JPH08502412A

JPH08502412A - 酵素的トリグリセリド変換

Info

Publication number: JPH08502412A
Application number: JP6510613A
Authority: JP
Inventors: チャンドラー、イアン・クリストファー; クウィンラン、ポール・トマス
Original assignee: ロダース・クロックラーン・ビー・ブイ
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-11
Publication date: 1996-03-19
Also published as: AU5942998A; EP0666925A1; MY130121A; CA2146848A1; WO1994010326A1; ATE175444T1; DE69322974D1; EP0666925B1; AU5176693A

Abstract

(57)【要約】本発明は、水分活性及び総変換度の非常に特定の条件下でミュコール種から誘導されるリパーゼを用いることにより１つのありうる鏡像異性体に富んだキラルトリグリセリド組成物の酵素的生成方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】酵素的トリグリセリド変換Ｒ₁Ｒ₂Ｒ₃又はＲ₁Ｒ₁Ｒ₃型の非対称トリグリセリドは、異なる立体異性的形態で存在し得ることが公知技術において認識されてきたが、酵素的にエステル交換されることにより合成された公知のＰＯＳ試料は、ラセミ混合物であると今まで考えられてきた［アリシマ等、ＪＡＯＣＳ、68巻、10号（1991年）、710-715頁］。事実、先の記載は、欧州特許第93602号の開示の確認であり、それには、２頁、52-55行において、酵素的変換におけるRh．arrhizusリパーゼの立体特異生が研究されたが、存在しないことが見出だされたと記載されている。リパーゼを含む酵素が、特定の鏡像異性体に富んでいる生成物の生成方法において用いられ得ることかも知られているので、先の記載は驚くべきことである。例えば、Biocatalysis、３巻（1990年）、307-317頁において、Jensenらは、特定のリパーゼは、特定のアルコール又は脂肪酸に対して選択的であると開示している。J．Am．Chem．Soc．（1985年）、107号、7072-7076頁において、Kirchner らは、酵母リパーゼ及び豚の膵臓リパーゼは、立体選択的にエステル化及びエステル交換の反応を触媒することを開示している。この技術により、光学的に活性のアルコール、カルボン酸及びそれらのエステルが生成された。Ching-Shin Che n及びC.J．Sihは、Angew．Chem．Int．英語編（Ed．Engl．）、28巻（1989年）、695-707頁に、その基本的原則が、光学的活性な酸及びアルコールの生成用の、リパーゼで触媒作用をした鏡像選択的エステル化及びエステル交換を支配していると記載した。 Agric．Biol．Chem．、54巻（11号）（1990年）、2907-2912頁において、リパーゼで触媒作用をした対称選択的（enantio-selective）加水分解が、ミツダらの論分の主題である。同様の開示が、Journ．Biol．Chem.、265巻（1990年）、2 0271中に、Rogalska，Ransac及びVergerの論文に見出だされる。 Chem．and Phys．of Lipids、61巻（1992年）、193-198頁におけるMeuselらによる最近の論文では、特にリゾミュコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼは、１-ｏ-オクタデシルグリセロールの酵素的生成におけるＳｎ−１部位に対して非常にわずかな立体選択性を示すことが開示されている。しかし、先に引用した先行技術のいずれからも、光学的活性なトリグリセリド組成物の製造のための酵素的方法にどのようにしてなるという示唆は導かれない。そのような方法は、公知のメソメリー組成物とは異なる物理的特性を有する有用な新しい脂肪組成物を生成する。例えば、本願発明者らは、キラルのＳｔＯＰは、ラセミＳｔＯＰよりもずっと迅速により高度の多形に変換する。さらに、キラルＳｔＯＰは、ココアバター用に良好に合う結晶化挙動を示した。ラセミＳｔＯＰは核形成し、よりゆっくりと結晶化する。従って、キラルＳｔＯＰは、ラセミＳｔＯＰよりもチョコレート組成物により良好に使用される（実施例VI参照）。１及び３位が異なる脂肪酸で占められているトリグリセリドは光学的活性な形態で存在する。フィッシヤーの投影（projection）が、頭ではＳＮ−１位、底部ではＳＮ−３位そして左では第二ヒドロキシル基を有する光学的活性なトリグリセリドが作られる場合に、下記のような２つの立体異性体が可能である：（Ｒ₁はパルミチルであり、Ｒ₂はオレイルであり、１つの異性体はＰＰＯと、他の異性体はＯＰＰと示される。）クリスティー（Christie）らによるJ．Am．Oil Chem．Soc．68巻（1991年）、 695-701頁には、異なるジアステレオマーの異性体の分離に関する高性能液体クロマトグラフィーに基づく方法が開示されている。この方法は、トリグリセリドのＳｎ−１及びＳｎ−３組成の両方を決定し、従って上記のＰＰＯ異性体をＯＰＰ異性体から区別する機会を与えている。本願発明者らは、１つより多い鏡像異性体を存在させ、そのトリグリセリド組成物が１つ以上の可能な鏡像異性体に富んでいる非対称のトリグリセリドの形成を生じる新規な方法を見出だした。本発明の方法には、下記の要件は、必須要件である：１．リパーゼは、ザイゴミュコール（Zygomucor）又はリゾミュコール（Rhizomu cor ）、特に、ミュコール・ミエヘイ（Mucor Miehei）としても知られているケカビ（Mucor）種から誘導されるリパーゼでなくてはならなく、そのリパーゼは、天然であっても、修飾リパーゼであってもよく、修飾リパーゼは、遺伝子操作により得られる。２．反応混合物の水分活性は、0.5未満に保たなくてはならない。３．温度、接触時間、反応体の割合、溶媒の使用等の他の条件は、40-95％、好ましくは50-85％と定義される総変換度を得るように選択されなくてはならない。リパーゼは、ザイゴミュコール（Zygomucor）又はリゾミュコール（Rhizomuco r ）・ミエヘイ（Miehei）としても知られているケカビ（Mucor）種から誘導されるリパーゼであることは必須である。そのリパーゼをそれ自体用いるか又は公知の担体に担持され得る（欧州特許第322213号参照）。好ましい担体は、デュオライト又はアキュレル（accurel）のような有機ポリマーである。本発明の上記定義によって用いられ得るリパーゼは、天然のミュコール・ミエヘイ、ザイゴミュコール又はリゾミュコール・ミエヘイリパーゼ；その他の宿主にリパーゼ発現遺伝子を導入することにより同じリパーゼを産生することができる宿主からのリパーゼ；適する宿主により産生された、修飾リパーゼ遺伝子の発現の結果である同様の立体特異活性を有する修飾リパーゼである。リパーゼは、回分反応又は充填層反応器系において用いられる。鏡像異性体富有度は、初期の水の活性度に直接関係する。水の活性度が低ければ低いほど効果が大きい（表Ｉ参照）。しかし、反応速度は水の活性度に直接関係するので、水分活性度の低減は、容認される反応速度により形成される。従って、水の活性度は、限りなく小さくはなり得ない。好ましい範囲は、0.01-0.4、特に0.05-0.3である。考慮されなくてはならない他の重要な要素は、非対称トリグリセリドの最大生成を達成させるために制御されるべき総変換度である。起こる総変換度は、２つの反応体の割合とともに変化する。その反応を平衡させるとトリグリセリドのラセミ化が生じるので、平衡にしてはならない。従って、その反応条件は、40-95 ％、好ましくは50-85％の総変換が起こることを保証する反応条件を選ばなくてはならず、選ばれる条件は、特に反応温度（通常、40-80℃）、接触時間（充填層で３時間未満、特に１時間未満で最も好ましくは15-45分間）、反応体の重量比（最終生成物は、非対称でなくてはならないので、対称生成物が生成されるほど反応体を多量に用いることを避けなければならない）等である。溶媒の使用も又、点２により選ばれる水分活性度は、総変換速度において役割を果たす。部分的なトリグリセリド酵素的変換は、例えば、欧州特許第34065号及び35883 号により知られている。従って、部分変換の条件もそれらの文献から誘導される。しかし、それらの文献において、例えば、リゾミュコール・ミエヘイリパーゼは、非対称トリグリセリドの生成に使用されていないように、立体特異的変換は開示されていない。先に記載された原則は、その例としてＳｔＯＰ、ＰＰＵ、ＳｔＳｔＵ、ＰＳｔＯ、ＰＰＢｕ、ＳｔＳｔＢｕ、ＢＵＵ、ＢＬｎＬｎ、ＢＭＭ、ＡＵＵ、ＭＭＯ及びＨＨＭ型トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）（Ｓｔは、ステアリン酸、Ｐはパルミチン酸、Ｂはベヘン酸、Ａはアラキン酸、Ｂｕは酪酸、Ｕは不飽和脂肪酸、Ｏはオレイン酸、Ｌｎはリノール酸、ＭはＣ₈−Ｃ₁₄飽和脂肪酸、ＨはＣ₁₆−Ｃ₂₄ 飽和脂肪酸）等が含まれる、非対称ＴＡＧの生成に適用する。上記の発見に加えて、本発明の新規な方法の予測しない他の利点を見出だした。この利点を、トリパルミチン（Ｐ₃）とオレイン酸間の酵素的反応を例として記載しただけの図１及び図２を用いて説明する。この反応においてＰ₃は最初の工程でＰＰＯ及びＯＰＰの混合物に変換され、第二工程において、ＯＰＯが生成される。それらの図において、反応（又は接触）時間に依存して生成されるトリグリセリド量間の相関関係についてプロットしたものである。図１では、Ｓｎ１，３エステル交換（Ｐ₃＋オレイン酸）の理論（算定）時間経過が示されている。そのグラフからわかるように、非対称トリグリセリド（ＰＰＯ）はその反応の早期に生成され、総トリグリセリド組成物の約48％の平衡値に達する。反応における一点において、ＰＰＯはその平衡値をわずかに過ぎ、50％の最大値に達し、その後に平衡における48％に下がる。しかし、図２において、本発明の変換に関して見出された実際の状況が表わされている。その反応の初期に、ＰＰＯの生成がその平衡値を過ぎ、約57％の最大値に達し、その後に平衡における48％にゆっくりと下がる。上記の現象は、接触時間を限定させることによって、平衡において得られる収率よりも高い収率の（非対称の）トリグリセリドが得られることを意味する。実際、ベヘン酸を用いてのトリオレオイルグリセリド（３：１のモル比）の変換によって得られる最大収率は、59％でさえある（平衡値は47.5％であるが）（表II参照）。酪酸エチル（ethylbutylrate）を用いてのトリパルミチントリグリセリドの変換はさらにもっと驚くべき効果を有した（最大値：46％、平衡において16.6％であるのと比較）（表II参照）。短鎖脂肪酸を有するトリグリセリドを用いる場合にも非対称のトリグリセリドが非常に良好な収率で得られる。例えば、トリアセチンのベヘン酸との反応において、非対称のトリグリセリドの最大収率は、平衡において43.2％であるのに対し、76.4％であった（表II）。種々の例によって、広範囲のトリグリセリドと脂肪酸基質を用いての本発明の条件下で増大した収率の非対称のＴＡＧが得られている。いくつかの例を表IIにまとめた。本発明による方法をどのタイプの非対称のトリグリセリド組成物の生成にも適用でき、トリグリセリドの脂肪酸部分及び脂肪酸反応体の鎖長自体は、Ｃ₁−Ｃ₂ ₆ 、好ましくはＣ₂−Ｃ₂₂、特にＣ₂−Ｃ₁₈であることができる。トリグリセリド最終生成物においても、不飽和（すなわち、モノ及びポリ不飽和の）脂肪酸部分が存在し得る。特に、Ｃ_18:1、Ｃ_18:2、Ｃ_18:3、Ｃ_20:4、Ｃ_20:5及びＣ_22:6からの残基が、シス及びトランス異性体も含めて存在し得る。さらに、先きに記載した脂肪酸反応体はその他のトリグリセリドであることができ、そしてトリグリセリド／トリグリセリドのエステル交換を行う。この場合に、変換度は、トリグリセリドの炭素数分布における変化により決まり、得られるトリグリセリドの光学活性は、先きに記載したように、分別又はクロマトグラフィー技術によるトリグリセリド種の分離後決定される。本明細書において、トリグリセリドと脂肪酸との反応の全体の変換は、（ＦＡｉ＝ＴＡＧにおける脂肪酸の初期濃度ＦＡｅ＝ＴＡＧにおける脂肪酸の平衡ＦＡｓ＝時間ｔで測定したＴＡＧにおける脂肪酸の平衡）と定義される。（Ｐ＝試料の水蒸気圧Ｐｏ＝同じ温度における純粋な水の水蒸気圧）と定義される。鏡像異性体過剰（enantiometric excess）＝（Ｂ−Ａ）／（Ａ＋Ｂ）×100％（式中、Ａ及びＢは２つの可能な鏡像異性体の濃度である。本発明は、又、少なくとも１つの可能な鏡像異性体に富んだ、酵素により生成された非対称のトリグリセリド組成物に関する。特に、10重量％より多い、さらに特には30重量％より多く富んだ組成物は本発明の一部である。それらの組成物において、可能な鏡像異性体のモル比は1.0以外であり、好ましくは1.5より多いか又は0.7未満であり、特に3.0より多いか又は0.33未満であり、さらに特に4.0 より多いか又は0.25未満である。好ましいキラルトリグリセリドは、主にＰＯＳｔ／ＳｔＯＰトリグリセリドを好ましくは40重量％より多く含む。そのようなキラルトリグリセリドも又、本発明の一部である。実施例実施例Ｉすべての実施例において、同じ実験操作を行った。詳細を、トリパルミチン（ＰＰＰ）とオレイン酸（Ｏ）との反応によりＯＰＰ／ＰＰＯ及びＯＰＯを生成することについて記載する。１部のトリパルミチン 1.048部のオレイン酸（１：３のモル比） 0.1-0.5部の触媒、低水分活性に予備平衡させる（＜0.5）もし必要なら溶媒、好ましくは疎水性の、例えばヘキサン又は石油エーテルそれらの条件下で平衡になるのに、その反応は一般に２−３時間かかり、そして反応速度は、用いる触媒の量とａ_wに依存する。ミュコール・ミエヘイ触媒を制御された湿度雰囲気中において低水分活性に予備平衡する。このことは、その触媒を公知の平衡湿度の飽和した無機塩溶液を含む密閉した環境において少なくとも７日保つことにより達成される。用いた飽和溶液は下記の通りである。塩 20℃での水分活性水酸化ナトリウム 0.06 塩化リチウム 0.11 酢酸カリウム 0.23 塩化マグネシウム六水和物 0.32 硝酸マグネシウム六水和物 0.55 硫酸ナトリウム十水和物／無水硫酸ナトリウム配合物 0.77 塩化カリウム 0.86 精製水 1.00 その反応の初期の水分活性の効果を表Ｉに示す。最も低い水分活性（＜0.01）、従って最も大きいリパーゼ選択性は、触媒を真空下で24時間以上乾燥させることによって達成される。ある範囲のトリグリセリド及び脂肪酸基質を異なるモル比で反応させた（上記のように）。非対称のトリグリセリドの得られた最大収率を平衡値と比較して、表IIに示す。「最大値が得られた時点での脂肪酸部分の変換の値（ＦＡＭＥ−co nversion value）」は、時間経過反応において最大に見られた値を表わし、最適変換はこの値とわずかに事なり得ることに注意されたい。Ｐ＝パルミチン酸の（＝Ｃ₁₆）Ｓｔ＝ステアリン酸の（＝Ｃ₁₈）Ｂ＝ベヘン酸の（Ｃ₂₂）Ｏ＝オレイン酸の（＝Ｃ_18:1）Ｂｕ＝酪酸の（Ｃ₄）ＥｔＢｕ＝酪酸エチルＡｃ＝酢酸の（Ｃ₂）Ｍ＝Ｃ₈乃至Ｃ₁₄ ＰＯ−ｓ＝パ−ム油ステアリンＨＯＳＦ−酸＝ヒマワリ高オレイン酸低水分活性（＜0.3）の条件下での種々のリパーゼ触媒を用いたときの効果及び制御された変換を表IIIに示す。その結果は、リゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼを用いたときのみに非対称のトリグリセリドの収率が増大することを示している。支持体［すなわち、アキュレル（accurel）対デュオライト（duolite）の性質は重要でなかった。実施例II 実施例Ｉにより、ＰＯＰをステアリン酸で変換した。酸：油のモル比は３：１であり、初期水分活性は、0.2未満であった。その反応を67％の変換で停止した。酵素変換生成物は、下記の炭素数分布を示した。Ｃ₅₀：25.3 Ｃ₅₂：55.9 Ｃ₅₄：17.3 トリグリセリドのｓｎ−１、２及び３位を、先きに記載したクリスティー（Ch ristie）らの方法により決定し、下記の結果を得た。脂肪酸部分ＴＧｓｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 39.0 37.1 5.4 74.6 18:0 29.3 60.6 3.8 23.6 18:1 31.6 2.3 90.8 1.8 ＴＧ＝トリグリセリドｓｎ＝１、３位でのパルミチン酸とオレイン酸分布はランダムではなく、従って、トリグリセリド組成物は、一様でない割合のトリグリセリド鏡像異性体を含有していることがわかる。「ｓｎ−１ランダム、ｓｎ−２ランダム，ｓｎ−３ランダム」分布理論を用いて、この試料における鏡像異性体ＰＯＳｔ及びＳｔＯｐの含量は、それぞれ7.9％及び41％と計算された。従って、これらの２つの鏡像異性体の比（ＳｔＯＰ／ＰＯＳｔ）は、およそ5.2であり、鏡像異性体過剰は、6 8％である。実施例III ＳｔＯＳｔとパルミチン酸から出発して、実施例IIにおけるような他の条件を用いて変換を繰り返した。部分的に変換された（67％）生成物の脂肪酸部分及び炭素数分布は、Ｃ₅₀：11.1 Ｃ₅₂：55.3 Ｃ₅₄：33.4 であった。トリグリセリドのｓｎ−１、２及び３位を前記のように決定し、下記の結果を得た。ＴＧｓｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 26.6 55.5 10.3 14.1 18.0 39.0 36.3 3.1 77.6 18.1 34.4 8.2 86.6 8.4 ｓｎ−１、３位での非ランダム分布は、非対称トリグリセリドの鏡像異性体過剰の存在を示している。本試料におけるＰＯＳｔ及びＳｔＯＰの含量は、それぞれ37.3％及び4.4％と計算され、8.5の鏡像異性体比（ＰＯＳｔ／ＳｔＯＰ）を示し、鏡像異性体過剰は79％である。実施例IV 実施例IIに記載されているように、トリパルミチンに富んだ供給原料及びオレイン酸（１：３のモル比）をリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼの存在下で反応させた。部分的酵素的変換（69％）の生成物を上記のように分析し、下記の結果を得た。ＴＧｓｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 72.2 63.4 58.2 95 18:1 27.8 36.6 41.8 5 上記から、この試料のＯＰＰ及びＰＰＯ含量は、それぞれ20.2％及び1.8％であり、11.2の鏡像異性体比（ＯＰＰ／ＰＰＯ）を示す。同様に、ＯＯＰ及びＰＯＯ含量は、14.5及び1.3％であり、19.3の比であり、鏡像異性体過剰が84％であると計算される。実施例ＶＰＰＵ（Ｕはオレイン酸の又はリノール酸の）型の二飽和トリグリセリドに富んだトリグリセリド生成物を１：１の重量割合で高オレイン酸のヒマワリ油及び低エルカ酸のナタネ油から誘導された脂肪酸と混合した。その混合物をシリカ予備カラムを用いて部分的に湿らせ、供給原料流れの水分活性は0.5であった。この供給原料混合物を70℃の温度で１乃至1.5ｋｇ／時間の流量で、デュオライト（ノボからのコードＳＰ−392）に固定された１ｋｇのリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼを含有するカラムに通した。最終生成物の93％の総変換（トリグリセリドのパルミテート含量における低減として測定された）が達成された。脂肪酸と部分的グリセリドを除去し、得られたトリグリセリドを−５℃でアセトン（６：１の溶媒：油）でろ別し、残存するトリ−及びジ−飽和トリグリセリドの大部分を除去した。最終的なオレインを分析し、ｓｎ−１、２及び３分布を決定した。結果を下記に示す。酵素カラムへのトリグリセリド供給原料及び得られた生成物の脂肪酸分析トリグリセリド供給原料酸との反応後トリグリセリド脂肪酸部分 sn-2位計算された平衡生成物 14:0 0.8 1.2 0.5 0.6 16:0 67.5 91.8 46.3 47.9 18:0 6.4 3.4 4.1 4.1 18:1 22.1 2.8 34.5 32.5 18:2w6 2.3 0.3 11.5 11.3 18:3w3 - - 3.0 3.0 生成物オレイン画分の立体特異体の分析総ＴＧｓｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 34.2 12.8 77.6 12.1 18:0 1.8 0.1 4.6 0.6 18:1 44.4 64.7 17.6 50.9 18:2w6 16.3 22.6 0 26.3 18:3w3 3.3 -0.3 0.3 10.0 ｓｎ−１及びｓｎ−３位におけるオレイン酸、リノール酸及びα−リノレン酸含量は、このトリグリセリドにおいて異なり、一様でない割合の、いくつかの鏡像異性体の存在を示している。例えば、この試料おいてＯＰｌｎ及びｌｎＰＯ（ｌｎ＝リノール酸）は、13.2％と8.9％と計算され、これらの２つの鏡像異性体の比（ＯＰｌｎ／ｌｎＰＯ）は1.48であり、19.5％の鏡像異性体過剰を与える。さらに、この試料においてＯＰｌＮ（ｌＮ＝α−リノレン酸）は５％であり、鏡像異性体ｌＮＰＯは、驚くべきことに０である。実施例VI 実施例IIに記載した方法及び条件を用いて、0.1のａ_wに予備平衡させたリゾミュコール・ミエヘイ触媒の存在下で純粋のＰＯＰ（4.9ｇ）を純粋のステアリン酸（5.0ｇ）と反応させることにより、キラルＳｔＯｐに富んだ脂肪（キラルＣＢＥ）を生成した。純粋のＰＯＰ（1.59ｇ）を純粋のＳｔＯＳｔ（0.657ｇ）及び純粋のラセミＰＯＳｔ（2.72ｇ）とブレンドすることによりラセミ化合物の、ＳｔＯｐに富んだ脂肪（ラセミＣＢＥ）を生成した。炭素数ＧＣにより脂肪は下記の組成（重量％）を有した（この分析において位置の分布が区別されなく、従って「ＳｔＯＰ」＝ＰＯＳｔ＋ＳｔＯＰ＋ｐＳｔＯ＋ＳｔＰＯ等）。キラルＣＢＥラセミＣＢＥココア脂 POP 30.9% POP 32% POP 16.6% StOP 53.1% StOP+POSt 55% St0P+P0St 38.9% StOSt 12.6% StOSt 13% StOSt 25.5% その他 3.4% その他 19% 下記、キラルＣＢＥラセミＣＢＥココア脂 POP 32 32 20.5 StOP+POSt 55 55 48 St0St 13 13 31.5 のようなＰＯＰ／ＳｔＯＰ＋ＰＯＳｔ／ＳｔＯＳｔ比を有する。脂肪のｓｎ−１、２及び３位をクリスティーらにより記載されたように決定し下記の結果を得た。キラルＣＢＥ脂肪酸部分（モル％）ＴＧＳｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 40.2 44.1 0 78.2 18:0 25.9 55.5 0.1 20.3 18:1 33.8 0 99.0 0ラセミＣＢＥ脂肪酸部分（モル％）ＴＧＳｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 39.6 61.3 0.1 61.3 18:0 25.9 38.6 0.1 38.5 18:1 33.8 0 99.8 0ココア脂脂肪酸部分（モル％）ＴＧＳｎ−１ｓｎ−２ｓｎ−３ 16:0 28.4 39.0 3.6 42.6 18:0 35.4 52.0 0.7 53.5 18:1 32.6 5.6 91.3 2.5 18:2 2.8 2.3 4.7 1.4 ラセミＣＢＥ及びココア脂は、非常に類似のｓｎ−１及びｓｎ−２分析値を有し、キラルＣＢＥはそれらの位置で実質的な違いを示す。この脂肪において計算されたＳｔＯＰ及びＰＯＳｔ含量は、それぞれ43.4及び8.9であり、4.9の鏡像異性体比及び鏡像異性体の66％過剰を示す。非常に迅速な０℃への冷却及び32.5℃で融解により脂肪を種晶にした。次に、ココア脂と異なり脂肪を20℃及び25℃で結晶化した。キラルＣＢＥはココア脂と同じ多形で迅速に結晶化した。ラセミＣＢＥは、20 ℃でより低い多形でそして25℃で正規形（Ｖ）多形で非常にゆっくりと結晶化した。結晶化結晶化（固体／分）（固体／分） 20℃ 多形 25℃ 多形キラルＣＢＥ 3.8 β(V) 2.1 β(V) ラセミＣＢＥ 2.5 β’(IV) 0.3 β(V) ココア脂 3.6 β(V) 1.7 β(V) 脂肪は、20℃での結晶化の後に下記の固体値を有した。Ｎ20 Ｎ25 Ｎ30 Ｎ32.5 Ｎ35 キラルＣＢＥ 92.6 88.9 45.6 17.0 0 ラセミＣＢＥ 91.8 68.3 30.5 15.0 0 ココア脂 81.2 74.7 40.8 17.8 0.2 従って、調質したチョコレート菓子製品においてキラルＣＢＥは非常に良好なココア脂の代替物であり（ココア脂よりかなり多いＰＯＰトリグリセリド成分及びより少ないＳｔＯＳｔを含有するが）、ラセミＣＢＥはゆっくりと調質し、貯蔵時にブルーミングする傾向がより多い。実施例VII 実施例Ｉにより、200mlのヘキサンと６ｇのリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼの存在下で0.2未満の初期水分活性で12ｇのＰＯＰを14.7ｇのベヘン酸（１：３のモル比において）と反応させた。その反応を63.9％の変換で止め、生成物トリグリセリドは、下記の炭素数分布を示した。Ｃ₅₀ 32.52重量％（ＰＯＰ）Ｃ₅₆ 56.23重量％（ＢＯＰ＋ＰＯＢ）Ｃ₆₂ 12.00重量％（ＢＯＢ）Ｃ₅₆値は、予測した平衡含量（47.1％）より重量で19.3％の増大を示す。実施例VIII 実施例Ｉによって、５mlのヘキサンと125mgのリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼの存在下で0.1未満の初期水分活性で250mgのトリパルミチンを185.8mgのラウリン酸（１：３のモル比で）と反応させた。その反応物を時々試料として採り、非対称のＴＡＧ生成物ＬａＰＰの最大値を74.6％の変換で得た。この点におけるそのトリグリセリド配合物の炭素数分布は、Ｃ₄₀ 15.6重量％（ＬａＰＬａ）Ｃ₄₄ 54.1重量％（ＬａＰＰ＋ＰＰＬａ）Ｃ₄₈ 30.00重量％（ＰＰＰ）であった。Ｃ₄₄値は、予測した平衡含量（48.7重量％）より重量で11％の増大を示す（Ｌａ＝ラウリンの）（Ａｃ＝酢酸の）。実施例IX 実施例Ｉにより、トリカプリリン（トリオクタノイン）、250mgをベヘン酸541 .4mgと（１：３のモル比で）、ヘキサン５mlとリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼ、125mgの存在下で0.1未満の初期水分活性で反応させた。その反応物をところどころで試料として採り、非対象のＴＡＧ生成物ＢＣｙＣｙの最大値が68.4％の変換で得られた。この時点でのトリグリセリド配合物の炭素数分布は、Ｃ₂₄ 21.54重量％（ＣｙＣｙＣｙ）Ｃ₃₈ 63.42重量％（ＢＣｙＣｙ＋ＣｙＣｙＢ）Ｃ₅₂ 15.04重量％（ＢＣｙＢ）であった。Ｃ₃₈値は、予測された平衡含量（45.2％）より、重量で40.4％の増加を示す（Ｃｙ＝カプリン酸）。実施例Ｘ実施例Ｉにより、トリアセチン150mgをオレイン酸579.5mgと（１：３モル比で）、ヘキサン5mlとリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼ125mgの存在下で0.1未満の初期水分活性で反応させた。その反応物をところどころ試料として採り、非対象のＴＡＧ生成物ＯＡｃＡｃを71.3％の変換で得られた。トリグリセリド配合物の炭素数分布はこの時点では、Ｃ₆ 13.04重量％（ＡｃＡｃＡｃ）Ｃ₂₂ 69.98重量％（ＯＡｃＡｃ＋ＡｃＡｃＯ）Ｃ₃₈ 16.46重量％（ＯＡｃＯ）であった。Ｃ₂₂値は、予測された平衡含量（43.6％）より、重量で60.5％の増加を示す（Ａｃ＝酢酸の）。実施例ＸＩ実施例Ｉにより、トリアセチン150mgをベヘン酸698.6mgと（１：３のモル比で）、ヘキサン５mlとリゾミュコール・ミエヘイ・リパーゼ125mgの存在下で0.1未満の初期水分活性で反応させた。その反応物をところどころ試料として採り、非対象のＴＡＧ生成物ＢＡｃＡｃを64.0％の変換で得られた。この時点での、トリグリセリド配合物の炭素数分布は、Ｃ₆ 13.04重量％（ＡｃＡｃＡｃ）Ｃ₂₆ 76.43重量％（ＢＡｃＡｃ＋ＡｃＡｃＢ）Ｃ₄₆ 9.28重量％（ＢＡｃＢ）であった。Ｃ₂₆値は、予測された平衡含量（43.2％）より、重量で77.1％の増加を示す。

【手続補正書】【提出日】１９９５年８月２４日【補正内容】１．明細書、２頁８行「変換する。」を「変換することを見出だした。」に訂正する。２．同、同頁下から８行「Ｒ₂はオレイルであり、」を「Ｒ₂がオレイルであるときに、」に訂正する。３．同、５頁21行「得られている。」を「得られていることが示されている。」に訂正する。４．同、６頁下から２行「キラルトリグリセリドも又、」を「キラルトリグリセリドを含むチョコレー卜も又、」に訂正する。５．同、８頁末行「事なり得る」を「異なり得る」に訂正する。６．同、13頁６行「非対称トリグリセリド」を「非対称トリグリセリド種」に訂正する。７．請求の範囲の範囲を以下の通りに訂正する。「１．異なる立体異性体が存在し、その立体異性体が１以外の分子比（molecula r ratio）で存在する非対象のトリグリセリドを生成することを特徴とし、それにより、所望の脂肪酸部分のトリグリセリド出発物質への導入のために、適するトリグリセリド出発物質が適する反応体で変換され、ザイゴミュコール又はリゾミュコール、特にミュコール・ミエヘイ、としても知られるケカビ種から誘導されるリパーゼを用いることによって達成され、反応混合物の水分活性が0.5未満であり、40-95重量％の総変換度を与える条件下でこの変換が行われる、酵素的に変換したトリグリセリドを生成する方法。２．リパーゼがリゾミュコール・ミエヘイから誘導される、請求項１に記載の方法。３．リパーゼが遺伝子工学により得られる修飾リゾミュコール・ミエヘイから誘導される、請求項１に記載の方法。４．酵素が、好ましくは有機ポリマー上に、担持されている、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の方法。５．水分活性が、0.01乃至0.4、特に0.05乃至0.3に維持される、請求項１乃至４のいずれか１請求項に記載の方法。６．総変換度が50乃至85％である、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。７．出発物質が、Ｓ₃、Ｕ₃、Ｏ₃、Ｍ₃、ＰＯＯ、ＳｔＯＯ、ＳｔＯＳｔ、ＰＯＰ、ＢＯＢ、Ｂ₃又はＢＯＯ（Ｓ＝Ｃ₂−Ｃ₂₂の飽和脂肪酸、Ｐ＝パルミチン酸、Ｓｔ＝ステアリン酸、Ｏ＝オレイン酸、Ｍ＝Ｃ₈−Ｃ₁₄の脂肪酸、Ｂ＝ベヘン酸、Ｕ＝不飽和脂肪酸）から成る群から選ばれるトリグリセリドを含む、請求項１に記載の方法。８．反応体が、Ｃ₁−Ｃ₂₆、好ましくはＣ₂−Ｃ₁₈の遊離脂肪酸、それらの短鎖アルキルエステル、Ｏ₃、Ｐ₃、Ｓｔ₃又はＢ₃から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。９．ありうる鏡像異性体のモル比が1.5より多いか又は0.7未満であり、好ましくは３より多いか又は0.33未満であり、特に４より多いか又は0.25未満であることを特徴とする、酵素的に生成された非対象トリグリセリド組成物。 10．１つ以上の成分脂肪酸についてｓｎ−１及びｓｎ−３脂肪酸含量（重量％）が10％以上、好ましくは20％以上、最も好ましくは30％以上互いに異なる、植物源から誘導された、酵素的に生成された非対象のトリグリセリド生成物。 11．トリグリセリドがＰＯＳｔ／ＳｔＯＰに富んでおり、特に、40重量％より多いキラルＰＯＳｔ／ＳｔＯｐを含む、酵素的に生成されたトリグリセリド組成物。 12．存在する脂肪の少なくとも一部が、請求項９乃至11のいずれか１請求項に記載の、酵素的に生成されたキラルトリグリセリド組成物から成る、チョコレート組成物。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．異なる立体異性体が存在し、その立体異性体が１以外の分子比（molecularr atio）で存在し、それにより、適するトリグリセリド出発物質を、所望の脂肪酸部分をトリグリセリド出発物質に導入するために適する反応体で変換させる非対象のトリグリセリドを生成することを特徴とし、ザイゴミュコール又はリゾミュコール、特にミュコール・ミエヘイとしても知られるケカビ種から誘導されるリパーゼを用いることによって達成され、反応混合物の水分活性を0.5未満にし、4 0-95重量％の総変換度を与える条件下でこの変換を行う、酵素的に変換したトリグリセリドを生成する方法。２．リパーゼがリゾミュコール・ミエヘイから誘導される、請求項１に記載の方法。３．リパーゼが遺伝子工学により得られる修飾リゾミュコール・ミエヘイから誘導される、請求項１に記載の方法。４．酵素が、好ましくは有機ポリマー上に、担持されている、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の方法。５．水分活性が、0.01乃至0.4、特に0.05乃至0.3に維持される、請求項１乃至４のいずれか１請求項に記載の方法。６．総変換度が50乃至85％である、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。７．出発物質が、Ｓ₃、Ｕ₃、Ｏ₃、Ｍ₃、ＰＯＯ、ＳｔＯＯ、ＳｔＯＳｔ、ＰＯＰ、ＢＯＢ、Ｂ₃又はＢＯＯ（Ｓ＝Ｃ₂−Ｃ₂₂の飽和脂肪酸、Ｐ＝パルミチン酸、Ｓｔ＝ステアリン酸、Ｏ＝オレイン酸、Ｍ＝Ｃ₈−Ｃ₁₄の脂肪酸、ベヘン酸、Ｕ＝不飽和脂肪酸）から成る群から選ばれるトリグリセリドを含む、請求項１に記載の方法。８．反応体が、Ｃ₁−Ｃ₂₆、好ましくはＣ₂−Ｃ₁₈の遊離脂肪酸、それらの短鎖アルキルエステル、Ｏ₃、Ｐ₃、Ｓｔ₃又はＢ₃から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。９．ありうる鏡像異性体のモル比が1.5より多いか又は0.7未満であり、好ましくは３より多いか又は0.33未満であり、特に４より多いか又は0.25未満であることを特徴とする、酵素的に生成された非対象トリグリセリド組成物。 10．１つ以上の成分脂肪酸についてｓｎ−１及びｓｎ−３脂肪酸含量（重量％）が10％以上、好ましくは20％以上、最も好ましくは30％以上互いに異なる、植物源から誘導された、酵素的に生成された非対象のトリグリセリド生成物。 11．トリグリセリドがＰＯＳｔ／ＳｔＯＰに富んでおり、特に、40重量％より多いキラルＰＯＳｔ／ＳｔＯＰを含む、酵素的に生成されたトリグリセリド組成物。 12．存在する脂肪の少なくとも一部が、請求項９乃至11のいずれか１請求項に記載の、酵素的に生成されたキラルトリグリセリド組成物から成る、チョコレート組成物。