JPH0856666A - 耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 - Google Patents
耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法Info
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- JPH0856666A JPH0856666A JP20186294A JP20186294A JPH0856666A JP H0856666 A JPH0856666 A JP H0856666A JP 20186294 A JP20186294 A JP 20186294A JP 20186294 A JP20186294 A JP 20186294A JP H0856666 A JPH0856666 A JP H0856666A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラー
ゼおよびその製造法を提供する。 【構成】 次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリン
スルフヒドリラーゼ；作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
とシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する。至適
ｐＨ：７．０〜９．０。安定ｐＨ：６．０〜１０．０。
至適温度：４０〜５０℃。熱安定性：ｐＨ７．５におい
て３０分保持した場合、７０℃まで安定。分子量：ゲル
濾過にて６０，０００〜８０，０００。 【効果】 耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラー
ゼおよびその製造法が提供される。
ゼおよびその製造法を提供する。 【構成】 次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリン
スルフヒドリラーゼ；作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
とシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する。至適
ｐＨ：７．０〜９．０。安定ｐＨ：６．０〜１０．０。
至適温度：４０〜５０℃。熱安定性：ｐＨ７．５におい
て３０分保持した場合、７０℃まで安定。分子量：ゲル
濾過にて６０，０００〜８０，０００。 【効果】 耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラー
ゼおよびその製造法が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｏ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を産生す
るバチルス属に属する新規細菌株、該酵素の製造法に関
する。
ルフヒドリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を産生す
るバチルス属に属する新規細菌株、該酵素の製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｏ−
アセチルセリンスルフヒドリラーゼ活性は、一部の植物
および微生物由来のものが知られており、例えば、ホウ
レンソウ由来（エフ・イケガミ（F.Ikegami）ら，フィ
トケミストリー（Phytochemistry），第２７巻，３３８
５〜３３８９頁（１９８１年）、あるいはクロモバクテ
リウム（Chromobacterium）属細菌由来（エム・アン
（M.Anne）およびジェー・ケイ・クリストファー（J.K.
Christopher）、ビオキミア・エト・ビオフィジカ・ア
クタ（Biochimica et Biophysica Acta），第７８６
巻，１２３〜１３２頁（１９８４年）のもの等が精製さ
れ、性質が調べられている。
アセチルセリンスルフヒドリラーゼ活性は、一部の植物
および微生物由来のものが知られており、例えば、ホウ
レンソウ由来（エフ・イケガミ（F.Ikegami）ら，フィ
トケミストリー（Phytochemistry），第２７巻，３３８
５〜３３８９頁（１９８１年）、あるいはクロモバクテ
リウム（Chromobacterium）属細菌由来（エム・アン
（M.Anne）およびジェー・ケイ・クリストファー（J.K.
Christopher）、ビオキミア・エト・ビオフィジカ・ア
クタ（Biochimica et Biophysica Acta），第７８６
巻，１２３〜１３２頁（１９８４年）のもの等が精製さ
れ、性質が調べられている。
【０００３】本酵素反応生成物β−シアノアラニンは、
生物学的活性を有する種々のアミノ酸誘導体の合成中間
体として有用であるが、これまで報告されてきたＯ−ア
セチルセリンスルフヒドリラーゼはいずれも不安定で、
特に熱安定性が低く、かかる有用物質の製造には適さな
かった。従って、熱安定性の高いＯ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼの検索が急務とされていた。
生物学的活性を有する種々のアミノ酸誘導体の合成中間
体として有用であるが、これまで報告されてきたＯ−ア
セチルセリンスルフヒドリラーゼはいずれも不安定で、
特に熱安定性が低く、かかる有用物質の製造には適さな
かった。従って、熱安定性の高いＯ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼの検索が急務とされていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記状況の下、本発明者
らは、鋭意研究を重ねた結果、熱安定性が非常に高いＯ
−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを産生する耐熱性
のバチルス属に属する細菌を見いだし、該細菌から耐熱
性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離するこ
とに成功して本発明を完成するに至った。
らは、鋭意研究を重ねた結果、熱安定性が非常に高いＯ
−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを産生する耐熱性
のバチルス属に属する細菌を見いだし、該細菌から耐熱
性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離するこ
とに成功して本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、 （１） 次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼ； １．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物から
β−シアノアラニンを生成する ２．至適ｐＨ：７．０〜９．０ ３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０ ４．至適温度：４０〜５０℃ ５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場
合、７０℃まで安定 ６．分子量：ゲル濾過にて６０，０００〜８０，００
０、 （２） 補酵素としてピリドリサルリン酸を要求する
（１）記載の酵素、 （３） Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、
Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル
−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−
クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする（１）記載の酵素、
特に、 （４） 好温性のバチルス（Bacillus）属に属する細菌
から得られる（１）ないし（３）いずれかに記載の酵
素、 （５） 該細菌がバチルス・ステアロサーモフィルス
（B.stearothermophilus）である（４）記載の酵素、 （６） 該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバ
チルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（４）
記載の酵素 を提供するものである。
ルフヒドリラーゼ； １．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物から
β−シアノアラニンを生成する ２．至適ｐＨ：７．０〜９．０ ３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０ ４．至適温度：４０〜５０℃ ５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場
合、７０℃まで安定 ６．分子量：ゲル濾過にて６０，０００〜８０，００
０、 （２） 補酵素としてピリドリサルリン酸を要求する
（１）記載の酵素、 （３） Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、
Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル
−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−
クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする（１）記載の酵素、
特に、 （４） 好温性のバチルス（Bacillus）属に属する細菌
から得られる（１）ないし（３）いずれかに記載の酵
素、 （５） 該細菌がバチルス・ステアロサーモフィルス
（B.stearothermophilus）である（４）記載の酵素、 （６） 該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバ
チルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（４）
記載の酵素 を提供するものである。
【０００６】また、本発明は、 （７） 請求項１記載のＯ−アセチルセリンスルフヒド
リラーゼの産生能を有する好温性のバチルス属に属する
細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地
で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセ
チルセリンスルフヒドリラーゼの製造法、特に、 （８） 該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生
能を有する好温性のバチルス属に属する細菌がバチルス
・ステアロサーモフィルスである（７）記載の方法、 （９） 該好温性のバチルス属に属する該Ｏ−アセチル
セリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する細菌が、工
業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−
４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサー
モフィルスＣＮ３株である（７）記載の方法を提供する
ものである。
リラーゼの産生能を有する好温性のバチルス属に属する
細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地
で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセ
チルセリンスルフヒドリラーゼの製造法、特に、 （８） 該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生
能を有する好温性のバチルス属に属する細菌がバチルス
・ステアロサーモフィルスである（７）記載の方法、 （９） 該好温性のバチルス属に属する該Ｏ−アセチル
セリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する細菌が、工
業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−
４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサー
モフィルスＣＮ３株である（７）記載の方法を提供する
ものである。
【０００７】さらに、本発明は、 （１０） 工業技術院生命工学技術研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス
・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を提供するものであ
る。
ＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス
・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を提供するものであ
る。
【０００８】以下、さらに詳しく本発明を説明する。本
発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ
は、耐熱性のバチルス属に属するＯ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼ産生能を有する細菌を培養することに
よって得ることができるが、該菌株の具体例としては、
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus）ＣＮ３株等が挙げられる。バチルス・ス
テアロサーモフィルスＣＮ３株は、本発明者らが天然よ
り単離したものであって、平成６年８月８日に工業技術
院生命工学技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
７７３として寄託されている。この細菌の菌学的性質は
以下の通りである。
発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ
は、耐熱性のバチルス属に属するＯ−アセチルセリンス
ルフヒドリラーゼ産生能を有する細菌を培養することに
よって得ることができるが、該菌株の具体例としては、
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus）ＣＮ３株等が挙げられる。バチルス・ス
テアロサーモフィルスＣＮ３株は、本発明者らが天然よ
り単離したものであって、平成６年８月８日に工業技術
院生命工学技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４
７７３として寄託されている。この細菌の菌学的性質は
以下の通りである。
【０００９】（ａ）形態 １．細菌の形態：細い桿菌 ２．運動性：− ３．胞子：＋（楕円形） ４．グラム染色性：−
【００１０】（ｂ）コロニー形態：７２時間培養で５ｍ
ｍ以下の円形で、不規則、淡黄色半透明、表面は滑らか
で平坦
ｍ以下の円形で、不規則、淡黄色半透明、表面は滑らか
で平坦
【００１１】（ｃ）生理学的性質 １．生育：３７℃では生育せず、４５℃、５５℃および
６７℃で生育 ２．細胞内小球体：− ３．リトマスミルク：分解 ４．３％ＮａＣｌでの生育：− ５．５％ＮａＣｌでの生育：− ６．７％ＮａＣｌでの生育：− ７．ｐＨ５．７での生育：− ８．グルコースからの酸生成：＋ ９．グルコースからのガス生成：− １０．卵黄反応：試験条件下で生育せず １１．カゼイン分解：＋ １２．ゼラチン分解：− １３．チロシン分解：− １４．デンプン加水分解：＋ １５．ＮＯ3 -からＮＯ2 -への変換：＋ １６．コーザー培地でのクエン酸利用：− １７．メラーのアルギニンジヒドロラーゼ：− １８．ＯＮＰＧ：＋ １９．酸キシロースＰＷＳ：＋ ２０．ＤＮａｓｅ：− ２１．カタラーゼ：＋ ２２．オキシダーゼ：＋
６７℃で生育 ２．細胞内小球体：− ３．リトマスミルク：分解 ４．３％ＮａＣｌでの生育：− ５．５％ＮａＣｌでの生育：− ６．７％ＮａＣｌでの生育：− ７．ｐＨ５．７での生育：− ８．グルコースからの酸生成：＋ ９．グルコースからのガス生成：− １０．卵黄反応：試験条件下で生育せず １１．カゼイン分解：＋ １２．ゼラチン分解：− １３．チロシン分解：− １４．デンプン加水分解：＋ １５．ＮＯ3 -からＮＯ2 -への変換：＋ １６．コーザー培地でのクエン酸利用：− １７．メラーのアルギニンジヒドロラーゼ：− １８．ＯＮＰＧ：＋ １９．酸キシロースＰＷＳ：＋ ２０．ＤＮａｓｅ：− ２１．カタラーゼ：＋ ２２．オキシダーゼ：＋
【００１２】以上の菌学的性質に基づいて、バージーの
細菌分類書（Bargy's Manual of Systematic Bacteriol
ogy）によって分類し、ＣＮ３株をバチルス・ステアロ
サーモフィルスと同定した。
細菌分類書（Bargy's Manual of Systematic Bacteriol
ogy）によって分類し、ＣＮ３株をバチルス・ステアロ
サーモフィルスと同定した。
【００１３】上記菌株の培地としては、特別な培地を用
いる必要はなく、通常の培地を用いればよい。炭素源と
しては、グルコース、マルトース、デンプン、デキスト
リン等の糖類、グルタミン酸等のアミノ酸類、あるいは
フマル酸、リンゴ酸等の有機酸、もしくはグリセロー
ル、窒素源としては、ポリペプトン、酵母エキス、大豆
粉加水分解物等の天然窒素源、無機塩としてはＮａＣ
ｌ、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等、また、微量
金属成分としては塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨ
ウ化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛
等を使用することができる。
いる必要はなく、通常の培地を用いればよい。炭素源と
しては、グルコース、マルトース、デンプン、デキスト
リン等の糖類、グルタミン酸等のアミノ酸類、あるいは
フマル酸、リンゴ酸等の有機酸、もしくはグリセロー
ル、窒素源としては、ポリペプトン、酵母エキス、大豆
粉加水分解物等の天然窒素源、無機塩としてはＮａＣ
ｌ、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等、また、微量
金属成分としては塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨ
ウ化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛
等を使用することができる。
【００１４】本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフ
ヒドリラーゼを得るための好適な培地組成の一例を次に
示す。ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリ
セロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、および
Ｌ−セリン０．１％。
ヒドリラーゼを得るための好適な培地組成の一例を次に
示す。ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリ
セロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、および
Ｌ−セリン０．１％。
【００１５】培養のｐＨは６．５約〜約７．５、好まし
くは７．２、培養温度は約４０℃〜約７０℃、好ましく
は５０〜６０℃であり、１２時間〜４８時間、好ましく
は２４時間好気的または振盪しながら培養を行う。本発
明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、
このようにして培養した細菌から該酵素を単離すること
により得ることができる。
くは７．２、培養温度は約４０℃〜約７０℃、好ましく
は５０〜６０℃であり、１２時間〜４８時間、好ましく
は２４時間好気的または振盪しながら培養を行う。本発
明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、
このようにして培養した細菌から該酵素を単離すること
により得ることができる。
【００１６】上記培養液から本発明の耐熱性Ｏ−アセチ
ルセリンスルフヒドリラーゼを単離するには、既知の精
製法を単独または併用して利用することができる。例え
ば、培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、これを超音
波処理またはダイノミル（Dyno-mill）処理により破砕
した後、遠心分離により無細胞抽出液を得る。これを硫
安分画し、透析等による脱塩処理等を行い、ついで、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等を行って本発明の耐熱性Ｏ−
アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することがで
きる。また、本発明酵素が耐熱性酵素であるために、例
えば７０℃、３０分の熱処理を行うことにより精製効率
を高めることができる。
ルセリンスルフヒドリラーゼを単離するには、既知の精
製法を単独または併用して利用することができる。例え
ば、培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、これを超音
波処理またはダイノミル（Dyno-mill）処理により破砕
した後、遠心分離により無細胞抽出液を得る。これを硫
安分画し、透析等による脱塩処理等を行い、ついで、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等を行って本発明の耐熱性Ｏ−
アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することがで
きる。また、本発明酵素が耐熱性酵素であるために、例
えば７０℃、３０分の熱処理を行うことにより精製効率
を高めることができる。
【００１７】また、本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリン
スルフヒドリラーゼを用いてシステイン、Ｌ−セリン、
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、
Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セ
リンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンと11Ｃまたは13Ｃ
あるいは14Ｃで標識したシアン化物とを、例えばリン酸
カリウム緩衝液等の水性媒体中で接触させて反応せし
め、臨床診断や生化学的研究に使用する11Ｃまたは13Ｃ
あるいは14Ｃで標識されたβ−シアノアラニンまたはそ
の誘導体あるいは塩を合成することができる。
スルフヒドリラーゼを用いてシステイン、Ｌ−セリン、
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、
Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セ
リンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンと11Ｃまたは13Ｃ
あるいは14Ｃで標識したシアン化物とを、例えばリン酸
カリウム緩衝液等の水性媒体中で接触させて反応せし
め、臨床診断や生化学的研究に使用する11Ｃまたは13Ｃ
あるいは14Ｃで標識されたβ−シアノアラニンまたはそ
の誘導体あるいは塩を合成することができる。
【００１８】
【実施例】以下に実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の培養 ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％，グリセロー
ル０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％（ｐＨ７．
２）からなる培地をそれぞれ８ｍｌずつ試験管（２．５
Ｘ２０ｃｍ）２本に分注し、１２０℃、２０分殺菌、冷
却後、バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を一
白金耳ずつ接種し、６０℃、２４時間振盪培養して、種
培養液とした。前記と同じ組成の培地に消泡剤（旭電化
社アデカノールＫＧ−１２６）０．０１％（ｖ／ｖ）を
添加した培地１．６リットルを２リットル容のジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、
これに上記の種培養液１６ｍｌ（試験管２本分）を接種
し、６０℃、２７時間、１．６リットル／分の通気量と
３００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養し、前培養液とし
た。次にポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グ
リセロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、Ｌ−
セリン ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地１６０リ
ットルを２００リットル容のジャーファーメンターに入
れ、１２０℃、３０分殺菌、冷却後、上記の前培養液
１．６リットルを接種し、６０℃、２４時間、１２０リ
ットル／分の通気量と２００ｒｐｍの撹拌速度の条件で
培養した。培養終了後、シャープレス（ＫＳ型超高速遠
心分離機、（株）関西遠心分離機製作所製）による遠心
分離により菌体を回収した。得られた菌体を８等分し
（２０リットル分ずつ）、それぞれ適当量の１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍＭジチオス
レイトール含有）に懸濁して、−８０℃で凍結保存し
た。これを解凍し、以後の酵素の製造に用いた。
するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の培養 ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％，グリセロー
ル０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％（ｐＨ７．
２）からなる培地をそれぞれ８ｍｌずつ試験管（２．５
Ｘ２０ｃｍ）２本に分注し、１２０℃、２０分殺菌、冷
却後、バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を一
白金耳ずつ接種し、６０℃、２４時間振盪培養して、種
培養液とした。前記と同じ組成の培地に消泡剤（旭電化
社アデカノールＫＧ−１２６）０．０１％（ｖ／ｖ）を
添加した培地１．６リットルを２リットル容のジャーフ
ァーメンターに入れ、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、
これに上記の種培養液１６ｍｌ（試験管２本分）を接種
し、６０℃、２７時間、１．６リットル／分の通気量と
３００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養し、前培養液とし
た。次にポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グ
リセロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、Ｌ−
セリン ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地１６０リ
ットルを２００リットル容のジャーファーメンターに入
れ、１２０℃、３０分殺菌、冷却後、上記の前培養液
１．６リットルを接種し、６０℃、２４時間、１２０リ
ットル／分の通気量と２００ｒｐｍの撹拌速度の条件で
培養した。培養終了後、シャープレス（ＫＳ型超高速遠
心分離機、（株）関西遠心分離機製作所製）による遠心
分離により菌体を回収した。得られた菌体を８等分し
（２０リットル分ずつ）、それぞれ適当量の１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍＭジチオス
レイトール含有）に懸濁して、−８０℃で凍結保存し
た。これを解凍し、以後の酵素の製造に用いた。
【００１９】バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３
株からの耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ
の単離 凍結菌体６０リットル分を全量が約２０００ｍｌになる
ように上記緩衝液に懸濁した後、ダイノミルにより菌体
を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、無
細胞抽出液２１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液に硫
安を４０％飽和になるように添加し、一晩放置後、析出
した沈澱物を遠心分離により除き、得られた上澄液に再
度硫安を９０％飽和になるように添加して５時間放置し
遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を、０．１ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解し透析膜を用いて同緩衝液に
て脱塩した。脱塩液１０６５ｍｌに終濃度７０％になる
ようにあらかじめ−８０℃に冷却したエタノールを添加
し、遠心分離により沈澱物を得た。これを同緩衝液に懸
濁し、７０℃で３０分の熱処理を行った。遠心分離で沈
澱を除去した後、上澄液をあらかじめ同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロファインＡ５００カラム（直径
６．０Ｘ高さ１８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同緩
衝液で洗浄後、同緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイト
ールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵
素を溶出して活性画分を集めた。この活性画分に硫安を
８０％飽和になるように添加し、一晩放置後遠心分離に
より沈澱物を得た。この沈澱物を０．１ｍＭジチオスレ
イトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解し、調製電気泳動（７．５％ポリアクリ
ルアミドゲル）にかけた。泳動後、ゲル中の活性のある
部分を切り出し、これを磨砕して同緩衝液を用いて酵素
を抽出した。この活性画分に３０％飽和になるように硫
安を添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジ
チオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ
−４Ｂカラム（直径２．５Ｘ高さ１２ｃｍ）に通し、酵
素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液
から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出
法で酵素を溶出して活性画分を集めた。この活性画分に
硫安を３０％飽和になるように添加し、あらかじめ３０
％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
オクチルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５Ｘ
高さ１０ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩
衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイ
トールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分
を集めた。ここで得られた酵素標品は電気泳動的に単一
であることが確認された。上記精製結果を下記表１にま
とめた。ステップ８において、当初の無細胞抽出液に比
べて２１８倍に純化されていた。
株からの耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ
の単離 凍結菌体６０リットル分を全量が約２０００ｍｌになる
ように上記緩衝液に懸濁した後、ダイノミルにより菌体
を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、無
細胞抽出液２１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液に硫
安を４０％飽和になるように添加し、一晩放置後、析出
した沈澱物を遠心分離により除き、得られた上澄液に再
度硫安を９０％飽和になるように添加して５時間放置し
遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を、０．１ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解し透析膜を用いて同緩衝液に
て脱塩した。脱塩液１０６５ｍｌに終濃度７０％になる
ようにあらかじめ−８０℃に冷却したエタノールを添加
し、遠心分離により沈澱物を得た。これを同緩衝液に懸
濁し、７０℃で３０分の熱処理を行った。遠心分離で沈
澱を除去した後、上澄液をあらかじめ同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロファインＡ５００カラム（直径
６．０Ｘ高さ１８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同緩
衝液で洗浄後、同緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイト
ールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵
素を溶出して活性画分を集めた。この活性画分に硫安を
８０％飽和になるように添加し、一晩放置後遠心分離に
より沈澱物を得た。この沈澱物を０．１ｍＭジチオスレ
イトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解し、調製電気泳動（７．５％ポリアクリ
ルアミドゲル）にかけた。泳動後、ゲル中の活性のある
部分を切り出し、これを磨砕して同緩衝液を用いて酵素
を抽出した。この活性画分に３０％飽和になるように硫
安を添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジ
チオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ
−４Ｂカラム（直径２．５Ｘ高さ１２ｃｍ）に通し、酵
素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液
から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出
法で酵素を溶出して活性画分を集めた。この活性画分に
硫安を３０％飽和になるように添加し、あらかじめ３０
％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
オクチルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５Ｘ
高さ１０ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩
衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイ
トールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分
を集めた。ここで得られた酵素標品は電気泳動的に単一
であることが確認された。上記精製結果を下記表１にま
とめた。ステップ８において、当初の無細胞抽出液に比
べて２１８倍に純化されていた。
【００２０】
【表１】
【００２１】バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３
株の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの諸
性質 酵素活性測定：１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）１０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、水８０μｌ、０．８
ｍＭピリドキサールリン酸２０μｌ（終濃度０．０８ｍ
Ｍ）、５０ｍＭ Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２０μｌ
（終濃度５．０ｍＭ）、１００ｍＭシアン化カリウム２
０μｌ（終濃度１０ｍＭ）および酵素液５０μｌからな
る反応液（全量２００μｌ）を４５℃で１０分インキュ
ベートした後、沸騰水浴中に２分間置いて反応停止し、
ついで、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄
液をＨＰＬＣにかけ、酵素反応で生成したβ−シアノア
ラニンを定量することにより行った。かかる条件下で、
１分間に１μｍｏｌのβ−シアノアラニンを生成する酵
素活性を１ユニットと定義する。ＨＰＬＣの条件は、カ
ラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（４．６Ｘ２５０
ｍｍ）(ジーエルサイエンス株式会社製）、溶出液：１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）／ＣＨ3
ＣＮ（８５／１５）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：蛍
光検出機（Ｅｘ：３４５ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ）、カラ
ム温度：４０℃、サンプルボリューム：１０μｌであっ
た。
株の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの諸
性質 酵素活性測定：１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）１０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、水８０μｌ、０．８
ｍＭピリドキサールリン酸２０μｌ（終濃度０．０８ｍ
Ｍ）、５０ｍＭ Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２０μｌ
（終濃度５．０ｍＭ）、１００ｍＭシアン化カリウム２
０μｌ（終濃度１０ｍＭ）および酵素液５０μｌからな
る反応液（全量２００μｌ）を４５℃で１０分インキュ
ベートした後、沸騰水浴中に２分間置いて反応停止し、
ついで、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄
液をＨＰＬＣにかけ、酵素反応で生成したβ−シアノア
ラニンを定量することにより行った。かかる条件下で、
１分間に１μｍｏｌのβ−シアノアラニンを生成する酵
素活性を１ユニットと定義する。ＨＰＬＣの条件は、カ
ラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（４．６Ｘ２５０
ｍｍ）(ジーエルサイエンス株式会社製）、溶出液：１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）／ＣＨ3
ＣＮ（８５／１５）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：蛍
光検出機（Ｅｘ：３４５ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ）、カラ
ム温度：４０℃、サンプルボリューム：１０μｌであっ
た。
【００２２】（１）至適ｐＨ ｐＨ６．０から１０．０の範囲の各ｐＨ下で、上記活性
測定法により活性測定を行った（活性測定用反応液にお
ける緩衝液を以下のものに代えて反応を行った）。使用
緩衝液は、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜６．５）、
２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０〜８．０）、２０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）および２０ｍＭ ＮＨ4Ｃ
ｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．０）であった。結
果を図１に示す。図１より、本酵素の至適ｐＨは８．０
であることがわかった。
測定法により活性測定を行った（活性測定用反応液にお
ける緩衝液を以下のものに代えて反応を行った）。使用
緩衝液は、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜６．５）、
２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０〜８．０）、２０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）および２０ｍＭ ＮＨ4Ｃ
ｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．０）であった。結
果を図１に示す。図１より、本酵素の至適ｐＨは８．０
であることがわかった。
【００２３】（２）安定ｐＨ また、本酵素を２０ｍＭ濃度の緩衝液に溶解し、６０
℃、３０分保持した後、残存活性を測定した。使用緩衝
液は、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜
５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）、ＫＨ2ＰＯ4
−Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．０〜８．０）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５〜９．０）、ＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ
８．５〜１０．５）およびグリシン／ＫＣｌ−ＫＯＨ
（ｐＨ１０．０〜１０．５）であった。結果を図２に示
す。図２の結果より、本酵素の安定ｐＨは６．０〜１
０．０であることがわっかった。
℃、３０分保持した後、残存活性を測定した。使用緩衝
液は、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜
５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）、ＫＨ2ＰＯ4
−Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．０〜８．０）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５〜９．０）、ＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ
８．５〜１０．５）およびグリシン／ＫＣｌ−ＫＯＨ
（ｐＨ１０．０〜１０．５）であった。結果を図２に示
す。図２の結果より、本酵素の安定ｐＨは６．０〜１
０．０であることがわっかった。
【００２４】（３）至適温度 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素
を溶解し、２０℃から８０℃までの範囲で上記酵素活性
測定法により活性測定した。結果を図３に示す。図３よ
り、本酵素の至適温度は４５℃であることがわかった。
を溶解し、２０℃から８０℃までの範囲で上記酵素活性
測定法により活性測定した。結果を図３に示す。図３よ
り、本酵素の至適温度は４５℃であることがわかった。
【００２５】（４）熱安定性 ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素
を溶解し、４０℃から９５℃までの各温度で３０分間酵
素を処理し、残存活性を調べた。結果を図４に示す。図
４より本酵素は熱安定性が非常に高く、７０℃まで安定
であることがわかった。
を溶解し、４０℃から９５℃までの各温度で３０分間酵
素を処理し、残存活性を調べた。結果を図４に示す。図
４より本酵素は熱安定性が非常に高く、７０℃まで安定
であることがわかった。
【００２６】（５）分子量およびサブユニット 液体クロマトグラフィーによるＴＳＫｇｅｌ Ｇ３００
０ＳＷ（２０Ｘ３００ｍｍ、東ソー株式会社製）カラム
を用いたゲル濾過により、分子量は７０，０００と算出
された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は３４，
０００と算出され、本酵素は同一サブユニットの２量体
酵素であると考えられた。
０ＳＷ（２０Ｘ３００ｍｍ、東ソー株式会社製）カラム
を用いたゲル濾過により、分子量は７０，０００と算出
された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は３４，
０００と算出され、本酵素は同一サブユニットの２量体
酵素であると考えられた。
【００２７】（６）基質特異性 前記活性測定用反応液において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リンに代えて種々の化合物を用いて活性を測定すること
により、基質特異性を調べた。本酵素の基質特異性は高
く、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン以外にはＬ−システイン
に対してわずかに作用した（Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
を１００％とした場合の相対活性は４．８％）。なお、
以下のアミノ酸は基質にならなかった。ＤＬ−ホモセリ
ン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−
ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−
アスパラギン酸。
リンに代えて種々の化合物を用いて活性を測定すること
により、基質特異性を調べた。本酵素の基質特異性は高
く、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン以外にはＬ−システイン
に対してわずかに作用した（Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン
を１００％とした場合の相対活性は４．８％）。なお、
以下のアミノ酸は基質にならなかった。ＤＬ−ホモセリ
ン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−
ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−
アスパラギン酸。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、熱安定性の非常に高い
Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素を産生
する細菌株、該酵素の製造法が提供される。
Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素を産生
する細菌株、該酵素の製造法が提供される。
【図１】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適ｐＨを
示す図である。
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適ｐＨを
示す図である。
【図２】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼのｐＨ安定性
を示す図である。
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼのｐＨ安定性
を示す図である。
【図３】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適温度を
示す図である。
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適温度を
示す図である。
【図４】 バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの熱安定性を
示す図である。
のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの熱安定性を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 グナー・アントーニ スウェーデン、エス−75185ウプサラ（番 地の表示なし） ウプサラ・アカデミス カ・シュークヒューセット、ウプサラ・ユ ニバーシティ・ピーイーティー・センター (72)発明者 ベングト・ロングストレーム スウェーデン、エス−75185ウプサラ（番 地の表示なし） ウプサラ・アカデミス カ・シュークヒューセット、ウプサラ・ユ ニバーシティ・ピーイーティー・センター
Claims (10)
- 【請求項１】 次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセ
リンスルフヒドリラーゼ； １．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物から
β−シアノアラニンを生成する ２．至適ｐＨ：７．０〜９．０ ３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０ ４．至適温度：４０〜５０℃ ５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場
合、７０℃まで安定 ６．分子量：ゲル濾過にて６０，０００〜８０，００
０。 - 【請求項２】 補酵素としてピリドキサルリン酸を要求
する請求項１記載の酵素。 - 【請求項３】 Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システ
イン、Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホス
ホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまた
はβ−クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする請求項１記載
の酵素。 - 【請求項４】 好温性のバチルス（Bacillus）属に属す
る細菌から得られる請求項１ないし３いずれかに記載の
酵素。 - 【請求項５】 該細菌がバチルス・ステアロサーモフィ
ルス（B.stearothermophilus）である請求項４記載の酵
素。 - 【請求項６】 該細菌が工業技術院生命工学技術研究所
に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７３の下に寄託されてい
るバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である請
求項４記載の酵素。 - 【請求項７】 請求項１記載のＯ−アセチルセリンスル
フヒドリラーゼの産生能を有する好温性のバチルス属に
属する細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘
導培地で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセ
リンスルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ
−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの製造法。 - 【請求項８】 該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラー
ゼ産生能を有する好温性のバチルス属に属する細菌がバ
チルス・ステアロサーモフィルスである請求項７記載の
方法。 - 【請求項９】 該好温性のバチルス属に属する該Ｏ−ア
セチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する細菌
が、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステ
アロサーモフィルスＣＮ３株である請求項７記載の方
法。 - 【請求項１０】 工業技術院生命工学技術研究所に受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバ
チルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20186294A JP3694335B2 (ja) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | 耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20186294A JP3694335B2 (ja) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | 耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856666A true JPH0856666A (ja) | 1996-03-05 |
| JP3694335B2 JP3694335B2 (ja) | 2005-09-14 |
Family
ID=16448126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20186294A Expired - Fee Related JP3694335B2 (ja) | 1994-08-26 | 1994-08-26 | 耐熱性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3694335B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0733374A3 (en) * | 1995-03-24 | 1999-06-02 | Research Development Corporation Of Japan | Cyano-alpha-amino carboxylic acids, and their use in preparing labelled alpha-amino acids |
| DE10116881A1 (de) * | 2001-04-04 | 2002-10-17 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
-
1994
- 1994-08-26 JP JP20186294A patent/JP3694335B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0733374A3 (en) * | 1995-03-24 | 1999-06-02 | Research Development Corporation Of Japan | Cyano-alpha-amino carboxylic acids, and their use in preparing labelled alpha-amino acids |
| DE10116881A1 (de) * | 2001-04-04 | 2002-10-17 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3694335B2 (ja) | 2005-09-14 |
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