JP2003510015A

JP2003510015A - 抗血管形成性化合物を用いる腫瘍の処置方法

Info

Publication number: JP2003510015A
Application number: JP2000616345A
Authority: JP
Inventors: スティーブン・ケイ・リブッティ; アンドリュー・フェルドマン
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2003-03-18
Also published as: DE60030850T2; AU4824900A; EP1179061B1; DE60030850D1; ATE340260T1; AU781134B2; EP1179061A1; CA2372699A1; WO2000068379A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ウイルス核酸内に抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含む化合物であって、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸の発現により、抗血管形成タンパク質が生産されるものを提供する。本発明はまた、抗血管形成タンパク質を細胞にデリバリーする方法、抗血管形成タンパク質を患者にデリバリーする方法、ならびに患者における腫瘍を処置する方法であって、ウイルス核酸に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルスを投与し、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、ここに抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸の発現は抗血管形成タンパク質の生産を生じさせ、これによりこの抗血管形成タンパク質が細胞にデリバリーされることを含む方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９９年５月７日出願の米国仮出願第６０／１３３，２４３号に
対する優先権を主張する。第６０／１３３，２４３号仮特許出願はこの引用によ
り、そのすべての内容が本明細書中に包含される。

【０００２】発明の背景発明の属する分野本発明は一般に、抗血管形成性化合物および組成物および抗血管形成性化合物
および組成物の利用方法に関する。具体的には、本発明は、抗血管形成性化合物
の生産方法、抗血管形成性化合物のデリバリー方法、抗血管形成性化合物を用い
る処置方法および、ウイルス発現系を用いる、抗血管形成性化合物のバイオ活性
に関するスクリーニング方法に関する。

【０００３】背景技術現在、血管形成は、腫瘍増殖の重要な過程であると認識されており、固形腫瘍
の拡大増殖に必要である。非血管形成性から血管形成性表現型への遷移およびそ
れに続く腫瘍血管新生には血管形成の正および負の調節因子が関与している可能
性がある（Gibalde M. 1998, "Regulating angiogenesis: a new therapeutic s
trategy" J. Clinic. Pharmacol. 38:898-903）。血管形成への切替えは、通常
、インサイチュ障害内の腫瘍細胞サブセットによって行われる．補充された新規
微小血管は、増殖を支持し、急速に拡大する腫瘍塊の侵襲および転移を促進する
新生血管網を提供する（O'Reilly et al. 1994. "Angiostatin: A Circulating
Endothelial Cell Inhibitor That Suppresses Angiogenesis and Tumor Growth
." Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, LIX:471-482）。
血管生育の調節にはまた、細胞外基質物質、タンパク質分解酵素および細胞接着
分子の複雑な相互作用が関与している。血管形成過程の各段階は治療的抗癌スト
ラテジーに関する潜在的標的である。

【０００４】エンドスタチン（endostatin）は前駆体コラーゲンＸＶＩＩＩの分解から派生
するタンパク質である。これは血管形成および腫瘍増殖の内因性阻害剤であり、
マウスでは、血管形成を完全またはほぼ完全に阻害でき、大型腫瘍の静止または
退行を誘導できる（Wu et al. 1997. "Suppression of Tumor Growth with Reco
mbinant Murine Angiostatin" Biochem and Biophys. Res. Comm. 236:651-654
）。腫瘍を有する動物に対してエンドスタチンを系統的に投与すると、血管が退
行し、腫瘍の退行が導かれる。さらに、エンドスタチンは、化学治療および他の
細胞化学治療に付随する問題である後天的薬物耐性を誘発しない（Boehm et al.
1997. "Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce ac
quired drug resistance" Nature 390:404-407）。しかし、広範な臨床使用に十
分な組換えエンドスタチンの生産における困難は、エンドスタチン治療モデルの
開発において重大な障害を示した。

【０００５】本発明は、エンドスタチン遺伝子を保持するアデノウイルスベクターを投与す
ることによって、エンドスタチンを細胞にデリバリーする改良された方法を提供
する。このアデノウイルス構築体の別の独特な特徴は、１８アミノ酸Ｅ３／１９
Ｋアデノウイルスシグナル配列であり、これはアデノウイルスベクターで感染さ
せた細胞からのエンドスタチンの分泌を可能にする。本明細書中に記載の方法は
、エンドスタチンをコードする核酸を含むウイルスベクターを提供し、種々の細
胞タイプ内への遺伝子輸送の有効な手段を提供する系を開示する。さらに、ウイ
ルス媒介性の遺伝子輸送は高レベルのタンパク質発現を生じさせる。この促進さ
れた遺伝子輸送および高度に特異的な活性の組み合わせによって、その後の宿主
への投与のためまたは宿主内でのエンドスタチンの生産のために、大量の組換え
分子を生産する迅速な方法を提供する。分泌性エンドスタチンの生産能は、アデ
ノウイルス感染部位での可溶性エンドスタチン生産を可能にし、この可溶性エン
ドスタチンは身体を通して循環し、より有効な処置ストラテジーを可能にする。
したがって、本発明方法はまた、従来の処置の有害な副作用を回避する、腫瘍の
処置において用いるための、非常に必要とされ、改良された治療方法を提供する
。

【０００６】発明の要約本明細書中で態様化され、広く記載されているように、本発明の目的（群）で
は、本発明は、一側面において、ウイルス核酸中に挿入された抗血管形成タンパ
ク質をコードする組換え核酸を含む化合物を提供し、ここではこの組換え核酸は
ウイルス粒子内にパッケージング可能であり、抗血管形成タンパク質をコードす
る組換え核酸の発現により抗血管形成タンパク質が生産される。

【０００７】本発明はまた、抗血管形成タンパク質を細胞へデリバリーする方法であって、
この細胞に、ウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組
換え核酸を含むウイルスを投与し、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子中にパ
ーケージング可能であり、ここに抗血管形成タンパク質をコードするこの組換え
核酸の発現により抗血管形成タンパク質が生産され、これにより抗血管形成タン
パク質は細胞にデリバリーされることを含む方法を提供する。

【０００８】本発明はまた、抗血管形成タンパク質を対象（被検体、患者）にデリバリーす
る方法であって、ウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードす
る組換え核酸を含むウイルスを対象に投与し、ここにこの組換え核酸はウイルス
粒子内にパッケージング可能であり、したがって対象の細胞が、抗血管形成タン
パク質をコードする組換え核酸を発現し、これにより抗血管形成タンパク質を対
象にデリバリーすることを含む方法を提供する。

【０００９】本発明はまた、対象内の腫瘍を処置する方法であって、該対象に、ウイルス核
酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルス
を投与し、ここに組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、し
たがって対象内の細胞は、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を発現
し、抗血管形成物質を生産し、これにより腫瘍を処置することを含む方法を提供
する。

【００１０】また、抗血管形成タンパク質を生産する方法であって、ウイルス核酸内に挿入
された抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルスを細胞に投
与し、ここに組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、したが
ってこの組換え核酸の発現によって抗血管形成タンパク質が生産されることを含
む方法を提供する。

【００１１】また、抗血管形成タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニングする方法で
あって、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルスを第一の
細胞に投与し、ここにこの第一の細胞は、抗血管形成タンパク質をコードする組
換え核酸を発現して、抗血管形成タンパク質を生産し、第二の細胞をこの抗血管
形成タンパク質と接触させ、この第二の細胞を、抗血管形成タンパク質に対する
生物学的応答に関してモニターすることにより、抗血管形成タンパク質をバイオ
活性に関してスクリーニングすることを含む方法を提供する。

【００１２】発明の詳細な説明本発明は、本発明の好ましい態様に関する以下の詳細な説明およびそこに含ま
れる実施例を参照することによってより容易に理解され得る。

【００１３】本発明の化合物および方法を開示および記載する前に、本発明が特定の化合物
および方法に限定されず、それはもちろん変化し得ることが理解されるべきであ
る。また、本明細書中で用いられる用語は、単に特定の態様を記載する目的のた
めのものであり、限定を意図しないことが理解されるべきである。

【００１４】明細書および請求の範囲で用いられる単数形「a」「an」および「the」は、特
に記載しない限り、複数形の対象を含むことに注意しなければならない。例えば
、細胞「a cell」は細胞集団中の単一細胞を意味し得る。

【００１５】本発明は、ウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組
換え核酸を含む化合物であって、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内にパッ
ケージング可能であり、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸が発現さ
れると抗血管形成タンパク質の生産が生じる化合物を提供する。

【００１６】したがって、その最も一般的な適用の１つでは、本発明は、抗血管形成タンパ
ク質をコードする配列を有するＤＮＡセグメントを含む組換えウイルスに関する
。抗血管形成タンパク質をコードする核酸は、次いで、その核酸がウイルス粒子
中にパッケージングされることを可能にするのに十分なウイルス核酸の部分とカ
ップリングされる。抗血管形成タンパク質および、本発明の抗血管形成タンパク
質をコードする核酸は、当分野に既知のこのような多数の抗血管形成タンパク質
のいずれかであってよい。特定の抗血管形成因子を例示すると、エンドスタチン
（endostatin）、色素上皮誘導成長因子（ＰＥＤＦ）、内皮性単球活性化ペプチ
ドＩＩ、カンスタチン（canstatin）、インターフェロン誘導性タンパク質−１
０、トロンボスポンジン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＩＰ−１０、アンギオスタチン（an
giostatin）、バソスタチン（vasostatin）、バスキュロスタチン（vasculostat
in）、ＩＬ−１２、血小板因子４、コラーゲンＶＩＩＩの分解産物、コラーゲン
ＸＶの分解産物、例えばレスチン（Ramchandran et al. 1999 "Antiangiogenic
activity of restin, NC10 domain of human collagen XV: comparison to endo
statin" Biochem. Biophys. Res. Commun. 24;255(3):735-739）、およびレスタ
チン（restatin）が含まれるがこれらに限定されない。

【００１７】当業者であれば、本明細書中に開示されている方法において用いられるウイル
スベクターおよび本明細書中に開示されている化合物の部分としてのウイルスベ
クターは、抗血管形成性化合物を生産しやすい任意のウイルスベクターまたは抗
血管形成性化合物の生産に用いることができるものを含み得ることが理解できよ
う。例えばこのようなウイルスは組換えアデノウイルスベクター（Mitani et al
. "Transduction of human bone marrow by adenoviral vector." Human Gene T
herapy 5:941-948(1994)）、アデノ随伴ウイルスベクター（Goodman et al. "Re
combinant adenoassociated virus-mediated gene transfer into hematopoieti
c progenitor cells." Blood 84:1492-1500(1994)）、レンチウイルスベクター
（Naidini et al. "In vivo gene delivery and stable transduction of nondi
viding cells by a lentiviral vector." Science 272:263-267(1996)）、偽型
レトロウイルスベクター（Agrawal et al. "Cell-cycle kinetics and VSV-G ps
eudotyped retrovirus mediated gene transfer in blood-derived CD34⁺ cells
." Exp. Hematol. 24:738-747(1996)）、ワクシニアベクターおよび物理的トラ
ンスフェクション技術（Schwarzenberger et al. "Targeted gene transfer to
human hematopoietic progenitor cell lines through the c-kit receptor." B
lood 87:472-478(1996)）を含み得る。本発明は、これらまたは他の一般に用い
られる遺伝子輸送方法のいずれかと組み合わせて用いることができる。本発明の
好ましい態様では、抗血管形成タンパク質をコードする核酸をデリバリーする特
定のベクターにはアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターが含ま
れる。

【００１８】レトロウイルスはレトロウイルスのオンコウイルス科サブファミリー中に見出
せるもの、例えばＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ（それぞれヒトＴ細胞白血
病ウイルスタイプＩおよびタイプＩＩ）由来のものであってよい。さらにこのレ
トロウイルスは、レンチウイルス科サブファミリーのレトロウイルス、例えばＨ
ＩＶ−１、ＨＩＶ−ＩＩ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＣＡＥＶ（それぞれ
ヒト免疫不全症ウイルスタイプＩ、ヒト免疫不全症ウイルスタイプＩＩ、サル免
疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ウマ感染貧血ウイルス、およびヤ
ギ関節炎−脳炎ウイルス）由来のものであってよい。

【００１９】抗血管形成タンパク質をコードする核酸はウイルスゲノムの任意の位置範囲内
に配置でき、ここにこの抗血管形成タンパク質をコードする配列を含むウイルス
ゲノムはさらにウイルス粒子内にパッケージングされ得る。例えば Ghosh-Choud
hury らは、アデノウイルスがウイルスキャップシド内へパッケージングできる
最大量の核酸は、過剰の野生型ゲノムにおける約２０００塩基であることを示し
た。（Ghosh-Choudhury et al.,(1987)EMBO J. 6:1733-1739）。したがって、あ
るものは抗血管形成タンパク質をコードする核酸をアデノウイルスのＥ１領域の
領域内に、またはある領域と置換して配置し、例えば、Ｅ１遺伝子を分裂させ、
このアデノウイルス遺伝子の細胞形質転換能を不活化し、ならびに組換えウイル
スが発現し、所望の抗血管形成タンパク質を生産可能にすることができる。これ
らの構築物中のアデノウイルス核酸の最小量は、組換えアデノウイルス抗血管形
成性核酸がパッケージングされるのを可能にする量である。さらに、抗血管形成
タンパク質をコードする核酸をアデノウイルスゲノムまたはその部分に挿入する
部位は、最終組換え核酸がパッケージングされることを可能にするように選択さ
れ、これは当業者に既知である。

【００２０】本明細書中で用いる用語「アデノウイルスのゲノム」または「アデノウイルス
ゲノム」とは、アデノウイルス粒子内へパッケージング可能なアデノウイルスの
核酸を示す。したがって、この核酸は完全野生型アデノウイルスゲノムまたはそ
の突然変異体、または存在するアデノウイルスの配列のみが該核酸をアデノウイ
ルス粒子内へパッケージング可能にするものである構築体、またはその任意のバ
リエーションを含み得る。具体的な抗血管形成タンパク質に関してパッケージ可
能な核酸の長さは当分野に既知である。このアデノウイルスゲノムは任意の所望
の核酸挿入物、例えば抗血管形成タンパク質と、アデノウイルスゲノムがアデノ
ウイルス粒子内へパッケージングされた場合、該核酸挿入物もまたパッケージン
グされるようにカップリング可能である。当業者であれば、アデノウイルスの核
酸と連結されたこの核酸挿入物は、この全核酸がアデノウイルス粒子内へパッケ
ージングされることを可能にする全核酸長であることが理解できよう。

【００２１】「組換え核酸を含む化合物」とは、核酸は通常核酸として称されるものを意味
するが、この化合物は例えば、典型的な核酸の誘導体、例えば末端または内部レ
ポーター分子を含むように修飾された核酸または典型的でない塩基または糖を含
む核酸であってもよい。これらのレポーター分子には、同位体および非同位体レ
ポーター分子が含まれるがこれらに限定されない。非同位体レポーター分子の例
には、ビオチン、ＬＣ−ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、コレステロー
ルおよびジニトロフェニルラベルであって、２−アミノブチル−１，３−プロパ
ンジオールバックボーンに結合可能なもの（Clontech, Palo Alto, CA）がこれ
らに限定されない。

【００２２】当業者であれば、抗血管形成タンパク質をコードする核酸配列を獲得できる利
用可能な多数の技術があることが理解できよう。核酸の獲得方法を一例は、組換
えＤＮＡ分子を合成して核酸を構築することによるものである。例えば、オリゴ
ヌクレオチド合成手法は、当分野において慣用されており、特定のタンパク質ま
たは調節領域をコードするオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成によって容易に
獲得可能である。二重鎖分子の一方の鎖に関する核酸を合成し、その相補鎖とハ
イブリダイズさせることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、得られた二
重鎖分子が、適当なベクターへのクローニング用に、内部制限部位または末端の
適当な５'または３'オーバーハングを有するように設計できる。比較的大きなタ
ンパク質または調節領域をコードする二重鎖分子は、まず、該タンパク質または
調節領域の特定領域をコードするいくつかの種々の二重鎖分子を構築し、次いで
これらのＤＮＡ分子をお互いに連結することによって合成できる。例えば Cunni
ngham, et al., "Receptor and Antibody Epitopes in Human Growth Hormone I
dentified by Homolog-Scanning Mutagenesis" Science, Vol. 243, pp. 1330-1
336(1989) は、まず、重複し、かつ相補的な合成オリゴヌクレオチドを構築し、
これらの断片を互いに連結することによって、ヒト成長ホルモン遺伝子をコード
する合成遺伝子を構築した。例えば Ferretti, et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
82:599-603(1986) を参照（ここでは、合成オリゴヌクレオチドからの１０５７
塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成が開示されている）。適当なＤＮＡ分
子が合成された後、このＤＮＡは適当なプロモーターの下流にクローニングでき
る。このような技術は当分野で慣用され、十分に報告されている。

【００２３】抗血管形成タンパク質をコードする配列を得る方法の別の例は、伝統的な組換
え技術を利用して、天然起源の個々の成分由来の配列を作成することである。そ
れが見出された生物由来の抗血管形成タンパク質の部分またはすべてに対応する
野生型核酸を単離し、適当なベクターにクローニングすることができる。例えば
ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを構築し、目的の核酸の存在に関してスクリ
ーニングできる。このようなライブラリーの構築およびスクリーニング方法は、
当分野に周知であり、この構築およびスクリーニング工程を行うためのキットは
市販されている（例えば、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）。単離
後、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を適当なベクター内へクローニング
し、あるいは必要であれば、修飾して、次のクローニング工程を容易にする。こ
のような修飾工程は慣用的であり、その例は、核酸の末端に、制限部位を含むオ
リゴヌクレオチドリンカーを追加することである。このような修飾工程を利用し
て、抗血管形成タンパク質をコードする配列の、ウイルスゲノム、例えばアデノ
ウイルスゲノムまたはレトロウイルスゲノム内への挿入を容易にすることができ
る。これらおよび他のクローニング手法に関する一般的方法は、Sambrook et al
., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laborator
y Press (1989) に記載されている。単離後、抗血管形成タンパク質をコードす
る配列を、他の目的、例えば特定のコドンの変更による発現増加のため、例えば
、またはレセプターまたはリガンドに対する結合増加のために修飾することもで
きる。

【００２４】抗血管形成タンパク質をコードする配列を得る方法のさらに別の例は、その野
生型核酸を含む宿主生物内に見られる核酸から対応する野生型核酸を増幅し、適
当なベクター内の増幅された核酸をクローニングすることである。当業者であれ
ば、所望であれば、例えば、核酸の増幅およびこの核酸の特定の位置の変更を同
時にするために、標的核酸に対して完全に相同ではないプライマーを用いて、増
幅工程は突然変異誘発工程と組み合わせることができることが理解できよう。

【００２５】いずれかの方法で得られた抗血管形成タンパク質をコードする核酸は、すでに
ウイルスゲノムの関連物でない場合、選択されたウイルスゲノム内に挿入できる
。抗血管形成タンパク質をコードする配列をウイルスゲノムまたはウイルスゲノ
ムの部分内にクローニングした後、この核酸は一般に、抗血管形成タンパク質を
コードする配列が有効なプロモーターに隣接し、その制御下に位置するように構
築される。プロモーターは発現が所望である最終の細胞に基づいて選択できる。
ある場合には、プロモーターは、抗血管形成タンパク質をコードする配列が原核
生物宿主ならびに真核生物ベクター内での発現に適合されている原核生物プロモ
ーターを含み得る。例えば、抗血管形成タンパク質をコードする配列は原核生物
宿主内で１つのプロモーターの指揮下に発現させることができ、また抗血管形成
タンパク質をコードする同じ配列を、同一構築物中の真核生物プロモーターの指
揮下に真核生物宿主内で発現させることができる。他の場合、プロモーターは真
核生物プロモーターのみを含むことができ、ここでこのベクターは真核生物宿主
内での発現に特に適合されている。本発明のベクター内で特に利用されるプロモ
ーターには、サイトメガロウイルスプロモーターおよびアデノウイルスプロモー
ターが含まれる。さらに誘導性プロモーター、例えば熱ショックプロモーター、
金属チオネインプロモーター、lac 誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導
性プロモーターまたは抑制性プロモーター（repressible promoter）を用いるこ
とができる。抗血管形成タンパク質プロモーターの正確な性質にかかわらず、本
発明の組換えウイルスは、本明細書中に記載の抗血管形成タンパク質をコードす
る核酸セグメントを包含するであろう。

【００２６】ウイルスゲノム内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする配列は、ウ
イルスプロモーターが抗血管形成タンパク質挿入物に作動可能に連結され、次い
でウイルスプロモーターが抗血管形成タンパク質をコードする配列の転写を指揮
できるか、あるいは抗血管形成タンパク質をコードする核酸が自身のプロモータ
ーを含み得るように配置することができる。同様に、抗血管形成タンパク質をコ
ードする配列は、この抗血管形成タンパク質をコードする核酸が他のウイルス調
節領域または部位、例えばスプライスジャンクションおよびポリアデニル化シグ
ナルおよび／または部位を利用することができるように配置することができる。
別法では、抗血管形成タンパク質をコードする核酸が異なるプロモーターまたは
他の調節配列、例えばスプライス部位およびポリアデニル化配列を含み、ここに
抗血管形成タンパク質をコードする核酸はこの抗血管形成タンパク質をコードす
る配列の発現に必要な配列を含み得るものであり、部分的または総合的にウイル
スゲノムのこれらの調節領域および／または部位を必要とすることはない。これ
らの調節部位はまた、別の起源、例えばアデノウイルスまたはレトロウイルス以
外のウイルス由来のものであってよい。例えば、本明細書中に記載されるように
、アデノウイルス、ヒトまたはマウスポリアデニル化シグナルよりＳＶ４０由来
のポリアデニル化シグナルを用いることができる。抗血管形成タンパク質をコー
ドする配列は、別法では、抗血管形成タンパク質の発現に必要ないくつかの配列
を含み、抗血管形成タンパク質の発現に必要な他の配列をウイルスゲノムから、
あるいは、この組換えウイルスが導入される宿主からさえ引き出すことができる
。

【００２７】上記のように、所望であれば、抗血管形成タンパク質の構造に修飾および変化
を施すことができ、さらに同様または他の所望の特徴を有する分子を得ることが
できると考えられる。このような変化は天然単離体において生じるものであるか
、あるいは部位特異的突然変異誘発を用いて合成的に導入することができ、その
ための方法、例えばミスマッチＰＣＲは当分野に周知である。

【００２８】例えば、特定アミノ酸は、抗血管形成タンパク質構造において、構造物、例え
ば抗体の抗原結合領域（または、例えば基質の結合部位またはレセプター分子）
との相互作用結合能を認識できるほど喪失せずに他のアミノ酸と置換することが
できる。タンパク質の生物学的機能的活性を規定するのはタンパク質の相互作用
能および性質であるから、抗血管形成タンパク質配列（または、当然、その元と
なる核酸配列）において、特定のアミノ酸配列置換を施すことができ、それにも
かかわらず、同様の性質または対抗する性質さえ（例えばアンタゴニスト性ｖ.
アゴニスト性）も有する抗血管形成タンパク質を得ることができる。したがっ
て、本発明が考慮するのは、抗血管形成タンパク質（またはその元となる核酸）
の配列に、その生物学的有用性または活性を認識できるほど喪失せずに、そのよ
うな有用性または活性の増大を伴うこともある、種々の変化を施し得ることであ
る。

【００２９】抗血管形成タンパク質をコードする核酸またはベクターにはまた、その核酸ま
たはベクターを含み、その選択マーカーを発現する細胞のスクリーニングに用い
ることができる選択マーカーを含ませることができる。この様式では、核酸また
はベクターを含み、選択マーカーを発現している細胞を、その核酸またはベクタ
ーを含むが、選択マーカーを発現していない細胞およびその核酸またはベクター
を含まない細胞から容易に分離できる。用いられる具体的な選択マーカーはもち
ろん、この選択マーカーを含まず、かつ発現しない真核生物細胞に対して選択す
るのに用いることができる任意の選択マーカーである。この選択は選択マーカー
を含まず、かつ発現しない細胞の死に基づくものであり、ここに例えばこの選択
マーカーは薬物耐性タンパク質をコードする遺伝子である。真核生物細胞に関す
るこのような薬物耐性遺伝子の例はネオマイシン耐性遺伝子である。ネオマイシ
ン耐性遺伝子を発現する細胞は、抗生物質Ｇ４１８または Geneticin（登録商標
）の存在下で生存可能であり、一方、ネオマイシン耐性遺伝子を含まないか、あ
るいは発現しない真核生物細胞はＧ４１８の存在下で選択される。当業者であれ
ば、選択マーカーの他の例、例えばｈｐｈ遺伝子（抗生物質ハイグロマイシンＢ
を用いて選択可能である）、または大腸菌Ecogpt遺伝子（抗生物質ミコフェノー
ル酸（Mycophenolic acid）を用いて選択できる）が存在することが理解できよ
う。したがって用いられる具体的な選択マーカーはさまざまである。

【００３０】選択マーカーはまた、抗生物質の存在下での生育能以外の手段によって、それ
を用いてその選択マーカー遺伝子を含み、かつ発現する細胞を、その選択マーカ
ー遺伝子を含まず、ならびに／あるいは発現しない細胞から単離できるマーカー
であってよい。例えば、選択マーカーは、発現された場合に、該マーカーをコー
ドする選択マーカーを発現している細胞を同定可能にするタンパク質をコードす
るものであり得る。例えば選択マーカーは発光タンパク質、例えばルシフェラー
ゼタンパク質または緑色蛍光タンパク質をコードでき、発光タンパク質をコード
する選択マーカーを発現する細胞は発光タンパク質をコードする選択マーカーを
含まないか、あるいは発現しない細胞から同定できる。別法では、選択マーカー
は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなタン
パク質をコードする配列であり得る。当分野に周知の方法によって、ＣＡＴを生
産する細胞は、ＣＡＴを生産しない細胞から容易に同定および識別できる。

【００３１】抗血管形成タンパク質をコードする核酸は、典型的に見られる塩基のみを含む
か、あるいは修飾塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の組み合わせで
あり得る。これらの修飾ヌクレオチドは当分野に周知であり、チオ修飾デオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートおよびボラノ修飾（borano-modified）デオキシ
ヌクレオチドトリホスフェートを含むがこれらに限定されない（Eckstein and G
ish, Trends in Biochem. Sci., 14:97-100(1989) and Porter Nucleic Acids R
esearch, 25:1611-1617(1997)）。

【００３２】別法では、核酸は別のタイプのシグナルリガンドおよび／またはレセプターを
コードし、このリガンドおよび／またはレセプターは細胞内に導入されて、その
細胞がこの核酸を発現し、これによりそのリガンドおよび／またはレセプターを
発現する場合、そのリガンドおよび／またはレセプターの相互作用は腫瘍細胞を
アポトーシスさせ、これにより腫瘍細胞を処置し、同時に抗血管形成タンパク質
をコードする核酸配列を発現させる。本発明の方法において用いることができる
他のシグナル分子の例には、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＢａｋおよびＢｉｋが含まれるが
これらに限定されない（Adams et al. "Control of cell death" WEHI Annual R
eport 1996/1997）。

【００３３】本発明の別の態様では、抗血管形成タンパク質をコードする核酸はまた、別の
タンパク質、例えば、抗血管形成タンパク質の発現を調節するのに用いることが
できる調節タンパク質をコードすることができる。例えば、調節タンパク質は細
胞膜での抗血管形成タンパク質の組織特異的局在化を生じさせるか、あるいは非
標的細胞における抗血管形成タンパク質の未成熟な代謝回転を生じさせるか、あ
るいは、転写および／または翻訳の調節を介して抗血管形成タンパク質の発現を
調節することができる。

【００３４】調節タンパク質はまた、独立に、あるいは連続して細胞にデリバリーされる別
の核酸によってコードされ得る。この態様では、２つの核酸は異なる配列、例え
ば異なるプロモーターを有し、例えば、例えばステロイドホルモン、例えばこの
ホルモンによって誘導できるプロモーターを調節可能な糖質コルチコイドホルモ
ンの使用により、一方または両方のプロモーターの発現を選択的に調節する薬物
の投与によって、それらが独立して制御され得るようにすることができる。

【００３５】抗血管形成タンパク質をコードする核酸はまた、融合タンパク質を含んでもよ
い。当業者であれば、タンパク質の局在化、タンパク質の活性化または脱活性化
、タンパク質の位置のモニター、タンパク質の単離、およびタンパク質の量の定
量のような目的のため、融合タンパク質は慣用的に使用されることが理解できよ
う。１つの態様では、融合タンパク質は抗血管形成タンパク質および緑色蛍光タ
ンパク質を含む。抗血管形成タンパク質を含む他の融合タンパク質の例には、Ｃ
ＡＴ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、ハイグロマイシン遺伝子などが含まれる。

【００３６】抗血管形成タンパク質をコードする核酸はまた、抗血管形成タンパク質の発現
調節能を有する配列を含む。例えば、この核酸は糖質コルチコイド調節因子（Ｇ
ＲＥ）を含み、糖質コルチコイドホルモンを用いて、抗血管形成タンパク質の発
現を調節できるようにすることができる。隣接する遺伝子の発現を制御すること
ができる調節配列の他の例は、ＲＮＡアプタマー、例えばＨ１０およびＨ１９を
プロモーター領域内へクローニングし、これにより薬物、例えば Hoechst 色素
３３２５８の投与がインビボでの遺伝子発現をブロックできることによるもので
ある（Werstuck et al. "Controlling gene expression in living cells throu
gh small molecule-RNA interactions" Scinence 282:296-298(1998)）。本発明
の別の態様では、調節配列には、Ｔｅｔ−オペロンまたはｌａｃオペロンまたは
、真核生物細胞内で調節配列として機能できる他の任意のオペロンが含まれる。

【００３７】本明細書中に記載の方法は、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を細胞内
に導入することを含む。当業者であれば、本方法のこの側面は、核酸構築物を細
胞内へ安定または一時的に導入することを含みうることが理解できよう。さらに
、安定または一時的に導入された核酸は宿主のゲノムに組み込まれることもある
し、組み込まれないこともある。当業者であれば、核酸を細胞内へ導入する正確
な手法は、もちろん変化し得るものであり、細胞の具体的タイプまたはアイデン
ティティーに依存し得ることが理解できよう。核酸を細胞に導入する方法の例に
は、エレクトロポレーション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トラン
スフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ウイルスベク
ターの感染、マイクロインジェクション、リポフェクチン媒介性トランスフェク
ション、リポソームデリバリーおよび微粒子銃技術、例えば金粒子上の遺伝子デ
リバリーであって、種々の「裸のＤＮＡ（naked DNA）」デリバリー手法を含む
ものが含まれるがこれらに限定されない。

【００３８】本発明の１つの態様では、プロモーターは、当業者であれば、抗血管形成タン
パク質をコードする核酸の発現に組織特異性を与えることができることが理解で
きる組織特異的プロモーターである。例えば組織特異的プロモーターは前立腺特
異的、乳組織特異的、大腸組織特異的、脳特異的、腎臓特異的、肝臓特異的、膀
胱特異的、肺特異的、甲状腺特異的、胃特異的、卵巣特異的または頚部特異的プ
ロモーターであってよい。組織特異的プロモーターが前立腺特異的プロモーター
である場合、このプロモーターには、ＰＳＡプロモーター、ΔＰＳＡプロモータ
ー、ＡＲＲ２ＰＢプロモーターおよびＰＢプロモーターが含まれるがこれらに限
定されない。

【００３９】組織特異性は、高度な組織特異性を有するベクターを選択することによって達
成できる。例えば粘膜細胞、例えば大腸癌に関係するものに選択的に感染するベ
クターを選択でき、次いで場合により、坐剤の使用によるもののような特定のデ
リバリー方法と組み合わせて用いて、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を
所望の細胞へ選択的にデリバリーすることができる。

【００４０】抗血管形成タンパク質をコードする核酸の発現に用いられる種々のベクターお
よび宿主を用いて、培養中またはインビトロで核酸を発現させることができる。
例えば、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を含むベクターを組織培養セル
ライン、例えばＣＯＳ細胞に導入し、発現させることができ、これにより核酸は
培養内で発現される。この様式では、当業者であれば、宿主生物内で制限された
寿命を有し、宿主が一定期間のうちに抗血管形成タンパク質を発現する細胞を効
率的に一掃できるようにし、非標的周囲細胞または組織へのいかなる有害な作用
をも最小化することができる細胞タイプを選択できる。別法として、対象由来の
細胞を対象から採り出し、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を投与し、次
いで対象内にもどすことができる。このエクスビボ処置手法では、細胞を操作し
て、対象への不必要な有害作用なく、抗血管形成タンパク質をコードする核酸の
取り込みを容易にすることができる。

【００４１】別法として、本発明の核酸を発現するのに用いられる種々のベクターおよび宿
主を用いて、インビボで該核酸を発現することができる。例えば、抗血管形成タ
ンパク質をコードする核酸を含むベクターを真核生物宿主の細胞、好ましくは腫
瘍細胞内へ導入し、腫瘍細胞をインサイチュで処置することができる。上に簡単
に記載されるように、当業者であれば、宿主にベクターを選択的に投与すること
によって特定の組織を処置することができることが理解できよう。例えば、吸入
器の使用によりアデノウイルスベクターをエアロゾルによって投与して、ベクタ
ーを肺に選択的に投与できる。別法では、坐剤の使用により、ベクターを大腸の
細胞に選択的に投与できる。別法では、ベクターを例えばクリーム中で局所的に
デリバリーし、このベクターまたは核酸を皮膚細胞または頚部に選択的にデリバ
リーできる。当業者であれば、ベクターあるいは抗血管形成タンパク質をコード
する核酸の、特定器官または細胞への選択的デリバリーに慣用的に用いることが
できる種々の方法を認識できよう。

【００４２】当業者であればまた、デリバリーがベクターまたは核酸の選択部位への注射な
どの方法によって手動で促進できることが理解できよう。例えば直接注射を用い
て、ベクターまたは核酸を特異的脳および／または乳位置へデリバリーすること
ができる。

【００４３】本発明の方法を用いて、抗血管形成タンパク質をコードする核酸を細胞または
対象、最も好ましくはヒトに投与して、疾患状態、好ましくは腫瘍発達を含む症
状を処置できることが考慮される。本発明の方法はまた、白血病、転移、リュー
マチ性疾患、糖尿病性新血管新生、血球新生および傷害治癒を含むがこれらに限
定されない血管形成によって媒介される任意の疾患またはプロセスを処置するの
に用いることができる。本核酸は、単独または別の化合物または組成物と組み合
わせて、あるいはベクターに基づくデリバリー系の部分として、非経口（例えば
静脈内）的に、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、局所的、経皮的など
により投与することができるが、局所投与が典型的には好ましい。必要とされる
このような核酸、組成物、ベクターなどの正確な量は、対象により、対象の種、
年齢、体重および全般的状態、処置すべき疾患または症状の重篤度、用いる具体
的化合物または組成物、その投与方法などに応じて変化する。したがって、その
正確な量を特定することはできないし、その必要はない。しかし、適当な量は、
当業者により当分野に周知の方法を用いて決定することができる（例えば Marti
n et al., 1989 を参照）。

【００４４】局所投与用には、抗血管形成タンパク質をコードするウイルスまたは核酸、そ
の組成物および／または該核酸を含むベクターを、固形、半固形または液状投与
剤型、例えば粉末剤、液状剤、懸濁剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤など
の剤型の、好ましくは正確な用量の単一投与に適した単位投与剤型の医薬組成物
とすることができる。組成物は典型的に、有効量の選択された核酸、組成物また
はベクターを、製薬的に許容される担体と組み合わせて含み、さらにこれには、
他の薬物、医薬物質、担体、アジュバント、希釈剤などを含ませることができる
。「製薬的に許容される」とは、生物学的にあるいは他の具合で望ましくないこ
とがない材料を意味し、すなわち、この材料は、いずれかの望ましくない生物学
的作用を生じさせるか、あるいはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれ
かと有害な様式で相互作用することなく、選択された核酸、その組成物またはベ
クターとともに個体に投与することができる。

【００４５】別法として、またはさらに、非経口投与は、使用する場合、一般に、例えば標
的細胞（群）を有する組織（群）または器官（群）に供給する血管を介する局所
潅流を含む、静脈内注射によるような、注射を特徴とする。注射物質は慣用の剤
型、例えば液状溶液剤または懸濁剤、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適
した固形剤型またはエマルジョンとして製造できる。非経口投与はまた、徐放系
または持続放出系を使用して、一定レベルの用量を維持することができる（例え
ば米国特許第３，７１０，７９５号を参照）。化合物は腫瘍を含む細胞または組
織の部位に直接注射でき、あるいは腫瘍細胞部位へ拡散または循環するように注
射できる。

【００４６】用量は投与方法、処置すべき疾患または症状、および個々の対象の症状に依存
するであろう。用量はまた、投与する物質、例えば核酸、核酸を含むベクター、
または別のタイプの化合物または組成物に依存する。このような用量は当分野に
既知である。さらに用量は、処置すべき具体的な疾患または症状に関する典型的
用量にしたがって調節できる。さらに、標的細胞タイプの培養細胞を用いて、イ
ンビボにおける標的細胞に関する用量を最適化することができ、標的細胞と同一
タイプの培養細胞において達成された種々の用量による形質転換をモニターでき
る。しばしば、単一投与は十分であり得るが、所望であればその投与を繰り返す
ことができる。用量は有害な副作用を生じさせるほど大量であるべきでない。一
般に、用量は、患者の年齢、状態、性および疾患の程度によって変化し、これは
当業者によって決定できる。また用量は任意の合併症発症において個々の医師に
よって調節され得るものである。

【００４７】対象内の細胞への投与では、化合物または組成物は、患者内に入ると、もちろ
ん対象の体温に合わられる。エクスビボ投与では、化合物または組成物は、細胞
の生存を維持する任意の標準的方法、例えばそれを（標的細胞に対して適当な）
培養培地へ添加することならびにこの培地を細胞に直接添加することによって投
与できる。当分野に既知であるように、本方法において用いられる任意の培地は
、細胞を非生存性にしないような水性かつ非毒性であり得る。さらにそれは、所
望であれば、細胞の生存を維持するための標準的栄養分を含むことができる。イ
ンビボ投与では、複合体を、例えば、患者由来の血液サンプルまたは組織サンプ
ルに加えるか、あるいは製薬的に許容される単体、例えば塩類溶液および緩衝化
塩類溶液に加えて、当分野に既知の任意のいくつかの方法によって投与する。投
与の他の例には、エアロゾルの吸入、皮下または筋肉内注射、核酸またはタンパ
ク質である化合物をコードする核酸配列の、例えば移植用に調製された脊髄細胞
内への直接トランスフェクションおよびその後の対象への移植、ならびに、次い
で対象へ移植される器官への直接トランスフェクションが含まれる。さらに投与
方法には、経口投与（特に組成物がカプセル化されている場合）または経直腸投
与（特に組成物が坐剤型である場合）が含まれる。製薬的に許容される担体には
、生物学的または他の具合で望ましくないことがない任意の物質が含まれ、すな
わちこの物質は、いかなる望ましくない生物学的作用を生じさせることなく、あ
るいはそれが含まれる医薬組成物中の他のいかなる成分とも有害な様式で相互作
用することなく、選択された複合体とともに個体に投与することができる。

【００４８】具体的には、特定の細胞タイプが、例えば器官または腫瘍の局所潅流によって
インビボで標的化されている場合、標的組織由来の細胞は生検することができ、
本明細書中に記載のように、かつ当分野に既知のように、複合体のその組織内へ
のインポートに最適な用量をインビトロで測定し、濃度および時間の長さを含む
インビボ用量を最適化することができる。別法では、同一細胞タイプの培養細胞
をまた、インビボ標的細胞に対する用量を最適化するのに用いることができる。
例えば腫瘍内注射量および割合は制御ポンプ、例えばコンピューター制御ポンプ
または微小熱ポンプを用いて制御し、腫瘍または組織内における核酸またはベク
ターの割合および分布を制御できる。

【００４９】エクスビボ、インビボ、インビトロまたは培養中使用では、核酸、ベクターま
たは組成物を任意の有効濃度で投与できる。有効濃度は部分的またはトータルの
殺生、サイズの減少、消失、増殖の阻害、血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、静
止の誘導または静止のみかけの誘導、または腫瘍または腫瘍細胞の転移の減少を
生じさせる量である。このような作用機構は単に、抗血管形成タンパク質が腫瘍
を処置できる方法の例示であり、主用な作用は腫瘍の血管新生の減少を介するも
のであることがわかる。

【００５０】核酸またはベクターは組成物中で投与できる。例えば、組成物は他の薬物、医
薬物質、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。さらに、この組成物
は、核酸またはベクターに加えて、脂質、例えばリポソーム、例えばカチオン性
リポソーム（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニ
オン性リポソームを含んでもよい。リポソームは、所望であれば、特定の細胞の
標的化を容易にするタンパク質をさらに含むことができる。核酸またはベクター
およびカチオン性リポソームを含む組成物は標的器官に輸入性の血液に投与でき
、あるいは呼吸管内の標的細胞へ吸入できる。リポソームに関しては、例えば B
righam et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100(1989); Felgner et a
l. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417(1987); 米国特許第４，８９７，
３５５号を参照。さらに、この核酸またはベクターは、特定の細胞タイプ、例え
ばマクロファージに標的化され得る微小カプセルの成分として投与でき、あるい
はここで微小カプセルからのこの化合物の拡散またはデリバリーは特定の割合ま
たは用量用に設計される。

【００５１】本発明の方法において用いられる任意の細胞、好ましくは腫瘍の近くまたは腫
瘍内の細胞は誘導可能である。この態様では、これらの細胞には、抗血管形成タ
ンパク質をコードし、発現する核酸を選択的に投与でき、それにより、上記の１
つまたはそれ以上の機構によって腫瘍を処置することができる。一態様では、こ
の腫瘍は固形腫瘍であってよく、この腫瘍または隣接組織に、この細胞に感染し
て抗血管形成タンパク質を発現させる組換えウイルスを注射し、これにより抗血
管形成タンパク質の存在により、腫瘍を処置する。抗血管形成タンパク質に影響
される細胞は、典型的に抗血管形成タンパク質発現細胞に隣接する細胞であり、
これは、好ましくは抗血管形成タンパク質は、抗血管形成タンパク質をコードす
る核酸を発現する細胞から分泌されるからである。影響を受けた細胞は、抗血管
形成タンパク質発現細胞のすぐまわりから除去され得るが、例えばここに抗血管
形成タンパク質発現細胞は移動性を有し、ならびに／あるいは抗血管形成タンパ
ク質発現細胞は、循環する可溶性抗血管形成タンパク質を生産する。抗血管形成
タンパク質発現細胞はまた、自身の死を生じさせ得る。これは抗血管形成タンパ
ク質がこれらの細胞にも影響できるからである。このアプローチでは、本発明の
方法は抗血管形成タンパク質を発現する細胞の死を引き起こすことができるが、
隣接する腫瘍細胞もまた死に、これにより他の状態では腫瘍の退行を引き起こす
かもしれないような腫瘍細胞を排除する。

【００５２】本発明はまた、アデノウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコ
ードする組換え核酸を含むアデノウイルスを提供し、ここにこの組換え核酸はア
デノウイルス粒子内にパッケージング可能であり、この抗血管形成タンパク質を
コードする核酸の発現は抗血管形成タンパク質生産を生じさせる。種々のアデノ
ウイルスは本明細書中に記載の化合物および方法において使用することができる
。例えば、および本明細書中に含まれる実施例に記載されるように、抗血管形成
タンパク質をコードする核酸は、アデノウイルスタイプ５のゲノム内に挿入可能
である。同様にして、他のタイプのアデノウイルス、例えばタイプ１、タイプ２
、タイプ３などを用いることもできる。ヒト細胞に感染できることが既知であり
、したがって本発明において用いることができるアデノウイルスの例示に関して
は、Fields, et al. (1990) Virology, Raven Press, New York を参照。さらに
、あるタイプのアデノウイルス由来のアデノウイルス核酸を含む組換え核酸は異
なるタイプのアデノウイルス由来のキャプシッドタンパク質を用いてパッケージ
ング可能であることが考慮される。

【００５３】ウイルスは、本明細書中に記載の化合物および方法の具体的適用に応じて、複
製不全であるものであってよい。ウイルスを複製不全にする方法は当分野に周知
である。例えば、点突然変異誘発、欠失および挿入、およびそれらの組み合わせ
のような突然変異誘発は、特定のアデノウイルス遺伝子または遺伝子群、例えば
Ｅ１遺伝子に対するもので指揮できる。遺伝子治療において使用するための複製
不全アデノウイルス作成の具体例に関しては、本明細書中に包含されるＷＯ９４
／２８９３８（Adenovirus Vectors for Gene Therapy Sponsorship）を参照。

【００５４】本明細書中に記載のすべての構築物または化合物において、抗血管形成タンパ
ク質は、このタンパク質の分泌に関して特定できる特定のリーダーペプチドに機
能的に連結することができる。例えば、ならびに以下の実施例に記載のように、
抗血管形成タンパク質はシグナル配列、例えば、抗血管形成タンパク質を、この
抗血管形成タンパク質をコードする配列を発現している細胞から分泌させること
ができるアデノウイルスＥ１９シグナル配列を有することができる。アデノウイ
ルスＥ１９シグナル配列の具体例には、以下のアミノ酸配列が含まれる：ＭＲＹ
ＭＩＬＧＬＬＡＬＡＡＶＣＳＡＡ。抗血管形成タンパク質の分泌を容易にするた
めに用いることができるシグナル配列の他の例には、マウスＩｇ−カッパーシグ
ナル配列（Blezinger et al. Nat. Biotechnol. 17:343-8, 1999）、ラットイン
シュリンリーダー配列（Fakhral et al. J. Immunother. 20:437-8, 1997）、Ｆ
ＧＦ−４シグナル配列（Ueno et al. Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17:2
453-2460, 1997）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（Rade et al. Gene The
r. 6:385-92, 1999）、ベータラクタマーゼシグナル配列（Hughes et al. Hum.
Gene Ther. 5:1445-55, 1994）、ウシプロラクチンシグナル配列（Gorman et a
l. Bran Res. Mol. Brain Res. 44:143-146, 1997）および他の同様のシグナル
配列が含まれるがこれらに限定されない。機能的結合は典型的にペプチド結合で
あるが、これに限定されない。また、さらなる配列をコードする核酸を付加する
か、あるいは抗血管形成タンパク質にペプチドを付加することのいずれかによっ
て、他のさらなる配列を抗血管形成タンパク質に結合させてもよい。同様に、本
発明の特定の抗血管形成タンパク質は、核酸の発現によってばかりか、ポリペプ
チドの合成によっても同様に得ることができる。当業者であれば、種々の核酸配
列が同一のポリペプチドをコードし、それゆえシグナル配列をコードする正確な
核酸配列は変化し得ることを理解できよう。

【００５５】本発明の抗血管形成タンパク質を含むタンパク質を生産する１つの方法は、タ
ンパク質化学の技術によって２個またはそれ以上のペプチドまたはポリペプチド
を互いに連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏ
ｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（tert−ブチルオ
キシカルボニル）化学を利用する、現在利用可能な実験室装置を用いて化学的に
合成できる（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。当業者であれば
、エンドスタチンに対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば、標準的化
学反応によって合成できることが容易に理解できよう。例えば、ペプチドまたは
ポリペプチドを合成し、その合成樹脂から開裂させないことができ、一方、抗血
管形成タンパク質の他の断片を合成し、次いでその樹脂から開裂させることがで
き、これにより、他の断片と接触して機能的にブロックされる末端基を暴露させ
る。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、それぞれ、そのカルボキ
シル末端およびアミノ末端においてペプチド結合を介して共有結合させ、抗血管
形成タンパク質を形成させることができる（Grant, G.A., "Synthetic Peptides
:A User Guide" W.H. Freeman and Co., N.Y.(1992) and Bodansky, M. and Tro
st, B., Ed., "Principles of Peptide Synthesis" Springer-Verlag Inc., N.Y
. (1993)）。別法では、ペプチドまたはポリペプチドは、上記のように独立して
インビボ合成できる。単離後、これらの独立のペプチドまたはポリペプチドを連
結させ、同様のペプチド縮合反応によって抗血管形成タンパク質を形成させても
よい。

【００５６】例えば、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素ライゲーションは、
比較的短いペプチド断片をつないで、より大きなペプチド断片、ポリペプチドま
たは完全タンパク質ドメインを生産することを可能にする（Abrahmsen, L., et
al., Biochemistry, 30:4151(1991)）。別法では、合成ペプチドの天然化学ライ
ゲーションを利用して、より短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペ
プチドを合成的に構築できる。この方法は２つの工程の化学反応から構成される
（Dawson, et al., "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation" Sc
ience, 266:776-779(1994)）。第一工程は、非保護合成ペプチド−％−チオエス
テルの、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチドセグメントとの化学選
択的反応であり、初期共有結合産物としてチオエステル結合中間体を得るもので
ある。この反応条件を変化させることなしに、この中間体は自発的に、高速分子
内反応を受け、ライゲーション部位で天然ペプチド結合を形成する。この天然化
学ライゲーション方法をタンパク質分子のトータル合成へ適用することは、ヒト
インターロイキン８（ＩＬ−８）の製造によって例示されている（Clark-Lewis,
I., et al., FEBS Lett., 307:97(1987), Clark-Lewis, I., et al., J. Biol.
Chem., 269:16075(1994), Clark-Lewis, I., et al., Biochemistry, 30:3128(
1991), and Rajarathnam, K., et al., Biochemistry, 29:1689(1994)）。

【００５７】別法では、非保護ペプチドセグメントを化学的に連結でき、化学的ライゲーシ
ョンの結果このペプチドセグメント間に形成された結合は非天然（非ペプチド）
結合である（Schnolzer, M., et al., Science, 256:221(1992)）。この技術を
用いて、タンパク質ドメインのアナログならびに大量の比較的純粋な完全な生物
学的活性を有するタンパク質が合成された（deLisle Milton, R.C., et al., "T
echniquies in Protein Chemistry IV" Academic Press, New York, pp. 257-26
7(1992)）。

【００５８】本発明はまた、生物学的活性を有する抗血管形成タンパク質の断片を提供する
。本発明のこのポリペプチド断片は、そのポリペプチド断片の生産を可能にする
発現系、例えば本明細書中に記載されるアデノウイルス系において、ポリペプチ
ドをコードする核酸をクローニングすることによって得られる組換えタンパク質
であり得る。例えば、エンドスタチンに関連する生物学的作用を生じさせること
ができるエンドスタチンの活性ドメインを決定することができる。１つの例では
、エンドスタチンの活性または結合特異性またはアフィニティーのいずれにも寄
与しないことが見出されたアミノ酸を、それぞれの活性を喪失することなく欠失
させることができる。

【００５９】例えば、アミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を、抗血管形成タンパク質分子
から連続して除去し、それぞれの活性を多くの利用可能なアッセイの１つにおい
てアッセイすることができる。別の例では、抗血管形成タンパク質の断片は、少
なくとも１個のアミノ酸が天然に存在するアミノ酸と特定部位で置換されており
、アミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸の部分またはエンドスタチンの内部
領域でさえもがポリペプチド断片または他の部分、例えばビオチンで置換され、
これによりこの修飾抗血管形成タンパク質の精製が容易にできる修飾エンドスタ
チンを含み得る。例えば、修飾された抗血管形成タンパク質は２個のポリペプチ
ド断片をコードする各核酸を発現ベクター内へクローニングして、コーディング
領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じさせるようにするいずれかのペプ
チド化学によってマルトース結合タンパク質と融合させることができる。このハ
イブリッドポリペプチドは、アミロースアフィニティーカラムに通してアフィニ
ティー精製することができ、次いで、このハイブリッドポリペプチドを特異的プ
ロテアーゼ因子Ｘａで分解することによって、修飾された抗血管形成タンパク質
レセプターをマルトース結合領域から分離できる（例えば New England Biolabs
Product Catalog, 1996, pg. 164. を参照）。同様の精製手法はハイブリッド
タンパク質を真核生物細胞から同様に単離するために利用可能である。

【００６０】抗血管形成タンパク質の活性断片は、直接合成するか、あるいはより大きな抗
血管形成タンパク質の化学的または機械的分解によって得ることができる。活性
断片は、天然に存在するアミノ酸配列由来の少なくとも約５個の連続アミノ酸の
アミノ酸配列であって、関連する活性、例えば結合活性または調節活性を有する
ものとして定義される。

【００６１】他の配列と結合しているか、あるいはしていない断片はまた、特定領域または
特定アミノ酸残基における挿入、欠失、置換または他の選択された修飾を含み得
るが、ただし、このペプチドの活性が、非修飾の抗血管形成タンパク質または抗
血管形成タンパク質断片と比較して有意に変更されたり、あるいは損なわれたり
しないことを条件とする。これらの修飾はいくつかの追加の性質を提供し、ジス
ルフィド結合可能なアミノ酸を除去／追加し、その生物寿命を増大させ、その分
泌の特徴を変更したりなどできる。いずれの場合でも、このペプチドは生物活性
、例えば結合活性、結合ドメインにおける結合の調節などを有さなければならな
い。抗血管形成タンパク質の機能的領域または活性領域は、このタンパク質の特
定の領域を突然変異誘発し、次いで発現させ、発現したポリペプチドを試験する
ことによって同定することができる。このような方法は当業者には容易に明らか
であり、このような方法には、レセプターをコードする核酸の部位特異的突然変
異誘発が含まれる（Zoller, M.J. et al.）。

【００６２】本発明はまた、抗血管形成タンパク質を細胞にデリバリーする方法であって、
この細胞に、ウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組
換え核酸を含むウイルスを投与し、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内にパ
ッケージング可能であり、ここにこの抗血管形成タンパク質をコードする組換え
核酸の発現はこの抗血管形成タンパク質の生産を生じさせ、これによりこの抗血
管形成タンパク質を細胞にデリバリーする方法を提供する。このような投与によ
り、この核酸を細胞に高度に首尾良くデリバリーすることができ、したがって、
抗血管形成タンパク質をコードする配列の比較的高いレベルの発現が導かれる。

【００６３】当分野に周知なことに、アデノウイルスは広範な細胞に感染し、したがって、
その核酸を宿主細胞にデリバリーでき、次いでその核酸を発現させ、これにより
アデノウイルス核酸によってコードされるタンパク質が生産される。例えば、ア
デノウイルスは呼吸管、眼、筋肉細胞、胃腸管の細胞および膀胱の細胞の種々の
部位に感染できる。上で論じたように、抗血管形成タンパク質をコードする核酸
を含むアデノウイルスが投与される細胞には、エクスビボの細胞、例えばアデノ
ウイルスが投与された対象から取り出され、次いでこの対象中に戻される細胞が
含まれ得る。別法では、この細胞は、例えば、抗血管形成タンパク質をコードす
る組換え核酸を含むアデノウイルスが対象内または対象に隣接する細胞にデリバ
リーされるようなインビボの細胞を含み得る。別法では、この細胞は、抗血管形
成タンパク質をコードする配列を含むアデノウイルスが組織培養細胞へデリバリ
ーされるような、培養中の細胞を含み得る。

【００６４】したがって、この方法を用いて、抗体血管形成タンパク質を特定の細胞または
細胞群、あるいは特定の組織または器官へデリバリーすることができる。抗血管
形成タンパク質をコードする配列を含むアデノウイルスまたは抗血管形成タンパ
ク質をコードする組換え核酸を細胞に投与した後、この細胞は、抗血管形成タン
パク質をコードする組換え核酸を発現し、これにより抗血管形成タンパク質が生
産され、これは、この抗血管形成タンパク質と接触するか、あるいは抗血管形成
タンパク質によって他の方法で影響される細胞または他の細胞由来の生物学的応
答を有し得る。

【００６５】本発明はまた、抗血管形成タンパク質を対象にデリバリーする方法であって、
この対象に、そのウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードす
る組換え核酸を含むウイルスを投与し、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内
にパッケージング可能であり、これによりその対象の細胞は、抗血管形成タンパ
ク質をコードする組換え核酸を発現し、この抗血管形成タンパク質が対象にデリ
バリーされる方法を提供する。

【００６６】抗血管形成タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルス、抗血管形成タ
ンパク質をコードする組換え核酸または本発明の抗血管形成タンパク質をコード
する核酸を含むウイルスを含む化合物は、それを必要としている対象に、一般に
用いられる化合物投与方法を用いて、アデノウイルスおよび／または抗血管形成
タンパク質を処置される組織または細胞と接触させる方法によって投与できる。
このような方法には、経口投与、非経口注射（ＩＰ）、皮下投与（ＳＣ−特に制
御された放出貯蔵物）、静脈内注射（ＩＶ）、筋肉内注射（ＩＭ）、鼻腔内（Ｉ
Ｎ）、眼内（ＩＯ）、外眼性（ＥＯ）、舌下（ＳＬ）または経口、例えば経口吸
入（ＯＩ）によるものが含まれる。一般に、治療有効量は、所望の結果を達成す
るのに必要とされる量であり、したがって標的化される疾患状態を首尾良く処置
する。George Hiller, Advanced Drug-Delivery Reviews, 10:163-204(1993)[El
sevier Science Publishers B.V.] and Lorraine L. Wearley, Critical Review
s in Therapeutic Drug Carrier Systems, 8(4):331-394(1991) による論文はこ
れらのタイプの投与の有用な論考である。これらの論文は引用により本明細書中
に包含される。

【００６７】本発明の化合物の投与は、他の治療、例えば外科手術、化学療法、放射線治療
、免疫治療またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせることができる。化学
療法剤の例には、シスプラチン、５−フルオロウラシルおよびＳ−１が含まれる
。免疫治療方法には、インターロイキン−２およびインターフェロン−αの投与
が含まれる。

【００６８】本発明化合物の投与量範囲は、本明細書中さらに記載されるように、その強度
に依存し、処置されるべき症状が処置、例えばはっきりと予防され、阻害され、
あるいは減少する所望の効果を生じさせるのに十分大きな量である。この用量は
有害な副作用を生じさせるほど多いべきでない。一般に、この用量は、対象の年
齢、状態、性および症状の程度に応じて変化し、これは当業者によって決定され
得るものである。この用量はまた、任意の合併症の発生において個々の医師によ
って調節できる。この用量は関連するアデノウイルス投与に関して典型的な量、
例えば、約１×１０^２〜約１×１０^１２プラーク形成単位のアデノウイルスであ
ってよく、例えば１×１０^２ｐｆｕ、１×１０^３ｐｆｕ、１×１０^４ｐｆｕ、１
×１０^５ｐｆｕ、１×１０^６ｐｆｕ、１×１０^７ｐｆｕ、１×１０^８ｐｆｕ、１
×１０^９ｐｆｕ、１×１０^１０ｐｆｕ、１×１０^１１ｐｆｕ、１×１０^１２ｐｆ
ｕであり得る。抗血管形成タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスの
投与に関して、この用量は約．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となり得、例え
ば約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ；約０．１〜約１０ｍｇ／ｋ；約１．０〜約１
０ｍｇ／ｋｇ；約０．００１〜約１ｍｇ／ｋｇ；約０．００１〜約０．１ｍｇ／
ｋｇ；および約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｋｇであってよい。１回の試験に関し
て、用いる用量は１ｍｇ／ｋｇまでであった（Hodges et al. "Phase 1 Study o
f Recombinant Human CD4-Immunoglobulin G Therapy of Patients with AIDS a
nd AIDS-related Complex" Antimicrob. Agents Chemother. 35:2580-6(1991)
参照）。

【００６９】本発明の治療化合物または組成物は、ＩＰ、ＩＭ、ＩＶ、ＩＮ、ＩＯ、ＥＯ、
ＳｕｂＣｕなどによって単位用量として慣用的に投与される。本発明の治療化合
物または組成物に関して用いられる用語「単位用量」は、対象への単位投与量と
して適当な物理的に区分される単位を表し、各単位は、所望の治療効果を生じる
ようにあらかじめ決められた量の活性物質を、必要な希釈剤；すなわち担体また
はビヒクルとともに含む。

【００７０】化合物または組成物は、投与製剤と混合しても化学反応を起こさない方法で、
その治療有効量が投与される。投与されるべき量は、処置される対象、活性成分
の利用に対する対象の系の受容力および所望の治療効果の程度に依存する。投与
されるべき必要な活性成分の正確な量は開業医の判断に依存し、各個人に特有で
ある。しかし、全身性の適用に適当な用量範囲は投与経路に依存し得る。適当な
投与療法はまた変化し得るものであるが、初期投与し、次いで次の注射または他
の投与により１またはそれ以上時間の間隔で繰り返し投与するのが典型的である
。別法では、インビボ治療に関して特定される範囲の血液内濃度を維持するのに
十分な連続静脈内注入を考慮する。

【００７１】本発明の別の側面は、治療有効量の本発明のウイルスまたは抗血管形成タンパ
ク質を、製薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む製薬的に許容される治療
組成物である。この組成物は、有効な様式での本発明のウイルスまたは抗血管形
成タンパク質の投与方法を容易にするように設計される。一般に、本発明の組成
物は、製薬的に許容される賦形剤に溶解または拡散されたウイルスまたは抗血管
形成タンパク質を含むだろう。

【００７２】本明細書中で用いる用語「製薬的に許容される」、「生理学的に寛容される」
およびその文法的バリエーションは、それが組成物、賦形剤（担体、希釈剤、安
定化剤、滑沢剤、試薬などを含む）を表す場合、交換可能に用いられ、この物質
は、毒性なく、好ましくは望ましくない生理学的作用、例えば嫌悪、めまい、胃
の不調などを生じさせることなく、対象に、あるいは対象に接触させて投与可能
であるものである。

【００７３】本発明の化合物または組成物は、投与方法に依存する種々の形態で対象に投与
することができる。投与方法は「侵入性」（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＩＰまたはＳ
Ｃ）または「非侵入性」（例えば眼、頬、経口、経皮、直腸、ＮＩ、ＯＩ（肺性
）など）として見ることができる。一般に、侵入性経路によってデリバリーされ
る組成物はヘルスケアの専門家によって投与されるが、非侵入性経路によってデ
リバリーされる組成物は患者自身が投与できるものである。

【００７４】非侵入性の方法による本発明の化合物または組成物の投与では、抗血管形成タ
ンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルス、抗血管形成タンパク質をコー
ドするアデノウイルスをコードする核酸または抗血管形成タンパク質を含む化合
物のデリバリーを高めるのに用いられる種々の一般的方法がある。まず第一に本
化合物の吸収を増大させることである。これはプロドラッグの使用、本化合物の
一次（primary）構造の化学修飾、この化合物のリポソームまたは他のカプセル
化物質への包含、浸透エンハンサーとの同時投与、物理的方法、例えばイオン導
入法およびフォノフォレシス（phonophoresis）の使用および特定組織への標的
化によって行うことができる。デリバリーを高める別の方法は化合物の代謝を最
小化することである。これは一次構造の化学修飾、ポリマーに対する共有結合、
リポソームまたは他のカプセル化物質への包含、酵素阻害剤との同時投与および
特定組織への標的化が含まれるだろう。本化合物のデリバリーを高める第三の一
般的方法には、ポリマーまたはリポソームで保護するか、生体接着物質を用いる
か、あるいは本組成物を特定の組織へ標的化することにより、本化合物の半減期
を延長させることが含まれる。

【００７５】一般には、眼、頬、経皮または直腸投与を介するか、あるいは鼻吸入または経
口吸入による本発明化合物の吸収を増加させることが所望である場合、特定の浸
透エンハンサーを用いることができる。これらのエンハンサーには、キレート剤
、例えばＥＤＴＡ、クエン酸、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、エナミン（ジケ
トンのＮ−アミノＮ−アシル誘導体）が含まれ得る。また界面活性剤を用いて
、浸透を高めることができる。これらには、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキ
シエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエテレン−２０−セチルエ
ーテル（polyoxyethelene-20-cetyl ether）が含まれる。胆汁塩および誘導体は
また、この化合物の浸透を高めることが既知であり、これらにはデオキシコール
酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロ
ジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含
まれる。本発明の組成物において有用なさらに別のタイプの浸透エンハンサーに
は、特定の脂肪酸および誘導体、例えばオリエック（oliec）、カプリル酸、カ
プリン酸、アシルカルニチン、アシルコリンおよびモノおよびジグリセリドが含
まれる。非界面活性剤もまた、浸透エンハンサーとして有用である。この浸透エ
ンハンサーには、本発明の化合物を有する溶液中で用いることができ、ここでは
化合物および浸透エンハンサーは製薬的に許容される滅菌溶液中にあり、これは
、例えば眼投与によって投与できる。別法では、浸透エンハンサーは粉末化製剤
中に含ませることができ、これは空気流中の粒子物質に懸濁することによってエ
アロゾルとして投与できる。このような粉末化製剤は、乾燥粉末吸入器、例えば
Ventolin Rotohaler（Glaxo, Inc., Research Triangle Park, North Carolina
, U.S.A）および Spinhaler（Fisons Corporation, Benford, MA）によって代表
されるものによって投与することができる。直径中央値が約０．５〜１０ミクロ
ンの粒子サイズを有する固形微粉化粒子形態の組成物は、ＰＣＴ出願国際公開番
号ＷＯ９１／１６０３８およびＷＯ９３／００９５１の教示内容にしたがって調
製することができる。粉末は Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edi
tion, Mack Publishing Co., Chapter 88:1645-1648 の教示内容にしたがって調
製することができる。これらの教示内容は引用により本明細書中に包含される。

【００７６】活性化合物は、例えば、不活性希釈剤または同化でき、食べられる担体ととも
に経口投与するか、あるいは硬または軟シェルゼラチンカプセル中に包含するか
、あるいは錠剤に圧縮するか、あるいは規定量の食物で直接包含してもよい。経
口治療投与用には、活性化合物を賦形剤に包含させ、摂取できる錠剤、頬錠剤、
トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの
剤型で用いることができる。このような組成物および調製物は少なくとも０．１
％の活性化合物を含むべきである。経口製剤の製造では、口および上部ＧＩ管に
おける分解の問題に気づく必要がある。したがって、本化合物と組み合わせて酵
素阻害剤を用いることが好ましいこともあり、あるいは浸透エンハンサーを用い
ること、または保護ポリマーまたはマイクロカプセルを用いることが好ましいこ
ともある。組成物および調製物のパーセンテージはもちろん、変化し得るもので
あり、これは投与単位中、本化合物の重量の約２０％まで含まれているのが都合
が良いかもしれない。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は適
当な用量が達成されるようにするものである。

【００７７】錠剤、トローチ剤、ピル剤、カプセル剤などは以下のような賦形剤を含み得る
：結合剤、例えばポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシア、スクロ
ース、コーンスターチ、ゼラチン、リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウムおよ
び炭酸カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチ、タピオカ
スターチ、特定の複合珪酸塩、アルギン酸など；滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナ
トリウム、タルクおよびステアリン酸マグネシウム；甘味料、例えばスクロース
、ラクトースまたはサッカリン；または香料、例えばペパーミント、ヒメコウジ
油またはサクランボ香料。同様のタイプの固形組成物はまた、軟および硬充填ゼ
ラチンカプセル中の充填物として用いることができ、この関連の物質にはまた、
ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量のポリエチレングリコールが含まれる
。投与単位剤型がカプセルである場合、上記タイプの物質に加えて、液状担体を
含み得る。種々の他の物質はコーティングとして存在するか、あるいは投与単位
の物理的形態を他の方法で修飾し得る。例えば、錠剤、ピル剤またはカプセル剤
はセラック、糖または両者でコーティングすることができる。シロップ剤または
エリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてのスクロース、保存剤としてのメチ
ルおよびプロピルパラベン、色素、香料、例えばサクランボまたはオレンジ香料
、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコ
ール、グリセリンおよび種々の同様のそれらの組み合わせのような希釈剤を含み
得る。もちろん、任意の投与単位剤型の製造に用いられるいずれの物質も、製薬
的に純粋であり、用いられる量において実質的に無毒であるべきである。さらに
、活性化合物を持続放出調製物および製剤中に包含させることもできる。さらな
る成分は当業者には明らかであろう。

【００７８】ＩＰ投与の目的では、ゴマ油またはラッカセイ油中の溶液または水性プロピレ
ングリコール中の溶液、ならびに対応する水溶性、アルカリ金属またはアルカリ
土類金属塩の滅菌水溶液を用いることができる。このような水溶液は適当に緩衝
化され、この液状希釈物はまず、十分な塩類溶液またはグルコースを用いて等張
にされる。遊離塩基または製薬的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、
例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で製造できる。分
散物はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物
中および油状物中で製造できる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調
製物には保存剤を含ませ、微生物の生育を防止する。これらの特定の水溶液は特
にＩＶ、ＩＭ、ＳＣおよびＩＰに適当である。この関連では、用いられる滅菌水
性溶媒はすべて、当分野に周知の標準的技術によって容易に獲得できるものであ
る。

【００７９】注射での使用に適当な医薬形態には、滅菌水溶液または分散物および、滅菌注
射溶液または分散物の即席調製用の滅菌粉末剤が含まれる。すべての場合におい
て、この剤型は滅菌しなければならず、容易に注射可能になる程度にまで流動的
でなければならない。これは製造および保存条件下で安定でなければならず、微
生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存的でなけらばならない。担
体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレング
リコール、液状ポリエチレングリコールなど）、それら適当な混合物、および植
物油を含む溶媒または分散媒体であってよい。適当な流動性は、例えばレシチン
ようなコーティングの使用によって、分散物の場合、必要な粒子サイズの維持に
よって、ならびに界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の防止は
種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール
、ソルビン酸（sorbic acid）、チメロサールなどによって達成できる。多くの
場合で、等張性物質、例えば糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましいだろう
。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリ
ン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって達成できる。

【００８０】滅菌注射溶液は、上に列挙された種々の他の成分を含む適当な溶媒中に必要量
の活性化合物を包含させ、必要とされるか、あるいは適当であれば、次いでろ過
滅菌することによって製造する。一般に、分散物は、滅菌活性成分を、基礎とな
る分散媒体および、上に列挙される必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに包含さ
せることによって製造する。滅菌注射溶液製造用の滅菌粉末剤の場合、好ましい
製造方法は減圧乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、前もって滅菌ろ過され
たその溶液から活性成分の粉末および任意の追加の所望の成分の粉末を生じさせ
る。

【００８１】制御放出されるＩＰ製剤に関しては、本発明の化合物を、化合物の放出を調節
し、その分解を保護するポリマーと混合することができる。一般に、このような
ポリマーは生体分解性または生体非分解性であってよく、さらに親水性または疎
水性であってよい。本発明の組成物において用いるのに適当な親水性の非分解性
ポリマーには、ヒドロゲル、例えばＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドと架橋
されたアクリルアミドまたはビニルピロリドンが含まれる。適当な非分解性疎水
性ポリマーには、エチレン／ビニルアセテートコポリマー、シリコンエラストマ
ー、ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane）などが含まれる。本発明
において有用な分解性親水性ポリマーには、１％未満のＮ,Ｎ'−メチレンビスア
クリルアミドと架橋されたＮ−ビニルピロリドンまたはアクリルアミド、グリシ
ジルメタクリレートで誘導化され、Ｎ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドと架橋
されたデキストラン、フマル酸およびポリ（エチレングリコール）から製造され
、Ｎ−ビニルピロリドンと架橋された水溶性ポリエステル、水容性ポリエステル
などが含まれる。本発明の組成物に有用な適当な分解性疎水性ポリマーには、ラ
クチド／グリコリドコポリマー、ポリ（オルトエステル）およびポリアンヒドラ
イドが含まれる。これらの種々のポリマーのうち、ラクチド／グリコリドコポリ
マーは好ましい。制御された非経口デリバリーに関するこれらのポリマーのより
詳細な説明は、George Heller, Advanced Drug-Delivery Reviews, 10:163-204(
1993)(Elsevier Science Publishers BV) による論文中に見出すことできる。こ
の論文は引用により本明細書中に包含される。

【００８２】好ましい本発明の制御放出組成物に関して、ラクチド／グリコリドコポリマー
は、約３０：７０〜約７０：３０、好ましくは約４０：６０〜約６０：４０のＤ
Ｌ−グリコール酸に対するＤＬ−乳酸の割合を有し得る。約４４：５６の割合が
代表的である。本発明のアデノウイルスまたは抗血管形成タンパク質は、当分野
に既知の方法によりコポリマー中でマイクロカプセル化でき、組成物を形成させ
ることができる。例えば１９８７年６月２３日発行の米国特許第４，６７５，１
８９号から Sanders, Kent, Lewis and Tice を参照。

【００８３】局所投与の目的では、眼への滴加投与に適当な容器中、適当なビヒクル、例え
ば、適当な抗菌剤、例えば安息香酸ナトリウムおよびチメロサールを伴う塩類溶
液中で、希釈滅菌、水溶液（通常は約０．１％〜５％濃度）、さもなければ上記
非経口溶液剤と同様のものを製造する。

【００８４】予防または処置に最も適当な本治療物質の用量は、投与の形態、選択された具
体的化合物および処置を受けている具体的対象の生理学的特徴に伴って変化する
。一般に、少量の用量をまず最初に用い、必要であれば、少量の増分で増加させ
、その環境下での最適な効果を達成する。経口投与はより大量の用量を必要とし
得る。

【００８５】また本発明は対象の腫瘍を処置する方法であって、この対象に、ウイルス核酸
内に挿入された抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルスを
投与し、この組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、これに
より対象中の細胞は、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を発現し、
抗血管形成性物質を生産し、これにより腫瘍を処置することを含む方法を提供す
る。

【００８６】前に議論したように、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸は複製適
格性または複製不全であってよい。したがってこの方法は、抗血管形成タンパク
質をコードする組換え核酸を対象に投与し、対象はこの抗血管形成タンパク質を
コードする組換え核酸を発現し、これにより、腫瘍を処置する抗血管形成タンパ
ク質を生産されることによって対象中の腫瘍を処置する方法を提供する。また上
に議論されているように、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸の投与
方法は当分野に周知であり、これには「裸のＤＮＡ」ならびに、担体、例えばカ
チオン性またはアニオン性リポソーム、またはポリリシンと組み合わせた核酸が
含まれ得る（例えば、Brigham et al., Amer. J. Respir. Cell and Mol. Biol.
8:209-213 (1993); Felgner et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:7413; お
よび米国特許第４，８９７，３５５号 (Eppstein et al.)）。

【００８７】また、抗血管形成タンパク質を生産する方法であって、ウイルス核酸内に挿入
された抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイルスを細胞に投
与し、ここにこの組換え核酸はウイルス粒子内にパッケージング可能であり、こ
れにより組換え核酸が発現され、抗血管形成タンパク質が生産されることを含む
方法を提供する。したがってこの方法を用いて、抗血管形成タンパク質を生産し
、これは細胞外に分泌され、この抗血管形成タンパク質を、細胞から分泌されな
い抗血管形成タンパク質の場合と同様に細胞外培地から回収できるが、後者の場
合、この細胞を崩壊させなけらばならず、さらに細胞膜の崩壊を含む可能性があ
る。好ましい態様では、抗血管形成タンパク質は容易に細胞から分泌される。タ
ンパク質回収方法は当分野で標準的であり、本明細書中で例証されている。抗血
管形成タンパク質は任意の所望のレベルの純度に精製でき、これもまた当分野で
標準的である。

【００８８】また、抗血管形成タンパク質を生物学的（バイオ）活性に関してスクリーニン
グする方法であって、第一の細胞に、抗血管形成タンパク質をコードする組換え
核酸を含むウイルスを投与し、ここに第一の細胞は、抗血管形成タンパク質をコ
ードする組換え核酸を発現し、抗血管形成タンパク質を発現し、第二の細胞をこ
の抗血管形成タンパク質と接触させ、この第二の細胞を抗血管形成タンパク質に
対する生物学的応答に関してモニターし、この抗血管形成タンパク質をバイオ活
性に関してスクリーニングすることを含む方法を提供する。

【００８９】したがって本方法は、上記のように、具体的バイオ活性、例えば腫瘍重量の減
少、腫瘍血管新生の減少、腫瘍壊死の増加および腫瘍細胞増殖の減少に関して特
定の抗血管形成タンパク質をスクリーニングすることができる。

【００９０】本スクリーニング方法は、その後に抗血管形成タンパク質に対する生物学的応
答に関してモニターされる第二の細胞に抗血管形成タンパク質を投与する前に、
この抗血管形成タンパク質を生産する第一の細胞から抗血管形成タンパク質を回
収することを必要とするか、あるいはこの方法は、抗血管形成タンパク質を生産
する第一の細胞を、その後にこの抗血管形成タンパク質に対する生物学的応答に
関してモニターされる第二の細胞と混合することを必要とし得る。同様に、抗血
管形成タンパク質を生産する第一の細胞は、第二の細胞と同一の細胞タイプであ
るか、あるいは第一の細胞と第二の細胞は異なる細胞タイプであってよい。

【００９１】本発明は抗血管形成タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニングする方法
であって、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むアデノウイルス
を細胞に投与し、ここに細胞は抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を
発現して、抗血管形成タンパク質を生産し、抗血管形成タンパク質に対する生物
学的応答に関して該細胞をモニターして、バイオ活性に関して抗血管形成タンパ
ク質をスクリーニングすることを含む方法を提供する。したがってこのスクリー
ニング方法は、抗血管形成タンパク質を生産していなくてもよい第二の細胞を必
要とせず、それ自身抗血管形成タンパク質を生産する細胞のみを用いて使用し得
る。

【００９２】本発明のスクリーニングアッセイは、抗血管形成タンパク質が生産される細胞
から直接由来する抗血管形成タンパク質を都合よく用いることができる。最も好
ましくは、細胞、典型的には真核細胞内で、選択された抗血管形成タンパク質を
単に発現させ、次いで抗血管形成タンパク質を含む細胞培養媒地のサンプルを製
造することによってこれを達成する。別法では、精製された量の抗血管形成タン
パク質分子を回収するために、さらにこの抗血管形成タンパク質を含む培養培地
に対して精製工程を行う。このさらなる精製工程には、抗血管形成タンパク質の
、抗血管形成タンパク質特異的リガンドまたはレセプターに対する特異的結合が
含まれ得る。

【００９３】抗血管形成タンパク質候補の存在または不存在下で、選択されたエフェクター
の結合を比較することにより、抗血管形成タンパク質の結合性質に関する情報を
得ることができる。細胞、特に上皮細胞に対する抗血管形成タンパク質の効果を
測定するのに用いることができる広く種々の態様があると考えられ、本発明はこ
のような方法のいずれかに限定されることを意図しない。しかし、抗血管形成タ
ンパク質の、用いられるエフェクターに対する結合能および／または該エフェク
ターによって修飾される能力を測定できる系を用いるのが一般に望ましい。用い
ることができる１つの方法は、ラベルされた抗血管形成タンパク質を使用するこ
とができ、これは該ラベルが得られた抗血管形成タンパク質／レセプター複合体
中で定量的に確保されるような様式でラベルされたものである。都合が良いアプ
ローチは、抗血管形成タンパク質および得られた複合体の両方において直接定量
することができる放射能ラベル、例えば^Ｉ１２５、^１４Ｃまたは^３Ｈを使用する
ことである。特定のアッセイでは、抗血管形成タンパク質およびレセプターを含
む混合物を、選択された時間量の間インキュベートしておき、任意の生産された
抗血管形成タンパク質／レセプター複合体から混合物中に残留する未結合抗血管
形成タンパク質を分離するために、得られたインキュベートされた混合物を分離
手段に付する。次いで、例えば、抗血管形成タンパク質候補が加えられなかった
コントロールに対するそれぞれの量を単純に測定する。この測定は種々の時点で
行うことができ、ここでは速さのデータが望ましい。これから、抗血管形成タン
パク質の、レセプターの機能を変更するか、あるいは修飾する能力を決定するこ
とができる。抗血管形成タンパク質／レセプター複合体からの抗血管形成タンパ
ク質の分離に用いることができる多数の技術が既知であり、このような方法はす
べて、本発明の範囲内に含まれることを意図する。薄層クロマトグラフィー法（
ＴＬＣ）、ＨＰＬＣ、分光測定法、ガスクロマトグラフィー／質量分析またはＮ
ＭＲ分析の使用。すでに記載した他の、より特異的な精製方法（アフィニティー
結合または免疫沈降）もまた同様に用いることができる。抗血管形成タンパク質
および複合体の区別が可能である限り、任意のこのような技術を用いることがで
き、これを用いて、例えば基質および生成物を同定または定量することによって
、酵素の機能を測定できることが考慮される。また抗血管形成タンパク質／レセ
プター複合体自体がｘ線結晶解析のような技術の対象であり得る。

【００９４】本明細書中に記載のスクリーニング方法はまた、抗血管形成タンパク質をコー
ドするウイルス核酸を第一の細胞に投与し、ここに第一の細胞は抗血管形成タン
パク質をコードするウイルス核酸を発現して、抗血管形成タンパク質を生産し、
この抗血管形成タンパク質と第二の細胞を接触させ、この抗血管形成タンパク質
に対する生物学的応答に関して第二の細胞をモニターし、これにより抗血管形成
タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニングすることが含む、抗血管形成タ
ンパク質のバイオ活性に関するスクリーニングに利用できる。

【００９５】同様に、本明細書中に記載のスクリーニング方法は、抗血管形成タンパク質を
コードするウイルス核酸を細胞に投与し、ここに、この細胞は抗血管形成タンパ
ク質をコードするウイルス核酸を発現して、この抗血管形成タンパク質を生産し
、この抗血管形成タンパク質に対する生物学的応答に関してこの細胞をモニター
し、これによりこの抗血管形成タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニング
することを含む、抗血管形成タンパク質のバイオ活性に関するスクリーニングに
利用できる。

【００９６】当業者であれば、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明にお
いて種々の修飾およびバリエーションを施すことができることが理解できよう。
本明細書中に開示される本発明の詳細および実施を考察することにより、本発明
の他の態様は当業者には明らかであろう。この詳細な説明および実施例は、請求
の範囲に示される発明の真の範囲および精神を有する、単なる例示として考えら
れることを意図するものである。

【００９７】以下に実施例は、本明細書中で特許請求されている方法を行うことができる方
法についての完全な開示および記載を当業者に提供するために記載され、純粋に
本発明を例示することを意図し、発明者がその発明とみなすものの範囲を限定す
ることを意図しない。数値（例えば量、温度など）に関する正確さを保証する努
力が施されたが、いくらかのエラーおよび偏差は説明されるべきである。特に記
載しない限り、パーセント（parts）は重量パーセントであり、温度は℃であり
、圧力は大気圧であるか、それに近いものである。

【００９８】実施例Ｉマウスエンドスタチンのクローニング年齢３週間のマウスの肝臓からＲＮＡを単離し、逆転写酵素反応を用いてこの
ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、マウスエンドスタチンをクローニングした。このｃ
ＤＮＡ鋳型とともにフォワード（gatctctagaccaccatgcatactcatcaggactttcag）
およびリバース（gatcatcgatctatttggagaaagaggtca）プライマーを用いて、マウ
スエンドスタチンｃＤＮＡを配列決定プラスミド（pkmendo-2）にクローニング
した。このＰＣＲは添加剤としてのグリセロールおよびＤＭＳＯとともにｐｆｕ
酵素を用いて行った。ＰＣＲ条件は９４℃４５秒、５０℃４５秒、２５サイクル
７０℃２分であった。配列は自動配列決定装置を用いて確認した。

【００９９】ヒトエンドスタチンのクローニングヒトエンドスタチンは、ヒト血管内皮腫にからＲＮＡを単離することによって
クローニングした。逆転写酵素反応を用いてこのＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、上
に記載される条件と同一の条件で、ＰＣＲの鋳型として用いた。フォワードプラ
イマーは gatctctagaccaccatggttgcgctcaacagccccctgt であった。リバースプラ
イマーは gatcatcgatctactacttggaggcagtcatgaagct であった。このＰＣＲ産物
を配列決定プラスミド（pkhendo-2）にクローニングし、この配列を自動配列決
定装置を用いて確認した。

【０１００】シグナル配列エンドスタチン（ss-endo）の作成Ｅ３/１９ｋアデノウイルスシグナル配列を、ＰＣＲによってマウスおよび
ヒトエンドスタチン構築物に加えた。シグナル配列およびエンドスタチンｃＤＮ
Ａの５'末端と相同な配列を含む特有のフォワードプライマーを創出した。マウスプライマー： gatctctagaccaccatgaggtacatgattttaggcttgctcgcccttgcggcagtctgcagcgcggcccat
actcatcaggactttcag ヒトプライマー： gatctctagaccaccatgaggtacatgattttaggcttgctcgcccttgcggcagtctccagcgcggccgtt
gcgctcaacagccccctg マウス構築物に関しては、同一のＰＣＲ条件で上記リバースプライマーととも
に、pkmendo-2 を鋳型として用いて、マウスエンドスタチンに対するｃＤＮＡの
５'にこのシグナル配列を有するＰＣＲ産物を作成した。これを配列決定プラス
ミドに連結し、pssmendo-6 を得た。この配列は自動配列決定装置で確認した。ヒト構築物に関しては、記載のものと同一のＰＣＲ条件で、pkhendo-2 を鋳型
として用いた。このＰＣＲ産物を配列決定プラスミドに連結し、psshendo を作
成した。

【０１０１】アデノウイルスシャトルプラスミドの作成プラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ．１をバックボーンとして用いて２個のアデノウイ
ルスシャトルプラスミドを創出した：一方はシグナル配列マウスエンドスタチン
を伴うもの（ｐＳＫＬ−３５）（図１）および一方はマウスエンドスタチンを有
し、シグナル配列を伴わないもの（ｐＳＫＬ−２２）（図２）。このプラスミド
は、適当な親プラスミド（pkmendo または pssmendo）からＥｃｏＲ１を用いて
、エンドスタチンをコードするＤＮＡ（シグナル配列を伴うか、あるいは伴わな
いもの）を切除して創出した。このＥｃｏ−Ｒ１断片をこのシャトルベクターに
連結し、制限消化によって配向（オリエンテーション）を確認した。次いで標準
的技術を用いて組換えアデノウイルスを作成した。

【０１０２】Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏのインビボ抗腫瘍効果生後６〜８週のヌードマウスに、第−４日において、ＰＢＳ２００ｍＬ中の
１０^６ Lewis 肺癌細胞を皮下注射した。マウスを、第０日、７日および１４日
において、ＰＢＳ２ｍＬ中の１×１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、エン
ドスタチンをコードするアデノウイルス（Ｅｎｄｏ、ｎ＝８）、ルシフェラーゼ
をコードするアデノウイルス（Ｌｕｃ、ｎ＝６）またはアデノウイルスなし（Ｐ
ＢＳ、ｎ＝５）で腹腔内処置した。腫瘍は、個々の動物の処置様式を知らない研
究者によってだいたい３日ごとに測定され、腫瘍容量は式：容量＝幅^２ｘ長さｘ
０．５２を用いて計算された。エンドスタチンで処置された動物は、第１２日か
ら１９日の実験終了までコントロール動物より有意に小さくなった腫瘍を有した
（図３）（ｐ＜０．０２、Kruskal-Wallis）。

【０１０３】アデノウイルスとインキュベートした後の上清エンドスタチンレベル１ｘ１０^７２９３（Ｅ１−形質転換ヒト胎児腎臓）細胞を、１０ｃｍ培養皿
中、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイ
シンおよびファンギゾン（fungizone）を含有するＤＭＥＭ中にまき、一晩イン
キュベートした。次いで細胞を１０^９ｐｆｕ（ＭＯＩ＝１００）の野生型アデノ
ウイルス（ヌル、null）、マウスエンドスタチン遺伝子を含むアデノウイルス、
シグナル配列エンドスタチン構築物を有するアデノウイルスまたはアデノウイル
スなしの同培地１０ｍＬで感染させ、２４時間インキュベートした。次いで上清
を回収し、５０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞片を除去した。各感染は３回行
い、拮抗免疫アッセイを用いて各感染に関して上清エンドスタチン濃度を２回測
定した（Cytimmune, College Park, MD）。ヌル、エンドスタチンまたは非感染
プレート由来の上清からはエンドスタチンを検出できなかった（ＮＤ）が、シグ
ナル配列エンドスタチン感染プレート由来の上清中には、６８．５±２．８ｎｇ
／ｍＬ（平均±Ｓ.Ｄ.）の濃度で存在した（図４）。

【０１０４】アデノウイルスでの感染後の上清エンドスタチンレベル実験の設計は以下の例外を除いて前の実験と同一であった：１０^６細胞／ウェ
ルを６−ウェルプレートにまき、培地１．０ｍＬ中の１０^８ｐｆｕ（ＭＯＩ＝１
００）のアデノウイルスで感染させた。Ａｄ−コントロールまたはＡｄ−ｍＥｎｄｏ−感染ウェル中で検出されたエン
ドスタチン濃度は非感染２９３細胞由来の条件化培地中（１６．３±１．３ｎｇ
／ｍＬ）より低かった。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ−感染ウェル中のエンドスタチ
ン濃度は７０５．７±１９１．４であった（図５）（平均±Ｓ.Ｄ.として示され
る濃度）。コントロールウェル中の免疫反応性は、１０％ＦＣＳのみの場合と同
様であり、このことからポリクローナル抗マウスエンドスタチン抗体と交差反応
するウシ血清中のタンパク質の存在が示される。

【０１０５】Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを用いる微小血管内皮細胞増殖の阻害アデノウイルスによって生産されたエンドスタチンのインビトロ機能を評価す
るため、前に実験において記載したように製造したＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏで感
染させた細胞由来の上清の存在下でヒト肺微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）の増殖
を試験した。第−１日に、１×１０^５ＭＶＥＣを１２ウェルプレートの各ウェ
ル中、ＥＧＭ−２内皮細胞培養培地にまいた。第０日および第４日に、細胞を、
Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ、コントロールアデノウイルスまたはアデノウイルスな
しで感染させた細胞由来の上清（濃縮上清または非濃縮上清）で処置した。さら
に、Calbiochem（ＣＢＣ）または Cytimmune Sciences（ＣＩ）から得られた組
換えエンドスタチンを試験した。すべてのウェルはトータル容量０．５ｍＬであ
り、１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を刺激剤として含ん
でいた。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏウェルでは、平均細胞数は３３３であり、２つ
のウェルが完全なＭＶＥＣの不存在を示した（図６）。ＥＧＭ−２または濃縮ま
たは非濃縮条件化培地を含む負のコントロールウェルは２３，０００〜２８，０
００の範囲の平均細胞数を含んでいた。組換えエンドスタチンで処理されたウェ
ルは、７，０００〜１０，０００の範囲の平均細胞数を生じた。コントロールウ
イルスで処理されたウェルは１２，０００の平均細胞数を生じ、これにより、い
くらかの非特異的アデノウイルスがＭＶＥＣ増殖に作用するが、これはエンドス
タチン構築物を用いて見られる完全に近い作用ではないことが示される。

【０１０６】Ａｄ−ｓｓｍＥｎｄｏはマウスにおいて血漿エンドスタチンレベルを増大させるＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏがインビボでエンドスタチンを生産する能力を評価す
るため、ヌードマウスに１０^９ｐｆｕのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ、コントロール
アデノウイルス（Ａｄ−ｎｕｌｌ）またはウイルスなしの塩類溶液（ＰＢＳ）２
．０ｍＬを腹腔内注射した。５日後、血漿サンプルをＥＬＩＳＡによってエンド
スタチン濃度に関して分析した。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ処置動物中の血漿レベ
ルは、それぞれＡｄ−ｎｕｌｌおよびＰＢＳ群における３７±１９．１ｎｇ／ｍ
Ｌおよび３４±８．５ｎｇ／ｍＬに対して、１０６±２８．０ｎｇ／ｍＬであっ
た（平均±Ｓ.Ｄ.）（図７）。

【０１０７】実施例ＩＩマウスエンドスタチン遺伝子のクローニングマウスｃＤＮＡは、急速凍結された生後２週間のＣ５７ＢＬ／６マウス（Char
les River Laboratories, Wilmington, MA）肝臓由来のＲＮＡを単離し（RNeasy
Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA）、Moloney マウス白血病ウイルス逆転写酵
素（Life Technologies, Gaithersburg, MD）で処理することによって得た。こ
のマウスエンドスタチン遺伝子を、プライマーセンス： GATCTCTAGACCACCATGCATACTCATCAGGACTT およびアンチセンス： ACTGGAGAAAGAGGTTTATCTAGCTACTAG を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よってＴＡクローニングベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローニン
グした。プライマーセンス： GATCTCTAGACCACCATGAGGTACATGATTTTAGGCTTGCTCGCCCTTGCGGCAGTCTGCAGCGCGGCCCAT
ACTCATACTCATCAGGACTTTCAG および上記アンチセンスを用いるＰＣＲによって１
８アミノ酸Ｅ３／１９Ｋシグナル配列（MRYMILGLLALAAVCSAA）をエンドスタチン
配列の上流に挿入した。プラスミドＤＮＡをＤＨ５ａ細胞（Life Technologies
）中で増幅し、シグナル配列−マウスエンドスタチン（ｓｓ−ｍＥｎｄｏ）配列
を確認した（ABI Prism 3 10 自動シーケンサー、PE Applied Biosystems, Fost
er City, CA）。

【０１０８】アデノウイルスベクターの合成ｓｓ−ｍＥｎｄｏ構築物をＥｃｏＲＩで消化し、平滑末端ライゲーションによ
ってアデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ．１のマルチクローニン
グ部位にクローニングした。得られたプラスミドを、以前に記載（６、７）され
るようにタイプ５ＥＩＡ／Ｂ欠失アデノウイルスと再連結し、これを用いて２
９３細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を感染させた。
プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出およびエタノール沈降を用いてプラーク
ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりｓｓ−ｍＥｎｄｏに関してスクリーニングした。
得られたウイルス、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを２９３細胞中で増幅した。同様の
ストラテジーを用いて、Ｐ−ガラクトシダーゼ（Ａｄ−ｐ−ｇａｌ）およびホタ
ルルシフェラーゼ（Ａｄ−ｌｕｃ）の遺伝子を含むコントロール組換えウイルス
を創出した。２９３細胞における標準的プラーク形成アッセイを用いてウイルス
を滴定した。

【０１０９】組換えアデノウイルスを用いたインビトロ感染１０％胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレ
プトマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、０．５〜μｇ／ｍＬファンギ
ゾンおよび４ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭからなる完全培地（Biofluids, Ro
ckville, MD）中で細胞を培養した。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ、Ａｄ−ｌｕｃま
たはウイルスなしを用いて０．１〜１００の範囲の感染多重度（ＭＯＩｓ）（完
全培地１．０ｍＬ中１０６細胞当たり１０５〜１０８プラーク形成単位［ｐｆｕ
］）で細胞を感染させ、３７℃で２４時間インキュベートした。上清を２ｘｇで
５分間遠心し、拮抗酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（Cytimmune Sciences, Colleg
e Park, MD）を製造元の指示書にしたがって用いてエンドスタチンに関してアッ
セイした。２９３細胞上清をセルロースカラム（Centricon YM-10, Millipore,
Bedfold, MA）中で１０倍濃縮し、５７０ｎｇ／ｍＬのウサギ抗マウスエンドス
タチンポリクローナルＩｇＧ抗体（Cytimmune Sciences のギフト）を用いるウ
エスタンブロッティング（NuPAGE, Novex, San Diego, CA）によって分析した。
ＥＩＡマウスエンドスタチン標準を正のコントロールとして用いた。上記のよう
に細胞をＡｄ−βｇａｌで感染させ、２４時間後に染色キットを用いてβ−ｇａ
ｌに関してアッセイすることにより、アデノウイルス感染に対する、マウス大腸
腺癌セルラインＭＣ３８（Surgery Branch, National Cancer Institute で開発
）の感受性を試験した。Ａｄ−β−ｇａｌ感染に対する、マウス肝臓セルライン
ＮＭｕＬｉ（American Type Culture Collection）の感受性を正のコントロー
ルとして用いた。

【０１１０】ウイルス生産エンドスタチンの機能的アッセイヒト黒色腫セルライン５０１Ｍｅｌ（Z.-H. Wang, National Cancer Institut
e）を種々のＭＯＩのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたはＡｄ−ｌｕｃで上記のよう
に感染させた。２４時間後に上清を回収し、上記のように遠心した。以前に記載
（８）される方法をわずかに修飾して、上清を内皮細胞増殖の阻害能に関して分
析した。簡単には、１０００ウシ毛細管内皮細胞（EJG, American Type Culture
Collection）をコラーゲン１でコーティングされた９６ウェルプレート（Bioco
at, Becton Dickinson, Bedfold, MA）の各ウェル中の完全培地にまいた。３７
℃で一晩インキュベートした後、培地を吸引し、試験される２０〜ｔＬの上清サ
ンプルで置換した。各上清の８サンプルを試験した。３７℃２０分間インキュベ
ートした後、５％胎児ウシ血清およびＩｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（
R＆D Systems, Minneapolis, MN）を含む修飾完全培地８０〜ＩＬを加えた。３
７℃で７２時間インキュベートした後、製造元の指示書にしたがい、ＷＳＴ−Ｉ
アッセイ（Boehringer Mannhreim）によって増殖を分析した。各サンプル中の増
殖阻害は式：阻害(％)＝(平均Ａ_{450(コントロール)}−Ａ_{450(サンフ゜ル)})／平均Ａ_{450(コントロール)}Ｘ100 ［ここにＡ₄₅₀は、Multiskan MCC/340 プレートリーダー（Titertek, Huntsvill
e, AL）中で測定された４５０ｎｍでの吸光度あり、コントロールは非感染細胞
上清である］にしたがって計算した。

【０１１１】エンドスタチンのインビボ生産動物実験は National Institutes of Health Animal Care and Use Committee
によって是認されるプロトコルにしたがって行った。用量応答および毒性を評
価するために、生後８週間の雌性ヌードマウス（Charles River Laboratories）
の側尾部静脈に、１０^９または１０^１０ｐｆｕのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたは
ウイルスなしのリン酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）１００μＬを静脈内注射した（
ｎ＝５動物／群）。動物の健康を６日間モニターし、生存マウスを安楽死させ、
剖検した。エンドスタチン発現の期間および量を評価するために、上記のように
第０日に、１０^９ｐｆｕのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたはＡｄ−ｌｕｃまたはウ
イルスなしをマウスに注射した。第２、４、８および１３日にマウスを二酸化炭
素で安楽死させ、心臓穿刺によって血液サンプルを得た（ｎ＝６動物／処置群／
時点）。サンプルをＥＤＴＡ含有試験管中（Microtainer, Becton Dickinson, F
ranklin Lakes, NJ）で遠心し、血漿エンドスタチンレベルをＥＩＡによって測
定した。

【０１１２】エンドスタチンのインビボ活性処置実験では、マウスに２００ＶｉＬＰＢＳ中の１０６ＭＣ３８細胞を皮下
注射した。２日後（処置日０）、およびＩ週間後（処置日７）に再び、１０９ｐ
ｆｕのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたはＡｄ−ｌｕｃまたはウイルスなしで上記の
ようにマウスに注射した（ｎ＝１０動物／処置群）。腫瘍は、処置群を知らない
研究者によって、第０、２、５、７、９、１１および１３日にノギスを用いて二
次元で測定された。腫瘍容量は式：容量＝幅^２ｘ長さｘ０．５２にしたがって計算した。

【０１１３】統計分析データは平均±Ｓ.Ｅ.によって示す。群の間の比較は Mann-Whitney Ｕ試験（
Instat 2.01, GraphPad Software）を用いて行い、０．０５より小さい両側ｐ値
を有意であると考えた。

【０１１４】上記のように、Ｅ３／１９Ｋシグナル配列によって先行されるマウスエンドス
タチン遺伝子（１４）をアデノシャトルプラスミドにクローニングし、組換えＡ
ｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを作成した（図８ａ）。２９３細胞の感染（ここにＥＩ−
欠失アデノウイルスは複製可能である）は、ＭＯＩ１００で９２０±３３ｎｇ／
ｍＬまでの上清エンドスタチン濃度の用量依存性増加を生じた（図８ｂ）。Ａｄ
−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ感染細胞上清のウエスタンブロッティングは、組換えマウス
エンドスタチンのものと同一の、単一の移動度のバンドを示した（図８ｃ）。次
いでヒト黒色腫細胞（ここにＥＩ−欠失アデノウイルスは複製不能である）にＡ
ｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたはＡｄ−ｌｕｃを感染させた。上清エンドスタチンレ
ベル（図９ａ）および上清サンプルの内皮細胞増殖阻害能（図９ｂ）を評価した
。６１±４％（Ａｄ−ｌｕｃ感染細胞由来の上清中では２５±４％に対して、ｐ
＝０．０００６）までの用量依存性の阻害増加が観察された。

【０１１５】次いでＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏがインビボでエンドスタチンを生産する能力を
評価した。１０^９ｐｆｕのＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを服用したマウスは１００％
の生存性を示し、健康であることが観察された。剖検では軽い肝腫大のみが示さ
れた。１０^１０ｐｆｕを服用後、６０％のマウスが死亡した。生存するマウスは
著しく嗜眠性であり、剖検では、過度のマクロ結節状の変化および胆汁性腹水を
伴う大量の肝腫大が示された。他の器官は毒性の徴候を示さなかった。これらの
発見は既知の高用量アデノウイルスの肝毒性（１５）と一致する。したがって、
１０^９ｐｆｕの投与後に循環エンドスタチンレベルを評価した（図１０）。ベー
スライン血漿エンドスタチンレベルはすべての時点でＡｄ−ｌｕｃおよび塩類溶
液処置動物の間で同様である（すべての時点の平均はそれぞれ５５ｎｇ／ｍＬお
よび５７ｎｇ／ｍＬ）。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ感染後のピーク発現は注射４日
後に観察され、この時点で血漿濃度は１７７０±２９２ｎｇ／ｍＬ（範囲１１８
０ｎｇ／ｍＬ〜３１３７ｎｇ／ｍＬ）であった。第１３日では、残存する血漿レ
ベルは有意に上昇した（Ａｄ−ｌｕｃ処置動物における５６±１２ｎｇ／ｍＬに
対して１８７３９ｎｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０４１）。達成されたピーク循環レベ
ルは、以前に非ウイルスベクターを用いて報告されたものより５０〜２００倍高
かった。

【０１１６】腫瘍直接性よりむしろ、全身性の抗血管形成性遺伝子治療の原理を最良に評価
するために、アデノウイルス感染および遺伝子発現に対して比較的耐性のマウス
腫瘍セルラインを選択した。マウス肝細胞はＭＯＩ１００のＡｄ−β−ｇａｌ
に容易に感染した（図１１ａ）が、ＭＣ３８腺癌細胞は時々青色染色を示すに過
ぎなかった（図１１ｂ）。２週間のインビボ処置モデルにおいて、上に記載のエ
ンドスタチン発現のタイムコースに基づいて、２週間の処置を施した。任意の時
点で、Ａｄ−ｌｕｃおよび塩類溶液処置動物間における腫瘍サイズの有意な変化
は存在しなかった（図１１ｃ）。Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ処置動物の平均腫瘍サ
イズは第５日以後、いずれのコントロール群のものよりも小さかった。この差異
は、実験の最後（第１３日）において最も著しく、この時点で、塩類溶液処置動
物と比較してポイント４０％の腫瘍増殖阻害が観察された（ｐ＝０．０１２）。
いずれの動物においても毒性は観察されなかった。

【０１１７】この実験は、アデノウイルスベクターを用いるエンドスタチン遺伝子治療の最
初のインビボ報告であり、高い循環エンドスタチンレベルに関連する腫瘍増殖の
阻害が、腫瘍直接性（tumor-directed）遺伝子輸送に比較的耐性である腫瘍モデ
ルにおいて示された。

【０１１８】実施例ＩＩＩ投与様式循環エンドスタチンレベルを最適化するために、マウスエンドスタチン遺伝子
有するアデノウイルスベクター（Ａｄ−Ｅｎｄｏ）の４経路の投与を比較した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各時点でｎ＝５〜６／群）を１０^９プラーク形成単位の
Ａｄ−Ｅｎｄｏまたはコントロールアデノウイルスで、静脈内（Ｉ.Ｖ.）、腹腔
内（Ｉ.Ｐ.）、脾臓内（Ｉ.Ｓ.）または鼻腔内（Ｉ.Ｎ.）投与によって処置した
。注射２、４、８および１２日後、拮抗免疫アッセイ（competitive immunoassa
ry）を用いて血漿エンドスタチング（endostating）レベルを測定した。コント
ロールマウスにおけるベースライン血漿レベルはすべての投与経路に関して同様
であった（平均４７ｎｇ／ｍＬ）。Ｉ.Ｖ.ウイルスは最も高いエンドスタチンレ
ベル（＞２０００ｎｇ／ｍＬ）を生産し、これは１２日を通して有意に上昇し続
けた（４８ｎｇ／ｍＬに対して３２１、ｐ＝０．００２、Mann-Whitney Ｕ試験
）（図１２）。Ｉ.Ｓ.注射はコントロールより高く、Ｉ.Ｖ.注射で達成されたも
のより低いエンドスタチンレベルを生産した。Ｉ.Ｐ.およびＩ.Ｎ.注射はエンド
スタチンレベルに対して最小の効果であるか、あるいは効果がなかった。したが
って、マウスエンドスタチング導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスは、マ
ウスにおいて、持続された、潜在的治療的循環レベルのエンドスタチンを導くこ
とができ、最も高いレベルはＩ.Ｖ.投与後に生じる。

【０１１９】実施例ＩＶ腫瘍性マウス肝細胞のエンドスタチンでのレトロウイルス形質導入腫瘍性マウス肝セルライン、ＮｍｕＬｉをマウスエンドスタチン遺伝子で形質
導入し、抗血管形成遺伝子輸送の腫瘍増殖阻害能に関して試験した。ｐＥＦ−ｎ
ｕｌｌプラスミドを用いて複製不適格レトロウイルスを生産した。エンドスタチ
ン遺伝子をマウス肝臓からクローニングし、ｐＥＦ−ｎｕｌｌ中にクローニング
し、ｐＥＦ−Ｅｎｄｏを創出した。ＮｍｕＬｉ細胞をｐＥＦ−ｎｕｌｌまたはｐ
ＥＦ−Ｅｎｄｏ誘導化レトロウイルスで形質導入し、Ｇ４１８中で選択した。４
つのエンドスタチング誘導化クローンを増幅し、上清エンドスタチンをウエスタ
ンブロッティングおよび拮抗酵素免疫アッセイによってアッセイした。無胸腺症
のヌードマウス（ｎ＝８／群）に５×１０^５ＮｍｕＬｉ細胞、ｐＥＦ−ｎｕｌ
ｌ形質導入細胞（ＮＥＦ−ｎｕｌｌ）または種々の量のエンドスタチンを発現す
るクローン（ＮＥＦ−Ｅｎｄｏ１〜４）でＳ.Ｑ.注射した。式：ｖ＝ｗ^２ｘｌｘ
π／６によって腫瘍容量を計算した。ＮＥＦ−Ｅｎｄｏクローンは２２３ｎｇ／
ｍＬまでの上清エンドスタチンレベルを生産した（ＮＥＦ−ｎｕｌｌ上清におけ
る２０ｎｇ／ｍＬに対して）（図１３）。注射２６日後、ＮＥＦ−ｎｕｌｌ腫瘍
は、ＮＥＦ−Ｅｎｄｏクローン由来の腫瘍より有意に大きかった（ｐ＜０／００
０１、Kruskal-Wallis 試験）。腫瘍性マウス肝細胞のエンドスタチン遺伝子で
のレトロウイルス形質導入は、腫瘍増殖を阻害するのに十分活性な機能性エンド
スタチンの分泌を導く。

【０１２０】本明細書を通して、種々の刊行物が引用されている。本発明が属する分野の技
術水準をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示内容、およびその中
に引用されている参考文献はそのすべてが引用により本明細書中に包含される。

【０１２１】参考文献

【表１】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はｐＳＳｍｅｎｄｏ−６（ＫｏｚａｃｋおよびＥ１９シグナ
ル配列を含むマウスエンドスタチン）およびｐＡｄＣＭＶから構築されたＳＫＬ
−３５プラスミドを示す。

【図２】図２はｐｋｍｅｎｄｏ−２（Ｋｏｚａｃｋを有するマウスエンド
スタチン）およびｐＡｄＣＭＶから構築されたＳＫＬ−２２プラスミドを示す。

【図３】図３はインビボにおけるＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏの抗腫瘍効果を
示す。

【図４】図４は２９３細胞のアデノウイルス感染後の上清エンドスタチン
レベルを示す。

【図５】図５は２９３細胞のアデノウイルス感染後の上清エンドスタチン
レベルを示す。

【図６】図６はＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ対Ａｄ−Ｌｕｃウイルス上清イン
キュベーション後の肺微小血管内皮細胞の阻害を示す。

【図７】図７は１０^９ｐｆｕアデノウイルス腹腔内注射５日後のヌードマ
ウスにおける血漿エンドスタチンレベルを示す。

【図８】図８ａはマウスエンドスタチン遺伝子を含むアデノウイルス構築
物の模式図である。図８ｂは、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏまたはコントロールアデノウイルス（Ａｄ
−ｌｕｃ）を用いて種々の感染多重度で感染させた２９３細胞であって、Ａｄ−
ｓｓ−Ｅｎｄｏ感染後、９２０±３３ｎｇ／ｍＬまでの用量依存性の上清エンド
スタチン濃度を生産するものを示す。図８ｃは、細胞由来の上清のウエスタンブロットを示し、ここに、Ａｄ−ｌｕ
ｃ（レーン６）ではなくＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ（レーン７）で感染させた細胞
は約２０ｋＤバンドを示した。レーン１〜５、組換えマウスエンドスタチンの２
倍希釈物（１０００ｎｇ／ｍＬ〜６２．５ｎｇ／ｍＬ）。

【図９】図９ａはＡｄ−ｓｓ−Ｅｎｄｏで感染させたヒト黒色腫細胞は、
上清中、用量依存性のエンドスタチン濃度を生じさせたことを示す。図９ｂは上清の５倍希釈物が、非感染細胞由来の上清と比較してウシ内皮細胞
の増殖を６１±４％まで阻害したことを示す。

【図１０】図１０は、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏの一回の静脈内注射２〜１
３日後の血漿エンドスタチンレベルを示す。レベルは４日の時点で１７７０±２
９２ｎｇ／ｍＬであり、１３日の時点でのコントロールより有意に高いままであ
った。

【図１１】図１１ａはマウス肝細胞がＡｄ−β−ｇａｌによって容易に感
染されることを示す。図１１ｂはＭＣ３８腫瘍細胞が同一感染多重度におけるアデノウイルス感染に
対して比較的耐性であることを示す。図１１ｃは、二週間の処置実験の終わりまでに、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを服
用したマウスにおける腫瘍はコントロールより４０％小さかったことを示す。

【図１２】図１２はエンドスタチン遺伝子を有するアデノウイルスベクタ
ーをＩＶ投与すると高エンドスタチンレベル（＞２０００ｎｇ／ｍＬ）が生じる
ことを示す。

【図１３】図１３は腫瘍性マウス肝細胞を、エンドスタチン遺伝子を有す
るレトロウイルスで形質導入すると、腫瘍増殖を阻害するのに十分な活性を有す
るエンドスタチンが分泌されることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８４ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ４Ｃ０８７Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:93 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アンドリュー・フェルドマンアメリカ合衆国20770メリーランド州グリーンベルト、グリーンブルック・ドライブ 7713番Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA03 EA02 GA11 HA11 HA17 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ03 QQ08 QR79 QS33 QX02 4B064 AG01 CA10 CA12 CA19 CD20 DA03 DA13 4B065 AA91Y AA93X AA93Y AA95X AA97X AB01 AC20 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA13 BA01 BA18 BA44 CA53 DA12 DA40 NA14 ZB262 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウイルス核酸内に挿入された抗血管形成タンパク質をコード
する組換え核酸を含む化合物であって、ここに該組換え核酸はウイルス粒子内に
パッケージング可能であり、ここに、該抗血管形成タンパク質をコードする組換
え核酸が発現すると、該抗血管形成タンパク質が生産される化合物。
【請求項２】ウイルス核酸がアデノウイルス核酸を含む、請求項１に記載
の化合物。
【請求項３】ウイルス核酸がレトロウイルス核酸を含む、請求項１に記載
の化合物。
【請求項４】抗血管形成タンパク質がエンドスタチンを含む、請求項１に
記載の化合物。
【請求項５】抗血管形成タンパク質がトロンボスポンジンを含む、請求項
１に記載の化合物。
【請求項６】抗血管形成タンパク質がＥＭＡＰ−ＩＩを含む、請求項１に
記載の化合物。
【請求項７】抗血管形成タンパク質がＩＰ−１０を含む、請求項１に記載
の化合物。
【請求項８】抗血管形成タンパク質がアンギオスタチンを含む、請求項１
に記載の化合物。
【請求項９】抗血管形成タンパク質がバソスタチンを含む、請求項１に記
載の化合物。
【請求項１０】抗血管形成タンパク質がバスキュロスタチンを含む、請求
項１に記載の化合物。
【請求項１１】抗血管形成タンパク質がＩＬ−１２を含む、請求項１に記
載の化合物。
【請求項１２】抗血管形成タンパク質が血小板因子４を含む、請求項１に
記載の化合物。
【請求項１３】抗血管形成タンパク質がコラーゲンＶＩＩＩの分解産物を
含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】抗血管形成タンパク質がコラーゲンＸＶの分解産物を含む
、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】抗血管形成タンパク質がレスタチンを含む、請求項１に記
載の化合物。
【請求項１６】組換え核酸が複製不全である、請求項２に記載の化合物。
【請求項１７】組換え核酸が複製不全である、請求項３に記載の化合物。
【請求項１８】請求項２に記載の化合物を含むアデノウイルス。
【請求項１９】請求項３に記載の化合物を含むレトロウイルス。
【請求項２０】抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸と作動可能
に連結されたシグナル配列をコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の化
合物。
【請求項２１】シグナル配列がアデノウイルスＥ１９シグナル配列を含む
、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】配列が、アミノ酸配列：ＭＲＹＭＩＬＧＬＬＡＬＡＡＶＣ
ＳＡＡを含むアミノ酸配列をコードする、請求項２１に記載のシグナル配列。
【請求項２３】抗血管形成タンパク質を細胞にデリバリーする方法であっ
て、該細胞に、請求項１８に記載のアデノウイルスまたは請求項１９に記載のレ
トロウイルスを投与し、これにより組換え核酸が発現すると、抗血管形成タンパ
ク質が生産され、これにより該抗血管形成タンパク質が該細胞にデリバリーされ
ることを含む方法。
【請求項２４】細胞が抗血管形成タンパク質をエクスビボで投与される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】細胞が抗血管形成タンパク質をインビボで投与される、請
求項２３に記載の方法。
【請求項２６】細胞が抗血管形成タンパク質を培養中で投与される、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２７】細胞がヒト肝細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】細胞が肺細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】抗血管形成タンパク質を被検体にデリバリーする方法であ
って、該被検体に、請求項３に記載のアデノウイルスを投与し、これにより被検
体の細胞は抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を発現し、これにより
該抗血管形成タンパク質が該被検体にデリバリーされることを含む方法。
【請求項３０】被検体の腫瘍を処置する方法であって、該被検体に、請求
項１８に記載のアデノウイルスまたは請求項１９に記載のレトロウイルスを投与
し、これにより被検体の細胞は抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を
発現し、抗血管形成性物質を生産し、これにより腫瘍が処置されることを含む方
法。
【請求項３１】抗血管形成タンパク質の生産方法であって、細胞に、請求
項１８に記載のアデノウイルスまたは請求項１９に記載のレトロウイルスを投与
し、これにより組換え核酸が発現すると抗血管形成タンパク質が生産されること
を含む方法。
【請求項３２】抗血管形成タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニン
グする方法であって、ａ．第一の細胞に、抗血管形成タンパク質をコードする組換え核酸を含むウイル
スを投与し、ここに第一の細胞は該抗血管形成タンパク質をコードする組換え核
酸を発現し、これにより該抗血管形成タンパク質が発現され；ｂ．第二の細胞を該抗血管形成タンパク質と接触させ；ならびに、ｃ．該第二の細胞を該抗血管形成タンパク質に対する生物学的応答に関してモニ
ターし、これにより該抗血管形成タンパク質をバイオ活性に関してスクリーニン
グすることを含む方法。
【請求項３３】抗血管形成タンパク質を第一の細胞から回収した後に、第
二の細胞を該抗血管形成タンパク質と接触させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】抗血管形成タンパク質を生産する第一の細胞を第二の細胞
に投与する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】第一の細胞および第二の細胞が同一細胞タイプである、請
求項３２に記載の方法。
【請求項３６】第一の細胞および第二の細胞が異なる細胞タイプである、
請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】抗血管形成タンパク質およびシグナル配列を含むタンパク
質。
【請求項３８】シグナル配列がアデノウイルスシグナル配列である、請求
項３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】アデノウイルスシグナル配列がアデノウイルスＥ１９シグ
ナル配列である、請求項３８に記載のタンパク質。