktion gegen das verabreichte Bindeprotein erheblich geringer als wenn das Bindeprotein ein nicht konjugierter Antikörper ist, der in erheblich größerer Dosierung verabreicht werden muß. Weiterhin werden die Kosten der Behandlungsmaterialien verringert.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung und Anwendung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung, sollen aber auf keine Weise den Umfang der Erfindung beschränken.

Beispiel 1

Biologische Verteilung einer In-111 Biotin-Verbindung

Biotin wurde, wie oben beschrieben, über einen Putresceinspacer an p-Isothiocyanato-EDTA gekoppelt und die biotinylierte Chelatsubstanz wurde mit In-111 nach Standardmethoden markiert. Die Tiere enthielten 6 Stunden nach intravenöser Injektion etwa 6 % der gesamten Radioaktivität und 24 Stunden nach Injektion etwa 2 %. Bei Komplexierung der In-111-Verbindung (0,03 nmol) mit Avidin (0,1 nmol) und intravenöser Verabreichung waren 70 % nach 24 Stunden vorhanden, aber meist in der Leber (42/g Leber; 0,03 %/g Blut) lokalisiert. Bei Substitution von Streptavidin waren 75 % nach 24 Stunden vorhanden, die aber in erheblich größerem Ausmaß in der Zirkulation blieben (10 %/g Leber; 6 %/g Blut).
BALB/c Mäuse mit KHJJ Tumoren wurden mit 0,25 nmol Streptavidin durch intravenöse Injektion vorbehandelt. Nach 20 Stunden wurde ein IV-Chase von biotinyliertem humanem Transferrin gegeben, gefolgt von 0,016 nmol der obigen biotinylierten EDTA-In-111-Verbindung nach 21 Stunden. Die biologische Verteilung der In-111-Verbindung, 3 Stunden nach Verabreichung der Verbindung bestimmt, zeigte eine Tumoraufnahmekonzentration von 0,45 % Dosis/g und ein Tumor/Blut-Verhältnis von 4,74. Bei Fehlen des Chase (das nach 20 Stunden gegebene biotinylierte humane Transferrin) war das Tumor/Blut-Verhältnis 1,52.
Die obigen Daten zeigen, daß (a) eine gute Tumorzielsteuerung durch Chelat, das an vorlokalisiertes Streptavidin bindet, erreicht werden kann und (b) die Entfernung von Streptavidin im Blut durch einen Chase den In-111-Hintergrund aufgrund der Blutkonzentrationen des gebundenen Chelatkomplexes erheblich verringert.

Beispiel 2

Zielsteuerung mit chimären Antikörpern

Der monoklonale Maus-Antikörper SIC5, ein IgG2a-Antikörper, der für das Oberflächen-IgM auf dem Maus-B-Zellenlymphom 38C- 13 antiidiotypisch ist, wurde kovalent mit Streptavidin verknüpft, wobei die bifunktionellen Quervernetzungsmittel 2- Imminothiolan und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat verwendet wurden, die beide aus kommerziellen Quellen bezogen wurden. Mit In-111 biotinyliertes EDTA wurde wie oben hergestellt.
Der bifunktionelle chimäre Antikörper wurde intravenös in C3H-Mäuse mit 38C-13 Flankentumoren injiziert und 20 Stunden lang lokalisieren gelassen, wobei nach dieser Zeit biotinyliertes humanes Transferrin als Chase gegeben wurde. Eine Stunde später, nachdem der Chase das Blut weitgehend vom Antikörper gereinigt hatte, wurden die Tiere jeweils mit der biotinylierten EDTA-In-111-Verbindung IV injiziert und die Organverteilung der Radioaktivität wurde innerhalb 1 bis 3 Stunden gemessen, wenn die Ausscheidung durch die Nieren die Hintergrundkonzentrationen von In-111 ausreichend verringert hatte. Kontrolltiere wurden ähnlich behandelt, aber ohne daß sie den Chase und/oder Antikörper erhielten, und mit kovalent markierten In-111-Chelat-Konjugaten des SIV5-Antikörpers.
Bei dem kovalenten In-111-Antikörper war der Hintergrund in allen Organen, insbesondere der Leber, der Milz, den Lymphknoten und dem Blut hoch. In vorbehandelten Tieren (anfängliche Antikörpergabe) waren die Hintergrundkonzentrationen ebenfalls hoch, insbesondere im Blut. Der Chase entfernte den Hauptteil des Bluthintergrundes mit verbesserten Tumor/Blut- Verhältnissen (mehr als 6-facher Anstieg).

Beispiel 3

Tumorabbildung

Drei A Balb/C-Mäuse, denen ein KHJJ-Adenokarzinomtumor in der Flanke implantiert worden war, wurden mit 100 mg eines für ein EDTA-Konjugat spezifischen monoklonalen Antikörpers behandelt. 20 Stunden nach Verabreichung des Antikörpers wurde den Tieren ein Chase des Transferrin/EDTA-Konjugat-Reinigungsmittels gegeben und 1 Stunde später (21 Stunden nach Verabreichung des Antikörpers) erhielten die Tiere eine Injektion des mit In-111 komplexierten EDTA-Konjugats. 3 Stunden später wurde eine Ganzkörperuntersuchung unter Verwendung einer Computer-Abtastung des Ganzkörperbildes an den Tieren durchgeführt. Eine repräsentative Abbildung, die für eines der Tiere erhalten wurde, ist in Figur 3A gezeigt. Das Bild zeigt eine Konzentration von Radiomarkierung in den Nieren (K), der Blase (B) und dem Tumorbereich (T). 16 % des verabreichten ¹¹¹In waren nach 3 Stunden vorhanden. 2 der Tiere wurden zu diesem Zeitpunkt getötet und auf ¹¹¹In-Konzentrationen im Blut, Tumor und anderen Geweben untersucht, wie in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet ist. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Behandlung eine gute Tumoraufnahme und hohe Tumor/Blut- und geringe Tumor/Nieren-Verhältnisse ergab, was mit (a) einer Lokalisierung des Radionuclids im Tumor und (b) einer raschen Ausscheidung des Radionuclids aus dem Körper durch die Nieren im Einklang steht. Tabelle 1 Organ % Dosis per Organ Tumor/Organ Blut Herz Lungen Leber Milz Nieren Tumor Muskel Knochen Haut Darm
24 Stunden später (48 Stunden nach Verabreichung des Antikörpers) wurde eine ähnliche Ganzkörperuntersuchung durchgeführt. Das in Figur 3B erhaltene Bild ist ähnlich wie das frühere Bild, zeigt aber das relative Fehlen von Markierung in der Blase. 14 % des ursprünglich injizierten ¹¹¹In-Materials war vorhanden.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung mit Komponenten, die ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel an einem Zielort des Körpers in einem Patienten lokalisieren,

wenn die Komponenten dem Patienten aufeinanderfolgend parenteral verabreicht werden, wobei die Komponenten umfassen:

ein Avidin-haltiges Bindeprotein, das zur selektiven Lokalisierung am Zielort in der Lage ist, wenn es dem Patienten parenteral verabreicht wird;

ein Reinigungsmittel, das ein biotinyliertes Protein enthält, wobei das Protein ein Molekulargewicht von mindestens 50.000 Da und ein Protein:Biotin-Verhältnis von mindestens 1:4 aufweist, das bei Zirkulation im Blutstrom des Patienten mit dem Bindeprotein reagieren und ein makromolekulares Aggregat bilden kann, das durch das jeweilige retikuloendotheliale System des Patienten ausgeschieden wird; und

eine biotinylierte Verbindung, die das mit Biotin derivatisierte Mittel enthält.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Bindeprotein Avidin oder Streptavidin ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Bindeprotein ein Antikörper ist, der mit Avidin oder Streptavidin konjugiert ist.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung beim Transport eines Radionuclids zum Zielort, worin die biotinylierte Verbindung eine biotinylierte Chelatverbindung ist, die mit einem Radionuclidmetallion komplexiert ist, um einen stabilen Metall-Chelat-Komplex zu bilden.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die Chelatverbindung ein Metallchelat von 1-Phenyl- oder 1-Benzyl-EDTA ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Chelatverbindung ein Metallchelat mit einem Thiobutanspacerarm, verknüpft mit der Benzylgruppierung, ist.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung eines festen Tumors und worin das Metallchelat ein Chelat von &sup9;&sup0;Y, ¹&sup9;&sup7;Hg oder &sup6;&sup7;Cu ist, oder zur Verwendung bei der Radiosensibilisierung eines Körpertumors und worin das Metallchelat ein Chelat von Eisen, Kupfer oder Ruthenium ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, die zur Verwendung bei der Radioabbildung eines Körpertumors ist, und worin das Metallchelat ein Chelat von ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup4;Cu, 99mTc, &sup6;&sup8;Ga, &sup6;²Zn, &sup6;&sup7;Cu, ¹&sup9;&sup7;Hg, &sup9;&sup7;Ru, &sup5;&sup7;Co oder &sup5;³Co ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Bindeprotein die Wände von Kapillaren, die Blut zu einem Tumor liefern, selektiv durchdringen kann.