JPH08505522A - キシリトールの製造のための組換え方法および宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キシリトールの合成のための新規方法が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 キシリトールの製造のための組換え方法および宿主関連出願の相互参照 本件出願は1992年11月５日付で提出された米国出願第07/973,325号の一部継続 出願である。 発明の背景 １．発明の分野 本願発明は一般に、有用な化合物を製造するために遺伝子的に修飾された微生 物を使用する方法（代謝工学）に関するものであり、そして更に詳細には、容易 に入手可能な炭素源、例えばＤ−グルコースを一層価値のある産生物、例えばキ シリトールに変換し得る微生物株を遺伝子操作によって構築することに関するも のである。 ２．関連技術 キシリトールは特別の甘味料としてかなり価値のある化合物である。これはス クロースとほぼ同じくらい甘く、非毒性でありそして非発癌性である。 現在、キシリトールはＤ−キシロースの化学的水素添加によって製造されてい る。Ｄ−キシロースは、他のペントースやヘキソースと共に常に混合して存在し ている種々の植物材料の加水分解物から得られる。それ故、キシロースの精製そ して更にはキシリトールの精製も重要な課題を提供する。多数のこのタイプの方 法が知られている。米国特許3,784,408、4,066,711、4,075,406および4,008,285 を例として述べることができる。 Ｄ−キシロースからキシリトールへの還元はまた、自然界から単離された株（ Barbosa，M．F．S．等、J．In dustrial Microbiol．3：241〜251（1988年）） かまたは遺伝子的に処理した株（Hallborn，J．等、Biote chnology 9：1090〜1 095（1991年））のいずれかを使用する微生物学的方法で達成することもできる 。しかし乍ら、パルプや紙の処理から得られる亜硫酸塩溶液のような安価なキシ ロース源は酵母増殖を阻止する不純物を含有しているので、基質、即ちＤ−キシ ロースを酵母発酵に適する形態で得ることも重要な課題である。 キシリトールの別の興味ある製造方法は、安価であり且つ容易に入手可能な基 質、例えばＤ−グルコースの発酵によってキシリトールを得ることであろう。し かし乍ら、共にキシリトールに構造的に非常に密接な関係があるＤ−キシロース およびＤ−キシルロース以外の通常の炭素源の１段階発酵中に、かなりの量のキ シリトールを産生する微生物は知られていない。 他方、多数の微生物、特に高浸透圧親和性酵母、例えばジゴサッカロミセス ルキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンジダ ポリモルファ（Candida po lymorpha）およびトルロプシス カンジダ（Torulopsis candida）はかなりの量 の密接に関係のあるペンチトール、Ｄ−アラビトールをＤ−グルコースから産生 する（Lew is D．H．およびSmith D．C．、New Phytol．66：143〜184（1967年 ））。この高浸透圧親和性酵母を使用し て、Ｈ．オーニシ（Onishi）およびＴ．スズキ（Suzuki）は３つの連続した発酵 によってＤ−グルコースをキシリトールに変換する方法を開発した（Appl．Micr obiol．18：1031〜1035（1969年））。この方法においては、高浸透圧親和性酵 母株による発酵でＤ−グルコースを先ずＤ−アラビトールに変換した。次に、ア セトバクター サブオキシダンス（Acetobacter suboxydans）による発酵でＤ− アラビトールを酸化してＤ−キシルロースにした。最後に、Ｄ−キシルロースを キシリトールに還元できる多数の酵母株のうちの１つを使用して３番目の発酵で Ｄ−キシルロースをキシリトールに還元した。 この方法の明白な欠点は、それぞれ２乃至５日間を要する３つの異なる発酵段 階に係わっていることであり、そして滅菌および細胞除去のような更に追加的な 段階も必要になるので処理費用が増加することである。この段階的発酵方法の収 量は低くそして副産生物量が多い。それ故、容易に入手可能な基質から、微生物 系でキシリトールを経済的に産生する方法の需要が依然として存在している。 発明の要約 本願発明は組換え体宿主を構築する方法および該方法によって構築された組換 え体宿主を提供する。このような宿主はＤ−キシルロースまたはＤ−キシロース 以外の、そしてポリマー若しくはオリゴマーまたはそれらの混合物以外の炭素源 で増殖させたとき、キシリトールを産生 することができる。本発明の宿主によって使用される炭素源は安価で且つ容易に 入手可能である。本発明の微生物はまた、合成されたキシリトールを培養培地中 に分泌することもできる。この目的は、所望の異種遺伝子を導入しそして発現さ せることによって、所望の微生物、好ましくは天然に発生する酵母微生物の代謝 を修飾することによって達成される。この目的はまた、天然状態の上記の所望の 微生物に同種の或る遺伝子の活性または発現を過剰発現させおよび／または不活 性化させるように、上記微生物の代謝を更に修飾することによっても達成される 。 それ故、本発明の１つの目的は、新規微生物株、即ち本願明細書で遺伝子処理 微生物とも称する新規の組換え体宿主を上記キシリトールの産生体として利用す るキシリトールの産生方法を提供することであり、その際上記遺伝子処理微生物 は、天然の処理していない微生物と比べたとき、新規（de novo）にかまたは増 加した量かのどちらかで上記キシリトールを産生する。 本発明の更にもう１つの目的は、微生物中に処理されている新規な代謝経路を 利用するキシリトールの産生方法を提供することであり、そして該方法はこのよ うな微生物によってキシリトールの新規産生または産生増加をもたらす。 本発明の更にもう１つの目的は、上記したような新規代謝経路を使用しそして Ｄ−アラビトール生合成および ／または代謝経路を修飾しているキシリトールの産生方法を提供することであり 、その際上記経路は、非修飾宿主がＤ−アラビトールの生合成に利用する炭素源 を発酵させることによって微生物がキシリトールを産生するように修飾されてい る。本発明の更にもう１つの目的は、Ｄ−アラビトール生合成用の以前から存在 する経路（Ｄ−アラビトールを利用する追加的な段階を有する）を拡張するかま たはＤ−アラビトール経路の１つ若しくはそれより多い段階をキシリトールを形 成する同様な段階で置換することによって改変されている上記の改変Ｄ−アラビ トール経路を利用するキシリトールの産生方法を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的は、Ｄ−キシロースを形成するＤ−アラビトール デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.11）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.9）をコードする遺伝子をＤ−アラビトール産生微生物中に導入しそし て過剰発現させることによって以前から存在するＤ−アラビトール経路を拡張す ることによって改変されている上記の改変Ｄ−アラビトール生合成経路を利用す るキシリトールの産生方法を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的は、上記のような新規微生物を使用し、そしてこ のような微生物中のトランスケトラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）をコードする遺伝子ま たはＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）をコードする遺 伝子を、化学的誘発突然変異または遺伝子破壊を使用して不活性化することによ って更に改変されている上記の改変Ｄ−アラビトール生合成経路を利用するキシ リトールの産生方法を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的は、上記のような新規微生物を使用し、このよう な微生物中のペントース−ホスフェート経路の酸化部分の酵素、特にＤ−グルコ ース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.49）および／または６ −ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.44）をコードする 遺伝子の、遺伝子的に処理して改変された過剰発現を利用するキシリトールの産 生方法を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的は、上記のような新規微生物を使用し、ペントー ス−ホスフェート経路の酸化部分の酵素をコードする遺伝子並びにＤ−リブロー ス−５−ホスフェートエピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1）遺伝子の、遺伝子的に処理 して改変された過剰発現を利用するキシリトールの産生方法を提供することであ る。 図面の簡単な説明 図１は、プラスミドｐＡＲＬ２中の挿入物の制限マップである。この挿入物は クレブシエラ テリゲナ（Klebsiella terrigena）Ｐhp１染色体遺伝子座のもの であり、そしてＫ．テリゲナ Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有 している。白箱部分はＫ．テリゲナ染色体ＤＮＡを表わす。矢印はこのＤＮＡ中 のＤ−アラ ビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.11）遺伝子の位置および方向を示す。 図２は、ｐＡＤＨおよびｐＡＡＨ５から得られるｐＹＡＲＤの構築を示す。プ ラスミド略図において、１本線（−）は細菌の配列を示し、波線はＳ．セレビシ エ（ｃ ＣＩプロモーター（ＡＤＣＩ遺伝子はＳ．セレビシエ アルコールデヒドロゲナ ーゼまたはＡＤＣＩをコードし、正式にはＡＤＨＩと呼ばれる）を示し、白ダイ ヤモンド印（◇）はＡＤＣＩ転写ターミネーターを示し、長方形ブロックはＬＥ Ｕ２遺伝子を示し、そして網掛け矢印はＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝 子を示す。 図３は、プラスミドｐＪＤＢ（ＡＸ）−16の構築を示す。ＸＹＬ２はピチア スチピチス（Pichia stipitis）から得られるキシリトールデヒドロゲナーゼ遺 伝子である。ｄａ１ＤはＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子である。ＡＤ ＣＩはＡＤＣＩ遺伝子の転写調節領域（プロモーター）であり、これはｄａ１Ｄ コード化配列に先行しそして該配列に作用し得るように結合される。記号は図４ と同一ではない。プラスミド略図において、１本線（−）は細菌配列でありそし て２μｍＤＮＡと記されている場所ではそれを示し、黒矢印はＡＤＣ１プロ 転写ターミネーターを示し、長方形ブロックはＬＥＵ２マーカー遺伝子を示し、 網掛け矢印はＸＹＬ２遺伝子を 示し、そして斜線長方形はｄａ１Ｄ遺伝子を示す。 図４は、大腸菌−Ｚ．ルキシイ シャトルベクターｐＳＲＴ（ＡＸ）−９の構 築を示す。記号は図３と同じである。 図５は、クローン化したＴ．カンジダｒＤＮＡフラグメントの転写マップを示 す。 図６はプラスミドｐＴＣ（ＡＸ）の構築を示す。 図７はクローン化したＴ．カンジダｒＤＮＡフラグメントの転写マップを示す 。 図７ａはプラスミドｐＣＰＵ（ＡＸ）の構築を示す。 図８はＺＷＦ１およびｇｎｄ遺伝子のクローニングを示す。 図８ａはＰＡＡＨ（ｇｎｄ）プラスミドの構築を示す。 図９はプラスミドｐＳＲＴ（ＺＧ）の構築を示す。 図１０は、発酵器中でのＺ．ルキシイ株ＡＴＣＣ13356［ｐＳＲＴ（ＡＸ）−0 9］の培養を示す。 図１１は、発酵器中でのＺ．ルキシイ株ＡＴＣＣ13356［ｐＳＲＴ（ＡＸ）− ９］から誘導した変異株の培養を示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 Ｉ．定義 以下の説明では、組換えＤＮＡ技術で使用される多数の用語を広範囲に使用す る。本願明細書および請求の範囲を明確に一貫して理解するために、上記用語で 示される範囲を含めて、以下の定義を提供する。 キシロースまたはキシルロース以外の炭素源。本願明細書で使用するとき、「 Ｄ−キシロースおよびＤ−キシルロース以外の炭素源」はＤ−キシロースおよび Ｄ−キシルロース或いはそれらのポリマー若しくはオリゴマーまたは混合物（例 えば、キシランおよびヘミセルロース）以外のキシリトール産生用の炭素基質を 意味する。炭素源は好ましくは、本発明の遺伝子的に処理した微生物宿主の増殖 および酵母宿主中の発酵を支持する。本願発明の微生物宿主でキシリトールを産 生するための炭素源として多数の安価で容易に入手できる化合物を使用すること ができ、これらにはＤ−グルコースおよび種々のＤ−グルコース含有シロップ並 びにＤ−グルコースと他の糖との混合物が含まれる。酵母や真菌を含む本発明の 宿主が同化できる他の糖、例えば種々のアルドヘキソースおよびケトヘキソース （例えば、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−マンノース）並びに それらのオリゴマーおよびポリマー（例えば、スクロース、ラクトース、澱粉、 インスリンおよびマルトース）はこの用語に含めるように意図されている。キシ ロースやキシルロース以外のペントース並びにグリセロール、エタノール、種々 の植物油または炭化水素（好ましくは、14〜16個の炭素原子を有するｎ−アルカ ン）のような非炭水化物炭素源もこの用語に含めるように意図されている。本願 発明の宿主によるキシリトール産生用基質として有用な炭素源の範囲は微生物宿 主に従って変動する。例え ば、グルコースおよびグルコース含有シロップは本発明の遺伝子操作したジゴサ ッカロミセス ルキシイによるキシリトール産生用の好ましい炭素源であり、一 方、好ましくは14〜16個の炭素原子を有するｎ−アルカンは修飾されたカンジダ トロピカリス（tropicalis）株用の好ましい炭素源である。 遺伝子。ＲＮＡポリメラーゼ用鋳型を含有するＤＮＡ配列。遺伝子から転写さ れたＲＮＡはタンパク質をコードすることができるか、またはコードすることが できない。タンパク質をコードするＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ） と呼称され、そして真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写さ れる。特異的なｍＲＮＡの配列と相補的であるが通常は翻訳されない配列を有す るＲＮＡ配列が転写されているＲＮＡポリメラーゼII鋳型（ＲＮＡポリメラーゼ IIプロモーターの結果として）を含有する遺伝子も構築することができる。この ような遺伝子構築物は本願明細書では「アンチセンスＲＮＡ遺伝子」と呼称し、 そしてこのようなＲＮＡ転写物は「アンチセンスＲＮＡ」と呼称する。アンチセ ンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ配列中に翻訳停止コドンが存在するため通常 翻訳されることはない。 「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」遺伝子は、例えばｍＲＮＡの逆転写によ って合成される組換え遺伝子を含有しているので、介在配列（イントロン）を欠 いている。 クローニングビヒクル。遺伝情報、特にＤＮＡを宿主細胞内に運ぶことができ るプラスミド若しくはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。クローニングビヒ クルはしばしば１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴としており 、そしてこのようなＤＮＡ配列は上記部位でビヒクルの本質的な生物学的機能を 損失させないで測定可能な態様で切断でき、そして宿主細胞中へのクローニング を生起させるために上記部位に所望のＤＮＡをスプライシングすることができる 。クローニングビヒクルは更に、クローニングビヒクルで転写された細胞の同定 に使用するのに適当なマーカーおよび１つまたはそれより多い原核または真核宿 主中でのビヒクルの維持および複製を可能にする複製起点を含有している。例え ば、マーカーはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。用語「ベ クター」はときには「クローニングビヒクル」に使用される。「プラスミド」は クローニングビヒクルであり、一般的には、少なくとも１つの宿主細胞中で維持 されそして自動的に複製する環状ＤＮＡである。 発現ビヒクル。クローニングビヒクルに類似しているが宿主中への形質転換後 にその中にクローン化されている遺伝子の発現を支持するビヒクルまたはベクタ ー。クローン化した遺伝子は通常、ビヒクルまたはクローン化した遺伝子の組換 え体構築物が提供し得るプロモーター配列のような或る種の制御配列の（即ち、 該配列と作用 し得るように結合した）制御下に置かれる。発現制御配列は、ベクターが原核ま たは真核生物宿主中で作用し得るように結合された遺伝子を発現するように設計 されているかどうか、そしてエンハンサーエレメント（上流の活性化配列）およ び終結配列、および／または転写開始および終結部位のような転写エレメントを 追加的に含有しているかどうかによって変動する。 宿主。宿主は組換え体材料の受容体および担体として使用される原核または真 核細胞である。 本発明の宿主。「本発明の宿主」は、Ｄ−キシロース若しくはＤ−キシルロー ス或いはそれらのポリマー若しくはオリゴマーまたは混合物以外の通常の炭素源 から発酵中にキシリトールを天然にはそれほど産生しないが本発明の方法によっ てかなりの量のキシリトールを産生するように処理されている微生物宿主である 。「かなりの量」によって、純粋な形態のキシリトールを単離するのに適当な量 または微生物発酵ブイヨン中で炭水化物の分析に通常使用される分析方法で信頼 度をもって測定することができる量を意味する。 アラビトールデヒドロゲナーゼ。２つのタイプのＤ−アラビトールデヒドロゲ ナーゼが存在する：Ｄ−キシルロース形成（ＥＣ 1.1.11）およびＤ−リブロー ス形成。Ｄ−リブロース形成デヒドロゲナーゼは野生タイプの酵母および真菌中 に見られる。Ｄ−キシルロース形成アラビトールデヒドロゲナーゼは細菌中にし か知られていな い。他に記載しない限り、本願明細書で意図されそしてアラビトールデヒドロゲ ナーゼとして本願明細書で称されるのはＤ−キシルロース形成アラビトールデヒ ドロゲナーゼである。 ペントース−ホスフェート経路の酸化的部分。「ペントース−ホスフェート経 路の酸化的部分」によって、酸化反応、例えばＤ−グルコース−６−ホスフェー ト デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.49）および６−ホスホ−Ｄ−グルコネート デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.44）で触媒される反応を触媒しそしてヘキソ ース基質を利用してペントースホスフェートを形成するペントースーホスフェー ト分路の部分を含めるように意味する。ペントースホスフェート経路の「非酸化 的」部分（これはＤ−グルコースからリボースの正味形成も触媒する）は、リボ ース−５−ホスフェート イソメラーゼ、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート− ３−エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼによって触媒される反応のような 非酸化的異性化を特徴とする。バイオロジカル ケミストリー（Biological Che mistry）、H．R．マーラー（Mahler）およびB．H．コーデス（Cordes）、発行者 、ハーパー アンド ロウ（Harper & Row）、ニューヨーク、1966年、448〜454 頁参照。 機能的誘導体。タンパク質または核酸の「機能的誘導体」は、上記タンパク質 または核酸から化学的または生化学的に誘導され（から得られ）そして上記天然 タンパ ク質または核酸の特徴である生化学的活性（機能的かまたは構造的のどちらかの ）を保持している分子である。用語「機能的誘導体」は、天然分子の所望の活性 を保持している分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または「化学 的誘導体」を含むように意図されている。 本願明細書で使用するとき、分子が通常は該分子の部分ではない追加的な化学 的部分を含有しているとき、分子は別の分子の「化学的誘導体」であると言われ る。このような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善するこ とができる。これらの部分は分子の毒性を低下させることができるか、或いは分 子の所望しない副作用などを消失させるかまたは弱めることができる。このよう な効果を介在し得る部分はレミントンズ ファーマシューチカル サイエンシズ （Remington's Pharmaceutical Sciences）（1980年）に開示されている。この ような部分を分子と結合させる方法は当該技術分野で良く知られている。 フラグメント。タンパク質または核酸のような分子の「フラグメント」は天然 のアミノ酸またはヌクレオチド遺伝子配列の部分、そして特に本発明の機能的誘 導体を称するように意味する。 変異体または類似体。タンパク質または核酸の「変異体」または「類似体」は 、機能的対立形質遺伝子によってコードされる分子のような天然分子のいずれか と構造 および生物学的活性が実質的に類似している分子を称するように意味する。 II．キシリトール生合成用代謝経路の構築 本発明に従って、キシリトール産生以外の目的での炭素利用を減少させるかま たは排除させるように微生物宿主の天然の代謝経路が操作される。本発明の宿主 は全て、１つの発酵段階でキシリトールを産生する。１つの実施態様では、本発 明の宿主はキシリトールを産生するのに十分なキシリトールデヒドロゲナーゼ（ ＥＣ 1.1.1.9）活性を保有することができる。しかし乍ら、以下に記載するよう に、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を過剰産生することが望ましい宿主では 、キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする組換え体遺伝子を宿主細胞中に形 質転換することができる。 本発明の具体的な実現においては、本発明の宿主は全て、Ｄ−グルコースのよ うな構造的に関係のない炭素源からであり、そして正にＤ−キシロースおよび／ またはＤ−キシルロースからではなく、キシリトールを合成し得ることを特徴と している。 詳細には、例示され且つ好ましい実施態様では、本発明の宿主は２つの経路の うちの１つを特徴とする。第１には、アラビトールがキシリトール形成の中間体 である経路、そして第２には、脱リン酸化および還元反応によってキシルロース −５−ホスフェートがキシリトール形成に向けられている経路。従って、本発明 の宿主は下記 遺伝子改変のうちの少なくとも１つを特徴としている： （１）Ｄ−キシルロース形成Ｄ−アラビトール デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1 .1.11）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化され ており、これによってＤ−アラビトールからＤ−キシルロースへの変換がもたら される（経路Ｉの特徴）；および／または （２）トランスケトラーゼ活性をコードする天然の宿主遺伝子が不活性化され ている（経路IIの特徴）。 加えて、宿主のキシリトール産生能力を高めるように宿主に種々の更なる修飾 を実施することができる。例えば、（１）および（２）に記載した宿主は下記の ように更に修復されていることができる： （３）キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）活性を有するタンパク 質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されている； （３）Ｄ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）をコードする天然の宿主遺伝 子が不活性化されている； （４）Ｄ−グルコース−６−ホスフェート デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.4 9）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されてい る； （４）６−ホスホ−Ｄ−グルコネート デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.44） 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されている； （５）Ｄ−リボース−５−ホスフェート−３−エピメ ラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中に クローン化されている。 好ましい実施態様では、本発明の宿主は１つより多い上記遺伝子改変を有して いる。例えば、好ましい実施態様では、炭素はＤ−アラビトールからＤ−キシル ロース「に直接」（即ち、１段階で）、そしてＤ−キシルロースからキシリトー ル「に直接」流れる。従って、このような実施態様では、本発明の宿主は、Ｄ− キシルロース形成Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を コードする遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）をコー ドする遺伝子が宿主中にクローン化されているように改変されている。多数の実 施態様では、Ｄ−アラビトールは本発明の宿主によって他の炭素源から内部的に 合成されるが、Ｄ−アラビトールは外部から培地に直接添加することもできるこ とに注意しなければならない。 もう１つの好ましい実施態様では、キシリトールの生合成経路は中間体として アラビトールを導入しない。むしろ、炭素は、Ｄ−キシルロース−５−ホスフェ ートからＤ−キシルロース、更にキシリトールに進む。Ｄ−グルコースを炭素源 として使用するとき、炭素は、ペントースホスフェート経路の酸化部分によって 、Ｄ−グルコースからＤ−グルコース−6−ホスフェート、６−ホスホ−Ｄ−グ ルコネート、Ｄ−リブロース−５−ホスフェートに進むであろう。Ｄ−リブロー ス−５−ホスフェー トは更にＤ−キシルロース−５−ホスフェートにエピマー化され、Ｄ−キシルロ ースに脱ホスホリル化され、そしてキシリトールに還元されるであろう。従って 、この実施態様で使用される本発明の宿主には下記の宿主が含まれるであろう： （ａ１）Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.4 9）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されてい るかまたは宿主の天然遺伝子が過剰発現される；および／または （ａ２）６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.44） 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されているか または宿主の天然遺伝子が過剰発現される；および／または （ａ３）Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ活性を有する タンパク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されているかまたは宿主の 天然遺伝子が過剰発現される；および／または （ａ４）キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）活性を有するタンパ ク質をコードする遺伝子が宿主中にクローン化されているかまたは宿主の天然遺 伝子が過剰発現される；および／または （ｂ） 天然のトランスケトラーゼ遺伝子が不活性化されている；および／ま たは （ｃ） キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）活性を コードする天然の宿主遺伝子が不活性化されている。 脱リン酸化段階（Ｄ−キシルロースホスフェートからＤ−キシルロースへの変 換）は、純粋な形態では特徴付けられたことがない酵素によって触媒される唯一 の段階である。しかし乍ら、高浸透圧親和性酵母の天然のＤ−アラビトール形成 経路で同様な段階（Ｄ−リブロース−５−ホスフェートからＤ−リブロースへ） に関与する酵素活性は、非特異性でありそしてキシルロース−５−ホスフェート の脱リン酸化も触媒し得ることが以前に知られていた（Ingram，J．M．およびW ．A．Wood、J．Bacteriol．89：1186〜1194（1965年））。トランスケトラーゼ の突然変異および酸化的ペントースホスフェート経路の２つのデヒドロゲナーゼ の過剰発現は二重の目的に役立つ。第１に、それらは細胞中のリブロース−５− ホスフェート量を増加させ、そしてその結果アラビトールおよびキシリトールの 産生を増加させて経路Ｉの効率を高める。第２に、同じ修飾の組合せから、経路 IIの操作に必要なキシルロース−５−ホスフェートの過剰蓄積も生じる。 それ故に、種々の炭素源からＤ−アラビトールを形成させる天然生起の経路を 使用し、そしてこの経路を更に２つの反応で延長させてＤ−アラビトールをキシ リトールに変換する方法が本発明内の唯一の考えられる経路ではない。最終代謝 産生物としてキシリトールに導きそして中間体としてＤ−アラビトールに係わっ ていない他の 経路を構築することができる。従って、Ｄ−リブロース−５−ホスフェートから キシリトールへの経路は１つより多い反応鎖で達成することができる。Ｄ−リブ ロース−５−ホスフェートは、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメ ラーゼによってＤ−キシルロース−５−ホスフェートに効率良く変換させること ができ、そしてＤ−キシルロース−５−ホスフェートの更なる変換がトランスケ トラーゼ遺伝子の突然変異によって阻止される場合、蓄積したＤ−キシルロース −５−ホスフェートはＤ−リブロース−５−ホスフェートと同じ非特異的ホスフ ァターゼによって脱リン酸化することができ（Ingram，J．M．等、J．Bacteriol ．89：1186〜1194（1965年））、そしてキシリトールデヒドロゲナーゼによって キシリトールに還元することができる。この経路を実現するには更に、無用な循 環：Ｄ−キシルロース−５−ホスフェート→Ｄ−キシルロース→Ｄ−キシルロー ス−５ーホスフェートによるエネルギー損失を最小にするためにＤ−キシルロキ ナーゼ遺伝子の不活性化が必要である。 非特異的ホスファターゼで産生されたＤ−リブロースを捕捉することによって、 上記株によるＤ−アラビトールの同時産生を最小にすることができよう。Ｄ−リ ブロースは元のＤ−リブロース−５−ホスフェート、そして更にはＤ−キシルロ ース−５−ホスフェートに変換される。 III．本発明の宿主の構築 本発明によれば、本発明の宿主を遺伝子的に処理する方法は、当該酵素をコー ドする純粋なタンパク質の単離および部分的配列決定または、上記タンパク質を コードし得る遺伝子配列のポリメラーゼ鎖反応技術によるクローニング、並びに 上記遺伝子配列の発現によって促進される。本願明細書で使用するとき、用語「 遺伝子配列」は核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を呼称するように意図されている 。タンパク質をコードし得る遺伝子配列は多様な供給源から誘導される。これら の供給源にはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの組合せが含ま れる。ゲノムＤＮＡの好ましい供給源は酵母ゲノムライブラリーである。ｃＤＮ Ａの好ましい供給源は、所望のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を誘導すること が知られている条件下で増殖させた酵母ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラ リーである。 本発明のｃＤＮＡが成熟ｍＲＮＡを鋳型として使用して作成された場合、該ｃ ＤＮＡは天然生起のイントロンを含有していない。本発明のゲノムＤＮＡは天然 生起のイントロンを含有していることができるかまたは含有していないことがで きる。更に、このようなゲノムＤＮＡは遺伝子配列の５’プロモーター領域およ び／または３’転写終結領域と連結して得ることができる。更に、このようなゲ ノムＤＮＡは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域をコードする遺伝子配列および／また は３’非翻訳領域 をコードする遺伝子配列と連結して得ることができる。宿主細胞がｍＲＮＡおよ びタンパク質の発現に関連した転写および／または翻訳調節シグナルを認識する ことができる程度にまで、それ故、天然遺伝子の５’および／または３’非転写 領域、および／または、ｍＲＮＡの５’および／または３’非翻訳領域は転写お よび翻訳調節を保持しそして転写および翻訳調節のために使用することができる 。ゲノムＤＮＡは、当該技術分野で周知の手段によって所望のタンパク質を天然 に発現する任意の宿主細胞、特に真菌宿主から抽出しそして精製することができ る（例えば、分子クローニング技術の手引き（Guide to Molecular Cloning Tec hniques）、S．L．Berger等編集、Academic Press（1987年）参照）。好ましく は、使用されるｍＲＮＡ調製物は、大量のタンパク質を産生する細胞から単離す ることによって天然にか若しくは、インビトロで特別の配列用のｍＲＮＡ調製物 を豊富化するために通常使用される技術、例えばスクロース傾斜遠心によって、 またはそれらの両方によって所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡで豊富化さ れよう。 ベクター中にクローニングするために、上記の適当なＤＮＡ調製物（ゲノムＤ ＮＡまたはｃＤＮＡのいずれか）はそれぞれ任意に切断するかまたは酵素開裂し 、そして適当なベクター中に連結して組換え体遺伝子（ゲノムまたはｃＤＮＡの いずれか）ライブラリーを形成する。 所望のタンパク質またはその機能的誘導体をコードす るＤＮＡ配列は慣用の技術に従ってＤＮＡベクター中に挿入することができる。 これら技術には、連結用末端の平滑末端化または付着末端化、適当な末端を提供 するための制限酵素消化、適当な場合付着末端の加入、所望しない結合を回避す るためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによる連結が含ま れる。このような操作技術はマニアチス（Maniatis）T．によって開示されてお り（Maniatis，T．等、分子クローニング（実験室マニュアル）、Cold Spring H arbor Laboratory、第２版、1988年）、そして当該技術分野で良く知られている 。 所望の遺伝子をコードする配列を含有するライブラリーは、そのような遺伝子 またはタンパク質をコードする配列を特異的に選択する任意の手段、例えば、ａ ）このタンパク質のＤＮＡに特異的な配列を含有する適当な核酸プローブとのハ イブリッド形成によって、またはｂ）問題のクローンとハイブリッド形成する天 然ｍＲＮＡをインビトロで翻訳させそして翻訳産生物を更に特徴付ける、ハイブ リッド形成が選択される翻訳分析によって、またはｃ）クローン化された遺伝子 配列自体でｍＲＮＡを発現することができる場合、該クローンを含有する宿主に よって産生された翻訳タンパク質産生物の免疫沈降法によって、スクリーニング しそして所望の遺伝子配列を同定することができる。 或る種のタンパク質のクローンを同定するために使用できる該タンパク質に特 異的なオリゴヌクレオチドプロ ーブはタンパク質のアミノ酸配列に関する知識からかまたはこのようなタンパク 質若しくは関連タンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列に関する知識から設計 することができる。或いは、タンパク質の精製形態に対して抗体を生じさせるこ とができ、そして該抗体を使用して所望のクローン化したタンパク質を発現する 形質転換体中の特有のタンパク質決定因子の存在を確認することができる。本願 明細書ではペプチド中のアミノ酸残基の配列は、通常使用される３文字名称を使 用するかまたは１文字名称によって呼称する。これらの３文字および１文字名称 の表は、バイオケミストリー（Biochemistry）、レーニンガー（Lehninger）A. 、ワースパブリッシャーズ（Worth Publishers）、ニューヨーク州ニューヨーク （1970年）のような教科書中に見ることができる。他に記載しない限り、アミノ 酸配列を水平方向に表示したとき、アミノ末端は左端にあるように意図しそして カルボキシ末端は右端にあるように意図している。同様に、他に記載しないかま たは本文から明白でない限り、核酸配列は５’末端を左側に示す。 遺伝暗号は縮重しているので、１つより多いコドンを使用して特別のアミノ酸 をコードすることができる（Watson，J．D．、遺伝子の分子生物学、第３版、W ．A．Benjamin，Inc.、カリフォルニア州メンロパーク（1977年）、356〜357頁 ）。ペプチドフラグメントを分析して、最も低い縮重度を有するオリゴヌクレオ チドがコ ードし得るアミノ酸配列を同定する。これは好ましくは、１つのコドンだけによ ってコードされるアミノ酸を含有する配列を同定することによって達成される。 時々１つのアミノ酸配列は１つのオリゴヌクレオチド配列しかコードできない が、このアミノ酸配列はしばしば類似する１組のオリゴヌクレオチドのいずれか でコードすることができる。重要なことは、この組のメンバーは全て同じペプチ ドフラグメンドをコードし得るオリゴヌクレオチド配列を含有しており、それ故 ペプチドフラグメンドをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を潜在 的に含有しているが、この組の１つのメンバーしか上記遺伝子の配列をコードす るエキソンと同一のヌクレオチド配列を含有していないということである。この メンバーは上記組内に存在しており、そしてこの組の他のメンバーの存在下であ ってもＤＮＡとハイブリッド形成できるので、１つのオリゴヌクレオチドを使用 してペプチドをコードする遺伝子をクローン化するのと同じ方法で、分別してい ないオリゴヌクレオチドの組を使用することができる。 遺伝暗号を使用して、１つまたはそれより多い種々のオリゴヌクレオチドは、 それぞれが所望のタンパク質をコードし得るアミノ酸配列から同定することがで きる。特別のオリゴヌクレオチドが実際のタンパク質コード化配列を実際に構成 する可能性は、異常な塩基の対合関係および特別のコドンが真核細胞中で実際に 使用され（特 別のアミノ酸をコードする）頻度を考慮して推計することができる。「コドン使 用法則（codon usage rule）」を使用して、タンパク質配列をコードし得る理論 上「最も可能な」ヌクレオチド配列を含有する１つのオリゴヌクレオチド配列ま たは１組のオリゴヌクレオチド配列が同定される。 或る遺伝子のフラグメントをコードし得る（または、オリゴヌクレオチド若し くはオリゴヌクレオチドの組に相補的である）適当なオリゴヌクレオチドまたは オリゴヌクレオチドの組は当該技術分野で周知の手段によって合成することがで き（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成および適用、S．A．Narang編集、1987年 、Academic press）カリフォルニア州サンジエゴ、参照）、そしてこれをプロー ブとして使用して当該技術分野で知られている技術によって上記遺伝子のクロー ンを同定しそして単離することができる。核酸のハイブリッド形成およびクロー ン同定に関する技術はマニアチスT．等、分子クローニング、実験室マニュアル 、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laborator ies）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1982年）およびハーメス （Hames）B．D．等、核酸ハイブリッド形成（Nucleic Acid Hybridization）、 実用的な方法、IRL Press、ワシントンＤＣ（1985年）によって開示されている 。次に、このようなハイブリッド形成を行い得ることが見い出されている上記の 遺伝子ライ ブラリーのメンバーを分析して、これらメンバーが含有しているコード化配列の 程度および性質を決定する。 所望のＤＮＡコード化配列の検出を促進するために、上記ＤＮＡプローブは検 出可能な基で標識する。このような検出可能な基は検出可能な物理的または化学 的特性を有する任意の材料であることができる。このような材料は、核酸ハイブ リッド形成の領域で良好に開発されており、そして一般に、このような方法に有 用な大部分の任意の標識を本願発明に適用することができる。32Ｐ、３Ｈ、14Ｃ 、35Ｓ、125Ｉ等のような放射性標識が特に有用である。適当なシグナルを提供 し且つ十分な半減期を有する任意の放射性標識を使用することができる。１本鎖 である場合、オリゴヌクレオチドはキナーゼ反応を使用して放射標識することが できる。或いは、ビオチン、酵素または蛍光性の基のような非放射性マーカーで 標識するとき、ポリヌクレチドも核酸ハイブリッド形成プローブとして有用であ る。 かくして、要約すると、部分的タンパク質配列を解明することによって、この ようなペプチドをコードし得る理論上「最も可能な」ＤＮＡ配列またはこのよう な配列の組の同定が可能になる。この理論上の配列と相補的なオリゴヌクレオチ ドを構築することによって（または、「最も可能な」オリゴヌクレオチドの組と 相補的なオリゴヌクレオチドの組を構築することによって）、遺伝子を含有する クローンの同定および単離用のプローブとし て機能し得るＤＮＡ分子が得られる。 遺伝子をクローニングする別の方法では、ライブラリーは、タンパク質を発現 ベクター中に発現できる細胞から調製したＤＮＡまたは一層好ましくはｃＤＮＡ をクローニングすることによって、発現ベクターを使用して作製される。次に、 ライブラリーは、例えばタンパク質の抗体でライブラリーをスクリーニングする ことによって、所望のタンパク質を発現するメンバーについてスクリーニングさ れる。 それ故、上記した方法は、タンパク質または該タンパク質の生物学的活性若し くは抗原性のフラグメントをコードし得る遺伝子配列を同定することができる。 このような遺伝子配列を更に特徴付けるため、そして組換え体タンパク質を産生 させるためには、これらの配列がコードするタンパク質を発現することが望まし い。このような発現によって、所望のタンパク質の特徴を有するタンパク質を発 現するクローンが同定される。このような特徴には、特に、抗体と特異的に結合 する能力、天然の非組換え体タンパク質と結合し得る抗体の産生を誘発する能力 、タンパク質の特性である酵素活性を細胞に提供する能力および受容体細胞に非 酵素的（しかし、特異的な）機能を提供する能力が含まれる。 ＤＮＡ配列は当該技術分野で知られている手段によって短縮して、所望の遺伝 子を本発明の宿主中で利用するのに必要なものより多い情報を含有している染色 体領域 から所望の遺伝子を単離することができる。例えば、制限消化を使用して全長の 配列を所望の位置で開裂することができる。別法として、または上記に加えて、 ＤＮＡ分子の３’末端から開裂するヌクレアーゼを使用して或る配列を短縮形態 に消化することができ、次に、所望の長さをゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定 によって同定しそして精製する。このようなヌクレアーゼには、例えばエキソヌ クレアーゼIIIおよびBal31が含まれる。他のヌクレアーゼは当該技術分野で周知 である。 本発明の実用的な実現においては、高浸透圧親和性酵母Ｚ．ルキシイを１つの モデルとして使用している。Ｚ．ルキシイは醤油を製造するために日本で伝統的 に使用されているので、これは食品製造に適合可能である。この酵母は例えば： 酵母、分類学的研究（The Yeasts，A T axonomic Study）、クリーガー−ファン リー（Kreger−van Rij）（編集）、エルセビア サイエンス パブリッシャ ーズ（Elsevier Science publishers）B．V.、3984アムステルダム中に記載され ており、そしてこの酵母は462〜465頁に記載されている。カンジダ ポリモルフ ァ、トルロプシス カンジダ、カンジダ トロピカリス、ピチア ファリノーサ （farinosa）、トルラスポラ ハンセニイ（Torulaspora hansenii）等のような 他のＤ−アラビトール産生酵母、並びにデンドリフィエラ サリナ（Dendryphie lla salina）またはシゾフィラム コミューン（Schizophyllum commune）のよ うなＤ −アラビトール産生真菌も、本願発明の目的の宿主生物として使用することがで きる。 Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに酸化する酵素（ＥＣ 1.1.1.11）は細 菌中には存在するが酵母または真菌中には存在しないことが知られている。本願 発明の目的では、クレブシエラ テリゲナは非病原性の土壌細菌でありそして高 誘発性のＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性を有しているので、Ｄ−アラビ トールデヒドロゲナーゼ（Ｄ−キシルロース形成）遺伝子の好ましい供給源であ る。実施例で使用されたクレブシエラ テリゲナ株Ｐ hp１はヘルシンキ大学の Ｋ．ハーテラ（Haahtela）から得た。この株の単離はハーテラ等のAppl．Env．M icrobiol．45：563〜570（1983年）に記載されている。Ｄ−アラビトールデヒド ロゲナーゼ遺伝子のクローニングはＫ．テリゲナ染色体ＤＮＡの遺伝子ライブラ リーを適当なベクター、例えば良く知られておりそして市販で入手可能なプラス ミドｐＵＣ19中で構築することによって好都合に達成することができる。このラ イブラリーは、単一の炭素源としてＤ−キシルロースは使用できるがＤ−アラビ トールは使用できない多数の大腸菌株の１つに形質転換される。ストラタジーン （Stratagene）から入手可能な大腸菌株ＳＣＳ１は好適な株の１例である。次に 、唯一の炭素源としてＤ−アラビトールを含有する培地に上記形質転換体を播種 し、そしてこの培地で増殖し得るクローンを単離する。Ｋ．テリゲナのＤ −アラビトールデヒドロゲナーゼのコード化領域は好都合に1.38kbのＢc1I−Ｃ1 aIフラグメントの形態で単離しそして適当なプロモーターおよび転写ターミネー ター配列と融合させることができる。酵母Ｚ．ルキシイを宿主生物として使用す るとき、サッカロミセスセレビシエのＡＤＣＩプロモーターおよび転写ターミネ ーターは本願発明の目的に好適な転写調節エレメントの例である。ＡＤＣＩの配 列はジーンバンク（GenBank）から入手可能である。 大部分の酵母や真菌はキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）遺伝子 を有しているが、本願発明の実施には上記遺伝子の過剰発現が典型的に必要であ る。キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）をコードするピチア スチ ピチス ＸＹＬ２遺伝子のクローニングは、ＸＹＬ２遺伝子のヌクレオチド配列 に関して発表された情報を使用してポリメラーゼ鎖反応技術で好都合に達成する ことができる（K tter等、Curr．Genet．18：493〜500（1990年））。遺伝子は 何も修飾しないで他の酵母種に導入しそしてそれ自身のプロモーターの制御下で 発現することができ、そしてプロモーターは別の強力な酵母プロモーターと交換 することができる。 遺伝子的に安定な形質転換体はベクター系または形質転換系を用いて構築する ことができ、そしてそれによって所望のＤＮＡは宿主染色体中に組込まれる。こ のような組込みは細胞内で新規に生じさせるかまたは宿主染色 体中に自体を機能的に挿入するベクター、例えば、ファージ、レトロウイルスベ クター、トランスポゾン若しくはＤＮＡ配列の染色体への組込みを促進する他の ＤＮＡエレメントでの形質転換によって組込みを助長することができる。 適当なプロモーター制御下でＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼおよびキシリ トールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）をコードする遺伝子を１つのプラスミ ド構築物中で組み合わせ、そして形質転換によってＤ−アラビトール産生生物の 宿主細胞中に導入することができる。プラスミドベクターの性質は宿主生物に依 存する。それ故、ｐＳＲ１のＤＮＡを導入しているＺ．ルキシイベクターでは、 隠れた（cryptic )プラスミド（Ushio，K．等、J．Ferment．Technol．66：481 〜488（1988年））を本願発明の好ましい実施態様で使用する。プラスミドを自 動的に複製することが知られていない他の酵母または真菌種では、キシリトール デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）およびＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ遺 伝子の宿主染色体中への組込みを使用することができる。宿主のリボソームＤＮ Ａ（リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ）遺伝子座への組込みを標的化するこ とは高コピー数組込みを得る好ましい方法であり、そして上記のように標的化す る２つのデヒドロゲナーゼ遺伝子の高レベル発現はこの遺伝子座に直接組込むの に十分な組換えＤＮＡ配列を組換え体構築物に提供することによって達 成することができる。Ｄ−アラビトール産生微生物の形質転換に使用される遺伝 子マーカーは好ましくは、ゲンタマイシン若しくはフレオマイシンのような種々 の抗生物質または銅のような重金属等に耐性を与える優性マーカーである。選択 性マーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させるかまたは共 形質転換によって同じ細胞中に導入することができる。 Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.9）遺伝子の導入に加えて、新規なキシリトール産生株を構築するため に他の遺伝子修飾を使用することができる。かくして、酸化的ペントースホスフ ェート経路の酵素をコードする遺伝子は、Ｄ−アラビトールプリカーサー Ｄ− リブロース−５−ホスフェートの合成度を高めるために過剰に発現 ペンツロース−５−ホスフェートまたはペントース−５ ドする遺伝子は、５炭素糖リン酸の蓄積を増加させる慣用の突然変異誘発または 遺伝子分裂技術によって不活性化することができる。Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝 子の不活性化はリン酸化によるＤ−キシルロースの損失をなくすことによってキ シリトール収量を高めることができる。中間体としてＤ−アラビトールが使用さ れないキシリトール産生経路の別のタイプを創製するために、トランスケトラー ゼ不活性化突然変異とＤ−リブロース−５−エ ピメラーゼの過剰発現との組合せを使用することができる。 所望のタンパク質および／またはその活性誘導体を発現させるためには、適当 な宿主が認識し得る転写および翻訳シグナルが必要である。上記した方法で、そ して好ましくは２本鎖形態で得られるクローン化したコード化配列は、発現ベク ター内の転写発現を制御する配列に作用し得るように結合させそして原核生物か または真核生物の宿主細胞中に導入して組換え体タンパク質またはその機能的誘 導体を産生させることができる。転写発現を制御する配列にコード化配列のどの ストランドが結合するかに依存して、アンチセンスＲＮＡまたはその機能的誘導 体を発現させることも可能である。 種々の宿主でのタンパク質の発現は、タンパク質の特性を変えることができる 種々の転写後修飾を生じさせることができる。好ましくは、本願発明は真核細胞 中、そして特に酵母中でのタンパク質またはその機能的誘導体の発現を包含する 。 ＤＮＡのような核酸分子が転写調節情報を有する発現制御配列を含有しており 、そしてこのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と「作用 し得るように結合され」ている場合、該分子は「発現可能」であると言う。 作用し得る結合は、配列の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような 方法で１つ（または複数）の調 節配列と連結している結合である。プロモーター機能の導入により所望のタンパ ク質をコードするｍＲＮＡの転写が生じる場合そして２つのＤＮＡ配列（例えば 、コード化配列およびコード化配列の５’末端に結合したプロモーター領域配列 ）が（１）コード化配列の読み取り枠を変えないか、（２）発現調節配列がタン パク質、アンチセンスＲＮＡの発現を指令する能力を妨害しないか、または（３ ）ＤＮＡ鋳型を転写させる能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ配列は作用し得 るように結合されていると言う。かくして、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を 行うことができた場合、プロモーター領域はＤＮＡ配列と作用し得るように結合 されているであろう。 遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種間または細胞タイプ間で変動す ることがあるが、一般には必要な場合、それぞれ転写および翻訳の開始に係わる ５’非転写および５’非翻訳（非コード化）配列、例えばＴＡＴＡボックス、キ ャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を有していなければならない。特に、このよう な５’非転写制御配列は、作用し得るように結合した遺伝子の転写制御用プロモ ーターを有する領域を含有している。このような転写制御配列は、所望の場合、 エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列も有していることができる。 酵母のような真核生物宿主におけるタンパク質の発現にはこのような宿主で機 能的な調節領域、そして好まし くは酵母調節系を使用することが必要である。宿主の性質に依存して、多様な転 写および翻訳調節配列を使用することができる。好ましくは、これらの調節シグ ナルはそれらの天然の状態では、宿主細胞中で高レベルの発現が可能である特別 の遺伝子と結合している。 転写が翻訳と連結していない真核生物では、このような制御領域は、クローン 化した配列がイニシエーターメチオニン（ＡＵＧ）を含有しているかどうかに依 存して、該メチオニンコドンを提供することができるかまたは提供できない。こ のような領域は、一般に、宿主細胞中でのＲＮＡ合成の開始を指令するのに十分 なプロモーター領域を含有している。翻訳可能なｍＲＮＡ産生物をコードする酵 母遺伝子から得られるプロモーターが好ましく、そして特に、強力なプロモータ ーが宿主細胞でプロモーターとして機能する場合、強力なプロモーターを使用す ることができる。好ましい強力な酵母プロモーターにはＧＡＬ１遺伝子プロモー ター、解糖作用遺伝子プロモーター、例えばホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ） 用のもの、または構成アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＣ１）プロモーターが 含まれる（Ammerer，G．Meth．Enzymol．101C：192〜201（1983年）；Aho、FBBS Lett．291：45〜49（1991年））。 広く知られているように、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコー ドするコドンで開始される。この理由により、真核生物プロモーターと所望のタ ンパク 質をコードするＤＮＡ配列またはその機能的誘導体間の結合がメチオニンをコー ドし得る介在コドンを確実に含有していないようにすることが好ましい。このよ うなコドンが存在すると、融合タンパク質（ＡＵＧコドンがタンパク質コード化 ＤＮＡ配列と同じ読み取り枠内にある場合）かまたは枠シフト突然変異（ＡＵＧ コドンがタンパク質コード化配列と同じ枠内にない場合）のどちらかが生じる。 作用し得るように結合した遺伝子の発現を調整できるように、抑圧または活性 化を可能にする転写開始調節シグナルを選択することができる。温度を変化させ ることによって発現を抑圧するか若しくは開始できるように温度感受性であるか または化学的調節、例えば代謝中間体に左右される調節シグナルが重要である。 アンチセンスＲＮＡ配列の発現を所望する場合、翻訳シグナルは必要でない。 所望の場合、所望のタンパク質をコードする配列の非転写および／または非翻 訳領域３’は上記したクローニング方法で得ることができる。３’−非転写領域 はその転写終結調節配列エレメントを保持することができ、３−非翻訳領域はそ の翻訳終結調節配列エレメントまたは真核細胞でポリアデニル化を指令するこれ らのエレメントを保持することができる。天然の発現制御配列シグナルが宿主細 胞中で十分機能しない場合には、宿主細胞中の機能的な配列で代用することがで きる。 本発明のベクターは更に、抗生物質耐性を与えるＤＮＡエレメントのような他 の作用し得るように結合した調節エレメント、または１つ若しくはそれより多い 宿主細胞中でベクターを維持するための複製起点を含むことができる。 特にＺ．ルキシイに関するもう１つの好ましい実施態様では、導入される配列 は、受容体宿主中で自動複製し得るプラスミドベクター中に組み入れられる。任 意の多様なベクターをこの目的に使用することができる。 特別のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際に重要なファクターに は次のものがある：ベクターを含有する受容体細胞を認識しそしてベクターを含 有しない受容体細胞から選択できる容易さ；特別の宿主内で所望されるベクター のコピー数；および種々の種の宿主細胞間でベクターを「運び」得ることが望ま しいかどうか。 好ましい酵母プラスミドは宿主に依存する。Ｚ．ルキシイでは、天然の隠れた プラスミドｐＳＲ１（Toh，E．等、J．Bacteriol．151：1380〜1390（1982年） ）、ｐＳＢ１、ｐＳＢ２、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４（Toh，E．等、J．Gen．Micr obiol．130：2527〜2534（1984年））に基づくベクターが好ましい。プラスミド ｐＳＲＴ303Ｄ（Jearnpipatkul，A．等、Mol．Gen．Genet．206：88〜84（1987 年））はジゴサッカロミセス酵母の有効なプラスミドベクターの１例である。 構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列は発現用 に調製するとすぐに、ＤＮＡ構築物は多種の適当な手段のどれかによって適当な 宿主細胞中に導入される。ベクターを導入した後、受容体細胞はベクター含有細 胞の増殖を選択する選択培地中で増殖させる。クローン化した遺伝子配列を発現 させると所望のタンパク質の産生が生じるかまたはこのタンパク質のフラグメン トの産生が生じる。この発現は形質転換細胞中で連続的な態様で生じるか、また は例えば発現を誘発することによって制御された態様で生じることができる。 ある種の遺伝子産生物をもはや発現できないように改変されている本発明の宿 主を構築するために、遺伝子分裂のような当該技術分野で知られている技術を使 用して、部位指向突然変異を実施することができる（Rothstein，R．S.、Meth． Enzymol．101C：202〜211（1983年））。 ＩＶ．キシリトールの産生 組換え体アラビトール産生酵母、好ましくはその高浸透圧親和性酵母を本発明 の宿主として使用するとき、それら酵母は高浸透圧培地、例えば、10〜60％のＤ −グルコース、そして好ましくは25％のＤ−グルコースを含有する培地中で増殖 させることができる。（「普通の」培地は通常２〜３％のグルコースしか含有し ていない。）高浸透圧培地は、Ｚ．ルキシイのような高浸透圧親和性酵母の野生 タイプ株でＤ−アラビトール形成を誘発する。組換え体および対照（野生タイプ ）株の培養培地は、キ シリトールの存在について種々の培養時間で当該技術分野で知られている方法に 従って分析する。Ｄ−アラビトール最大収量用に最適化されていない培養条件で は、実験株Ｚ．ルキシイＡＴＣＣ13356［ｐＳＲＴ（ＡＸ）−９］はキシリトー ルとＤ−アラビトールの両方を産生しそして培養培地中に分泌した。対照株の培 養培地ではＤ−アラビトールしか検出されなかった。第１回の試験のキシリトー ルの収量［実施例４の表４参照］は培養４８時間後に概ね7.7ｇ／ｌであった。 キシリトールは、当該技術分野で既知の任意の技術に従って本発明の宿主の培 地から精製することができる。例えば、本願明細書に参照として組み入れた米国 特許5,081,026は酵母培養物からキシリトールのクロマトグラフィー分離を記載 していた。それ故、発酵段階から、キシリトールは米国特許5,081,026に記載さ れたようなクロマトグラフィー段階、続いて結晶化を使用して培養培地から精製 することができる。 本発明は一般的に記載したが、これは或る特定の実施例を参照して更に良く理 解されることになろう。これら実施例は単に説明の目的だけで本願明細書に含ま れ、他に明示しない限り、限定するように意図するものではない。 実施例 実施例１ 細菌性Ｄ−アラビトール脱水素酵素遺伝子のクローン化 クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）Ｐｈｐ１（Ｋ．ハーテラ（ Haahtela）、ヘルシンキ大学から得られた、ハーテラ他、Appl．Bnv．Microbiol .、４５：５６３−５７０（１９８３）参照）を１リットルのＬＢ培地（１％ト リプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）の中で３０℃において一夜成長 させた。細菌細胞（約５ｇ）を遠心により集め、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の中で１回洗浄し、そして１％のドデシル硫 酸ナトリウムおよび２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有するＴＥ中に再 懸濁させた。懸濁液を３７℃において３０分間培養し、そして次に等容量のフェ ノールを用いて１回そしてクロロホルムを用いて２回抽出した。３Ｍ酢酸ナトリ ウム（１／１０容量）およびエタノール（３容量）を加え、そして沈澱した核酸 を遠心により集めそして５ｍｌのＴＥ中に再溶解させた。ＲＮＡをベックマンＴ ｉ５０．２ローターの中で２５ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌを通す一夜にわたる３０， ０００ｒｐｍにおける溶液の遠心により除去した。上記方法により得られたＫ． テリゲナ染色体ＤＮＡは５０，０００個以上の塩基対（ｂｐ）の平均フラグメン ト寸法を有していた。ＤＮＡを次に制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａの供給業 者（ベーリンガー社）の緩衝液中で５Ｕ／ｍｇの酵素：ＤＮＡ比で、平均ＤＮＡ フラグメント寸法が約５−１０ｋｂ（アガロースゲル電気泳動）に減少するまで 、消化させた。消化物をＴＢＥ 緩衝液（０．０９Ｍトリス−ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の５Ｖ ／ｃｍにおける一夜にわたる２０×１０×０．６ｃｍの０．６％アガロースゲル を通す電気泳動により分画し、ウェルをアガローススラブ中で約５ｋｂのフラグ メント寸法に相当する位置で切断し、透析膜の片をウェルに沿って固定しそして ５ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントの本質的に全てが膜上に吸着されるまで電 気泳動を続けた。ｐＵＣ１９のプラスミドＤＮＡ（ファーマシアから購入）を供 給業者の緩衝液および反応条件を使用して制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩお よび細菌性アルカリ性ホスファターゼで消化させた。ｐＵＣ１９の線状形を調整 用ゲル電気泳動により上記の膜電気溶出法を使用して精製し、そしてクレブシエ ラ・テリゲナ染色体ＤＮＡの５−１５ｋｂフラクションと連結反応させた。連結 反応混合物を使用して大腸菌ＳＣＳ１のコンピテント細胞（ストラタジーンから 購入）をアンピリシン抵抗性に転換させた。この実験で、約１０，０００個の組 み換え体クローンが得られた。転換板から得られたプールされた細胞をＤ−ラビ トール（１％）を単一炭素源として含有する最小培地板上のに塗り付けた。３７ ℃における２日間の培養後に、数個のコロニーが得られた。プラスミドＤＮＡを これらのクローンの中の２個（最も速い成長）から単離しそしてＤ−アラビトー ルを異化させられないがＤ−キシルロースを使用することができる大腸菌の菌株 ＨＢ１０１を再転換させるために 使用した。全ての被転換体はマッコンケイ（ジフコから得られる）の寒天−Ｄ− アラビトール板上でＤ−アラビトール−利用陽性であることが証明されたが、全 ての対照クローン（ｐＵＣ１９で転換された同一の菌株）は陰性であった。制限 分析は、２個の単離されたクローンが同一のプラスミドを含有していたことを示 した。２個の単離されたプラスミドの中の１個（ｐＡＲＬ２と称される）をその 後の同定用に使用した。Ｄ−アラビトール脱水素酵素遺伝子を担持するｐＡＲＬ ２中のＫ．テリゲナＤＮＡのクローン化された９．５ｋｂ（概略）フラグメント の制限酵素地図が図１に示されている。 実施例２ 酵母中の細菌性Ｄ−アラビトール脱水素酵素遺伝子の発現 Ｄ−アラビトール脱水素酵素遺伝子を含有する原Ｋ．テリゲナ９．５ｋｂＤＮ Ａクローンから、約１．８ｋｂ ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを一般的 な組み換え体ＤＮＡ技術を使用して継代クローン化し、そしてＤ−アラビトール 脱水素酵素遺伝子を含有していることが見いだされた。ｐＵＣ１９ベクター中に このＤＮＡフラグメントを含有するプラスミド（ｐＡＤＨ、ここでＡＤＨはＤ− アラビトール脱水素酵素を意味する）を大腸菌の菌株ＪＭ１１０から単離し、Ｂ ｃｌＩおよびＣ１ａＩ制限エンドクレアーゼで消化させ、そして１．３８ｋｂ ＤＮＡフラグメントを調整用アガロースゲル電気泳 動により単離した。このＤＮＡフラグメントを全部で４種の三燐酸デオキシヌク レチドの存在下でＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、そ して予めＨｉｎｄIIIを用いて切断され且つクレノウフラグメントで処理された 酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（アンメラー（Ammerer）、Meth．Enzymol.、１０ １：１９２−２０３（１９８３））と連結反応させた（図２）。生じた発現プラ スミドであるｐＹＡＲＤは、複製およびアンピリシン抵抗遺伝子の細菌（大腸菌 ）源、２μｍ ＤＮＡからの複製の酵母（Ｓ．セレヴィシエ）源、および酵母中 での選択用の酵母（Ｓ．セレヴィシエ）ＬＥＵ２遺伝子を含有するシャトル大腸 菌−サッカロミセス・セレヴィシエベクターである。発現カセットは酵母アルコ ール脱水素酵素Ｉ（ＡＤＣＩ）プロモーターおよび（ＡＤＣＩ）転写ターミネー ターフランキングを含んでおりそしてＫ．テリゲナＤ−アラビトール脱水素酵素 遺伝子と操作可能式に結合されている。 サッカロミセス・セレヴィシエ菌株ＧＲＦ１８（ＭＡＴα、１ｅｕ２−３，１ １２、ｈｉｓ３−１１，１５）およびＳ．セレヴィシエ菌株ＤＢＹ７４６（ＡＴ ＣＣ４４７７３；ＭＡＴα、１ｅｕ２−３，１１２ ｈｉｓ３−Ａ１ ｕｒａ３ −５２ ｔｒｐ１−２８９）が両者とも上記のＤ−アラビトール脱水素酵素発現 ベクターｐＹＡＲＤを用いる転換用の宿主として使用され、同じ結果を与える。 転換は標準的塩化リチウム方法（イトウ（It o）他、Bacteriol.、１５３：１６３−１６０（１９８３））により被転換体選 択用のｐＹＡＲＤのＬＥＵ２マーカーを使用して行われた。被転換体を液体培養 物中で最小培地：０．６７％酵母窒素基質（「ジフコ」）、２％Ｄ−グルコース 、１００ｍｇ／ｌのヒスチジンおよびトリプトファン：の中で３０℃において一 夜にわたり振盪しながら成長させた。細胞を遠心により集め、１ｍＭ ＮＡＤ＋ を含有する最少量の０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８の中に懸濁させ、 そしてビードビーター装置（「バイオスペック製品」）の中で氷冷しながら６分 間にわたり破壊した。Ｄ−アラビトール−成長Ｋ．テリゲナ細胞抽出物をこれら の実験で陽性対照として使用し、そしてｐＡＡＨ５で転換させたＤＢＹ７４６を 陰性対照として使用した。表２に表されている結果はＫ．テリゲナから単離され たＤ−アラビトール脱水素酵素遺伝子が酵母中で効果的に発現されたことを示す 。 実施例３ キシリトール脱水素酵素およびＤ−アラビトール脱水素酵素遺伝子の過剰発現用 酵母ベクターの構造 キシリトール脱水素酵素をコードづけする酵母（ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）遺伝子であるＸＹＬ２の既知のヌクレオチド配列（ケッター（K tte r）他、Curr．Genet.、１８：４９３−５００（１９９０））を使用してポリメ ラーゼ鎖反応によりこの遺伝子のクローン化用のオリゴヌクレオチドを合成した 。２種のオリゴヌクレオチド類： ＣＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＣＧＴＣＣＣ（５′−オリゴヌ クレオチド）［配列番号：１］およびＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴ ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＣ（３′−オリゴヌクレオチド）［配列番号：２］を設計し てＰＣＲ生成物の５′−および３′末端における一般的制限部位ＸｂａＩおよび ＥｃｏＲＩを加えた。ケッター他、Curr．Genet.、１８：４９３−５００（１９ ９０）で使用された番号づけに従い、５′−オリゴヌクレオチドをＸＹＬ２の位 置１−２４においてアニーリングし、そして３′−ヌクレオチドを位置１５３１ −１５６０においてアニーリングする。 ピチア・スチピチスＣＢＳ６０５４（セントラルビューロー・フール・シンメ ルカルッチャーズ、オーステルストラート１、ＰＯボックス２７３、３７４０Ａ Ｇバー ン、オランダ）をＹＥＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％Ｄ−グル コース）の中で一夜成長させ、細胞を遠心により集め、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有 する１Ｍソルビトール溶液、ｐＨ７．５で１回洗浄し、同じ溶液中に再懸濁させ そしてリチケーゼ（シグマ）を用いて消化させた。光学的密度を６００ｎｍの細 胞懸濁液の１％ＳＤＳ中１：１００希釈度で監視することにより消化を調節した 。この値が初期値の約１／７に低下した時に、消化を終了させた。スフェロプラ スト懸濁液を１％ＳＤＳ中に溶解させそして２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ Ｋで３７℃において３０分間処理した。１回のフェノールおよび２回のクロロホ ルム抽出後に、核酸をエタノール沈澱させそして少量のＴＥ緩衝液中に再溶解さ せた。染色体ＤＮＡの組み込みをアガロースゲル電気泳動により検査した。平均 ＤＮＡフラグメント寸法は５０ｋｂより大きかった。ＰＣＲは供給業者の緩衝液 中でＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー）を使用して行われた。熱サイク ルは９３℃−３０秒間、５５℃−３０秒間、７２℃−６０秒間であった。ＰＣＲ 生成物をクロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、そしてＥｃｏＲＩおよびＸ ｂａＩを用いて標準条件下で消化させた。アガロースゲル精製後に、ＤＮＡフラ グメントをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１８（プラスミドｐＵＣ（ＸＹ Ｌ２））にクローン化した。その後の制限分析は、クローン化されたフラグメン トの制限地図がＰ．スチピチスＸ ＹＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に相当することを確認した。 Ｄ−アラビトール脱水素酵素およびキシリトール脱水素酵素を過剰発現させる ための酵母プラスミドは図３および図４により示されているように構成されてい た。プラスミドｐＹＡＲＤのＤ−アラビトール脱水素酵素発現カセットのフラン キング制限部位を変更するために、カセット全体をＢａｍＨＩ消化により削除し そしてＢａｍＨＩ分裂ｐＵＣ１８にクローン化した。生じたプラスミドｐＵＣ（ ＹＡＲＤ）をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化させ、そして１個だけの２ ．０ｋｂ ＤＮＡフラグメントを調整用ゲル電気泳動により単離した。このフラ グメントをプラスミドｐＵＣ（ＸＹＬ２）から単離された１．６ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントと連結反応させ、そして大腸菌酵母シ ャトルベクターｐＪＤＢ２０７の６．６ｋｂフラグメント（ベッグス（Beggs） ，J．D.、Nature、２７５：１０４−１０９（１９７８））をＨｉｎｄＩＩＩお よびＳａｌＩを用いて消化させた。プラスミドｐＪＤＢ（ＡＸ）−１６を上記連 結反応混合物を用いる大腸菌の転換後に単離した。このプラスミドは大腸菌およ びサッカロミセス・セレヴィシエの両者において複製可能である。Ｓ．セレヴィ シエ中では、それはＤ−アラビトール脱水素酵素およびキシリトール脱水素酵素 の両者の高水準合成に向いている。プラスミドｐＪＤＢ（ＡＸ）−９からの４． ７ｋ ｂＳａｌＩフラグメントとＳａｌＩを用いる部分的加水分解により得られる線状 形のプラスミドｐＳＲＴ３０３Ｄ（ジアーンピパツクル（Jearnpipatkul）他、M ol．Gen．Genet.、２０６：８８−９４（１９８７））の連結反応により、プラ スミドｐＳＲＴ（ＡＸ）−９が合成された。 実施例４ キシリトールを分泌する酵母菌株の構造 ジゴサッカロミセス・ロウキシイ（Zygosaccharomyceｓ rouxii）ＡＴＣＣ１ ３３５６をこれまでに記載されている方法のわずかな変更によりプラスミドｐＳ ＲＴ（ＡＸ）−９を用いて転換させた（ウシオ（Ushio），Ｋ．他、J．Ferment ．Technol.、６６：４８１−４８８（１９８８））。簡単に述べると、Ｚ．ロウ キシイ細胞をＹＥＰＤ培地（３−５の６００ｎｍにおける光学的密度を有する培 養物を与える）の中で一夜成長させ、低速遠心により集め、１Ｍソルビトール， １ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．５の中で２回洗浄し、１％２−メルカプトエタ ノールを含有する初期培養容量の１／５の同一溶液中に再懸濁させ、そして室温 においてリチケーゼ（シグマ）を用いて消化させた。消化後に、細胞懸濁液の適 当な部分試料を１％ＳＤＳ溶液の中で希釈しそして希釈された試料の光学的密度 を６００ｎｍにおいて測定した。この値が初期値の１／７に低下した時に、懸濁 液を氷上で冷却しそしてメルカプトエタノール臭がもはや検出できなくなるまで 洗浄（１０分間、１０００ｒｐｍ遠心、０℃） することにより消化を停止させた。スフェロプラストを冷たい１Ｍソルビトール 中の０．３Ｍ塩化カルシウム溶液で１回洗浄し、そして初期培養容量の１／４の 同一溶液中に再懸濁させた。この懸濁液の２００μｌ部分試料および１０−２０ μｇのプラスミドＤＮＡを混合しそして０℃において４０分間培養した。０．３ Ｍ塩化カルシウムを含有する０．８ｍｌの氷冷５０％ＰＥＧ−６０００溶液をス フェロプラスト懸濁液に加え、そして冷時培養を１時間続けた。スフェロプラス トをテーブル−トップ遠心機の中で４００ｒｐｍにおける１０分間にわたる遠心 により濃縮し、１Ｍソルビトールを含有する２ｍｌのＹＥＰＤ中に再懸濁させ、 そして再生のために室温において一夜放置した。再生された細胞を５０−１００ μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＹＥＰＤ板の上で板培養しそして３０℃ において４−６日間培養した。 被転換体を液体ＹＥＰＤ培地中で成長させ、細胞抽出物をＳ．セレヴィシエ（ 実施例２）に関して記載されている通りに製造し、そしてＤ−ラビトール脱水素 酵素およびキシリトール脱水素酵素の活性を測定した。これらの測定結果を表３ 中で他の有機体中で行われた同様な測定と比較した。それらは両者の遺伝子がＺ ．ロウキシイ中で効果的に発現されたことを示している。 ｐＳＲＴ（ＡＸ）−９で転換されたＺ．ロウキシイＡＴＣＣ１３３５６の細胞 を５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する５０ｍｌのＹＥＰＤ中で２日間成 長させ、 遠心により集め、そして２５重量％Ｄ−グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのゲン タマイシンを含有する１００ｍｌのＹＥＰＤに接種した。この培養物を１０００ ｍｌフラスコ中で回転振盪機（２００ｒｐｍ）上で３０℃において成長させた。 他の実験（実験２）では、酵母抽出物なしの同一培地（低ホスフェート培地）を 使用した。培養ブロス中のキシリトール含有量を標準ＨＰＬＣおよびガスクロマ トグラフィーにより分析した。結果は表４に示されている。同一培地（ゲンタマ イシンなし）中で転換されなかったＺ．ロウキシイの培養培地中ではキシリトー ルは検出されなかった。 同様な方式を使用して、他の炭素源からのキシリトール生成性菌株を構成する ことができる。例えば、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）はｎ− アルカン類を良好な収率でＤ−アラビトールに転化させうる（ハットリ（Hattor i），Ｋ．およびスズキ（Suzuki）Ｔ．、Agric．Biｏl．Chem.、３８：１８７５ −１８８１（１９７４））。プラスミドｐＪＤＢ（ＡＸ）−９からの４．７ｋｂ ＳａｌＩフラグメントをプラスミドｐＣＵ１中に挿入することができ（ハース （Haas），Ｌ．他、J．Bact eriol．、１７２：４５７１−４５７７（１９９０ ））、そしてＣ．トロピカリス菌株ＳＵ−２（ｕｒａ３）を転換させるために使 用できる。或いは、同一発現カセットを優性選択マーカーを担持するプラスミド ベクター上で原栄養性Ｃ．トロピカリス菌株に転換させることもできる。 実施例５ アラビトール脱水素酵素およびキシリトール脱水素酵素の発現並びにトルロプシ ス・カンジダ（Tolulopsis candida）の転換用の組み込み優性選択ベクターの構 造 染色体ＤＮＡをＴ．カンジダ（ＡＴＣＣ２０２１４）からＳ．セレヴィシア用 に使用された標準方法と同様な方法により単離した。しかしながら、Ｔ．カンジ ダスフェロプラストの製造は有効な細胞壁溶解を得るには１０ｇの細胞当たり約 ５０，０００Ｕという高濃度のリチケーゼ（シグマ）および室温における５、６ 時間から一夜 の培養という長い培養時間を必要とする。スフェロプラスト製造用の緩衝液は１ Ｍソルビトールおよび１％メルカプトエタノールを含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８であった。スフェロプラストを同一緩衝液（メルカプトエタノールなし） で３回洗浄し、そして１５ｍｌの１％ＳＤＳ中で溶解させた。２回のフェノール 抽出を細胞溶解直後に行い、そして２容量のエタノールの添加および遠心（１０ ，０００ｒｐｍにおいて５分間）によりＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡを７０％エ タノールで２回洗浄しそして真空下で乾燥した。ＤＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含 有する５ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、ＲＮＡｓｅ Ａを １０μｇ／ｍｌ濃度となるまで加え、そして溶液を３７℃において１時間培養し た。ＤＮＡの組み込みは分子量対照として未切断ラムダＤＮＡを使用するアガロ ースゲル電気泳動により確認された。 ２００μｇのＴ．カンジダの染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ を用いて切断し、消化物を０．７％（８×１５×０．８ｃｍ）調整用アガロース ゲル上で６ｃｍ幅のウェルの中に適用しそして電気泳動により分離した。ゲルの １ｃｍ幅の片をゲルから切断しそして正に荷電されたナイロン膜（ベーリンガー １２０９ ２９９）上ににじませた。にじみ点をプラスミドｐＡＴ６８（Ｋ．ス ギハラ（Sugihara）他、Agric．Biol．Chem.、５０（６）：１５０３−１５１（ １９８６））からＳａｌＩを用いて削除されたジゴサッカロミセス・バイリ イ（Zygosaccharomyces bailii）ｒＤＮＡの１０ｋｂ ＤＮＡフラグメントを用 いて検査した。プローブに標識づけしそしてにじみ点を製造業者の指示に従いＤ ＩＧ ＤＮＡ標識づけおよび検出キット（ベーリンガー１０９３ ６５７）を使 用して塗り付けた。約４．５、２．７および１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントに 相当する３つのハイブリッド形成帯が観察された。対照としてにじみ点を使用し て、最大（４．５ｋｂ）ハイブリッド形成性ＤＮＡフラグメントに相当する帯を 調整用ゲルの残存部分から切断し、ＤＮＡを電気溶離しそしてＥｃｏＲＩおよび ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されたｐＵＣ１９と連結反応させた。 連結反応混合物を使用して大腸菌を転換させた。転換させた細菌をアンピシリ ンと共にＬＢ培地を含有する板の寒天表面上に置かれた荷電されたナイロン膜（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ１６２−０１６４）の上に置いた。３７℃における２４時間の培 養後に、膜を持ち上げそしてその場で製造業者の指示に従い細菌コロニーの溶解 を行った。大腸菌はこの型の膜を浸透しそしてフィルターを持ち上げた後に寒天 表面上の全ての細菌コロニーの可視痕跡があるため、レプリカ板は必要なかった 。膜を上記と同じＤＩＧ検出キットを使用して同じＺ．バイリイｒＤＮＡフラグ メントを用いて検査した。多数の陽性クローンが同定された（全クローンの約２ −５％）。８つのハイブリッド形成陽性クローンおよび４つのハイブリッド形成 陰 性クローンからのプラスミド微小調合物の制限分析をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ ＩおよびＥｃｏＲＶの混合物を使用して行った。全てのハイブリッド陽性クロー ンは同一の制限フラグメントパターン（０．５５および１．５ｋｂの特徴フラグ メントを有する）を生成したが、ハイブリッド形成陰性クローンの同じパターン は全て異なっていた。ハイブリッド形成陽性クローンの１つからのプラスミドＤ ＮＡを調整用秤の上で単離し、そしてｐＴＣｒＤＮＡと名付けた。クローン化さ れた片はＴ．カンジダｒＤＮＡのフラグメントであると結論づけられ、その理由 は１）それがＺ．バイリイのｒＤＮＡと強くハイブリッド形成しそして２）それ が高頻度で部分的に富んだＴ．カンジダ染色体ＤＮＡ消化物からクローン化され たからである（ｒＤＮＡは酵母中で約１００個のコピーにより発現されることが 知られている）。クローン化されたＤＮＡフラグメントの部分的制限地図は図５ に示されている。 Ｔ．カンジダのｒＤＮＡフラグメントを優性選択マーカーと組み合わせている プラスミドは下記の如くして構成された。プラスミドｐＵＴ３３２（ガチグノー ル（Gatignol），Ａ．他、Gene、９１：３５−４１（１９９０））をＨｉｎｄＩ ＩＩおよびＫｐｎＩを用いて切断し、１．３ｋｂ ＤＮＡフラグメントをアガロ ース電気泳動により単離し、そしてＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化させたｐＴ ＣｒＤＮＡおよびｐＵＣ１９からの４．５ｋ ｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲｉフラグメントと連結反応させた（図６）。連結 反応混合物を大腸菌に転換させ、そしてプラスミドｐＴＣ（ＰＨＬＥ）を担持す るクローンを制限分析により同定した。 ＰＴＣ（ＰＨＬＥ）をＳａｌＩを用いて部分的に消化させそして線状形のプラ スミドをアガロースゲル電気泳動により精製した。それをｐＪＤＢ（ＡＸ）−１ ６から単離された５ｋｂＳａｌＩフラグメントと連結反応させた（実施例２）。 この連結反応混合物から大腸菌への転換後に得られたクローンの中でプラスミド ｐＴＣ（ＡＸ）を同定した（図６）。このプラスミドは下記の機能要素を含んで いる： ａ）このプラスミドにより転換させた酵母細胞の直接的選択を可能にする酵母 プロモーターおよび転写ターミネーターの調節下における細菌性フレオマイシン −抵抗性遺伝子、 ｂ）Ｔ．カンジダ染色体との同種組み換え用の目標を与えそ して転換効率を改良するＴ．カンジダｒＤＮＡの片、 ｃ）アラビトール−キシリトール転化工程の２種の酵素の合成のためのアラビ トール−脱水素酵素およびキシリトール脱水素酵素用の発現カセット。 実施例６ Ｔ．カンジダの転換およびキシリトール生成の分析 プラスミドｐＴＣ（ＡＸ）を使用してトルロプシス・カンジダ菌株ＡＴＣＣ２ ０２１４を転換させた。Ｔ．カ ンジダを１０％グルコースを含有するＹＥＰＤ培地中で３６時間成長させた。細 胞を遠心（２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により集め、そして殺菌性１Ｍソ ルビトールで３回洗浄した。細胞ペレットを等容量の冷たい１Ｍソルビトール中 に懸濁させ、２００μｌの部分試料をｐＵＴ（ＡＸ）ＤＮＡ（２０−１００μｇ ）と混合しそして氷冷２ｍｍ電極間隙電気穿孔キュベットの中に移しそしてイン ヴィトロゲン・エレクトロポレーター装置を使用して以下の設定で電気穿孔した ：電圧１８００Ｖ、キャパシタンス５０μＦ、平行抵抗１５０Ω。細胞を１Ｍソ ルビトールを含有する２ｍｌのＹＥＰＤ中に移しそしてシェーカー上で３０℃に おいて一夜培養した。転換させた細胞を低速遠心により集め、そしてｐＨ７．５ に滴定されているＹＥＰＤ培地を含有し且つ３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを 含有する板の上で板培養した。板を３０℃において７−１０日間培養した。同様 な数のコロニーが対照板（それは同様に処理された細胞を含有していたがＤＮＡ の添加はなかった）上で出現したため、この時間中に成長した酵母コロニーの大 部分は背景変異体であった。自生変異体と真の被転換体を区別するために、染色 体ＤＮＡを７２個の個別酵母コロニーから上記のＴ．カンジダ染色体ＤＮＡを単 離するためのスケールダウン方法により単離した。１０μｇずつのこれらのＤＮ ＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの混合物を用いて切断した。消化物を１％アガ ロースゲル上で分離しそして 次に実施例５に記載されている通りに正に荷電されたナイロン膜の上ににじませ た。にじみ点をアラビトール−脱水素酵素配列およびｐＵＣ配列を含有するが（ 可能な同種酵母配列間のハイブリッド形成を避けるため）酵母源のＤＮＡフラグ メントは含有していないプラスミドｐＡＤＨ（実施例２）からのＤＮＡを用いて 検査した。プローブに標識づけしそしてにじみ点をＤＩＧ ＤＮＡ標識づけおよ び検出キット（ベーリンガー１０９３ ６５７）を使用して塗り付けた。転換性 プラスミド（２−３ｋｂ領域中の３つの帯）の構造に匹敵するハイブリッド形成 信号を有する１個だけのクローン（Ｔ．カンジダ：：ｐＴＣ（ＡＸ））が非常に 低い転換効率を示すことが発見された。陽性ハイブリッド形成信号がもう１つの クローンに関して検出されたが、その１つだけのハイブリッド形成帯の位置（約 ５−７ｋｂ）はｐＴＣ（ＡＸ）のフラグメントだけが酵母染色体中に組み込まれ たかまたは幾らかの転位が組み込み部位で起きたことを示していた。我々はプラ スミドがＴ．カンジダ染色体中に組み込まれたと推定した。この推定は非−選択 的培地中での成長およびクローン化後にＴ．カンジダ：：ｐＴＣ（ＡＸ）の全て のクローンがフレオマイシン抵抗性表現型を保有するという観察と矛盾しない。 Ｔ．カンジダ：：ｐＴＣ（ＡＸ）被転換体を１０％グルコースを含有するＹＥ ＰＤ培地中で３６時間成長させ、そしてアラビトール脱水素酵素およびキシリト ール脱水 素酵素活性を実施例４に記載されている通りに測定した。 結果は表５に示されている。 キシリトール−脱水素酵素の活性は内因性Ｔ．カンジダキシリトール脱水素酵 素の活性水準より意義あるほどは増加しなかった。プラスミド−コードづけされ たアラビトール−脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１１）の活性を内因的に同義で あるが異なっている（リブロース−生成性、ＥＣ１．１．１．）の活性から分離 するのは困難である。この実験からの唯一の最終的結論は、両方の酵素の発現水 準がＺ．ロウキシイよりはるかに低いことであった。Ｔ．カンジダ：：ｐＴＣ（ ＡＸ）を増加したフレオマイシン濃度を高めながら培地上で培養することにより プラスミドコピー数および組み込みプラスミドの２種の脱水素酵素の発現水準を 増加しようとする試みは成功しなかった。 Ｔ．カンジダ：：ｐＴＣ（ＡＸ）によるキシリトール生成を、それを１０％グ ルコースを含有するＹＥＰＤ中で５−７日間成長させた後に試験した。３回の個 別実験において、被転換体は１．１、１．６、および０．９ｇ／ｌのキシリトー ルを生成したが、野生型Ｔ．カンジダの培養培地中ではＨＰＬＣによりキシリト ールは検出されなかった。我々が使用した分析方法の検出限度は０．１ｇ／ｌ以 下である。従って、Ｔ．カンジダ：：ｐＴＣ（ＡＸ）によるキシリトール生成は 実際にはプラスミドにより測定されると結論できる。 実施例７ アラビトール−脱水素酵素およびキシリトール−脱水素 酵素遺伝子を用いるカンジダ・ポリモルファ（Candida polymorpha）の転換 アラビトール脱水素酵素およびキシリトール脱水素酵素遺伝子をカンジダ・ポ リモルファ中に加えるためには、燐酸オロチジン脱水素酵素遺伝子中の変異体（ 以下ではＵＲＡ３とも称される）をボエケ（Boeke）他の方法（ボエケ，Ｊ．Ｄ ．他、Mol．Gen．Genet.、１９７：３４５−３４６（１９８４））を使用して単 離した。Ｃ．ポリモルファ菌株ＡＴＣＣ２０２１３をＹＥＰＤ中で２４時間成長 させ、細胞を遠心（２０００ｒｐｍ、１０分間）により集め、水で２回洗浄し、 そして３容量の殺菌性０．１Ｍ離散ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０の中に懸濁さ せた。メタンスルホン酸エチルを１％濃度となるまで加え、そして細胞を室温に おいて２時間培養した。細胞を０．１Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液中に移しそして それらを殺菌水で３回洗浄することにより反応を停止させた。変異生成細胞を０ ．５リットルのＹＥＰＤ中に移しそして３０℃において振盪しながら２日間にわ たり成長させた。酵母を遠心により集め、水で２回洗浄しそして０．７％のイー ストナイトロジェンベース（ジフコ）、２％のグルコース（ＳＣ培地）を含有す る１リットルの培地中に移し、そして回転振盪機中で３０℃において２４時間培 養した。１ｍｇのニスタチンを培養物に加えそして培養を４時間続けた。ニスタ チン−処理細胞を遠心により培地から分離し、水で２回洗浄し、５０ｍｇ／リッ トルの ウラシルを含有する１リットルのＳＣ培地中に移した。細胞を回転振盪機中で５ 日間培養しそして次に５０ｍｇ／リットルのウラシルおよび１ｇ／リットルのフ ルオロオロチン酸を含有するＳＣ培地板の上で板培養した。板を３０℃において ２週間培養した後に、約４００個のフルオロオロチン酸抵抗性コロニーが得られ 、そしてそれらの全てをウラシル栄養要求に関して試験した。５個のウラシル− 依存性クローンを単離した。しかしながら、３個のクローンはウラシルを含まな い培地中で成長したが、速度は減少した。明らかなウラシル−依存性表現型を有 する２個のクローン（Ｃ．ポリモルファＵ−２およびＣ．ポリモルファＵ−５と 名付けられる）を転換実験用に使用した。 Ｃ．ポリモルファＵＲＡ３遺伝子のクローン化は一般的方法により行われた。 染色体ＤＮＡを実施例５に記載されている方法により単離した。ＤＮＡをＳａｕ ３Ａを用いて部分的に切断しそしてアガロースゲル上で分別した。５、６個の留 分を集めそしてそれらの分子寸法分布を分析ゲル電気泳動により検査した。５〜 １０ｋｂ範囲の留分をクローン化実験用に使用した。ライブラリー構成用に使用 されるベクターであるｐＹＥｐ１３（ブローチ（Broach）他、Gene、８：１２１ −１３３（１９７９））はＳ．セレヴィシエＬＥＵ２遺伝子、２μの複製源およ びＢａｍＨＩ用の独特な制限部位を含有する。ベクターをＢａｍＨＩを用いて切 断し、アガロースゲル電気 泳動により精製し、そして細菌性アルカリ性ホスファターゼを用いて脱ホスホリ ル化した。ベクター対挿入部の比および反応容量を変えて、小規模実験で数個の 独立したベクター調合物および連結反応条件を試験して最大数の被転換体および 最高百分率の組み換えクローンを最適化した（不規則的クローンからのプラスミ ド微小調合の制限分析により分析された）。大規模連結反応は最適化条件を使用 して行われ、そして大腸菌の菌株ＬＣ１−ＢＬＵＥに転換させた。構成されたラ イブラリーは約１５，０００個の一次被転換体を含んでおり、その約９０％は挿 入−含有性であった。 酵母菌株ＤＢＹ７４６（ＭＡＴａｌｐｈａ、ｌｅｕ２−３，１１２、ｈｉｓ３ −Ａｌ、ｔｒｐｌ−２８９、ｕｒａ３−５２）をＣ．ポリモルファ遺伝子ライブ ラリーを用いて転換させた。約２０μｇのプラスミドＤＮＡを別個に使用しそし て被転換体をウラシル、トリプトファンおよびヒスチジンが補充されている１つ の板の上で板培養して（すなわちロイシン選択だけを使用して）各々のライブラ リープールをＳ．セレヴィシエに転換させた。１つの板当たり３，０００−１０ ，０００個の酵母被転換体が得られた。酵母被転換体を次にトリプトファンおよ びヒスチジンが補充されている最小培地を有する板（ウラシルが除かれた板）の 上でレプリカ板培養した。ヒスチジン−ヒスチジン（ウラシルが除かれた板）の 上の対照レプリカも製造された。ヒスチジンが除かれたお よびトリプトファンが除かれた板上の対照レプリカも製造された。１〜４個のウ ラシル−依存性クローンがほとんど全ての板の上で出現した。ヒスチジン−依存 性およびトリプトファン−依存性単離体も得られたが、単離体の数はＵＲＡ３単 離体より２−３倍低かった。 ウラシル−依存性クローンのうちの６個からのプラスミドを大腸菌の中で救済 し、製造用規模で単離し、そしてＤＢＹ７４６をロイシン原栄養性に再転換する ために使用した。各々の転換からの１０−２０個の不規則的コロニーを次にウラ シル依存性に関して検査した。６個の救済されたプラスミドのうちの５個がＤＢ Ｙ７４６をＬｅｕ＋Ｕｒａ＋表現型に転換させた。名付けられた５個のプラスミ ドの制限分析は非常に似ている制限パターンを表していた。これらのパターンは 非常に複雑であるためクローン化されたフラグメントの明確な制限地図を製造す ることは難しい。しかしながら、ＨｉｎｄＩＩＩ消化により全てのクローン中で ＤＮＡ挿入部（約４．５ｋｂ）のほとんどを覆うフラグメントが発生することが 見いだされた。Ｃ．ポリモルファＵＲＡ３単離体の１個からのこのフラグメント −ｐＣＰ２９１−をアガロースゲル電気泳動により精製しそしてＨｉｎｄＩＩＩ で部分的に消化されたｐＪＤＢ（ＡＸ）にサブクローン化した。このクローン化 実験の結果として単離されたプラスミドｐＣＰＵ（ＡＸ）の構造は図７Ａ．Ｚに 示されている。 Ｃ．ポリモルファＵ−２およびＣ．ポリモルファＵ−５の両者の転換は実施例 ６に記載されているのと同じ電気穿孔条件を使用して試みられた。電気穿孔され た細胞を、１Ｍソルビトールを含有するＹＥＰＤ中で一夜振盪した後に、ＳＣ培 地板上で２回にわたり板培養した。３０℃における１０日間の培養後に、約１０ ０個のコロニーがｐＣＰＵ（ＡＸ）で転換されたＣ．ポリモルファＵ−２を含有 する板の上で観察されたが、対照板（ＤＮＡは加えられずに同様に処理されたこ の菌株の細胞を含有する）上のコロニー数は１４であった。Ｃ．ポリモルファＵ −５はＤＮＡなしの対照上の転換実験では意義ある効果を示さなかった。Ｃ．ポ リモルファＵ−２転換板からの３個の不規則的クローンを最初に新しいＳＣ培地 上で画線培養しそしてこれらの画線を使用して１５％のグルコースを含有する１ ００ｍｌのＹＥＰＤ培養物に接種した。対照培養物にはＣ．ポリモルファＵ−２ を接種した。３０℃における１０日間にわたる回転振盪機上での培養後に、培養 培地中のキシリトール含有量をＨＰＬＣにより分析した。この実験の結果を表６ に示す。 異なるクローン間でキシリトール生成水準における相当な変動が観察された。 それはＣ．ポリモルファ染色体の異なる位置におけるプラスミドｐＣＰＵ（ＡＸ ）の組み込みの結果であるかもしれない。菌株Ｃ．ポリモルファＵ−２：：ｐＣ ＰＵ（ＡＸ）−２は多分復帰変異体でありそして真の被転換体ではない。しかし ながら、これらの実験はアラビトール−キシリトール工程もＣ．ポリモルファ中 に加えらていれるかもしれないことを明白に示していた。 実施例８ 酸化性燐酸ペントース工程の酵母のクローン化および耐浸透圧性酵母中でのそれ らの過剰発現 酸化性燐酸ペントース工程の第一酵素であるＤ−グルコース−６−ホスフェー ト脱水素酵素をＳ．セレヴィシエ中でＡＺＷＦ１遺伝子によりコードづけした。 この遺伝子の配列は既知である（ノガエ（Nogae）Ｔ．およびジョンストン（Joh nston），Ｍ．、Gene、９６：１６１−１９（１９９０）；トーマス（Thomas） Ｄ．他、The BMB0 J.、１０：５４７−５５３（１９９１））。完成コードづけ 領域である５′−非コードづけ領域の６００ｂｐおよび３′−非コードづけ領域 の４５０ｂｐを含む遺伝子を２種のオリゴヌクレオチド類： ＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣ（５′−オリゴヌクレ オチド）［配列番号：３］および ＡＡＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣ（３′ −オリゴヌクレオチド）［配列番号：４］を使用するＰＣＲによりクローン化し た。ノガエ，Ｔ．およびジョンストン，Ｍ．、Gene、９６：１６１−１９（１９ ９０）に記載されている通りのＤ−グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素の 番号指定において、５′−オリゴヌクレオチドを位置９８２−１００７において アニーリングし、そして３′−オリゴヌクレオチドを位置３５２３−３５５５に おいてアニーリングした。染色体ＤＮＡをＳ．セレヴィシエ菌株ＧＲＦ１８から 実施例３に記載されている方法により単離した。ＰＣＲパラメーターは実施例３ 中と同じであった。ＺＷＦ１伝子を含有する増幅されたＤＮＡフラグメントをＳ ａｌＩで消化させそして同じ制限酵素で消化させたｐＵＣ１９中でクローン化し てプラスミドｐＵＣ（ＺＷＦ）を生じた。クローン化された遺伝子の同定を制限 分析により検査した。 燐酸ペントースの第二酵素である６−ホスホグルコン酸脱水素酵素を大腸菌中 でｇｎｄ遺伝子によりコードづけした。この遺伝子のオリゴヌクレオチド配列は 既知である（ナソフ（Nasoff），Ｍ．Ｓ．他、Gene、２７：２５３−２６４（１ ９８４））。大腸菌からのｇｎｄ遺伝子をクローン化するために、染色体ＤＮＡ を大腸菌の菌株ＨＢ１０１からクレブシエラ・テリゲナＤＮＡの単離のために使 用された方法（実施例１）と同じ方法により単 離した。ｇｎｄ遺伝子のＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチド類 （ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧ ［配列番号：５］およびＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴ ＴＣＧＧＴＡＴＧＧ［配列番号：６］を設計してコードづけ領域だけを増幅しそ して初期化コドンのすぐ上流に且つ停止コドンのすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位 を加えた。ナソフ，Ｍ．Ｓ．他、Gene、２７：２５３−２６４（１９８４）に記 載されている通りのＤ−グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素の番号指定に おいて、５′−オリゴヌクレオチドを位置５６−７８においてアニーリングし、 そして３′−オリゴヌクレオチドを位置１４２２−１４６８においてアニーリン グした。増幅させたＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化させそしてＨｉ ｎｄＩＩＩ消化させたベクターｐＵＣ１９と連結反応させた。生じたプラスミド ｐＵＣ（ｇｎｄ）の１０個の独自の明らかに同一のクローンをプールした。これ はＰＣＲ増幅中に加えられたかもしれない配列誤差に伴う起こり得る問題を避け るために行われた。ｐＵＣ（ｇｎｄ）プールからの１．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ を発現ベクターｐＡＡＨ５（アンメラー（Ammerer）、Meth．Bnzymol.、１０１ ：１９２−２０３（１９８３））中に移すことにより、ｇｎｄ遺伝子のコードづ け領域をＳ．セレヴィシエＡＤＣＩプロモーターおよび転写ターミネー ターと融合させた。生じたプラスミドｐＡＡＨ（ｇｎｄ）の数個の独立クローン を塩化リチウム方法（イトウ他、J．Bacteriol．、１５３：１６３−１６８（１ ９８３））によりＳ．セレヴィシエ菌株ＧＲＦ１８中に移し、そして６−ホスホ −Ｄ−グルコネート脱水素酵素の活性を被転換体中で測定した。全ての被転換体 において、６−ホスホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素の活性は転換されていない 宿主と比べて数倍高められ、それは細菌性６−ホスホ−Ｄ−グルコネート脱水素 酵素が酵母中で効果的に発現可能であることを示している。酵母中で最高活性を 生じたｐＡＡＨ（ｇｎｄ）のクローンをその後の構造用に選択した。ＺＷＦ１お よびｇｎｄ遺伝子のクローン化並びにｐＡＡＨ（ｇｎｄ）プラスミドの構造は図 ８および８ａに示されている。 耐浸透圧性酵母宿主中でＤ−グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素および ６−ホスホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素遺伝子の両者を同時に過剰発現させる ために、プラスミドｐＳＲＴ（ＺＧ）を構成した。このプラスミドを構成するた めの方法は図９に示されている。簡単に述べると、プラスミドｐＡＡＨ（ｇｎｄ ）からの６−ホスホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素発現カセットを３．１ｋｂ ＢａｍＨＩＤＮＡフラグメントとしてＢａｍＨＩ切断ｐＵＣ１９の中に移した。 生じたプラスミドｐＵＣ（ＡＤＨｇｎｄ）をＳａｃＩおよびＸｂａＩを用いる分 裂させ、そして３．１ｋｂ ＤＮＡフラグメントをア ガロースゲル電気泳動により精製した。このフラグメントを２個の他のＤＮＡフ ラグメントであるＳａｃＩを用いる消化およびＰｓｔＩを用いる部分的消化によ り得られたｐＵＣ（ＺＷＦ）の２．５ｋｂフラグメントとＰｓｔＩおよびＸｂａ Ｉで消化されたプラスミドｐＳＲＴ（ＡＸ）−９（実施例３）のベクターフラグ メントに連結反応させた。生じたプラスミドｐＳＲＴ（ＺＧ）の構造は制限分析 により確認された。Ｚ．ロウキシイＡＴＣＣ１３３５６をｐＳＲＴ（ＺＧ）を用 いて（実施例４に記載されている方法により）転換させた後に、Ｄ−グルコース −６−ホスフェート脱水素酵素および６−ホスホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素 の活性を転換させた菌株中で測定した。両方の酵素は転換させた菌株中では転換 させなかった対照より約２０倍ほど高い活性を有していた（表７）。同様な方法 を使用して他の酵母種中で燐酸ペントース工程の酸化性部分の酵素をコードづけ する２種の遺伝子の過剰発現を得ることができる。しかしながら、サッカロミセ スまたはジゴサッカロミセス以外のほとんどの酵母種中に染色体外プラスミドと して保持可能なベクターがないため、組み込み転換がそのような宿主用の唯一の 有用な方法である。好ましい型の組み込みベクターはリボソームＤＮＡ座におけ る組み込み用に目標づけされたベクターであり、その理由はこの型のベクターは 高いコピー数組み込みを与え且つその結果としてより高い発現水準を与えるから である（ロペス（Lopes），Ｔ． Ｓ．他、Gene、７９：１９９−２０６ １９８９））。 実施例９ 酵母中のトランスケトラーゼ異性体の構成 酵母中のトランスケトラーゼ異性体は最も一般的には部位指定遺伝子破壊方法 により得られるが、一般的な化学的変異生成も適用可能である。遺伝子破壊技術 を適用するためには変異生成が望まれる酵母種からクローン化された同種トラン スケトラーゼ遺伝子が一般的に必要であるが、時には非常に近い関連種からの異 種クローンを使用することもできる。Ｓ．セレヴィシエからのトランスケトラー ゼの配列は既知である（フレッチャー（Fletcher），Ｔ．Ｓ．およびウィー（Kw ee），Ｉ．Ｌ．、ＥＭＢＬ ＤＮＡ配列ライブラリー、ＩＤ：ＳＣＴＲＡＮＳＫ 、受け入れ番号Ｍ６３３０２）。この配列を使用して、Ｓ．セレヴィシエ・トラ ンスケトラーゼ遺伝子をＰＣＲ．オリゴヌクレオチド類ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡ ＴＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧ［配列 番号：８］によりクローン化し、そしてトランスケトラーゼ遺伝子を含有するＤ ＮＡフラグメントの増幅用にＳ．セレヴィシエからの染色体ＤＮＡ（上記の如く して単離された）を使用した。（フレッチャー，Ｔ．Ｓ．およびウィー，Ｉ．Ｌ ．、ＥＭＢＬ ＤＮＡ配列ライブラリー、ＩＤ：ＳＣＴＲＡＮＳＫ、受け入れ番 号Ｍ６３３０２）に記載されている如きトランスケトラーゼの番号指定において ５′−オリゴヌクレオチドを位置２６９−３０４に おいてアニーリングしそして３′−オリゴヌクレオチドを位置２２７１−２３０ ５においてアニーリングした。フラグメントをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを用い て消化させそして同じ酵素で分裂させたｐＵＣ１９中でクローン化した。生じた プラスミドｐＵＣ（ＴＫＴ）の制限分析は、クローン化されたＤＮＡフラグメン トの同定を確認した。このプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩを用いて切断 し、そして大きいＤＮＡフラグメントをアガロース電気泳動により精製した。こ のフラグメントをプラスミｐＵＴ３３２から単離された２個のＤＮＡフラグメン ト（ガチグノール（Gatignol），Ａ．他、Gene、９１：３５−４１（１９９０） ）：；ＵＲＡ３遺伝子およびブレオマイシン抵抗性遺伝子の３′一部分を担持す るＣｌａＩ−ＰｓｔＩフラグメント並びに酵母ＴＥＦ１（転写伸長ファクター１ ）プロモーターおよびブレオマイシン抵抗性遺伝子コードづけ配列の５′一部分 を担持するＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメントと連結反応させた。上記 の連結反応混合物を用いる大腸菌の転換およびプラスミドクローンの制限分析後 に、プラスミドｐＴＫＴ（ＢＬＵＲＡ）を単離した。このプラスミドはＳ．セレ ヴィシエ・トランスケトラーゼ遺伝子のコードづけ配列を含有しており、その中 でＣｌａＩおよびＢｇｌＩＩ部位間の９０ｂｐフラグメントがＴＥＦ１プロモー ターおよびＣＹＣ１転写ターミネーターの調節下でＳ．セレヴィシエ中で選択可 能な２つのマーカーすなわ ちＵＲＡ３遺伝子およびブレオマイシン抵抗性遺伝子のフラグメントで置換され ている。このプラスミドを使用して、塩化リチウム方法（イトウ他、J．Bactero l.、１５３：１６３−１６８（１９８３））によりＳ．セレヴィシエ菌株ＤＢＹ ７４６（ＡＴＣＣ４４７７３；ＭＡＴα ｈｉｓ３Ａ１ ｌｅｕ２−３， １１ ２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐｌ−２８９）をプレオマイシン抵抗性（１０μｇ／ ｍｌのＹＥＰＤ培地中フレオマイシン）に転換させた。被転換体をウラシル原栄 養性およびＤ−キシルロース上での成長能力に関して試験した。その中の３個が Ｄ−キシルロース上では減じられた成長を示したものであるような５個のＵＲＡ ３クローンを１００ｍｌの培養物中で成長させ、ガラスビーズと共に振ることに より細胞抽出物を製造し、そしてトランスケトラーゼ活性を粗製抽出物中で測定 した。検定は、３ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭピロ燐酸チアミン、０．２ ５ｍＭ Ｎ ＡＤＨ、および０．２ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミンを含有する０． １Ｍグリシル−グリシン緩衝液、ｐＨ７．６の中で行われた。測定直前に、０． ５Ｍ Ｄ−キシロース−５−ホスフェートおよび０．５Ｍリボース−５−ホスフ ェートを含有する３μｌの溶液を１ｍｌの上記緩衝液に加え、その後に７．５Ｕ のトリオースホスフェート・イソメラーゼおよび１．５Ｕのα−グルセロホスフ ェート脱水素酵素（両者ともシグマから）を加えた。菌株ＤＢＹ７４６の細胞抽 出物を対照として使用した。ＤＢ Ｙ７４６の粗製抽出物およびＤ−キシロース上の非遅延成長の２個の被転換体中 のトランスケトラーゼ活性は約０．２５Ｕ／ｍｇの蛋白質において容易に測定可 能であった。Ｄ−キシロース上での減じられた成長の３個の被転換体は我々の方 法の検出限度以下のトランスケトラーゼ活性（野生型より少なくとも２０倍低い ）を有していた。Ｄ−グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素および６−ホス ホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素の活性も細胞抽出物の製造中に起こりうる酵素 不活性化用の対照として測定した。これらの２種の酵素の活性は全ての６種の菌 株中で非常に似ていた。従って、Ｄ−キシロース上で劣悪に成長した３個のクロ ーンがトランスケトラーゼ遺伝子中で変異体を含有していたことが結論づけられ た。破壊されたトランスケトラーゼ遺伝子を有する菌株の成長は芳香族アミノ酸 フェニルアラニンおよびチロシンが欠けた合成培地上では幾分遅延したが、効果 はＤ−キシロース利用に対するこの変異体の影響より小さかった。 他の酵母種からのトランスケトラーゼ遺伝子は上記のＳ．セレヴィシエ中のト ランスケトラーゼ変異体の相補により簡単にクローン化することができる。好適 には、適当なベクター（例えば、既知のプラスミドＹＥｐ１３）中での非−サッ カロミセス酵母菌株の遺伝子ライブラリーを構成し、このライブラリーをトラン スケトラーゼ変異体（例えば、上記の遺伝子破壊により得られる変異体）を担持 するＳ．セレヴィシエ菌株に転換させそし てＤ−キシロース上での回復された成長の被転換体を選択することにより、クロ ーン化を行うことができる。プラスミドＤＮＡはそのようなＤ−キシロース−陽 性被転換体から救済させそして同じ受容体菌株を転換させるために使用すること ができる。この被転換体からの全てのクローンはＤ−キシロース上で良好に成長 しるはずである。トランスケトラーゼ活性は被転換体から測定することができ、 そして意義ある水準のその再出現性はクローン化された遺伝子の同定の証明とな る。追加のおよび最終的な証明はクローン化されたＤＮＡの短い伸長部を配列さ せそしてＳ．セレヴィシエ・トランスケトラーゼ遺伝子配列と同種の配列の片を 見いだすことによりまたはＳ．セレヴィシエからの自生トランスケトラーゼクロ ーンを用いてクローン化されたＤＮＡフラグメントのハイブリッド生成を示すこ とにより行われる。或いは、クローン化方法は非−サッカロミセス酵母の遺伝子 ライブラリーからのトランスケトラーゼ遺伝子を含有するクローンを選択するた めの主要方法としてのＤＮＡハイブリッド生成を基にしてもよい。Ｓ．セレヴィ シ・エトランスケトラーゼ遺伝子のフラグメントをコロニーまたはプラークハイ ブリッド生成実験用のプローブとして使用することができ、そして最強のハイブ リッド生成信号を与えるクローンを部分的配列化によりさらに分析することがで きる。 選択された酵母種からのトランスケトラーゼ遺伝子の クローン化用にどの方法を使用しても、この酵母中の変異体トランスケトラーゼ 遺伝子を得るためのその後の段階は同じである。クローン化されたＤＮＡフラグ メントは、部分的制限地図を作成しそして好適にはトランスケトラーゼ遺伝子の コードづけ領域を局在化することにより、同定すべきである。次に、選択された 酵母中の選択可能マーカーとして機能しうるＤＮＡの片をこのフラグメントのい ずれかの端部から数百個のｂｐより近くないトランスケトラーゼ遺伝子含有ＤＮ Ａフラグメント中に挿入した。プラスミドｐＵＴ３３２からの上記カセットの如 き強い酵母プロモーターの調節下で細菌性フレオマイシン遺伝子を含有するカセ ットを、例えば、優性選択性マーカーとして多くの酵母種用に使用することがで きた。トランスケトラーゼ遺伝子のコードづけ領域を挿入されたＤＮＡにより破 壊するか、または好適には挿入されたＤＮＡ構造を次にＳ．セレヴィシエ中でト ランスケトラーゼ変異体を得るための上記方法と同様な方法により選択された酵 母中のトランスケトラーゼ遺伝子の染色体コピーを破壊するために使用できるよ うな方式で、選択性マーカーを担持するＤＮＡフラグメントの挿入を行うことが 必須である。いずれの適当な転換方法でも使用することができ、好適な方法はプ ロトプラスト転換および電気穿孔である。破壊されたトランスケトラーゼ遺伝子 を担持するクローンの選択はＳ．セレヴィシエ用の上記方法と同様にして行うこ とができる。また、サザーン ハイブリッド生成によるトランスケトラーゼ染色体領域の構造分析を変法として または他の方法に加えて使用することができる。 実施例１０ Ｄ−リブロキナーゼ遺伝子のクローン化 Ｄ−リブロキナーゼ遺伝子をクローン化するための好適な方法はＤ−アラビト ール脱水素酵素のクローン化に関して実施例１に記載されている方法と同様であ る。例えば大腸菌およびクレブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes） の如き数種の細菌中のＤ−リブロキナーゼがリビトール利用オペロンの一部であ ることは既知である（ロヴィニー（Loviny），Ｔ．他、Biochem．J．、２３０： ５７９−５８５（１９８５））。大腸菌Ｂ菌株はこのオペロンを含有せず従って リビトールを炭素源として利用できないことも既知である。従って、大腸菌Ｂ菌 株（例えば一般的な研究室菌株ＨＢ１０１およびＪＭ１０３または高い効率で転 換しうる菌株、例えばストラタゲンからのＳＣＳ１またはＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を いずれかの適当なベクター、好適にはｐＵＣ１９中で構成されたリビトール−利 用細菌の遺伝子ライブラリーを用いて転換させることができる。例えばクレブシ エラ・テリゲナの如き非−病原性細菌種がＤ−リブロキナーゼ遺伝子単離用の好 適な原料有機体である。リビトールを単一炭素源として含有する最小培地上で成 長可能な大腸菌被転換体を次に選択することができる。そのようなリビト ール−陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを単離しそして大腸菌Ｂ菌株を再転 換させるために使用することができる。そのような再転換からの全ての被転換体 は単一炭素源としてのリビトール上で成長させるべきである。クローン化された 挿入部の制限地図を次に作成することができる。この地図を使用して、元のクロ ーンの種々の削除誘導体を製造しそして上記の機能試験によりリビトールオペロ ンの保有に関して分析することができる。数個の連続的削除を行ってリビトール オペロンを担持するＤＮＡフラグメントの寸法を３．５−４ｋｂ（Ｋ．アエロゲ ネス中のこのオペロンの寸法）に最少化できる。最後に、Ｄ−リブロキナーゼ遺 伝子の（部分的）ヌクレオチド配列を測定しそして適当な天然産出制限部位を使 用するかまたはそのような部位の導入用の既知のＰＣＲ技術を使用してこの遺伝 子のコードづけ領域を励起できる。Ｄ−リブロキナーゼ遺伝子は他の宿主、好適 には酵母中で、例えばＤ−リブロキナーゼ遺伝子のコードづけ領域を適当なプロ モーターおよび転写ターミネーターと融合させ、発現カセットを選択された宿主 の転換用に適するベクターに移し、被転換体を得て、そして最後にＤ−リブロキ ナーゼ発現の効果を変動させるような標準的工程を含む方法により発現させるこ とができる。 実施例１１ Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ遺伝子のクローン化およ び過剰発現 同種Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼをパン酵母（工業 用サッカロミセス・セレヴィシエ酵母）から単離する方法は既知である（ウィリ アムソン（Williamson），Ｗ．Ｔ．他、Meth．Enzymol.、９：６０５−６０８（ １９６６））。酵素を単離することができ、そしてＮ−末端並びに部分的内部ア ミノ酸配列を一般的に既知の方法により測定することができる。次にこのように して得られた部分的アミノ酸配列を使用して、逆翻訳として知られている方法に より、オリゴヌクレオチドの配列を生成することができ、次にそれを使用してポ リメラーゼ鎖反応を準備することができる。ＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラ グメントをハイブリッド生成ブローブとして使用してＤ−リブロース−５−ホス フェート−３−エピメラーゼ遺伝子の全長コピー用の酵母遺伝子ライブラリーを スクリーニングできる。他の酵母宿主中でＤ−リブロース−５−ホスフェート− ３−エピメラーゼ遺伝子を過剰発現させるための好適な方法はそれを希望する宿 主中の高いコピー数を有するベクター（例えば、Ｚ．ロイキシイ用のｐＳＲＴ３ ０３Ｄベクター）中でクローン化する方法である。遺伝子を過剰発現させるため の別のそしてさらに有効な方法は、翻訳開始コドン周辺のＤ−リブロース−５− ホスフェート−３−エピメラーゼ遺伝子の少なくとも部分的なヌクレオチド配列 を決定しそしてこの情報をＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラー ゼ遺伝子のコードづけ配列を単 離するためおよびそれを選択された宿主中で効果的に機能することが知られてい るプロモーターと融合させるために使用する方法である。 実施例１２ Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝子のクローン化およびＤ−キシルロキナーゼ変異体の 構造 Ｄ−キシルロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）を異なる酵母種からクローン 化する方法は記載されている（ホー（Ho），Ｎ．Ｗ．Ｙ．他、Enzyme Microbiol ．Technol.、１１：４１７−４２１（１９８９）；スティーヴィス（Stevis）， Ｐ．Ｅ．他、Applied and Environmental Microbiol.、５３：２９７５−２９７ ７（１９８７））。また、Ｓ．セレヴィシエ中で遺伝子破壊によりＤ−キシルロ キナーゼ変異体を構成するための方法も記載されている（スティーヴィス，Ｐ． Ｅ．他、Appl．Ｂiochem．Biotechnol.、２０：３２７−３３４（１９８９）） 。他の酵母中でＤ−キシルロキナーゼ変異体を構成するために同様な方法を使用 できる。Ｓ．セレヴィシエ以外の酵母種に関しては、Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝 子用に使用される共通マーカーは好適には優性抗生物質抵抗性マーカーである（ 実施例９参照）。或いは、化学的（例えば、メタンスルホン酸エチルまたはアク リフラビンを用いる処理）または物理的（紫外線、Ｘ線）変異生成を基にした古 典的な変異体構成方法を使用することもできる。変異体富裕化は、変異生成細胞 を単一炭素源 としてのＤ−キシルロース上で成長細胞だけを死滅させる抗生物質（ニスタチン ）の存在下で成長させることにより行うことができる。Ｄ−キシルロキナーゼ変 異体が成長用の単一炭素源としてＤ−キシルロースを利用できないという性質を を変異体の選択用に使用することができる。 実施例１３ Ｄ−アラビトールを介してキシリトールを改良された収率で製造する菌株 実施例４は例えばＤ−グルコースの如き構造的に関連のない炭素源からＤ−ア ラビトールを重要な中間生成物として利用する工程によりキシリトールを製造し うる酵母菌株の構成方法を記載している。この「Ｄ−アラビトール工程」を利用 する菌株を用いる発酵におけるキシリトール収率を改良するためには、Ｄ−アラ ビトール収率を改良しなければならない。Ｄ−アラビトール−生成性酵母中でＤ −グルコースからＤ−アラビトールを生ずる工程はすでに記載されている（イン グラム（Ingram），Ｊ．Ｍ．他、J．Bacteriol．８９：１１８６−１１９４（１ ９６５））。Ｄ−アラビトールはＤ−リブロース−５−ホスフェートから脱ホス ホリル化およびＮＡＤＰＨ−連結Ｄ−リブロースレダクターゼを用いる還元を介 して製造される。Ｄ−グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素および６−ホス ホ−Ｄ−グルコネート脱水素酵素を用いる２つの連続的な不可逆的脱水素化工程 によるＤ −リブロース−６−ホスフェートからのＤ−リブロース−５−ホスフェートの製 造は燐酸ペントース（または一燐酸ヘキソースシャント）工程としての酸化別法 として知られている一般的に起きる工程である。燐酸ペントース工程の非−酸化 別法では、Ｄ−リブロース−５−ホスフェートは可逆的にリブロース−５−ホス フェートおよびＤ−キシルロース−５−ホスフェートに異性化される。リブロー ス−５−ホスフェートおよびＤ−キシルロース−５−ホスフェートはトランスケ トラーゼによりさらに代謝される。従って、トランスケトラーゼはＤ−アラビト ール−生成性微生物菌株中で変異可能であり、そしてＤ−アラビトール中で転化 されたＤ−リブロース−５−ホスフェートの部分が増加するであろう。実施例９ はトランスケトラーゼ変異体を得るための方法を記載している。Ｄ−ルビロース −５−ホスフェート生合成速度を上記（実施例８）の燐酸ペントース工程の酸化 別法の酵素をコードづけする２個の遺伝子の過剰発現により最大にすると、Ｄ− アラビトール収率のさらなる増加が得られる。この方法でＤ−アラビトール収率 に関して最適化された菌株を次にキシリトール脱水素酵素およびＤ−アラビトー ル脱水素酵素遺伝子（実施例３および４）を担持する組み換えＤＮＡ構造を用い て転換させて、改良されたキシリトール生成効率で菌株を生成する。 実施例１４ 別工程によりキシリトールを製造する菌株 実施例４および１３に従う方法はＤ−グルコースおよび他の炭素源をキシリト ールに転換させうる微生物菌種の構成用の最も直接的な方法である。これらの方 法は天然産出工程を利用してＤ−アラビトールを種々の炭素源から生成しそして この工程をさらに二つ反応だけ延長させてＤ−アラビトールをキシリトールに転 化させる。しかしながら、この工程が唯一の可能な工程ではない。キシリトール を最終的代謝生成物として生成し且つ中間生成物としてＤ−アラビトールを含ま ない他の工程を構成することもできる。すなわち、同一先駆体であるＤ−リブロ ース−５−ホスフェートからキシリトールへの工程を異なる連続的反応により実 現できる。Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（実施例１１ ）によりＤ−リブロース−５−ホスフェートをＤ−キシルロース−５−ホスフェ ートに効果的に転化させることができ、そしてＤ−キシルロース−５−ホスフェ ートのさらなる転化がトランスケトラーゼ遺伝子中の変異体により防止されるな ら、集めたＤ−キシルロース−５−ホスフェートをＤ−リブロース−５−ホスフ ェートと同じ非−特異的ホスファターゼにより脱ホスホリル化させ（イングラム （Ingram），Ｊ．Ｍ．他、J．Bacteriol．、８９：１１８６−１１９４（１９６ ５））、そしてキシリトール脱水素酵素によりキシリトールに還元することがで きる（実施例３）。この工程の実現には、無益回路：Ｄ−キシルロース−５−ホ スフェート → Ｄ−キシル ロース → Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートによるエネルギー損失を最少 にするためのＤ−キシルロキナーゼ遺伝子（実施例１２）の不活性化をさらに必 要とする。追加の遺伝子変化であるＤ−リブロキナーゼ遺伝子（Ｅ．Ｃ．２．７ ．１．４７）の導入および（過剰）発現により、非特異的ホスファターゼにより 製造されたＤ−リブロースを捕獲することによるそのような菌株によって同時に 起きるＤ−アラビトール製造を最小にすることができる。Ｄ−リブロースは逆に Ｄ−リブロース−５−ホスフェートにそしてさらにＤ−キシルロース−５−ホス フェートに転化されるであろう。 実施例１５ 発酵機培養条件下での組み換えＺ．ロウキシイ菌株の安定性およびキシリトール の生成 延長培養中のキシリトール生成の安定性を選択的条件（選択的培地：５０ｍｇ ／リットルのＧ４１８および３０％グルコースを含有するＹＥＰＤを使用する） および非−選択的条件（Ｇ４１８なしの同一培地を使用する）の両者において検 査した。１個の得られたばかりのＺ．ロウキシイＡＴＣＣ１３３５６の被転換体 ［ｐＳＲＴ（ＡＸ）−９）］を２００ｍｌ容量のＧ４１８含有ＹＥＰＤ中で成長 させた。細胞を５０％グリセロール溶液中１移しそして−７０℃において１ｍｌ の部分試料中で凍結させた。４個の凍結されたＺ．ロウキシイ［ｐＳＲＴ（ＡＸ ）−９）］の部分試料を使用して選択的培地中で ２個の５０ｍｌ培養物にそして非−選択的培養物中で２個に接種した。培養物が 成長の静止段階に達した（３０℃および２００ｒｐｍにおいて５０−６０時間） 後に、試料をペンチトール含有量のＨＰＬＣ分析のために採取しそして１ｍｌの 培養物を使用して他の５０ｍｌの同一培地（選択的または非−選択的）に接種し た。成長−希釈サイクルをさらに４回繰り返した。この実験の条件は大規模発酵 における標準的凍結接種物からの組み換え菌株の増殖と似ている。この実験の結 果は表８に示されている。予期できるように、組み換え菌株の安定性は選択的培 地上の方が高い。しかしながら、非−選択的培地中でさえキシリトール収率にお ける減少は約２０世代後にのみ検出された。選択的条件下では、キシリトール製 造は約３０世代にわたり安定であった。 転換されたＺ．ロウキシイの凍結原料の部分試料を使用し１リットルの下記組 成（１リットル当たり）を有する培地を含有する２リットル発酵機に接種した： ０．１ｇのＮａＣｌ、６．８ｇの燐酸カリウム、０．５ｇの硫酸アンモニウム、 ２０ｇの酵母抽出物および４００ｇのグルコース、５０ｍｇのＧ４８１、ｐＨ６ ．０。培養条件は、通気速度０．５ｖ／分；撹拌４００ｒｐｍ；温度３０℃であ った。 図１０はこの発酵中のグルコース消費およびキシリトール集積の時間過程を示 す。酵母培養物の呼吸活性を反映する溶解された酸素の濃度も示されている。明 白な二 段階成長が観察され、第一段階ではグルコースおよびキシリトール濃度における 平坦部分には約４０時間で達し（利用可能なグルコースがその時点で消費される ものの半分以下）、第二段階はグルコース消費およびキシリトール生成が再開し た時に約２００時間の培養後に観察された。最終的なキシリトール濃度は１５ｇ ／リットルであり、それはフラスコ発酵で得られる濃度の約２倍ほど高かった。 長い遅滞期間を有する二段階成長は、自発的変異体（多分親菌株より高いアルコ ール耐性を有する）が選択されたことを示していた。この仮説を検証するために 、１個のクローンを培養物から発酵機操作の終点で単離した。この単離体を発酵 機中で上記と同じ条件下で成長させた。この実験の結果（図１０１１）により、 約６０時間内の４００ｇ／リットルのグルコースの完全同化可能な変異体が実際 に単離されたことが確認された。実験は、キシリトール−生成性Ｚ．ロウキシイ 菌株も培養培地中の全てのグルコースが消費された時にキシリトールを同化可能 であることも示している。 全ての対照をここでは参考として加える。本発明を今までに十分に記載してき たが、当技術の専門家は本発明の精神もしくは範囲またはその態様に影響を与え ることなくこの範囲を広範囲で且つ同等な濃度、パラメーターなどを用いて実施 できることは理解されるであろう。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： ハルッキ，アヌ エム． ミアスニコフ，アンドレイ エヌ． アパヤラハティ，ユーハ エイチ．エー． パスチネン，オッシ エー． （ii）発明の名称： キシリトールの製造 （iii）配列の数： ８ （iv）通信用住所： （Ａ）受信人： （Ｂ）通り： （Ｃ）都市： （Ｄ）州： （Ｅ）国： （Ｆ）郵便番号： （ｖ）コンピュータの読み取り可能な形式： （Ａ）媒体の形式： フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ： ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）使用したＯＳ： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア： ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０． Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： ＰＣＴ／ＦＩ９３／００４５０ （Ｂ）出願日： １９９３年１１月５日 （Ｃ）分類： （vi）優先権出願データ： （Ａ）出願番号： ＵＳ ０８／１１０６７２ （Ｂ）出願日： １９９３年８月２４日 （vi）優先権出願データ： （Ａ）出願番号： ＵＳ ０７／９７３３２５ （Ｂ）出願日： １９９２年１１月５日 （viii）代理人に関する情報： （Ａ）氏名： （Ｂ）登録番号： （Ｃ）照会／認可証番号： （ix）遠隔通信に関する情報： （Ａ）電話： （Ｂ）ファックス： （２）配列番号：１に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ２８ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：１： （２）配列番号：２に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ２９ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：２： （２）配列番号：３に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ２６ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：３： （２）配列番号：４に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ３３ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：４： （２）配列番号：５に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ３５ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：５： （２）配列番号：６に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ３４ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：６： （２）配列番号：７に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ４４ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：７： （２）配列番号：８に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ： ４４ （Ｂ）配列の型： 核酸 （Ｃ）鎖の数： 両形態 （Ｄ）トポロジー： 両形態 （xi）配列の表示： 配列番号：８：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アパヤラハティ ユーハ ヘイッキ アン テロ フィンランド国 エフアイエヌ―00670 ヘルシンキ キテニーチンティー 24 シ ー（番地表示なし) (72)発明者 パスチネン オッシ アンテロ フィンランド国 エフアイエヌ―02460 カントビク ラヤカッリオ ディー（番地 表示なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の段階： （ａ）Ｄ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロー スの混合物並びに主要成分としてＤ−キシロースまたはＤ−キシルロースを含有 するポリマーおよびオリゴマー以外の炭素源から最終産生物としてキシリトール を合成する新規代謝経路を微生物宿主内に構築し、 （ｂ）上記経路を使用して上記キシリトールの上記合成を提供する条件下並び にＤ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースの混 合物並びに主要成分としてＤ−キシロースまたはＤ−キシルロースを含有するポ リマーおよびオリゴマー以外の炭素源で段階（ａ）の上記組換え体宿主を増殖さ せ、そして （ｃ）段階（ｂ）で産生された上記キシリトールを回収する、 からなる組換え体宿主からキシリトールを製造する方法。 ２．アラビトールが上記経路の中間体である請求項１記載の方法。 ３．上記新規代謝経路が天然宿主中の最終産生物としてアラビトールが得られ るように天然宿主の代謝経路を拡張および／または修飾している請求項２記載の 方法。 ４．上記新規代謝経路の構築がＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1 .1.11）コード化ＤＮＡでアラビトール産生微生物宿主を形質転換することを含 む請求 項３記載の方法。 ５．上記新規代謝経路の構築が、上記の構築された組換え体宿主をキシリトー ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）コード化ＤＮＡで形質転換することを更に 含む請求項４記載の方法。 ６．上記天然宿主がアラビトール産生酵母またはアラビトール産生真菌のいず れかである請求項１記載の方法。 ７．上記宿主がＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）を発現しない請求項 ６記載の方法。 ８．上記宿主がトランスケトラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）を発現しない請求項６記 載の方法。 ９．上記宿主が、キシリトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−グルコース−６−ホス フェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.49）、６−ホスホ−Ｄ−グルコネート デヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.44）およびＤ−リブロース−５−ホスフェート −３−エピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1）コード化ＤＮＡからなる群から選択される １つまたはそれより多いコード化配列で更に形質転換される請求項６記載の方法 。 １０．上記酵母がＺ．ルキシイおよびカンジダ ポリモルファ、トルロプシス カンジダ、ピチア ファリノサ、トルラスポラ ハンセニィからなる群から選 択され、そして上記真菌がデンドリフィエラ サリナおよびシゾフィラム コミ ューンからなる群から選択される請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法 。 １１．上記酵母がＺ．ルキシイである請求項１０記載の方法。 １２．キシリトールがＤ−キシルロース−５−ホスフェートをＤ−キシルロー スに変換し、続いてＤ−キシルロースをキシリトールに還元することによって形 成される請求項１記載の方法。 １３．上記宿主が、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.49）、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1. 44）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1） 、Ｄ−リブロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.47）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ （ＥＣ 1.1.1.9）からなる群から選択される１つまたはそれより多い酵素をコー ドする構築物で更に形質転換される請求項１２記載の方法。 １４．上記宿主がトランスケトラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）を発現しない請求項１ ２記載の方法。 １５．上記宿主が、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.49）、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1. 44）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1） 、Ｄ−リブロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.47）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ （ＥＣ 1.1.1.9）からなる群から選択される１つまたはそれより多い酵素をコー ドする構築物で更に形質転換される請求項 １４記載の方法。 １６．上記宿主がＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）を発現しない請求 項１２記載の方法。 １７．上記宿主が、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.49）、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1. 44）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1） 、Ｄ−リブロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.47）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ （ＥＣ 1.1.1.9）からなる群から選択される１つまたはそれより多い酵素をコー ドする構築物で更に形質転換される請求項１６記載の方法。 １８．上記宿主がトランスケトラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）およびＤ−キシルロキ ナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）を発現しない請求項１２記載の方法。 １９．上記宿主が、Ｄ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｅ Ｃ 1.1.1.49）、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1. 44）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（ＥＣ 5.1.3.1） 、Ｄ−リブロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.47）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ （ＥＣ 1.1.1.9）からなる群から選択される１つまたはそれより多い酵素をコー ドする構築物で更に形質転換される請求項１８記載の方法。 ２０．上記酵母がジゴサッカロミセス ルキシイ、カ ンジダ ポリモルファ、トルロプシス カンジダ、ピチア ファリノサ、トルラ スポラ ハンセニィからなる群から選択され、そして上記真菌がデンドリフィエ ラ サリナおよびシゾフィラム コミューンからなる群から選択される請求項１ ２ないし１９のいずれか１項に記載の方法。 ２１．上記酵母がＺ．ルキシイである請求項２０記載の方法。 ２２．Ｄ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロー スの混合物または主要成分としてＤ−キシロースおよび／またはＤ−キシルロー スを含有するポリマー若しくはオリゴマー以外の炭素源から１回の発酵でキシリ トールを合成することができ、そしてこの合成は対応する非組換え体微生物宿主 の合成より多い、組換え体微生物宿主。 ２３．非組換え体宿主中の最終産生物としてアラビトールが得られる天然代謝 経路が上記組換え体宿主による上記キシリトールの上記合成を高めるように拡張 または修飾されている請求項２２記載の組換え体宿主。 ２４．上記経路がＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.11）コー ド化ＤＮＡを上記宿主中に形質転換することによって拡張または修飾されている 請求項２３記載の組換え体宿主。 ２５．上記経路がキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.9）コード化Ｄ ＮＡを上記宿主中に形質転換す ることによって拡張または修飾されている請求項２４記載の組換え体宿主。 ２６．上記宿主がＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）を発現しない請求 項２２記載の組換え体宿主。 ２７．上記宿主がトランスケトラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）を発現しない請求項２ ２記載の組換え体宿主。 ２８．上記宿主がＤ−キシルロキナーゼ（ＥＣ 2.7.1.17）またはトランスケ トラーゼ（ＥＣ 2.2.1.1）を発現しない請求項２２記載の組換え体宿主。 ２９．上記宿主がキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子で形質転 換されている請求項２２記載の組換え体宿主。 ３０．上記宿主がＤ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1.1.49）をコードする遺伝子で形質転換されている請求項２２記載の組換え 体宿主。 ３１．上記宿主が６−ホスホ−Ｄ−グルコネートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ 1.1 .1.44）をコードする遺伝子で形質転換されている請求項２２記載の組換え体宿 主。 ３２．上記宿主がＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エピメラーゼ（Ｅ Ｃ 5.1.3.1）をコードする遺伝子で形質転換されている請求項２２記載の組換え 体宿主。 ３３．上記宿主がキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする構築物で形質転 換されている請求項２２記載の組換え体宿主。 ３４．上記の非組換え体微生物宿主がアラビトール産 生酵母またはアラビトール産生真菌である請求項２２ないし３３のいずれか１項 に記載の組換え体宿主。 ３５．上記酵母が ジゴサッカロミセス ルキシイ、カンジダ ポリモルファ 、トルロプシス カンジダ、ピチア ファリノサ、トルラスポラ ハンセニィか らなる群から選択され、そして上記真菌がデンドリフィエラサリナおよびシゾフ ィラム コミューンから選択される請求項３４記載の組換え体宿主。 ３６．上記酵母がＺ．ルキシイである請求項３５記載の組換え体宿主。