JPH0838169A - ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 - Google Patents
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法Info
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- JPH0838169A JPH0838169A JP6181047A JP18104794A JPH0838169A JP H0838169 A JPH0838169 A JP H0838169A JP 6181047 A JP6181047 A JP 6181047A JP 18104794 A JP18104794 A JP 18104794A JP H0838169 A JPH0838169 A JP H0838169A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素生産菌を培地に培養し、その培養物から３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取してなる３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素の製造法。 【効果】 アルカリゲネス属に属する微生物による新規
な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるケト
ン体の１つの３−ヒドロキシ酪酸の測定用酵素をして提
供できた。
酸脱水素酵素生産菌を培地に培養し、その培養物から３
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取してなる３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素の製造法。 【効果】 アルカリゲネス属に属する微生物による新規
な製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるケト
ン体の１つの３−ヒドロキシ酪酸の測定用酵素をして提
供できた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアルカリゲネス（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）生産菌を培養し、その培養物か
ら３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取してなる３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法に関する。
ａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する３−ヒドロキシ酪酸脱水
素酵素（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）生産菌を培養し、その培養物か
ら３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取してなる３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来技術及び課題】３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
（ＥＣ．１．１．１．３０）は、ＮＡＤの存在下３ーヒ
ドロキシ酪酸に作用して１モルのＮＡＤを消費し、１モ
ルのアセト酢酸及び、１モルの還元型ＮＡＤに変換する
触媒作用を示す酵素として知られている。
（ＥＣ．１．１．１．３０）は、ＮＡＤの存在下３ーヒ
ドロキシ酪酸に作用して１モルのＮＡＤを消費し、１モ
ルのアセト酢酸及び、１モルの還元型ＮＡＤに変換する
触媒作用を示す酵素として知られている。
【０００３】これまで３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素に
ついて、動物由来のものとしては例えばラット脳（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，９８０−９
８３（１９９０））、ラット肝臓（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，１２２５−１２３０（１９
９０））、ウシ心臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．，２６２，８５−９８（１９８８））が報
告されている。
ついて、動物由来のものとしては例えばラット脳（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，９８０−９
８３（１９９０））、ラット肝臓（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６８，１２２５−１２３０（１９
９０））、ウシ心臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．，２６２，８５−９８（１９８８））が報
告されている。
【０００４】また、微生物由来のものとしてはロードス
ピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｒｕｂｒｕｍ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７，６
０３−６０７（１９６２））、シュードモナス・レモイ
グネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅ
ｉ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０，４０２３−４
０２９（１９６５））、マイコバクテリウム・フレイ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）（Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０４，１２３−１２６
（１９７８））、パラコッカス・デニトリフィカンス
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８３９，
３００−３０７（１９８５））、ズーグロエア・ラミゲ
ラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．８９，６２５−６３５（１９８１））、ロ
ードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．２４１，２９７−３００（１９８
７））、アゾスピリルム・ブラジレンズ（Ａｚｏｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６，６４５−６４９（１９９
０））等が知られている。
ピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
ｒｕｂｒｕｍ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７，６
０３−６０７（１９６２））、シュードモナス・レモイ
グネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｅｍｏｉｇｎｅ
ｉ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０，４０２３−４
０２９（１９６５））、マイコバクテリウム・フレイ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）（Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０４，１２３−１２６
（１９７８））、パラコッカス・デニトリフィカンス
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８３９，
３００−３０７（１９８５））、ズーグロエア・ラミゲ
ラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．８９，６２５−６３５（１９８１））、ロ
ードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．２４１，２９７−３００（１９８
７））、アゾスピリルム・ブラジレンズ（Ａｚｏｓｐｉ
ｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）（Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６，６４５−６４９（１９９
０））等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の菌株以外の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有
する菌株による該酵素の製造法の開発が望まれていた。
の菌株以外の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有
する菌株による該酵素の製造法の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素の工業的生産の可能な製造法を求
めて鋭意研究を重ねた結果、奈良県五条市のジャガイモ
畑の土壌から単離したアルカリゲネス属菌ＮＯ．９８１
菌株が３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有するこ
とを初めて見いだし、本発明を完成した。
ロキシ酪酸脱水素酵素の工業的生産の可能な製造法を求
めて鋭意研究を重ねた結果、奈良県五条市のジャガイモ
畑の土壌から単離したアルカリゲネス属菌ＮＯ．９８１
菌株が３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産能を有するこ
とを初めて見いだし、本発明を完成した。
【０００７】本発明は上記の知見に基づいて完成された
もので、アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素生産菌を培養し、その培養物から３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法である。以下に本発明
について詳細に説明する。
もので、アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキシ酪酸
脱水素酵素生産菌を培養し、その培養物から３−ヒドロ
キシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴とする３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法である。以下に本発明
について詳細に説明する。
【０００８】まず、本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素
酵素生産菌について、アルカリゲネス属に属する３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物
であれば何ら限定されるものではなく、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素生産能を有する変種や変異株であっても
よく、好ましくはアルカリゲネス属に属するＮＯ．９８
１株が挙げられ、本菌株は工業技術院技術研究所（現；
工業技術院生命工学技術研究所）に寄託番号微工研条寄
第２５７０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５７０）として寄託
したものである。なお本菌株の菌学的性質、同定及び命
名については特開平３−１２７９８５号公報、米国特許
第５１７３４１６明細書に詳細に記載されている。
酵素生産菌について、アルカリゲネス属に属する３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物
であれば何ら限定されるものではなく、３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素生産能を有する変種や変異株であっても
よく、好ましくはアルカリゲネス属に属するＮＯ．９８
１株が挙げられ、本菌株は工業技術院技術研究所（現；
工業技術院生命工学技術研究所）に寄託番号微工研条寄
第２５７０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５７０）として寄託
したものである。なお本菌株の菌学的性質、同定及び命
名については特開平３−１２７９８５号公報、米国特許
第５１７３４１６明細書に詳細に記載されている。
【０００９】本発明を実施するにあたり、その培養形態
としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業
的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用す
る培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素
源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、アル
カリゲネス属に属する微生物の利用できる栄養源であれ
ばすべて使用できる。
としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業
的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用す
る培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素
源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、アル
カリゲネス属に属する微生物の利用できる栄養源であれ
ばすべて使用できる。
【００１０】炭素源としてはグルコース、フルクトー
ス、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロ
ール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪
酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用い
られる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいず
れも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アン
モニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては大
豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープ
リカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵
母エキス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素として
はリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウ
ム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性
剤、消泡剤等の菌の生育や３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用でき
る。
ス、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロ
ール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪
酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用い
られる。窒素源としては無機窒素源、有機窒素源のいず
れも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アン
モニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては大
豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープ
リカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵
母エキス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素として
はリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウ
ム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性
剤、消泡剤等の菌の生育や３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用でき
る。
【００１１】培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育
し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が産生する範囲であ
ればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５゜Ｃ〜
３５゜Ｃである。培養時間は条件により異なるが３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素が最も産生される時間まで培養
すればよく、通常２４〜１００時間程度である。３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素は主としてその菌体内に含有、
蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の抽出法を例示すればまず培
養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液や
トリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処
理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理
などの種種の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗
製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液を得る。
し、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が産生する範囲であ
ればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５゜Ｃ〜
３５゜Ｃである。培養時間は条件により異なるが３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素が最も産生される時間まで培養
すればよく、通常２４〜１００時間程度である。３−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素は主としてその菌体内に含有、
蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の抽出法を例示すればまず培
養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液や
トリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処
理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理
などの種種の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗
製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液を得る。
【００１２】粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有
液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を
用いて精製３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を得る。例え
ば、粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液にアセ
トン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分
別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用して
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を沈澱させ、回収する。
さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行
った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン
交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマ
トグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法
を適当に組み合わせることにより３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行う
ことができる。
液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を
用いて精製３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を得る。例え
ば、粗製の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有液にアセ
トン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分
別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用して
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を沈澱させ、回収する。
さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行
った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン
交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマ
トグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法
を適当に組み合わせることにより３−ヒドロキシ酪酸脱
水素酵素の精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行う
ことができる。
【００１３】これらの方法によって得られる酵素は安定
化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界
面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃
縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形の３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素を得ることができ、また、適宜凍
結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカ
ロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５
〜１０％程度添加してもよい。
化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界
面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃
縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形の３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素を得ることができ、また、適宜凍
結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカ
ロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５
〜１０％程度添加してもよい。
【００１４】つぎに本発明で得られる３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素の理化学的性質及び酵素活性測定法を述べ
る。 ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性測定法 ０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２ｍ
ｌ、５０ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸０．１ｍｌ、１０ｍ
ＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ
０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロテトラゾニ
ウムブルー）０．０２ｍｌ、１０％のトリトンＸ−１０
０を０．０１ｍｌ、及び蒸留水０．５２ｍｌよりなる反
応液１ｍｌを３７゜Ｃで１分間予備加温した後、２０μ
ｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、
０．１Ｎの塩酸を添加して反応を停止させ、５分以内に
層長１．０ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸
光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわ
りに蒸留水２０μｌを用いて同一の操作を行って吸光度
を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と
盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵
素活性を求める。酵素活性１単位は３７゜Ｃで１分間に
１μモルの還元型ＮＡＤを生成させる酵素量とし、計算
式は下記の通りである。
酸脱水素酵素の理化学的性質及び酵素活性測定法を述べ
る。 ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性測定法 ０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２ｍ
ｌ、５０ｍＭの３−ヒドロキシ酪酸０．１ｍｌ、１０ｍ
ＭのＮＡＤ０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ
０．０５ｍｌ、０．２５％のＮＴＢ（ニトロテトラゾニ
ウムブルー）０．０２ｍｌ、１０％のトリトンＸ−１０
０を０．０１ｍｌ、及び蒸留水０．５２ｍｌよりなる反
応液１ｍｌを３７゜Ｃで１分間予備加温した後、２０μ
ｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、
０．１Ｎの塩酸を添加して反応を停止させ、５分以内に
層長１．０ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸
光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわ
りに蒸留水２０μｌを用いて同一の操作を行って吸光度
を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と
盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵
素活性を求める。酵素活性１単位は３７゜Ｃで１分間に
１μモルの還元型ＮＡＤを生成させる酵素量とし、計算
式は下記の通りである。
【００１５】
【数１】
【００１６】理化学的性質 （１）酵素作用：基質として３−ヒドロキシ酪酸を用い
た酵素作用を以下に示す。
た酵素作用を以下に示す。
【００１７】
【化１】
【００１８】（２）基質特異性：３−ヒドロキシ酪酸に
基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通
りである。
基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通
りである。
【００１９】
【表１】
【００２０】（３）Ｋｍ 値：１．６±０．５（ｍＭ）
（３−ヒドロキシ酪酸に対して） ０．１２±０．０２（ｍＭ）（ＮＡＤに対して） ４）等電点：５．０±０．２（キャリアー−アンホライ
ンを用いた電気泳動法にて） （５）分子量：６００００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−３
０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、３００００±５０
００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて） （６）至適ｐＨ 前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ５．０〜６．０の範
囲は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範囲
は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の範囲
は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．
０の範囲は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは８
〜９にあった。 （７）ｐＨ安定性 １００ｍＭ各種緩衝液（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
１Ｕ／ｍｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活
性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を
図２に示す。ｐＨ４．０〜５．０は１００ｍＭクエン酸
緩衝液、ｐＨ５．０〜６．０は１００ｍＭ酢酸緩衝液、
ｐＨ６．０〜７．５は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７．５〜９．０は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ
９．０〜１１．０は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液を使用した。ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も
良好な安定性を示した。 （８）至適温度 前記酵素活性測定法に従って、温度を２５゜Ｃ〜６０゜
Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示
すとおりであり、本酵素の至適温度は４５〜５０゜Ｃで
あった。 （９）熱安定性 １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）（３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０
分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に
従って測定した。その結果、図４に示すとおり少なくと
も３７゜Ｃまで安定であった。 （１０）金属イオンの影響 各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響につい
て調べた結果は表２に示すとおりで、銅イオンによる強
い阻害がみられた。
（３−ヒドロキシ酪酸に対して） ０．１２±０．０２（ｍＭ）（ＮＡＤに対して） ４）等電点：５．０±０．２（キャリアー−アンホライ
ンを用いた電気泳動法にて） （５）分子量：６００００±５０００（ＴＳＫ Ｇ−３
０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、３００００±５０
００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて） （６）至適ｐＨ 前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもの
で、その結果を図１に示した。ｐＨ５．０〜６．０の範
囲は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．５の範囲
は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０の範囲
は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．
０の範囲は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは８
〜９にあった。 （７）ｐＨ安定性 １００ｍＭ各種緩衝液（３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
１Ｕ／ｍｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活
性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を
図２に示す。ｐＨ４．０〜５．０は１００ｍＭクエン酸
緩衝液、ｐＨ５．０〜６．０は１００ｍＭ酢酸緩衝液、
ｐＨ６．０〜７．５は１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７．５〜９．０は１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ
９．０〜１１．０は１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液を使用した。ｐＨ７．５〜１１の範囲で最も
良好な安定性を示した。 （８）至適温度 前記酵素活性測定法に従って、温度を２５゜Ｃ〜６０゜
Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示
すとおりであり、本酵素の至適温度は４５〜５０゜Ｃで
あった。 （９）熱安定性 １００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．５）（３−
ヒドロキシ酪酸脱水素酵素１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０
分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に
従って測定した。その結果、図４に示すとおり少なくと
も３７゜Ｃまで安定であった。 （１０）金属イオンの影響 各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響につい
て調べた結果は表２に示すとおりで、銅イオンによる強
い阻害がみられた。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【実施例】ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、
本発明はなんらこれにより限定されるものではない。
本発明はなんらこれにより限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】アルカリゲネス・エスピーＮＯ．９８１株
をグルタミン酸２％、酵母エキス５．０％からなる培地
（ｐＨ７．０）１００ｍｌに接種し、２８゜Ｃ、４８時
間培養し、得られた種培養液を上記と同一組成培地に消
泡剤を加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌに添加し、２８
゜Ｃで４８時間培養した。培養終了後、培養物を４５０
０ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体５６０ｇを回収し
た。
をグルタミン酸２％、酵母エキス５．０％からなる培地
（ｐＨ７．０）１００ｍｌに接種し、２８゜Ｃ、４８時
間培養し、得られた種培養液を上記と同一組成培地に消
泡剤を加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌに添加し、２８
゜Ｃで４８時間培養した。培養終了後、培養物を４５０
０ｒｐｍで３０分間、遠心し、菌体５６０ｇを回収し
た。
【００２４】この菌体に１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１％リゾチ
ーム溶液２ｌを加え、３７゜Ｃ、３０分間反応させて、
可溶化を行った。その後、これを４５００ｒｐｍで３０
分間遠心分離して不溶物を除去して、その上清１８７０
ｍｌ（４１１００Ｕ）を得た。ついでこの上清に５％硫
酸プロタミン１８．７ｍｌを加えて沈でん物を遠心除去
し、その上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（２．７
×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマト
グラフィーを行った。溶出は塩化カリウムの０〜１Ｍの
リニアグラジエントにより行い、０．２０．３ＭＫＣｌ
の溶出画分（３１７００Ｕ）を回収した。この酵素溶液
に４Ｍ濃度となるようにＮａＣｌを溶解し、フェニルセ
ファロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社
製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は４Ｍ〜
０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０．５
ＭのＮａＣｌの溶出画分（２０８０Ｕ）を回収した。
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含む０．１％リゾチ
ーム溶液２ｌを加え、３７゜Ｃ、３０分間反応させて、
可溶化を行った。その後、これを４５００ｒｐｍで３０
分間遠心分離して不溶物を除去して、その上清１８７０
ｍｌ（４１１００Ｕ）を得た。ついでこの上清に５％硫
酸プロタミン１８．７ｍｌを加えて沈でん物を遠心除去
し、その上清を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（２．７
×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマト
グラフィーを行った。溶出は塩化カリウムの０〜１Ｍの
リニアグラジエントにより行い、０．２０．３ＭＫＣｌ
の溶出画分（３１７００Ｕ）を回収した。この酵素溶液
に４Ｍ濃度となるようにＮａＣｌを溶解し、フェニルセ
ファロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社
製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は４Ｍ〜
０ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行い、１Ｍ〜０．５
ＭのＮａＣｌの溶出画分（２０８０Ｕ）を回収した。
【００２５】ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファ
ロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）
のイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜
０．４ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより行い、
０．２〜０．２５ＭのＮａＣｌの溶出画分（２００００
Ｕ）を回収した。更に、この酵素液を１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキ
シアパタイト（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス
社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．３
Ｍリン酸緩衝液による直線グラジエントにより行い、
０．０６〜０．１Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６０
００Ｕ）を回収し、凍結乾燥して精製３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素（２１３Ｕ／ｍｇ、７５ｍｇ）を得た。
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファ
ロース（２．６×１９．５ｃｍ）（ファルマシア社製）
のイオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜
０．４ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより行い、
０．２〜０．２５ＭのＮａＣｌの溶出画分（２００００
Ｕ）を回収した。更に、この酵素液を１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキ
シアパタイト（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス
社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．３
Ｍリン酸緩衝液による直線グラジエントにより行い、
０．０６〜０．１Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６０
００Ｕ）を回収し、凍結乾燥して精製３−ヒドロキシ酪
酸脱水素酵素（２１３Ｕ／ｍｇ、７５ｍｇ）を得た。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、アルカリゲネス属に属す
る微生物による新規な製造法を提供できるものであり、
本酵素を用いるケトン体の１つの３−ヒドロキシ酪酸の
測定用酵素をして提供できた。
る微生物による新規な製造法を提供できるものであり、
本酵素を用いるケトン体の１つの３−ヒドロキシ酪酸の
測定用酵素をして提供できた。
【図１】図１は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の至適ｐＨ曲線を示す。
の至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
のｐＨ安定曲線を示す。
のｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の至適温度曲線を示す。
の至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の熱安定曲線を示す。
の熱安定曲線を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素生産菌を培地に培養し、その培養物か
ら３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を採取することを特徴
とする３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。 - 【請求項２】 アルカリゲネス属に属する３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素生産菌が，アルカリゲネス・エスピー
Ｎｏ．９８１（微工研条寄第２５７０号）株である請求
項１記載の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18104794A JP3602162B2 (ja) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18104794A JP3602162B2 (ja) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838169A true JPH0838169A (ja) | 1996-02-13 |
| JP3602162B2 JP3602162B2 (ja) | 2004-12-15 |
Family
ID=16093849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18104794A Expired - Fee Related JP3602162B2 (ja) | 1994-08-02 | 1994-08-02 | ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3602162B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1304453C (zh) * | 2004-09-27 | 2007-03-14 | 江苏南天集团股份有限公司 | 可完全生物降解聚3－羟基丁酸酯的制备方法 |
| JP2019140958A (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 大阪瓦斯株式会社 | アセト酢酸の製造方法 |
-
1994
- 1994-08-02 JP JP18104794A patent/JP3602162B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1304453C (zh) * | 2004-09-27 | 2007-03-14 | 江苏南天集团股份有限公司 | 可完全生物降解聚3－羟基丁酸酯的制备方法 |
| JP2019140958A (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 大阪瓦斯株式会社 | アセト酢酸の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3602162B2 (ja) | 2004-12-15 |
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