JPH08508252A - 小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドをエンコードする核酸配列を含有する免疫原性キメラ、及びこのキメラのワクチン及び疾患の治療における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を開示する。本発明は、免疫原として、ワクチンとして、または癌、感染性疾患または自己免疫性疾患の治療方法において用いることのできる免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得るワクシニアウイルス構造物の設計に関する。

Description

【発明の詳細な説明】小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドをエンコードする 核酸配列を含有する免疫原性キメラ、及びこのキメラのワクチン及び疾患の治療 における使用 発明の分野 本発明は免疫療法の分野に属する。より詳細には、本発明は小胞体シグナルペ プチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を 免疫原として、インビボでワクチンに利用したり、哺乳動物の癌、ウイルス感染 、細菌感染、寄生虫感染または自己免疫疾患の治療法に利用することに関する。 発明の背景 ヒトの癌及び他の疾患に対する治療法として胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）に基 づく免疫療法を確立することは、非常に興味ある研究対象である（Oethgen，H.F .et al．（1991）in Biologic Therapy of Cancer：eds.：DeVita，V.T．Jr.，H ellman，S.，Rosenberg，S.A．J.B．Lippincott，p.87）。Ｔ細胞に基づく効果 的な免疫療法を確立する上で大きな障害となるのは、細胞表面上の抗原提示が抗 原に対するＴ細胞の応答を引き出すのに不十分なことがしばしばあることである 。従って、癌生物学、ウイルス学、及び免疫学のような分野の研究者の主な目的 は、Ｔ細胞に対する抗原の提示を増大させる方法を発展させることである。本発 明をより良く理解するために、Ｔ細胞が抗原をいかにして認識し、あるいは認識 しないかについての短い総説を以下に示す（Restifo，N.P Biologic Therapy of Cancer Updates 2:1-10（1992）；Yewdell，J.W．Adv．in Immunology 52:1-12 3（1992）も参照）。 他の分子の関与なしに抗原を認識できるＢ細胞と異なり、Ｔ細胞は標的細胞の 表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と共にしか抗原を認識できない 。詳細には、２つの型のＭＨＣ分子が存在し、それぞれの型は、抗原となるペプ チドと非共有的に結合して、Ｔ細胞の異なるサブセットのリガンドを構成する。 より詳細に言えば、クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体はＣＤ８⁺Ｔ細胞によっ て認識され、一方クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体はＣＤ４⁺Ｔ細胞によっ て認識される。Ｔ細胞に基づく免疫療法の発展に関与する研究者にとって興味あ る ことに、時には細胞障害性Ｔ細胞あるいはＣＴＬｓと呼ばれるＣＤ８⁺Ｔ細胞は 、細胞表面にクラスＩ／ペプチド複合体を提示している標的細胞を直接殺し、こ れらの標的細胞の破壊のためのシグナルとなるサイトカインを分泌することがで きると説明されてきた。ＣＤ８⁺Ｔ細胞のこうした性質により、多くの研究者は 、ＣＤ８⁺T細胞へのペプチドの提示に関与する分子機構をより良く理解するため に、標的細胞内でのクラスＩ／ペプチド複合体の形成、及びこれに続くこれら複 合体の標的細胞表面上への提示に到る過程の研究に力を入れた。クラスＩ ＭＨ Ｃ分子によって結合されたペプチドの切断及び輸送に関与する過程については、 今、明らかにされつつあることろであるが、現在までに、いくつか詳細なことが わかっている。 簡潔に言えば、クラスＩ分子にとって抗原となるペプチドの細胞質タンパク質 からの生成（Tevethia，S.S.，et al．Virology 107:13-23（1980）；Bennink， J.R.，et al．Nature 296:75-76（1982）；Yewdell，J.W.，et al．Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 82:1785-1789（1985）；Yewdell，J.W.，et al．Science 239 :637-640（1988）；Townsend，A.R.M.，et al．Cell 39，13-25（1984））は、 未知の細胞質にあるプロテアーゼによって行われる。一旦細胞質で生成すると、 これらのペプチドはＴＡＰ１及びＴＡＰ２と呼ばれるＭＨＣにエンコードされる ２個の遺伝子産物の存在を必要とする過程を経て小胞体（ＥＲ）に運ばれる（De verson，E.，et al．Nature 348:738-741（1990）；Trowsdale，J.，et al．348 :741-744（1990）；Spies，T.，et al．Nature 348:744-747（1990）；Monaco， J.J.，et al．Science 250:1723-1726（1990））。ＥＲにおいて、ペプチドはク ラスＩ ＭＨＣ分子と非共有的に結合してクラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体を 形成し、次いでこれが細胞表面に輸送される。細胞表面上に提示されたクラスＩ ／ペプチド複合体はＣＤ８⁺Ｔ細胞の細胞表面受容体のリガンドとして働き、そ して提示されたペプチドに対するＴ細胞の応答を引き出すことができる。最終的 にＣＤ８⁺Ｔ細胞への抗原提示に到るプロセシング経路が複雑であるため、ここ に概略した抗原プロセシング経路の構成員のいずれかひとつでも発現しない場合 には、ＣＴＬＳに対する抗原の提示が減少することになると予想される。 Eisenlohrら（Cell 71:963-972（1992））及びAndersonら（J．Exp．Med．174 : 489-492（1991））の最近の研究では、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２をエンコードする 遺伝子に欠失を有する細胞系では対照細胞と比較してＣＴＬｓに対する抗原の提 示が劇的に減少しているが、抗原となるペプチドをＥＲシグナル配列のカルボキ シ末端側の近くにつないだ“ミニ遺伝子”をこれらの細胞に導入することにより 、ＴＡＰ欠損細胞系でも効果的な抗原提示が達成されることが証明された。こう したシグナル配列は一般にタンパク質のＮＨ₂−末端にみられ、その機能はその タンパク質をＥＲ膜に向かわせることである。しかしながら、これらの研究にみ られるＥＲシグナル配列の抗原提示に対する増幅効果は対照細胞ではみられない こと、従ってＴＡＰ欠損細胞系にインビトロでトランスフェクションあるいは感 染をさせた場合にのみみられることに注意すべきである。しかしながら、近年、 ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の発現は細胞をガンマ−インターフェロンに曝した後に増 大するという他の研究者による知見（Trowsdale，J.，et al．Cell，348:741-74 4（1990））から、細胞質から開始された抗原提示はインビボでは制限されてい るという考えを支持する証拠が出された。この結果より、ＴＡＰ−介在性のペプ チド輸送はインビトロと同様インビボで制限されている可能性があり、従ってイ ンビボでのペプチドの輸送を増大できるか、または輸送活性全体を迂回できる方 法によって、Ｔ細胞に対するペプチドの提示を増加させることができると示唆さ れた。 発明の要約 本発明は、小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含 有する免疫原性キメラタンパク質に関する。免疫原性キメラタンパク質はインビ ボで特異的なＴ細胞応答を引き出すために用いられる。 本発明は、均等な天然の核酸配列と同様に免疫原性キメラタンパク質の製造を 指令することのできる合成核酸配列に関する。この応用のためには、核酸配列と はＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの合成による変異型であって免疫原性 キメラタンパク質をエンコードするいずれのものをもいう。 本発明はまた、免疫原性キメラタンパク質または該免疫原性キメラタンパク質 をエンコードする核酸配列を薬理学的に許容し得る担体中に含有する、哺乳動物 を癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染あるいは自己免疫疾患に対して免疫 化するためのワクチンに関する。 本発明はまた癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染あるいは自己免疫疾患 にり患した哺乳動物の予防または治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組 成物は免疫原性キメラタンパク質または該免疫原性キメラタンパク質をエンコー ドする核酸配列を適当な希釈剤または担体中に含有する。 本発明は更に下記（ａ）〜（ｃ）からなる、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄 生虫感染あるいは自己免疫疾患の治療方法に関する： （ａ）特異的なＴ細胞応答を引き出すのに有効な量の免疫原性キメラタンパク質 または該免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列で哺乳動物を免疫 化し； （ｂ）該Ｔ細胞を該免疫化した哺乳動物から単離し；そして （ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化した哺乳動物あるいは免疫化していない哺乳動物に治 療学的に有効な量で適用する。 図面の説明 図１はアデノウイルスＥ３／１９Ｋシグナル配列ペプチド及び選択されたもう １つのペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質を発現させるために用いら れるワクシニアウイルス（ＶＶ）構造物（construct）の構造を示す。 図２は種々のワクシニアウイルス（図の右手）で免疫化されたマウスの脾細胞 を、Ｐ８１５標的細胞（左図）、合成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスした Ｐ８１５細胞（中図）または野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ）に感染したＰ８ １５細胞（右図）といろいろなエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベ ートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。 図３Ａ及び３ＢはワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５（図３ Ａ）またはＶＶ−ＮＰ（図３Ｂ）で（ＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性を１つのアッセイで 測定できるように）続けて免疫化したマウスの脾細胞を、合成ペプチドＮＰ１４ ７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞（白三角）または野生型ワクシニアウ イルス（ＶＶ）に感染したＰ８１５細胞（黒丸）と種々のエフェクター：標的（ Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。 図４は種々の量のワクシニアウイルスＶＶ−ＮＰ（左図）またはＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５（右図）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＶＶ−ＮＰ（上図 ）または野生型−ＶＶ（下図）に感染したＰ８１５細胞と種々のエフェクター： 標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベートして行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示 す。 図５はワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳＰＩＡ（黒丸）、ＶＶ−ＰＩＡ（白三角 ）またはＶＶ−ＥＳＮＰ（黒三角）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＣＴ２６標 的細胞（左図）、ＰＩＡペプチドでパルスしたＣＴ２６細胞（中図）またはＰ８ １５細胞（右図）と種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率でインキュベート して行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。 図６は組換えワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５（黒丸）ま たはＶＶ−ＮＰ（白三角）で免疫化したマウスの脾細胞を、これらの脾細胞を合 成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞で希釈してインキ ュベートする前にインフルエンザウイルスに感染した自家細胞（Restifo，N.P． et al．J．of Immunol．47:1453-1459（1991））と共に培養して行った⁵¹Ｃｒ遊 離アッセイの結果を示す。 図７はワクシニアウイルスＶＶ−ＥＳ ＶＳＶ５２−５９（最上列）、ＶＶ− ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４（中央列）またはこれらのウイルスを共に混合した もの（最下列）で免疫化したマウスの脾細胞を、ＲＭＡ−Ｓ標的細胞（左欄）、 ペプチドＶＳＶ５２−５９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（中欄）またはペプチド ＯＶＡ ２５７−２６４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（右欄）とインキュベート して行った⁵¹Ｃｒ遊離アッセイの結果を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、小胞体（ＥＲ）シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプ チドを含有する免疫原性キメラタンパク質に関する。本発明のためには、“シグ ナル配列ペプチド”とは、一般にタンパク質のアミノ末端に位置することがこの 分野で知られており、該タンパク質を小胞体に向かわせることのできる、約１５ から約２５個のアミノ酸の長さのアミノ酸配列をいう。好ましい具体例で、利用 されるシグナル配列ペプチドとして、アデノウイルス タイプ５、Ｅ３／１９Ｋ 遺伝子産物由来のもの（Persson，H．et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:6 349-6353（1980））があり、これは以下の配列番号１として示される。 しかしながら、多くの他のシグナル配列ペプチドが知られており（van Heijne ，G.，J．Mol．Biol．184:99-105（1985））、これらのペプチド配列またはその 類縁体は本発明の免疫原性キメラタンパク質において配列番号１に置き代わるこ とができることは当業者が容易に認めるところである。 “他のペプチド”とは、明細書及び請求の範囲を通して用いているように、あ るペプチドをＥＲシグナル配列ペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク質の １部として用いた場合に免疫原性があることを示す。すなわち、“他のペプチド ”自体は免疫原性があってもなくても良い。１つの具体例として、他のペプチド は約５から約１０００個のアミノ酸の長さの範囲であり、腫瘍細胞、ウイルス、 細菌、または寄生虫由来のもの、あるいは自己免疫疾患と関連するものでも良い 。 好ましい具体例で、他のペプチドは約８から約１０個のアミノ酸の長さである 。こうしたペプチドの例として、配列番号２ で示すアデノウイルスＥ１Ａペプチド（Kast et al．Cell，59:603-314（1989） ）、配列番号３ で示すＳＶ４０ Ｔ抗原ペプチド（Gould et al．J．Virol.，65:5401-5409（19 91））のような腫瘍ペプチド、及び配列番号４ で示すエプスタイン・バールウイルス抗原ペプチド（Burrows，S.R．et al．Eur .J．Immunol．22:191-195（1992））、配列番号５ で示すインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の核タンパク質のペプチドＮ Ｐ１４７−１５３（Rotzscke，O.et al．Nature 348:252-254（1990））のよう なウイルスペプチドがあるが、これに限定されるものではない。 典型的な腫瘍ペプチドはＰ８１５肥満細胞腫細胞由来のＰＩＡ（Lethe，B.，E ur．J．Immunol.，22:2283-2288（1992））である。ＰＩＡの配列は配列番号６ で示す。 本発明において、シグナル配列ペプチドと他のペプチドが免疫原性キメラタン パク質の中で配置される順序は変えることができる。１つの具体例として、他の ペプチドはシグナル配列ペプチドより先にあるか、またはアミノ末端側にある。 好ましい具体例は、シグナル配列ペプチドが他のペプチドのアミノ末端側にある ものである。これらの配置の順序に関わらず、シグナル配列ペプチドと他のペプ チドはゼロから約１０００個のアミノ酸によって分離していても良い。好ましい 具体例は、シグナル配列ペプチドと他のペプチドは互いに直接隣り合っている、 すなわち０個のアミノ酸で分けられているものである。 更に別の具体例として、免疫原性キメラタンパク質の中に他のペプチドの複数 個のコピーがあっても良い。該他のペプチドのコピーの数は２から１００の範囲 である。好ましいコピーの数は、約２から約１０である。好ましい具体例として は、シグナル配列ペプチドは他のペプチドの複数個のコピーのアミノ末端側にあ り、これらの複数個のコピーは途切れることなく連続して配置したものがある。 更に別の具体例として、数種の異なる他のペプチドが免疫原性キメラタンパク 質内にあり、異なる他のペプチドの数が２から約１０個の範囲のものがある。好 ましい具体例としては、これらの他のペプチドがシグナル配列ペプチドの後にあ り、他のペプチドの配置順は変えられるように連続して配置したものがある。 本発明の免疫原性キメラタンパク質は合成ポリペプチド、または免疫原性キメ ラタンパク質をエンコードする核酸配列から合成されるタンパク質として提供す ることができる。 １つの具体例として、合成免疫原性キメラタンパク質は、免疫原性キメラタン パク質に含有されるべきシグナル配列ペプチドと他のペプチドの既知のアミノ酸 配列に基づいて合成することができる。ＰＩＡ腫瘍ペプチドのアミノ末端側にＥ Ｒシグナル配列を含有する好ましい免疫原性キメラタンパク質のアミノ酸配列は 配列番号７として示す。 当業者であれば、約２５から約１００個の範囲のアミノ酸の長さの免疫原性キメ ラタンパク質は種々のメーカーから販売されている自動化された装置で合成でき 、また注文して調製することもできることを知っているだろう。 もう１つの具体例として、免疫原性キメラタンパク質は核酸配列から発現させ ることができ、こうした配列としてはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク 合成を指令し得るこれらの変異型のいずれでも良い。１つの具体例としては、シ グナル配列ペプチドと他のペプチドをコードする配列を含有するそれぞれの制限 消化断片を連結し、原核生物または真核生物の細胞内で機能する適当な発現ベク ターに挿入することができる。こうした制限消化断片はシグナル配列ペプチドま たは他のペプチドをエンコードする原核生物または真核生物の細胞から単離され たクローンから得ることができる。 適当な発現ベクターとは、免疫原性キメラタンパク質をコードする完全な核酸 配列を運び、発現できるベクターを意味する。 こうしたベクターとして、好ましい、あるいは必要な作動性エレメントと共に 上記のような核酸配列が挿入され、次いで宿主の中に運ばれ、その中で複製され るベクターがある。好ましいベクターは、その制限部位がよく報告され、核酸配 列の転写に好ましい、あるいは必要な作動性のエレメントを含有するものである 。 ここでいう“作動性エレメント”とは、少なくとも１個のプロモーター、少な くとも１個のオペレーター、少なくとも１個のリーダー配列、少なくとも１個の 決定因子、少なくとも１個の終止コドン、そしてベクターの核酸の適当な転写及 びこれに続く翻訳に必要な、あるいは好ましい他のＤＮＡ配列を含む。特に、こ うしたベクターは、核酸配列の転写を開始できる、少なくとも１個の選択し得る マーカー及び少なくとも１個のプロモーター配列と共に、宿主内で認識され得る 少なくとも１個の複製の元の配列を含有することが期待される。 本発明のクローニングベクターをつくるために、免疫原性キメラタンパク質及 びそれに付き添う作動性エレメントをエンコードする核酸配列の複数個のコピー をそれぞれベクターに挿入することができることに更に注意すべきである。こう した具体例では、宿主は１個のベクターから目的とする免疫原性キメラタンパク 質をより大量に製造するであろう。同様のやり方で、複数の異なる免疫原性キメ ラタンパク質及びそれに付き添う作動性エレメントをエンコードする核酸配列の １個の（または複数の）コピーをベクターに挿入することによって、１個のベク ターからそれぞれの免疫原性キメラタンパク質を発現させることができる。更に 別の具体例として、internal ribosomal entry site（ＩＲＥＳ）の統制下でそ れぞれの免疫原性キメラタンパク質の発現を行うことで、複数の（配列が同一ま たは異なる）免疫原性キメラタンパク質が１個のベクターから発現できるポリシ ストロン性ベクターがつくられる（Molla A．et al．Nature 356:255-257（1992 ）；Jang S.K．et al．J．of Virol．263:1651-1660（1989））。ベクターに挿 入される免疫原性キメラタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列のコピーの数は 、適当な宿主に運ばれ、そこで複製・転写されるために、生成するベクターの大 きさの限界にのみ制限される。 発現ベクターの好ましいものは真核生物細胞内で機能するものである。こうし たベクターの例としてワクシニアウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイ ルスがあるが、これらに限定されるものではない。最も好ましいベクターはワク シニアウイルスである。実施例１では本発明で用いるワクシニアウイルス構造物 、ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５の構造を記載する。 更に他の具体例として、ＥＲキメラタンパク質をエンコードする合成オリゴヌ クレオチドを合成し、適当な発現ベクター内にサブクローン化することができる 。好ましいオリゴヌクレオチド配列を配列番号８に示す。 当業者であれば、オリゴヌクレオチドは種々のメーカーから販売されている自 動化された装置で合成でき、あるいは注文により調製できることがすぐわかるで あろう。 免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列が適当な発現ベクター内 に存在すると、発現ベクターは適当な真核生物細胞系で免疫原性キメラタンパク 質を発現するために利用できる。こうした真核生物細胞系としてはＨｅＬａ,， Ｌ９２９、Ｔ２またはＲＭＡ−Ｓのような細胞系があるが、これらに限定される ものではない。好ましい真核生物細胞系はＴ２及びＲＭＡ−Ｓである。１つの好 ましい方法は、Ｔ２またはＲＭＡ−Ｓ細胞系にトランスフェクトするためにワク シニアウイルス構造物を利用するものである。発現した免疫原性キメラタンパク 質は代謝的放射標識のようなこの分野で知られる方法で検出することができる。 更に他の具体例としては、細胞内で発現した免疫原性キメラタンパク質を粗ラ イゼートとして得るか、あるいは分画沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イ オン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティー 及びイムノアフィニティークロマトグラフィー等を含むこの分野で知られる標準 的なタンパク質精製方法で精製できる。イムノアフィニティークロマトグラフィ ーの場合、免疫原性キメラタンパク質は免疫原性キメラタンパク質に特異的な抗 体が結合した樹脂を含有するカラムを通過させることによって精製することがで きる。 本発明はまた、他のペプチドに対するＴ細胞の応答を引き出すのに有効な量の 免疫原性キメラタンパク質を適用することからなる免疫化の方法を提供する。こ のようなＴ細胞の応答は、⁵¹Ｃｒ遊離アッセイ（Restifo，N.P．J．of Exp．Med .，177:265-272（1993））を含む種々のアッセイによって測定できる。このよう な細胞障害性応答をすることのできるＴ細胞は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）、 ＣＤ４⁺Ｔ細胞またはこれら双方である。 免疫原性キメラタンパク質は、純粋な、または実質的に純粋な形で適用し得る が、薬理学的な組成物、処方または製剤として提供するのが好ましい。そうした 処方では、免疫原性キメラタンパク質は１種またはそれ以上の薬理学的に許容し 得る担体及び任意の他の治療のための成分と共に含有される。便宜的には処方は １回の投与量で提供し、製薬分野でよく知られる方法で調製することができる。 全ての方法において、活性成分を１種またはそれ以上の補助成分を構成する担 体と関連させる段階がある。一般に、処方は均一に、そして活性成分を液体担体 または微粉砕された固体担体あるいはこれら双方と密に関連させ、必要に応じ、 製品を望みの処方に成型して調製される。 静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内投与に適した処方では、好ましくは患者 の血液と等張な活性成分の殺菌した水溶液を含有するのが好適である。こうした 処方は固体の活性成分を塩化ナトリウム（例えば０．１−２．０Ｍ）、グリシン 等のような生理的に適合する物質を含有し、生理的条件に適合する緩衝されたｐ Ｈを有する水に溶解させて水溶液とし、該水溶液を殺菌することで調製すること ができる。これらは、例えば密閉したアンプルまたはバイアルのような１回量ま たは数回量分の容器に入れることができる。 本発明の処方には安定剤を入れることができる。安定剤の例としては、ポリエ チレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸及び有機酸があり、単 独で、または混合剤として用いられる。これらの安定化剤は抗体の重量に対して ０．１１−１０，０００倍量で用いるのが好ましい。２種またはそれ以上の安定 化剤であっても適当な濃度及びｐＨの水溶液において用いられる。このような水 溶液で調整される特異的な浸透圧は、一般に０．１−３．０osmosesの範囲であ り、好ましくは０．８０−１．２の範囲である。水溶液のｐＨは５．０−９．０ の範囲、好ましくは６−８の範囲に調整する。本発明の免疫原性キメラタンパク 質を調製するにあたり、抗−吸着剤を用いることができる。 作用の持続時間をコントロールするために、更に別の薬理学的方法を用いるこ とができる。タンパク質またはその誘導体と複合体を形成するか、これを吸着す るポリマーを利用して製剤の放出をコントロールすることができる。送達のコン トロールは、放出のコントロールのために用いる方法と同様、適当な高分子（例 えばポリエステル、ポリアミンの酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルア セテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタ ミン）及びその高分子の濃度を選択することで行うことができる。製剤の放出を コントロールすることによって作用の持続時間をコントロールするために可能な 他の方法は、タンパク質、タンパク質類似体、またはその機能的な誘導体を、ポ リエステル、ポリアミンの酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニル アセテート共重合体のような重合性物質の粒子の中に取り込むものである。 あるいはまた、これらの薬剤を重合性粒子中に取り込む代わりに、これらの物 質を、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、 及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのような、コアセルベーシ ョン法や界面重合法によって調製したマイクロカプセル、リポソーム、アルブミ ンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセ ルのようなコロイド状の薬物運搬システム、あるいはマクロエマルジョン中に包 接することが可能である。 経口投与の薬剤が要求される場合には、組成物をラクトース、スクロース、澱 粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、 カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビ アガムのような典型的な担体と組み合わせることができる。 更に他の具体例として、免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し 得る核酸配列をＴ細胞の応答を引き出すのに有効な量で適用することからなる免 疫化の方法がある。こうした核酸配列は、当業者に知られる方法で適当な発現ベ クターに挿入される（図１）。インビボで高率で遺伝子の転移をさせるのに適し た発現ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイ ルスのベクターがある。そのような発現ベクターの作動性エレメントは本明細書 で先に開示しており、また当業者に知られているものである。好ましいベクター はワクシニアウイルスである。免疫原性キメラタンパク質の宿主細胞による合成 を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターは、純粋な、または実質的に純粋 な形で、あるいは核酸に親和性を有する物質及び核酸に親和性を有する物質に結 合したインターナリゼーション因子との複合体として適用することができる（Wu G．et al．J．BIol．Chem．262:4429-4432（1987）；Wagner E．et al．Proc．N a tl．Acad．Sci．USA87:3655-3659（1990））。核酸に親和性を有する物質で好ま しいものは、ポリリジンのようなポリカチオンである。インターナリゼーション 因子には、マクロファージ、リンパ球、Ｂ細胞、樹状細胞またはランゲルハンス 細胞のような免疫原提示細胞の表面上に存在する受容体に対して特異性を有する リガンドがある。インターナリゼーション因子として好ましいものには、トラン スフェリン及び免疫原提示細胞に特異的な抗体があるが、これらに限定されるも のではない。 免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を含有する発現ベクター は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口投与することができる。好ましい 投与形態は静脈内投与である。 免疫原性キメラタンパク質及び免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を 指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターは、キットの形で、単独で、または 上記の医薬組成物の形で供給できる。 本発明はまた、薬理学的に許容し得る担体中に免疫原性キメラタンパク質また は免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列を含有する 発現ベクターを含有する、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自 己免疫疾患に対して哺乳動物を免疫化するためのワクチンに関する。他の具体例 で、異なる免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る核酸配列を それぞれ含有する複数の発現ベクターは、多価のワクチンとして適用できる。 ワクチンの接種は伝統的な方法で行うことができる。例えば、免疫原性キメラ タンパク質を食塩水または水のような適当な希釈剤、あるいは完全または非完全 アジュバントの中で用いることができる。更に、タンパク質の免疫原性をより強 くするために、免疫原性キメラタンパク質を担体に結合させても、またさせなく ても良い。こうした担体分子の例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカ シガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド等があ るが、これらに限定されるものではない。免疫原性キメラタンパク質はＴ細胞応 答を引き出すのに適した、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等のいずれの経路によ っても投与することができる。免疫原性キメラタンパク質は、Ｔ細胞応答が引き 出されるまで、１回または周期的な間隔をおいて投与できる。Ｔ細胞応答を引き 出 すのに有効な免疫原性キメラタンパク質の投与量は、約０．００００１から約１ ０mg/kgの範囲である。Ｔ細胞応答を引き出すのに有効な、免疫原性キメラタン パク質をエンコードする発現ベクターの投与量は、約１０⁵から約１０⁷プラーク 形成単位の範囲である。Ｔ細胞応答は、細胞障害性アッセイ、増殖アッセイ及び サイトカイン放出アッセイを含む当業者に知られる種々の方法によって検出でき るが、これらに限定されるものではない。 本発明はまた、免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質の 宿主による合成を指令し得る核酸配列を含有する発現ベクターを含有する医薬組 成物を治療的に有効な量で適用することからなる、癌、ウイルス感染、細菌感染 、寄生虫感染または自己免疫疾患を治療する方法に関する。ワクチンの場合と同 様、複数の発現ベクターを同時に適用しても良い。治療に用いる場合、免疫原性 キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質をエンコードする発現ベクタ ーは感染初期（または直後）に、あるいは癌、ウイルス、細菌、寄生虫または自 己免疫疾患によって引き起こされる感染または疾患の何らかの症状の始まった時 に投与する。免疫原性キメラタンパク質または免疫原性キメラタンパク質をエン コードする発現ベクターの治療としての適用により、感染または疾患の程度を弱 くすることができる。 好ましい具体例は、免疫原性キメラタンパク質をエンコードする核酸配列を含 有するワクシニアウイルスを哺乳動物に治療学的に有効な量で適用することから なる治療方法である。腫瘍ペプチドまたはウイルスペプチドを含有する免疫原性 キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得るワクシニアウイルスベクターは これらのペプチドに対するＴ細胞応答を引き出すことができることが既に報告さ れている（実施例２−５参照）ことから、疾患を治療する有用性は示されている 。 本発明はまた、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる、癌、ウイルス感染、細菌感染 、寄生虫感染または自己免疫疾患を治療する方法に関する： （ａ）特異的なＴ細胞応答を引き出すのに有効な量の免疫原性キメラタンパク質 または免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成を指令し得る発現ベクターで 哺乳動物を免疫化し； （ｂ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物から単離し；そして （ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物または免疫化されていない哺乳動物に 治療学的に有効な量で適用する。 免疫原性キメラタンパク質に含有される他のペプチド（例えば腫瘍ペプチド）に 対して反応するＴ細胞集団は、免疫原性キメラタンパク質で免疫後約３から約３ ０日後に、免疫化されたドナーの末梢血試料または脾細胞から単離することがで きる。エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）はヒトリンパ球を不死にするた めに用いられ、またヒト融合パートナーはヒトーヒトハイブリドーマをつくるた めに用いられる。免疫原性キメラタンパク質を用いてのインビトロでの最初の免 疫化は、免疫原性ペプチドに反応するＴ細胞の生成のためにも用いることができ る。 Ｔ細胞は約７から約９０日間培養され（Yanelli，J.R．J．Immunol．Methods1 39:1-16（1991））、その後Ｔ細胞活性をアッセイする既知の方法を用いて免疫 原性キメラタンパク質に含有される他のペプチドに対して目的の活性を有するク ローンを決定するためにスクリーニングされる；目的の活性を有するＴ細胞がこ うして選択される。 上記のＴ細胞は、約１０⁷から約１０¹¹個のＴ細胞を哺乳動物に静脈内、腹腔 内、筋肉内または皮下投与することによって、癌、ウイルス感染、細菌感染、寄 生虫感染または自己免疫疾患にり患した患者の治療にインビボで用いることがで きる。好ましい投与形態は静脈内または腹腔内投与である。 ここに引用した論文または特許は参考のために入れたものである。以下の実施 例は本発明の種々の面を説明するものであるが、決してその範囲を制限すること を意味するものではない。 材料および方法 以下の実施例において用いた材料および方法は次のとおりである：方法 以下の実施例において用いたワクチニアウイルス（ＶＶ）構築物は次のも のである：ＶＶ−ＮＰは、インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ ／８／３４（ＰＲ８）（Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１７８５−１７８９（１９８５） の全長核蛋白質（ＮＰ）遺伝子をコードする；ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５は、Ｎ Ｐ遺伝子の９アミノ酸の「最少決定因子（ｍｉｎｉｍａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎ ２５２−２５４（１９９０））をコードする；ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５ は、ＰＲ８のＮＰ遺伝子からの９アミノ酸長さの「最少決定因子」を用いるが、 アデノウイルス５型Ｅ３／１９ＫからのＥＲシグナル配列の後に配置されている ；ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ ＥＳでは、ＥＲシグナル配列が最少決定因子の下 流に配置されている；ＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４は、同一のＥＲシグナ ル配列からなるが、その後に卵白アルブミンの最少決定因子を有する；ＶＶ−Ｅ Ｓ ＶＳＶ ５２−５９は、同一のＥＲシグナル配列からなるが、その後に水疱 性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の核蛋白質遺伝子からの最少決定因子（Ｖａｎ Ｂ ｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２１３−２１５（１９９０） を有する；ＶＶ−ＥＳＰ１Ａは、同一のＥＲシグナル配列からなるが、その後に Ｐ１Ａ腫瘍抗原（Ｌｅｔｈ６，Ｂ．，ＥｗＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：２２８ ３−２２８８（１９９２））を有する。ＮＰ、ＥＳ ＮＰ１４７−１５５および ＮＰ１４７−１５５をコードするワクチニアウイルス構築物は既に記載されてい る（Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９８５）；Ｅｉｓｅｎｌｏｈｒ， Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９９２）；およびＷｅｉ Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９ ２））。ＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４は、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド （Ｃａｒｂｏｎｅ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０ ３−６１０（１９８９））に対応する二本鎖合成オリゴヌクレオチドを、プラス ミド中のＥ３／１９Ｋリーダー配列をコードし追加のＡｌａコドンを含むヌクレ オチドのすぐ下流に挿入したことを除き、ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５につ いて記載されているように構築した。ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ ＥＳを構築す るためには、Ｅ３／１９Ｋ ＥＲシグナル配列に対応し、５’コーディング末端 にＮｄｅＩ部位を、３’コーディング末端に二重の終止コドンをコードするよう に改変した二本鎖オリゴヌクレオチドを、改変ｐＳＣ１１（Ｅｉｓｅｎｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ（１９９２））のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位に挿入した。次に、 この中間体プラスミド（ｐＳＣ１１−ＥＳ）をＳａｌＩおよびＮｄｅＩで切断し 、適当なオーバーハング、開始ＭｅｔおよびＮＰ１４７−１５５に対応する残基 をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドと連結した。ＶＶ−ＥＳ ＶＳＶ５２− ５９およびＶＶ−ＥＳＰ１Ａは、実施例１に略述されるプロトコールにしたがっ て構築した。外来遺伝子を、ＣＶ−１細胞内での同種組み換え（Ｃｈａｋｒａｂ ａｒｔｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３４０３−３ ４０９（１９８５））によりＶＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に挿入し、 ブロモデオキシウリジンの存在下で、ＴＫ^-ヒト１４３Ｂ骨肉腫細胞株（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）中 で３プラーク精製を３ラウンド実施した後、同一の細胞内で成長させた。ＶＶ− ＮＰは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を欠失するプラスミド（同種組 み換えの後、プラスミド挿入物を有するｒＶＶ（組み換えワクチニアウイルス） を同定するために用いた）を用いて製造した。 Ｔ細胞活性のための⁵¹Ｃｒ放出アッセイ ８−１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０⁶プラーク形成単位（ＰＦ Ｕ）のｒＶＶを静注（ｉ．ｖ．）した。６日後、牌臓を除去し、ダウンスホモジ ナイザーを用いて、７．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ＤＭＥＭ（Ｉ ＤＭＥＭ）中で分散させて単一細胞懸濁物とした。脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙ ｔｅ）Ｔ細胞の細胞毒性をアッセイするために用いた標的細胞は、Ｐ８１５肥満 細胞腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ，ＡＴＣＣ）、ＣＴ２６繊維肉腫細胞、またはＲＭＡ−Ｓ腫瘍細胞（Ｌｊｕ ｎｇｒｅｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１７４５− １７５９（１９８５））であった。標的細胞は、標的細胞をＮａ⁵¹ＣｒＯ₄およ び適当な実施例において示されるペプチド１μＭとともに３７℃において１時間 共インキュベートすることにより、抗原特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞による溶解に感受 性にさせた。ＨＰＬＣ精製ペプチドＮＰ１４７−１５５、ＯＶＡ２５７−２６４ 、ＶＳＶ５２−５９およびＰ１Ａは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｓ Ｂｒａｎｃｈ，ＮＩＡＩＤ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより提供された。実施 例２−４においては、Ｐ８１５細胞を、１０ＰＦＵ／細胞の多重度で、野生型Ｖ Ｖに１時間感染させ、次にＮａ⁵¹ＣｒＯ₄（⁵¹Ｃｒ）（Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ ．（１９９３））を用いて３７℃において１時間標識した。標的細胞（適当なペ プチドでパルスした、またはワクチニアウイルスに感染させた）を脾臓細胞とと もに、種々のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）（特定の比率については実施例を 参照のこと）で３７℃において６時間インキュベートした。放出された⁵¹Ｃｒの 量を、ガンマ計数により決定し、特異的溶解のパーセンテージを次のようにして 計算した： ［実験ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）］×１００。 実施例１ 免疫原性キメラ蛋白質の発現に用いるワクチニアウイルス構築物の構築 図１に示すプラスミドｐＳＣ１１（Ｄｒ．Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ，ＮＩＡ ＩＤ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄより寄贈）を、同種組み換え（Ｃｈ ａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５）によりワクチニアウイルス中に 挿入されうる免疫原性キメラ蛋白質をコードする核酸配列を含むプラスミドの構 築のための出発材料とした。この実施例は、免疫原性キメラ蛋白質ＥＳＮＰ１４ ７−１５５をコードする核酸配列を含むプラスミドの製造のプロトコールを記載 するが、このプロトコールは他の免疫原性キメラ蛋白質をコードするプラスミド の製造にも容易に用いることができる。配列番号９： および配列番号１０： として示される相補オリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃ ｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ，ＭＤ）、リン酸化し、一緒にアニーリングして、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限 部位を含む二本鎖ＤＮＡポリリンカーを形成した。次に、このポリリンカーＤＮ Ａを、ＳｍａＩで切断したｐＳＣ１１に平滑末端ライゲーションにより挿入し、 ＳａｌＩおよびＮｏｔＩポリリンカープラスミドを有するｐＳＣ１１プラスミド （ｐＳＣ１１リンカープラスミド）を作成した。配列番号１１： および配列番号１２： に示される相補オリゴヌクレオチドを合成し、リン酸化し、一緒にアニーリング して、アデノウイルスＥ３／１９Ｋシグナル配列およびＮｏｔＩおよびＳｔｙＩ 制限部位をコードする二本鎖ＤＮＡを形成した。次に、このＥ３／１９Ｋシグナ ル配列ＤＮＡを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断した上述のｐＳＣ１１リンカー プラスミド中にサブクローニングして、Ｅ３／１９Ｋシグナルプラスミドと称さ れるプラスミドを作成した。配列番号１３： および配列番号１４： に示される相補オリゴヌクレオチドを合成し、リン酸化し、一緒にアニーリング して、ＮＰ１４７−１５５ペプチドおよび二重の終止コドンおよびＮｏｔＩおよ びＳｔｙＩ制限部位をコードする二本鎖ＤＮＡを形成した。次に、ＮＰ１４７− １５５ＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＳｔｙＩで切断したＥ３／１９Ｋシグナルプラ スミド中にサブクローニングした。得られたプラスミドは、ＥＳＮＰ１４７−１ ５５をコードしており、これを上述のようにワクチニアウイルスに挿入して、ワ クチニアウイルス構築物ＶＶ−ＥＳＮＰ１４７−１５５を製造した。 実施例２ Ｔ細胞応答発生におけるワクチニアウイルス構築物 ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５の効力 ＥＲシグナル配列の後に配置されたペプチドを含む免疫原性キメラ蛋白質を用 いることにより抗原提示の有効性が最適化されるという見解を試験するために、 ５×１０⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、上述のワクチニアウイルス構築物： ＶＶ−ＮＰ、ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５、ＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ Ｅ ＳまたはＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４の１つをマウスに静脈内投与した。 静注から６日後、マウスを殺して脾臓を回収した。脾臓細胞を⁵¹ＣＲ放出アッ セイにおいて、Ｐ８１５標的細胞のみ（左パネル）、ＮＰ（インフルエンザウイ ルス核蛋白質）のアミノ酸残基１４７−１５５に対応する合成ペプチドでパルス したＰ８１５細胞（中パネル）またはワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５ 細胞（右パネル）に対する細胞毒性について試験した。免疫したマウスから得た 脾臓細胞（すなわち、エフェクター細胞）を、一定の数のＰ８１５標的細胞とと もに、図２の横軸（ｘ）に示される種々の比でインキュベートした。⁵¹Ｃｒ標識 標的細胞に対する脾臓細胞の毒性を、ｙ軸に示されるように、特異的⁵¹Ｃｒ放出 （％）として測定した。予期されたように、試験したすべてのワクチニアウイル ス構築物は、ワクチニアウイルス感染Ｐ８１５細胞に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答 を同様に引き出すことができ（右パネル）、非感染対照Ｐ８１５細胞に対するＣ Ｄ８⁺Ｔ細胞応答を同様に引き出すことができなかった（右パネル）ことを示し た。しかし、ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５で免疫したマウスから得た脾臓細 胞のみが、ＮＰ残基１４７−１５５に対応する合成ペプチドとプレインキュベー トしたＰ８１５標的細胞を溶解（ｌｙｓｅ）させる能力を有することによって示 されるように、ＮＰ特異的活性を示した（中パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳ Ｎ Ｐ１４７−１５５で免疫したマウスから得た脾臓細胞のみが、インフルエンザウ イルス感染Ｐ８１５細胞を、ＮＰ１４７−１５５ペプチドでパルスしたＰ８１５ 細胞について観察されたもの（中パネル、図２）とほぼ同じレベルで特異的に溶 解させることが観察された（データ示さず）。その上、ＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５ ７−２６４で免疫したマウスから得た脾臓細胞が、ペプチドＮＰ１４７−１５５ でパルスした細胞を特異的に溶解することができなかった（中パネル）ことは、 ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５の増強された免疫原性が、Ｅ３／１９Ｋシグナ ル配列の非特異的効果に起因するものではないことを示した。最後に、ＶＶ−Ｅ Ｓ ＮＰ１４７−１５５またはＶＶ−ＮＰ１４７−１５５ ＥＳのいずれかによ り免疫したマウスから得た脾臓細胞の、ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスし たＰ８１５細胞に対する細胞毒性活性の大きな相違（中パネル）は、Ｅ３／１９ Ｋシグナル配列が単にペプチドの疎水性を増加させることにより作用したのでは ないことを示した。 実施例３ ワクチニアウイルス構築物により免疫したマウスから得た脾臓細胞の 応答の速度論 ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５の、他のＶＶ構築物と比較して見かけ上増強 された免疫原性が、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の速度論における相違に起因するという 可能性を試験するために、マウスに５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７ −１５５（図３Ａ）またはＶＶ−ＮＰ（図３Ｂ）を注入し、１から１９日後に、 これらの脾臓細胞を、ペプチドでパルスしたＰ８１５（ペプチドＮＰ１４７−１ ５５）標的細胞を用いて、ＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞活性について試験した（図 ３Ａおよび３Ｂ）。使用したエフェクター対標的比は２００：１であった。ＶＶ −ＥＳ ＮＰ１４７−１５５で免疫してから５から９日後のマウスから得た脾臓 細胞を用いて、ＮＰペプチド特異的活性のピーク（すなわち、ＮＰ１４７−１５ ５ペプチドでパルスしたＰ８１５細胞、白三角により示される）を観察した。こ のＮＰ特異的活性は、ＶＶ特異的活性ピークに匹敵した（黒丸、ワクチニアウイ ルスに感染させたＰ８１５細胞）。ＶＶ−ＮＰ免疫マウスから得た脾臓細胞は、 実験の全期間にわたり、無視しうるＮＰ特異的溶解活性を示した。ＶＶ−ＥＳＮ Ｐ１４７−１５５によりひき出されたものと同様の程度のＶＶ特異的応答が観察 されたため、この結果は、このワクチニアウイルス構築物がＣ８⁺Ｔ細胞応答 を引き出すことができなかったためではない。 実施例４ 種々の用量のワクチニアウイルス構築物により免疫したマウスにおいて 引き出されたＣＤ８⁺Ｔ細胞応答 増加する用量のＶＶ構築物に対するマウスの一次ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を比較し た（図４、与えられた用量は図の下部の記号により示される）（上のパネルは、 ペプチドＮＰ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５標的細胞を用い、下のパネル は、ワクチニアウイルスに感染させたＰ８１５標的細胞を用いる）。免疫感作の ６日後、マウスを殺しその脾臓を回収した。⁵¹Ｃｒ放出アッセイの結果は、マウ スが５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＮＰを注入した後の有意のＮＰ特異的応答を示さ なかった（左パネル）のに対し、５×１０⁴ｐｆｕのＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７− １５５による免疫感作が、容易に検出しうるＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を誘 導したこと（右パネル）を示す。アッセイされたエフェクター対標的比は、図の 下部に示される。すなわち、ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５は、一次ＮＰ特異 的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の誘導において、他のＶＶ構築物より少なくとも１００倍 有効性が高い。抗ＶＶ ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答（下のパネル、ワクチニアウイルス に感染させたＰ８１５標的細胞）を、それぞれの用量の試験したワクチニアウイ ルス構築物において試験した。下のパネルに示される結果から、全てのＶＶ構築 物が類似する応答を誘導することができ、したがって免疫原性の相違は、ＮＰ決 定因子の側方の残基（すなわちＥＳシグナル配列）に関係していることが確認さ れた。 図２のウイルス性ペプチドＮＰ１４７−１５５において観察される、５×１０⁶ ｐｆｕの、ＶＶ−ＥＳＰ１Ａ、ＶＶ−Ｐ１ＡまたはＶＶ−ＥＳＮＰをマウスに 投与した。静注の６日後に脾臓を回収し、脾臓細胞を静注によりＰ１Ａペプチド とともに６日間培養し、次に⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴ２６腫瘍細胞（左 パネル）、Ｐ１ＡペプチドでパルスしたＣＴ２６細胞（中パネル）、またはＰ８ １５細胞（右パネル）に対する細胞毒性について試験した。エフェクター脾臓細 胞の源は図５の下部に示され、⁵¹Ｃｒ放出アッセイは、２００：１、およびそれ に続く２倍希釈列のエフェクター対標的比で実施した。予期されたように、試験 した３つ全てのＶＶ構築物は、ＣＴ２６標的細胞に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を 引き出さなかった（左パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳＰ１Ａで免疫したマウスか ら得た脾臓細胞は、ＶＶ−Ｐ１Ａで免疫したマウスから得た脾臓細胞について観 察されたものよりもはるかに高いＰ１Ａ特異的活性を示した（中および右パネル ）。これらの結果は、免疫原性ペプチドのアミノ末端のＥＲシグナル配列を含む ＥＲキメラ蛋白質を使用することが、クラスＩＭＨＣ分子との相互作用を介して プロセシングされたそのペプチドの抗原提示を増強させるのに一般に有用であろ うことを示唆する。 実施例６ ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５またはＶＶ−ＮＰのいずれかで免疫した マウスから得た脾臓細胞の二次ＮＰ特異的応答 「ＥＳ」構築物（ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５）がＶＶ−ＮＰよりも効果 的にＣＤ８⁺Ｔ細胞の二次応答をプライミングするか否かを決定するために、次 の用量（ｐｆｕ）のＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５（丸）またはＶＶ−ＮＰ（ 三角）でマウスを免疫した：５×１０¹、５×１０²、５×１０³、５×１０⁴、５ ×１０⁵、５×１０⁶。次に、３０日間経過させてマウスに「記憶」応答を発生さ せ、この時点において、マウスを殺し、脾臓細胞を除去して、インフルエンザウ イルスによりインビボで７日間刺激した。次に、⁵¹ＣＲ放出アッセイにおいて、 二次的に刺激された脾臓細胞集団を、種々の希釈率で（各パネル、左から右へ、 １：１、１：３、１：９、１：２７、１：８１および１：２３４）、ペプチドＮ Ｐ１４７−１５５でパルスしたＰ８１５細胞に対してアッセイした。結果は、試 験した低用量では、２つのＶＶ構築物の二次ＮＰペプチド特異的応答をプライミ ングする能力にはほとんど差がなかった（５００ｐｆｕという低いプライミング が観察された）ことを示す。しかし、５×１０⁴ｐｆｕまたはそれ以上の用量に おいては、ＶＶ−ＥＳ ＮＰ１４７−１５５によるプライミングにより、脾臓細 胞はＶＶ−ＮＰプライムマウスから得た脾臓細胞の約１０倍の活性に回復した。 この結果は、最少免疫原性決定因子またはペプチドにシグナル配列を付加するこ とにより、二次および一次ＮＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の両方が増強されるこ とを示す。 実施例７ ２以上の組み換えワクチニアウイルス構築物の単一用量での投与は、 それぞれの構築物に特異的なＴ細胞応答を引き出す 同時に投与したとき、２つの異なるワクチニアウイルス構築物がＣＤ８⁺細胞 応答を引き出すことができるか否かを決定するために、２×１０⁶ｐｆｕのＶＶ −ＥＳ ＶＳＶ５２−５９単独（上パネル）、５×１０⁶ｐｆｕのＶＶ−ＥＳＯ ＶＡ２５７−２６４単独（中パネル）または２×１０⁶ｐｆｕのそれぞれの構築 物を一緒に（下パネル）をマウスに静注し、これらの脾臓細胞を単離した。免疫 感作から６日後、マウスを殺して脾臓を回収した。次に、脾臓細胞を⁵¹Ｃｒ放出 アッセイにおいて、対照ＲＭＡ−Ｓ細胞（左カラム）、ペプチドＶＳＶ５２−５ ９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（中カラム）またはペプチドＯＶＡ２５７−２６ ４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞（右カラム）を溶解させる能力についてアッセイ した（図７）。 アッセイは、５０：１ Ｅ：Ｔ比（それぞれのパネルの最も右の点）、および 連続する２倍希釈（すなわち、１００：１、２００：１等）を用いて実施した。 予期されたように、試験したいずれの脾臓細胞も対照ＲＭＡ−Ｓ細胞を溶解しな いが（左パネル）、ＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４で免疫したマウスから得 た脾臓細胞は、ペプチドＯＶＡ２５７−２６４でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞を特 異的に溶解し（中列、右パネル）、ＶＶ−ＥＳ ＶＳＶ５２−５９で免疫したマ ウスから得た脾臓細胞は、ペプチドＶＳＶ５２−５９でパルスしたＲＭＡ−Ｓ細 胞を特異的に溶解した（上列、中央パネル）。さらに、ＶＶ−ＥＳ ＯＶＡ２５ ７−２６４およびＶＶ−ＥＳ ＶＳＶ５２−５９の両方で免疫したマウスから得 た脾臓細胞は、ＶＶ−ＥＳ ＶＳＶ５２−５９（上列、中央パネル）またはＶＶ −ＥＳ ＯＶＡ２５７−２６４（中列、右パネル）のいずれかで免疫したマウス から得た脾臓細胞について観察されたものに匹敵するレベルで、ＶＳＶ−特異的 溶解（下列、中央パネル）およびＯＶＡ特異的溶解（下列、右パネル）を示した 。 すなわち、これらの結果は、それそれの構築物に対する特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応 答を刺激する能力を失うことなく、２以上のワクチニアウイルス構築物を一緒に 投与しうることを示す。 実施例８ Ｐ８１５腫瘍細胞による抗感染ワクチン 免疫原性キメラ蛋白質または免疫原性キメラ蛋白質をコードするワクチニアウ イルス構築物は、ヒトおよび動物の両方において、癌、感染性疾患または自己免 疫疾患を予防するために用いることができる。例えば、雌ＤＢＡ／２マウスに１ ０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−ＥＳ Ｐ１Ａまたは０．１μｇか ら１．０ｍｇの対応するＥＲキメラペプチドを静脈内に与える。免疫感作から３ 日から６ヶ月後（免疫応答を生じさせるため）、マウスに１０²から１０⁶個のＰ ８１５腫瘍細胞を、静脈内または腹腔内または皮下に与えてチャレンジする。次 に、チャレンジ用量のＰ８１５の投与の直後から始めて、皮下腫瘍の測定または マウスの死亡、または肺および／または肝および／または脾臓転移の視覚または 顕微鏡検査による監視により、腫瘍の発達についてマウスを監視する。 実施例９ 腫瘍Ｐ８１５を有する哺乳動物の治療方法 免疫原性キメラ蛋白質または免疫原性キメラ蛋白質をコードするワクチニアウ イルス構築物は、癌、感染性疾患または自己免疫疾患を有する哺乳動物を治療す る上で有効であろう。例えば、雌ＤＢＡ−２マウスに１０²から１０⁶個のＰ８１ ５腫瘍細胞を、静脈内または腹腔内または皮下に与える。腫瘍を確立させるため に１から２１日経過した後、１０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−Ｅ Ｓ Ｐ１Ａまたは０．１μｇから１．０ｍｇの対応するＥＲキメラ蛋白質をマウ スに与える。次に、マウスの死亡、または肺および／または肝および／または脾 臓転移の視覚または顕微鏡検査による監視のいずれかにより、腫瘍サイズの減少 または腫瘍の完全な消失についてマウスを監視する。 実施例１０ Ｐ８１５腫瘍を有する哺乳動物の養子免疫療法による治療 雌ＤＢＡ／２マウスに、１０⁴−１０⁸ｐｆｕのワクチニアウイルスＶＶ−ＥＳ Ｐ１Ａまたは０．１μｇから１．０ｍｇの対応する免疫原性キメラ蛋白質を静 脈内に与える。免疫感作から約３日から６ヶ月後（免疫応答を生じさせるため） 、マウスの脾臓または腫瘍を回収し、ドウンスホモジナイザーを用いて脾臓また は腫瘍中に含まれるリンパ球を単離する。次に、これらのリンパ球を１０⁷−１ ０¹¹細胞で、Ｐ８１５誘導性腫瘍を有するマウスに静脈内または腹腔内投与する 。処置は、１０²−１０⁶個のＰ８１５腫瘍細胞をマウスに静脈内または腹腔内ま たは皮下に投与することによりＰ８１５腫瘍を誘導した後、１から２１日で実施 することができる。次に、処置されたマウスを、マウスの死亡、または肺および ／または肝および／または脾臓転移の視覚または顕微鏡検査による監視のいずれ かにより、腫瘍サイズの減少または腫瘍の完全な消失について監視する。 上述の開示にかんがみて当業者には明らかなように、本発明の実施において、 本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更、改変および置換が可 能である。 配列表 （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１０アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：９アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：９アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：９アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：９アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７アミノ酸残基 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｘｉ）配列： （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：９０アミノ酸残基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１０の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：７１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：７１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列： （２）配列番号１４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｘｉ）配列：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年６月２０日 【補正内容】 請求の範囲を以下のものと差し替える。 『 請求の範囲 １．下記（ａ）〜（ｂ）からなる免疫原性キメラタンパク質： （ａ）小胞体シグナル配列ペプチド；及び （ｂ）腫瘍ペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾患ペプチド からなる群から選ばれるペプチド。 ２．該小胞体シグナル配列ペプチドが配列番号１に従った配列を有する、請求項 １に記載のキメラタンパク質。 ３．該ペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク質。 ４．該ペプチドが細菌ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク質。 ５．該ペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク質。 ６．該ペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパ ク質。 ７．下記（ａ）〜（ｂ）からなる免疫原性キメラタンパク質： （ａ）小胞体シグナル配列ペプチド；及び （ｂ）配列番号４に従うウイルスペプチド。 ８．該小胞体シグナル配列ペプチドが配列番号１に従った配列を有する、請求項 ７に記載のキメラタンパク質。 ９．下記（ａ）〜（ｂ）から実質的になる核酸配列： （ａ）小胞体シグナル配列ペプチドをエンコードする第１の配列；及び （ｂ）腫瘍ペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾患ペプチド からなる群から選ばれるペプチドをエンコードする第２の配列。 １０．該第２の配列が腫瘍ペプチドをエンコードする、請求項９に記載の核酸配 列。 １１．該配列が配列番号６で示される腫瘍ペプチドをエンコードする、請求項９ に記載の核酸配列。 １２．下記（ａ）〜（ｂ）から実質的になる核酸配列： （ａ）小胞体シグナル配列をエンコードする第１の配列；及び （ｂ）アデノウイルスＥ１Ａペプチド、ＳＶ４０Ｔ抗原ペプチド、エプスタイン ・バールウイルスペプチド及び水庖性口内炎ウイルスタンパク質ペプチドからな る群から選ばれるウイルスペプチドをエンコードする第２の配列。 １３．請求項９または１２に記載の核酸配列を含有するベクターであって、免疫 原性キメラタンパク質の合成を宿主生物に指令しうる発現ベクター。 １４．該ベクターがワクシニアウイルスを含む、請求項１３に記載の発現ベクタ ー。 １５．小胞体シグナル配列ペプチド、並びに腫瘍ペプチド、ウイルスペプチド、 細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾患ペプチドからなる群から選ばれ るペプチドをもつキメラタンパク質を、他のペプチドに対するＴ細胞応答を引き 出すのに有効な量で適用することからなる免疫化の方法。 １６．該キメラタンパク質が腫瘍ペプチドを含有する、請求項１５に記載の方法 。 １７．該キメラタンパク質が細菌ペプチドを含有する、請求項１５に記載の方法 。 １８．該キメラタンパク質が寄生虫ペプチドを含有する、請求項１５に記載の方 法。 １９．該キメラタンパク質が自己免疫疾患ペプチドを含有する、請求項１５に記 載の方法。 ２０．該キメラタンパク質がウイルスペプチドを含む、請求項１５に記載の方法 。 ２１．小胞体シグナル配列ペプチドをエンコードする第１の配列、並びに腫瘍ペ プチド、ウイルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾患ペ プチドからなる群から選ばれるペプチドをエンコードする第２の配列をもつ核酸 配列を、該ペプチドに対するＴ細胞応答を引き出すのに有効な量で適用すること からなる免疫化の方法。 ２２．薬理学的に許容し得る担体中に請求項１に記載のキメラタンパク質を含有 する、哺乳動物を免疫化するためのワクチン。 ２３．薬理学的に許容し得る担体中に請求項７に記載のキメラタンパク質を含有 する、哺乳動物を免疫化するためのワクチン。 ２４．請求項１３に記載の組換え発現ベクターを含有する、哺乳動物を免疫化す るためのワクチン。 ２５．請求項１のキメラタンパク質を含有する医薬組成物。 ２６．請求項１３の組換え発現ベクターを含有する医薬組成物。 ２７．請求項７のキメラタンパク質を含有する医薬組成物。 ２８．下記（１）〜（２）からなる、哺乳動物の癌、ウイルス感染、細菌感染、 寄生虫感染、または自己免疫疾患をインビボで治療する方法： （１）ＥＲシグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免 疫原性キメラタンパク質を用意し；そして （２）該哺乳動物に該免疫原性キメラタンパク質を注射して該他のペプチドに対 するＴ細胞応答を引き出す。 ２９．該他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項２８に記載の方法。 ３０．該他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項２８に記載の方法。 ３１．該他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項２８に記載の方法。 ３２．該他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項２８に記載の方法 。 ３３．該他のペプチドがウイルスペプチドである、請求項２８に記載の方法。 ３４．請求項２５、２６または２７の医薬組成物を含有する、哺乳動物の癌、ウ イルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患の予防または治療に使 用するためのキット。 ３５．下記（ａ）〜（ｄ）からなる、哺乳動物の癌、ウイルス感染、細菌感染、 寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療する方法： （ａ）ＥＲシグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免 疫原性キメラタンパク質を用意し； （ｂ）該哺乳動物に該キメラタンパク質を注射して該他のペプチドに対するＴ細 胞応答を引き出し； （ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物から単離し；そして （ｄ）治療学的に有効な量の該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物または免疫化さ れていない哺乳動物に適用する。 ３６．該他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項３５に記載の方法。 ３７．該他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項３５に記載の方法。 ３８．該他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項３５に記載の方法。 ３９．該他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項３５に記載の方法 。 ４０．該他のペプチドがウイルスペプチドである、請求項３５に記載の方法。 ４１．癌、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患に悩む患 者を治療するための医薬の製造のための、ＥＲシグナル配列ペプチド、並びに腫 瘍ペプチド、ウイルスペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾 患ペプチドからなる群から選ばれるペプチドを含有する免疫原性キメラタンパク 質の使用。 』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ ＡＥＡ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 39/00 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｃ０７Ｋ 14/82 ＡＤＹ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＺ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＥＡ // Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＢＣ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ローゼンバーグ，スティーヴン・エイ アメリカ合衆国メリーランド州20817，ベ セズダ，ハニービー・レーン 9015 (72)発明者 ベンニンク，ジャック・アール アメリカ合衆国メリーランド州20832，オ ルネイ，ストリート・テレサ・ドライヴ 17414 (72)発明者 バシク，イゴー アメリカ合衆国メリーランド州20851，ロ ックヴィル，クルーストン・レーン・ナン バー44 12907 (72)発明者 ユーデル，ジョナサン・ダブリュー アメリカ合衆国メリーランド州20906，シ ルヴァー・スプリング，ノルディック・ヒ ル・サークル 1619

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記（ａ）〜（ｂ）からなる免疫原性キメラタンパク質： （ａ）小胞体シグナル配列ペプチド；及び （ｂ）腫瘍ペプチド、細菌ペプチド、寄生虫ペプチド及び自己免疫疾患ペプチド からなる群から選ばれる少なくとも１個の他のペプチド。 ２．該小胞体シグナル配列ペプチドが配列番号１に従った配列を有する、請求項 １に記載のキメラタンパク質。 ３．該他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク質 。 ４．該他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク質 。 ５．該他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項１に記載のキメラタンパク 質。 ６．該他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項１に記載のキメラタ ンパク質。 ７．下記（ａ）〜（ｂ）からなる免疫原性キメラタンパク質： （ａ）小胞体シグナル配列ペプチド；及び （ｂ）配列番号４に従うウイルスペプチド。 ８．該小胞体シグナル配列ペプチドが配列番号１に従った配列を有する、請求項 ７に記載のキメラタンパク質。 ９．下記（ａ）〜（ｂ）からなる、免疫原性キメラタンパク質の宿主による合成 を指令し得る核酸配列： （ａ）小胞体シグナル配列；及び （ｂ）腫瘍ペプチドをエンコードする配列。 １０．配列番号６で示される、請求項９に記載の核酸配列。 １１．下記（ａ）〜（ｂ）からなる、免疫原性キメラタンパク質の宿主による合 成を指令し得る核酸配列： （ａ）小胞体シグナル配列；及び （ｂ）ウイルスペプチドをエンコードする配列。 １２．請求項９に記載の核酸配列を含有する発現ベクター。 １３．該ベクターがワクシニアウイルスを含む、請求項１２に記載の発現ベクタ ー。 １４．請求項１に記載のキメラタンパク質を、他のペプチドに対するＴ細胞応答 を引き出すのに有効な量で適用することからなる免疫化の方法。 １５．該キメラタンパク質が腫瘍ペプチドを含有する、請求項１４に記載の方法 。 １６．該キメラタンパク質が細菌ペプチドを含有する、請求項１４に記載の方法 。 １７．該キメラタンパク質が寄生虫ペプチドを含有する、請求項１４に記載の方 法。 １８．該キメラタンパク質が自己免疫疾患ペプチドを含有する、請求項１４に記 載の方法。 １９．請求項９に記載の核酸配列を、該腫瘍ペプチドに対するＴ細胞応答を引き 出すのに有効な量で適用することからなる免疫化の方法。 ２０．請求項１１に記載の核酸配列を、該ウイルスペプチドに対するＴ細胞応答 を引き出すのに有効な量で適用することからなる免疫化の方法。 ２１．薬理学的に許容し得る担体中に請求項１に記載のキメラタンパク質を含有 する、哺乳動物を免疫化するためのワクチン。 ２２．薬理学的に許容し得る担体中に請求項７に記載のキメラタンパク質を含有 する、哺乳動物を免疫化するためのワクチン。 ２３．請求項１２に記載の組換え発現ベクターを含有する、哺乳動物を免疫化す るためのワクチン。 ２４．請求項１のキメラタンパク質を含有する医薬組成物。 ２５．該組成物がワクチンである、請求項２４の組成物。 ２６．請求項１２の組換え発現ベクターを含有する医薬組成物。 ２７．該組成物がワクチンである、請求項２６の組成物。 ２８．請求項７のキメラタンパク質を含有する医薬組成物。 ２９．該組成物がワクチンである、請求項２８の組成物。 ３０．下記（１）〜（２）からなる、哺乳動物の癌、ウイルス感染、細菌感染、 寄生虫感染、または自己免疫疾患をインビボで治療する方法： （１）ＥＲシグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免 疫原性キメラタンパク質を用意し；そして （２）該哺乳動物に該免疫原性キメラタンパク質を注射して該他のペプチドに対 するＴ細胞応答を引き出す。 ３１．該他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項３０に記載の方法。 ３２．該他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項３０に記載の方法。 ３３．該他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項３０に記載の方法。 ３４．該他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項３０に記載の方法 。 ３５．該他のペプチドがウイルスペプチドである、請求項３０に記載の方法。 ３６．請求項２４、２６または２８の医薬組成物を含有する、哺乳動物の癌、ウ イルス感染、細菌感染、寄生虫感染、または自己免疫疾患の予防または治療に使 用するためのキット。 ３７．下記（ａ）〜（ｄ）からなる、哺乳動物の癌、ウイルス感染、細菌感染、 寄生虫感染、または自己免疫疾患を治療する方法： （ａ）ＥＲシグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドを含有する免 疫原性キメラタンパク質を用意し； （ｂ）該哺乳動物に該キメラタンパク質を注射して該他のペプチドに対するＴ細 胞応答を引き出し； （ｃ）該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物から単離し；そして （ｄ）治療学的に有効な量の該Ｔ細胞を該免疫化された哺乳動物または免疫化さ れていない哺乳動物に適用する。 ３８．該他のペプチドが腫瘍ペプチドである、請求項３７に記載の方法。 ３９．該他のペプチドが細菌ペプチドである、請求項３７に記載の方法。 ４０．該他のペプチドが寄生虫ペプチドである、請求項３７に記載の方法。 ４１．該他のペプチドが自己免疫疾患ペプチドである、請求項３７に記載の方法 。 ４２．該他のペプチドがウイルスペプチドである、請求項３７に記載の方法。