KR100288889B1 - 형질전환효모한세눌라폴리모르파를이용한인간혈청알부민의제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입(integration)된 형질 전환 효모를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈청 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈청 알부민의 제조 방법, 발현 벡터 및 형질전환 효모에 관한 것이다.
Description
본 발명은 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 재조합 인간 혈청 알부민을 효율적으로 대량 생산하기 위한 알부민 발현벡터 및 이를 함유한 형질전환 균주를 이용하여 인간 혈청 알부민을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세히는, MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입(integration)된 형질 전환체를 선별, 이로부터 알부민을 고효율로 생산하는 형질전환 균주를 선별하여 알부민을 생산하는 방법에 관한 것이다.
인간 혈청 알부민 (Human serum albumin; HSA)은 585 개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다 (Peters, T. The plasma proteins, ed. F.W. Putnam, p. 133(1975), Academic Press Inc). 알부민은 혈장 확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액 보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈청 알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균 또는 바이러스의 오염에 의한 안정성 문제가 최근에 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요하게 되었다.
이와 같은 의학적 중요성으로 인해 유전공학 기법에 의해 여러 미생물 발현 시스템을 이용하여 재조합 알부민을 대량 생산하기 위한 시도들이 행하여져 왔다 (Goodey, A.R. TIBTECH. 11, 430(1993)). 원핵 세포인 대장균이나 바실러스속 미생물을 숙주로 사용한 경우 알부민 단백질이 응집된 상태로 발현되거나 (Latta et al., Bio/Technology, 5, 1309(1987)) 그 분비 효율이 극히 낮은 문제점이 있었다 (Saunders et al., J. Bacteriol. 169, 2917(1987)). 이에 반해 단세포 미생물이면서도 진핵 세포인 효모를 숙주로 사용한 경우 올바르게 만들어진 알부민이 세포배양액으로 효율적으로 분비됨이 보고되었다. 전통적으로 재조합 단백질 생산 숙주로 사용되어 온 제빵효모인 사카로마이세스 세레비시에 [Sleep et al., Bio/Technology 8, 42 (1990), Okabayashi et al., J. Biochem. 110, 103(1991), Kang et al., J. Microbiol. Biotechnol., 8, 42, (1998)]외에도 새로운 대체효모로 개발된 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)와 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris)를 숙주로 하여 재조합 알부민을 발현 분비하였다 [Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991); Sreekrishan, K. Industrail microorganisms, pp119-126].
재조합 단백질 생산시 숙주 세포로서 효모 사카로마이세스 세레비시에가 갖는 단점들, 예로서 강력하고 정교하게 조절되는 프로모터의 부재, 고농도 배양시 유가식 배양의 필요, 장시간 발효시 발현벡터의 불안정성, 당단백질의 과당화 등의 문제점들 (Romanos et al., Yeast 8, 423(1992))의 보완을 위하여 최근에 여러 다른 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되었다. 이들중 피키아 패스토리스와 더불어 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)는 메탄올 자화효모로서 높은 생산성 및 고농도 배양의 장점으로 인해 새로운 재조합 단백질 발현 시스템으로 각광을 받고 있다 (Faber et al., Yeast 11, 1331(1995)). 이들은 값 싼 원료물질인 메탄올을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있어 경제성이 높고, 메탄올 대사에 관련되는 메탄올 옥시다제 (Methonol oxidase: MOX) 또는 알코올 옥시다제 (Alcohol oxidase: AOX) 유전자의 프로모터와 같이 비교적 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터를 갖고 있어 산업적 응용 측면에서 응용성이 매우 높다. 또한 고농도 배양 (100-130g DCW/L)이 용이하고 형질 전환시 발현 목표유전자가 숙주의 염색체상으로 다수 도입되어 비선택 배지에서 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있다.
이들 메탄올 자화 효모 경우에는 지금까지 22nm 간염표면항원 단백질 (Janowicz et al., Yeast 7, 431(1991)), 인체 표피성장인자 (Clare et al., Gene 105, (1991)), 글루코아미라제 (Gellissen et al., Bio/Technology 9, 291(1991)), 유로카이나제 (Tsujikawa et al, Yeast 12, 541(1996)) 등을 비롯한 20 여종의 산업적으로 유용한 재조합 단백질 생산이 성공적으로 수행되었는데, 동일한 재조합 단백질 생산시 사카로마이세스 세레비시에보다 오히려 생산수율이 높게 나타나는 경우가 자주 있다 (Buckholz and Gleeson Bio/Technology 9, 1067 (1991); Cregg et al., Bio/Technology 11, 905(1993)). 인간 혈청 알부민의 경우도 피키아 패스토리스에서 AOX 프로모터를 이용한 경우 사카로마이세스 세레비시에서 보고된 생산수율보다 훨씬 높은 생산수율을 얻었다 (Cregg et al., Bio/Technology 11, 905(1993)).
본 발명자들은 상기한 바와 같은 장점을 갖고 있는 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파를 범용 재조합 단백질 발현 시스템으로 개발하기 위해 자체적인 노력을 기울인 결과 벡터 다중도입을 유도하는 자기복제서열 ARS (autonomous replication sequence)를 클로닝에 확보하였고 (Sohn et al., J. Bacteriol. 178, 4420 (1996)), 이를 이용하여 한세눌라 폴리모르파에서 항혈전 히루딘 (Kim et al., Biotechnol. Lett. 18, 417(1996)), 인체 표피 성장 호르몬(Oh et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22, 477 (1994))과 혈장 단백질인 알파1-안티트립신 (Kang et al., Yeast 14, 371(1998))의 발현 시스템을 성공적으로 확립하였다.
이에 본 발명자들은 효모에서 인간 혈청 알부민을 고효율로 발현 분비시키기 위한 노력의 연장으로 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파를 숙주세포로 이용하여 인간 혈청 알부민(HSA)을 한세눌라 폴리모르파에서 발현시키는 데에 적합한 벡터를 조립하였다. 발현율이 높은 재조합 알부민 발현벡터를 개발하기 위해 5' 비해독 영역 (5'untranslated region ; 5'UTR), 선택 표지, 자기복제서열 (ARS) 등 여러 벡터 구성 성분이 다른 발현벡터를 조립하여 이들이 형질전환 효율 및 인간 혈청 알부민 발현에 미치는 영향을 조사하였고 이 벡터가 염색체상으로 도입된 형질 전환체를 선별한 후 이로부터 알부민을 고효율로 생산하는 균주를 선별하여 재조합 인간 혈청 알부민을 발현 생산하였다.
본 발명은 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입(integration)된 형질 전환체를 제조, 이로부터 알부민을 고효율로 생산하는 형질전환 균주를 선별하여 알부민을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
더욱 상세히는, 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터를 이용하여 알부민 자체의 분비 시그날을 지닌 알부민 cDNA로부터 인간 혈청 알부민을 효율적으로 발현시키기 위해서 자기복제서열 (ARS), 5'UTR 및 선별 표지가 각기 다른 여러 인간 혈청 알부민 발현 벡터들을 조립하고, 이 벡터들이 도입된 형질전환주의 선별 및 고효율 발현주의 선별을 통한 인간 혈청 알부민의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 한세눌라 폴리모르파용 알부민 발현벡터들의 조립방법에 대한 도식이다.
도 2는 MOX 프로모터에 연결된 인간 혈청 알부민을 코딩하는 cDNA의 5'UTR에 대한 도식이다.
도 3은 알부민 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 니트로셀룰로오즈 디스크 상에서 배양한 후 웨스턴 블럿하여 고효율 생산 균주를 선별하는 결과에 관한 사진이다.
도 4는 선별된 효모균주의 배양액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동한 후 웨스턴 블럿한 결과이다.
도 5는 알부민 발현벡터를 함유하는 효모균주의 DNA를 추출하여 그 카피수를 측정하기 위해 서던 블럿한 결과이다.
도 6은 알부민 발현벡터를 함유하는 효모균주의 RNA를 추출하여 그 유전자 전사 발현정도를 측정하기 위해 노던 블럿한 결과이다.
도 7은 재조합 알부민의 N-말단 아미노산 분석에 사용하기 위해 알부민이 생산된 효모 배양액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동 한후 염색한 결과이다.
도 8은 재조합 알부민 단백질의 배양 농축액을 비변성 등전점 측정 겔 (Isoelectric Focusing Gel)에 전기영동 하여 pI값을 측정한 결과이다.
본 발명은 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입(integration)된 형질 전환 효모를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈청 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈청 알부민의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한 이때 발효 배양시 형질전환 효모를 메탄올이 함유된 배지에서 배양시킴을 특징으로 한다. 또한 알부민 cDNA는 한국인 태아 간세포로부터 만든 cDNA 라이브러리에서 유래된 pBlue-HSA1 으로부터 분리된 유전자이다.
한편, 알부민을 코딩하는 cDNA에서 5'UTR(5' 비해독 영역)이 제거되고 알부민 개시코돈이 직접 MOX 프로모터에 연결된 발현 벡터 pYHSA12 (KCTC-0503BP호)와 숙주세포의 염색체로 발현벡터 pYHSA12가 삽입(integration)된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T7 (KCTC-0502BP호) 및 숙주세포의 염색체로 발현벡터 pYHSA12가 삽입(integration)된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T8 (KCTC-0501BP호)를 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모르파를 숙주세포로하여 인간 혈청 알부민을 발현시키는 데 적합한 발현벡터들을 조립하는 과정과 상기 발현벡터를 함유한 효모 형질전환체 선별, 이로부터 고효율 발현주를 선별하는 과정 및 고효율 발현주로부터 인간 혈청 알부민을 제조하는 방법으로 구성된다.
이하, 본 발명은 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
(실험균주 및 유전자)
인간 혈청 알부민 cDNA 유전자는 한국인 태아 간세포로부터 만든 cDNA 라이브러리 (library)에서 유래된 pBlue-HSA1 [Kang et al., J. Microbiol. Biotechnol., 8, 42, (1998)]에서 확보하였다. 또한 알부민 발현을 위한 효모 한세눌라 폴리모르파 숙주로는 NPO Biotechnologia (모스크바, 러시아)에서 제공한 루이신 영양요구성 변이주인 DL1-L(leu2)와 이를 자외선 조사하여 얻은 균주 DL1L-uv10 (leu2, ura3)등을 사용하였다. 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC-26012)의 MOX 프로모터와 MOX 터미네이터는 MOX 유전자를 포함한 9 kb의 염색체 DNA 절편이 클로닝된 pMOX3615 (생명공학연구소 보고서 BSKG 1050-885-3)로부터 확보하였다.
(신규한 형질 전환된 효모 세포주 제조)
효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 또는 DL1L-uv10 균주에 힐 등의 방법(Hill et al., Nucl. Acids Res. 19, 5791(1991))에 의해 알부민 발현벡터들을 도입하여 URA3+ 또는 LUE2+로 전환된 형질전환체를 선별하였다. 사카로마이세스 세레비시애 유래의 유라실 합성유전자 URA3를 선별표지로 사용한 발현벡터의 경우 형질전환체가 안정화될 때까지 유라실이 결핍된 배지에서 배양하였다. 한세눌라 폴리모르파 유래의 LEU2와 대장균 유래의 G418에 대한 내성을 갖게하는 APH 유전자를 선별표지로 사용한 벡터의 경우 1차적으로 LUE2+형질전환체를 얻은뒤 YPD 배지에서 약 50 세대정도 계대배양하여 안정화시킨 후 G418농도를 달리한 배지에 도말하여 2차 선별을 하였다.
(배지조성 및 배양조건)
종균배지로는 복합배지인 YPG 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 글라이세롤 2%)를 사용하여 효모 균주를 16-20 시간 배양한 후, 30 ml 발현유도 YPM 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 메탄올 2%)를 넣은 250 ml 배플드 플라스크(baffled flask)에 1%로 접종하여 24 시간동안 진탕 배양하였다. 메탄올 피딩 (feeding)시에는 YPM 배지에서 24 시간 배양한 후 배지내의 메탄올 농도가 2%가 되도록 매 12 시간마다 72 시간까지 메탄올을 첨가해 주었다. 배양온도는 공히 37℃를 유지하였다.
(웨스턴 블럿 분석)
세포배양액으로부터 세포와 배양 상등액을 원심분리를 통해 분리한 후 배양 상등액을 램리(Laemmli, Nature 227, 680 (1970)) 방법에 의하여 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔에 전기영동한 다음 Towbin(Towbin, Proc. Natl. Acad. USA, 76, 4350 (1979))방법으로 나이트란 막에 붙여서 인체 혈청 알부민에 대한 폴리 클로날 항체(Sigma사)로 반응시켰다. 알칼린 포스파타제가 붙어 있는 항토끼 Ig에 대한 항체(Sigma사)로 부차적 반응을 진행한 후 알칼린 포스파타제에 의한 색깔 반응으로 알부민 발현량을 분석하였다. 발현된 알부민의 양은 미국 시그마사로부터 구입한 혈장 알부민을 표준으로 하여 웨스턴 블럿에서 나타나는 단백질 밴드의 감도를 덴시토미터 (Image analysis system, Bio-Rad, Model GS-700)로 읽어 정량하였다.
(서던 블럿 분석)
알부민 발현벡터가 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L의 염색체상으로 삽입된 양상과 카피수 (copy number)를 분석하기 위해 복합배지 YPD 배지에서 24 시간 동안 배양한 형질전환체에서 DNA를 추출하여 제한 효소로 절단한 후, Sambrook 등(Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 의해 수행하였다. 프로브(probe)는 1.5 kb MOX 프로모터 유전자를 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트 (Non-radioactive DNA labelling and detection kit)를 사용하여 디그옥시제닌(digoxigenin)으로 표지하여 제조하였다. 알부민 발현벡터의 다중 도입수를 결정하기 위해 DNA 밴드의 감도를 덴시토미터를 사용하여 읽어서 결정하였다.
(노던 블럿 분석)
발현 유도배지에서 약 8-15 시간 동안 배양한 형질전환체를 회수하여 핫페놀 방법 (Elion and Warner, Cell 39, 663 (1984))에 의해 RNA를 추출하여 Sambrook 등 (Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 의해 수행하였다. 프로브는 상기 제작된 비방사성 디그옥시제닌으로 표지된 MOX 프로모터 유전자를 사용하였다.
이하, 본 발명을 참조예 및 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) MOX 프로모터를 이용한 인간 혈청 알부민 발현 벡터 제조
한세눌라 폴리모르파에서 인간 혈청 알부민의 발현을 유도하기 위해 강력하며 발현조절이 가능한 프로모터로 알려진 MOX 프로모터를 이용하고, 발현된 알부민을 효모 배양액으로 분비시키기 위한 분비 신호 서열로는 사카로마이세스 세레비시에에서 매우 높은 분비 효율이 확인된 인간 혈청 알부민(이하, ″HSA″라 칭함) 자체의 분비 서열 (Kang et al., J. Microbiol. Biotechnol. 8, 42 (1998))을 이용하였다. 선별표지와 ARS의 존재여부가 형질 전환율 및 발현 벡터 다중 도입율에 미치는 영향을 살펴보기 위해 여러 발현벡터를 조립하였다. 또한 HSA 발현 카세트내에 도입된 HSA cDNA의 5'UTR이 한세눌나 폴리모르파에서 HSA 발현에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 HSA 5'UTR이 제거되고 MOX 프로모터에 직접 연결된 HSA 발현 카세트를 조립하였다.
1) YIP-HSA 의 조립
MOX 터미네이터를 HSA cDNA에 연결하기 위해서 일차적으로 pMOX3615에서 MOX 터미네이터를 포함한 0.5 kb BglII/EcoRV DNA 절편을 얻어 pBluescriptKS (Stratagene사)의 BamHI과 SmaI 부위에 클로닝하여 pBKS-Tmox(I)를 조립하였다. pBKS-Tmox(I)에서 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site)의 EcoRI과 HindⅢ 부위를 크리나우 절편 (Klenow fragment) 처리하여 제거하여 pTmox(II)를 조립하였다. pTmox(II)를 NotI으로 절단한 후 크리나우 절편 처리하고 다시 XhoI으로 절단하여 0.5 kb MOX 터미네이터를 얻어내고 pBlue-HSAI의 크리나우 절편 처리된 XhoI 부위와 HindⅢ 부위에 삽입하여 pHSA-Tmox를 완성하였다. pHSA-Tmox를 EcoRI와 ClaI으로 절단하여 MOX 터미네이터와 연결된 HSA cDNA 절편 (2.5 kb)을 얻어서 pMOX3615에서 유래한 1.5 kb SalI/EcoRI MOX 프로모터와 연결하여 벡터 YIP5 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1035 (1979))의 SalI과 EcoRI 부위에 삽입하여 YIP-HSA를 조립하였다. 따라서 YIP-HSA는 5'UTR을 지닌 HSA cDNA에 한세눌라 폴리모르파의 MOX 프로모터와 터미네이터가 연결된 3.5 kb 크기의 HSA 발현 카세트를 함유하고 있다 (도 1).
2) pUR-HSA 의 조립
벡터 다중도입을 유도하는 HARS36 (Sohn et al., J. Bacteriol. 178, 4420 (1996))을 포함한 HSA 발현벡터를 조립하기 위해 pCEU-EGF를 NotI으로 절단하고 크리나우 절편 처리한 후 XbaI으로 절단하여 얻은 7 kb 벡터 골격에다 YIP-HSA을 SalI으로 절단한 후 크리나우 절편 처리하고 XbaI으로 절단하여 얻은 상기 3.5 kb HSA 발현 카세트를 연결하여 pUR-HSA를 조립하였다 (도 1).
3) pDLMOX-G418HSA 의 조립
한세눌라 폴리모르파 LEU2를 선택표지로 하는 발현벡터를 조립하기 위해 pBlueHSA1에서 얻어진 2 kb EcoRI/HindⅢ HSA cDNA를 pDLMOX-HIR (Kang et al., Yeast 14, 371(1998))의 EcoRI과 HindⅢ 부위에 삽입하여 HSA cDNAI이 MOX 프로모터와 아직 분석되지 않은 유전자에서 유래된 터미네이터에 연결된 발현벡터 pDLMOX-HSA를 조립하였다. 상기 벡터의 SnaBI 부위에 pUC4K(Pharmacia사)에서 유래된 1.3 kb G418 저항성 유전자 (kanr)를 삽입하여 pDLMOX-G418HSA를 조립하였다 (도 1).
4) pYHSA12 의 조립
5'UTR이 제거된 HSA cDNA를 MOX 프로모터에 제한효소를 사용하지 않고 직접 연결하기 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하였다. 첫 단계로 두 올리고뉴크레오타이드 MOX/HSA-33mer(5'-CTAAAGTACAAAAACAAAATGAAGTGGGTAACC-3') [이때 HSA 유전자의 개시코돈은 밑줄친 것]와 HSA(AflⅢ)-19mer(5'-GCTGACTCATCAGCAACAC-3')를 사용하여 pBlue-HSAI로부터 MOX 프로모터의 5'UTR(비해독 영역)에 HSA의 개시코돈(ATG)이 바로 연결된 약 250 bp 크기의 HSA N-말단부위를 포함한 DNA 절편을 합성하였다. 두 번째 단계로 pMOX36159에서 유래된 1.5 kb SalI/EcoRI MOX 프로모터 DNA 절편이 pBluescriptKS에 삽입되어있는 pBMOX8으로부터 기존에 보고한 바와 같이(Sohn et al., J. Microbiol. Biotechnol. 2, 65(1993)) 리버스 프라이머 (5'-AACAGCTATGACCATG-3')와 MOX-19mer(5'-CATTTTGTTTTTGTACTTT-3')를 사용하여 1.5 kb 크기의 MOX 프로모터 DNA 절편을 합성하였다. 상기 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 합성된 DNA 절편들을 함께 섞은 후 이로부터 MOX/HSA-33mer와 리버스 프라이머를 사용한 PCR를 통해 MOX 프로모터에 HSA cDNA N-말단부위가 연결된 1.8 kb 크기의 DNA 단편을 합성한 후, 이를 pT7Blue (Novagen)에 삽입하여 pT7Blue/PmoxHSA247를 조립하였다. 상기 PCR은 95 ℃ 30 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃ 3 분, 35 회의 조건으로 수행하였다. PCR 과정중 발생할 수 있는 염기배열의 변화여부는 염기배열 분석으로 확인하였다. pT7Blue/PmoxHSA247로부터 AflⅢ와 SalI으로 절단된 1.8 kb 크기의 MOX 프로모터와 HSA cDNA N-말단 부위가 연결된 DNA 절편을 얻어서 YIP-HSA에서 유래된 알부민 유전자의 뒷부분과 MOX 터미네이터를 포함하고 있는 2 kb 크기의AflⅢ와 EcoRI DNA 절편과 연결하여 5'UTR이 제거된 HSA cDNA가 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 MOX 프로모터와 터미내이터에 연결된 3.5 kb 크기의 HSA 발현 카세트를 조립하였다. 상기 알부민 발현 카세트를 선별 표지로서 한세눌라 폴리모르파 LEU2 유전자와 외래 유전자인 G418 저항성유전자 (kanr) 발현카세트를 포함하는 벡터 pGLG61 (Sohn J.H. et al, Yeast 에 제출중)의 NotI 제한효소 인지부위에 클로닝하여 pYHSA12로 명명하였다 (도 1). 따라서 pYHSA12는 5'UTR이 제거된 HSA cDNA이 MOX 프로모터에 연결된 알부민 발현 카세트를 지니고 있다 (도 2).
상기의 방법으로 제조된 재조합 발현 벡터 pYHSA12는 1998년 7월 14일 한국과학기술연구원 내 생명공학 센터에 기탁번호 KCTC-0503BP호로 기탁하였다.
(실시예 2) HSA 발현 형질전환주 확보
1) 영양요구성 선별 표지를 이용한 1차 선별
상기 발현 벡터들로 DL1-L (leu2) 또는 DL1L-uv10 (ura3 leu2) 균주를 형질전환시켰을 때 ARS가 없는 발현 벡터인 YIP-HSA의 경우는 형질 전환율이 너무 낮아 형질 전환체를 얻을 수 없었지만 HARS36 전체를 지닌 발현벡터 pUR-HSA에서는 비교적 높은 비율로 URA3+ 형질 전환체를 얻었고 발현벡터를 안정화시키는 과정을 거쳐서 HSA 발현벡터가 숙주의 염색체에 여러 카피로 도입된 균주들을 확보하였다. 그러나 pUR-HSA는 한세눌라 폴리모르파내에서 발현효율이 낮은 사카로마이세스 세레비시의 URA3를 선별 표지로 사용하기 때문에 한세눌라 폴리모르파의 LEU2를 선별 표지로 이용하는 경우에 비해 형질 전환율도 낮고 얻어진 형질전환체를 안정화하는 데에 매우 많은 시간과 노동력이 소모되었다. pDLMOX-G418HSA의 경우처럼 한세눌라 폴리모르파 LEU2만을 선택표지로 사용하면 대부분의 형질전환체들이 한 두 카피 정도만 숙주의 염색체내로 도입되는데 비해 pYHSA12는 한세눌라 폴리모르파에서 발현되는 G418 저항성 유전자 (kanr) 발현 카세트를 갖고 있어 얻어진 LEU2+ 형질전환체를 G418 농도별로 2차적 선별을 수행하여 이로부터 다중도입주를 선별하였다.
2) 콜로니 블럿에 의한 HSA 발현주 선별
확보된 형질전환체들을 YPG 플레이트에서 15-20 시간 정도 키운 후 나이트로셀룰로즈막 (Nitrocellulose membrane)으로 부착시킨 다음 이를 메탄올을 함유한 YPM 배지에 옮긴 뒤 37℃에서 24 시간동안 배양하였다. 나이트로셀룰로즈 막위의 세포와 그밖의 찌꺼기들을 완충용액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM)으로 3회 씻어낸 뒤 알부민 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 하였다. 상기 과정을 3 회에 걸쳐 최종적으로 진하게 색깔반응을 보인 균주를 선별하였다 (도 3). 선별된 균주들을 YPD를 넣은 15 ml 테스트 튜브 (test tube)에서 24 시간 배양하여 배양상등액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동 한 후 웨스턴 블럿으로 HSA 발현 정도를 재검토하였다 (도 4).
(실시예 3) 플라스크 배양에서 HSA의 발현
한세눌라 폴리모르파는 MOX 프로모터의 조절하에서 재조합 단백질을 생산할 경우, 메탄올을 MOX 프로모터의 발현 유도를 위한 유도원으로서 뿐만 아니라, 알부민 발현을 위한 균주 자체의 성장에 요구되는 탄소원으로도 이용하기 때문에 MOX 프로모터의 지속적 발현을 유도하기 위해 메탄올을 일정한 시간 간격으로 공급해 보았다. 제빵효모 사카로마이세스 세레비시에 경우는 배양시간이 진행됨에 따라 배지 pH가 산성화되는데 갈락토즈같은 탄소원만을 계속적으로 공급하면 배지 pH가 더욱 급격히 감소하고 발현된 HSA 단백질 분해가 촉진되는 현상이 관찰되었다 (Kang et al., J. Microbiol. Biotechnol. 8, 42 (1998)). 그러나 이에 반해 한세눌라 폴리모르파의 경우 메탄올을 함유한 YPM 배지에서 약 3일간 배양을 지속해도 배지 pH가 오히려 7.9 정도로 상승하며 발현된 HSA의 급격한 분해현상은 일어나지 않았다. 그러나 12시간 간격으로 계속적으로 메탄올을 공급한 경우에는 메탄올을 공급하지 않은 경우에 비해서 배지내의 완전한 크기(66 KDa)의 HSA양은 크게 변화되지 않았지만 더 많은 분해산물을 감지되었다. 이것은 아마도 총 생성된 HSA양은 메탄올의 지속적인 공급시 더 많았지만 그러한 배양방법이 어떠한 단백질 분해효소의 작용을 유도하여 HSA이 분해되어 배지내에 존재하는 HSA의 양은 증가되지 않았음을 시사한다. 두가지 배양방법에 따른 알부민 발현을 비교할 때, 메탄올을 계속적으로 공급하는 경우는 세포 성장은 증가하였지만 단위 세포당 알부민 발현량으로 환산한 값은 오히려 크게 감소되었다 (표 1). 따라서 한세눌라 폴리모르파에서도 사카로마이세스 세레비시에의 경우처럼 HSA 분해를 방지하는 배양 조건에 관한 연구가 수행되면 현재의 생산량 (플라스크 배양시 100 mg/L)을 훨씬 증진시킬 수 있다고 사료된다.
| OD600 | pHa | HSAb(μug/ml) | Specific productivity(μg/OD660) | |
| YPMc | 49 | 7.9 | 100 | 2.04 |
| YPM+Md | 81 | 7.8 | 100 | 1.23 |
a배양 상등액의 최종 pH값이다.
b알부민 발현은 3 일간 배양한 세포 상등액을 측정하였다.
c효모추출물(1% w/v), 펩톤(2% w/v), 메탄올(2% w/v)
d메탄올(2% w/v) 피딩은 24 시간 배양 후 매 12 시간마다 공급하였다.
(실시예 4) 서던 블럿에 의한 발현벡터 도입수 분석
상기 선별된 형질전환체들의 서던 블럿을 분석한 결과 발현 벡터 pUR-HSA의 경우는 발현 벡터가 7 카피 정도까지 숙주의 염색체상으로 도입된 형질전환주가 얻어졌고, pYHSA12의 경우는 G418의 농도가 높을수록 HSA 발현 벡터 카피 수가 1 에서 6 까지 도입된 형질 전환체가 얻어졌음을 알 수 있었다. 이들 벡터들의 도입 부위는 크게 두 부류로 나뉘어지는 데, MOX 유전자 또는 알려지지 않은 유전자 위치로 도입된 경우가 있다 (도 5).
(실시예 5) 한세눌라 폴리모르파 형질전환주에서 HSA 발현 효율 비교분석
상기 확보된 형질전환주를 배양하여 웨스턴 블럿에 의한 HSA 단백질 양과 노던 블럿에 의한 HSA mRNA 양을 분석하여 HSA 발현 효율을 상호 비교하였다. 발현벡터 pUR-HSA가 7 카피 정도로 도입된 균주 827d-5는 1 카피 도입된 균주 827d-8에 비해 HSA mRNA 발현양은 카피수의 증가와 비례해서 약 7 배정도 증가하였고 배지로 분비된 HSA 단백질 양도 약 5 배 정도의 증가를 보였다 (표 2). pUR-HSA가 도입된 형질전환주들과 HSA cDNA의 5'UTR가 제거된 발현벡터 pYHSA12가 도입된 형질 전환주들의 노던 블럿을 비교 분석한 결과, 5'UTR의 제거가 HSA mRNA의 발현에는 별 영향을 미치지 않았지만 (도 6), 약 8-10 배 정도로 HSA 단백질 발현효율을 증가시켰음을 확인하였다. 그러나 발현 벡터 pYHSA12를 지닌 형질전환주들의 경우는 HSA 발현 벡터 도입수 증가에 따른 HSA 단백질 생성량의 증가를 보이지 않았는 데 이는 벡터 도입수 증가에 따른 HSA mRNA 발현양의 증가가 없었기 때문으로 분석되었다(도 6). 표 2에 각 형질전환주의 HSA 발현벡터 도입수, HSA mRNA 발현양, HSA 단백질 분비 발현양을 종합적으로 나타내었다.
| 형질전환주 | 발현벡터 | HSA-5'UTR | 서던 | 노던 | 웨스턴b | |
| 삽입부위 | 카피수 | mRNA 발현 | 단백질 발현량(mg/L) | |||
| u10-827d-8 | pURHSA | + | uka | 1 | ++ | 5 |
| u10-827d-5 | 〃 | + | uk | 7 | +++++++ | 10∼20 |
| DL1-L/T7 | pYHSA12 | - | mox | 1 | ++ | 40∼50 |
| G3T7 | 〃 | - | mox | 2 | ++ | 40∼50 |
| DL1-L/T8 | 〃 | - | mox | 2 | ++ | 40∼50 |
| G4T9 | 〃 | - | mox | 3 | ++ | 40∼50 |
| G0.8T3 | 〃 | - | uk | 1 | + | 20∼30 |
| G4T13 | 〃 | - | uk | 2 | ++ | 40∼50 |
| G2T7 | 〃 | - | uk | 3 | + | 20∼30 |
| G3T5 | 〃 | - | uk | 6 | + | 20∼30 |
aunknown
b250 ml 배플드 플라스크에서 24시간 배양 후 배양 상등액의 발현된 알부민을 정량한 값이다.
상기 형질전환 균주 중 가장 성능이 우수한 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T7 균주는 1998년 7월 14일 한국과학기술연구원 내 생명공학 센터에 기탁번호 KCTC-0502BP호로, 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T8 균주는 기탁번호 KCTC-0501BP호로 기탁하였다.
(실시예 6) 재조합 알부민 특성 분석
1) 발현 분비된 재조합 알부민의 N-말단 아미노산 서열 분석
상기 형질 전환주에서 발현 분비된 대부분의 재조합 알부민은 사람의 혈장에서 분리된 알부민과 동일한 크기 (66 kDa)를 지녔으나 배양시간이 오래 진행됨에 따라 제빵 효모 사카로마이세스 세레비시에에서 관찰되었던 45 kDa 크기의 HSA 분해 산물이 감지되었고 이외에도 52 kDa 크기의 또 다른 분해 산물도 감지되었다 (도 7). YM10 막(Amicon사)을 이용하여 농축한 배양 상등액을 SDS-전기영동 한 뒤 아미노산 분석용 PVDF 막에 옮겨 폰소-S으로 염색한 후 알부민 66 kDa에 해당하는 단백질 밴드와 약 45 kDa 분해 산물에 해당되는 밴드를 분리하여 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과 두 단백질 모두 혈장 알부민과 동일하게 D-A-H-K-S로 시작되는 N-말단 아미노산 서열을 나타내어 한세눌라 폴리모르파에서도 알부민 분비 시그날이 올바르게 절단되고 있음을 확인하였다.
2) 등전치(pI 치)의 분석
상기 재조합 알부민의 등전점을 분석하기 위해 상기 형질전환주의 배양 상등농축액을 미국 노벡스(Novex)사에서 판매하는 pI 3-7 비변성 등전점 측정 겔 (Isoelectric Focusing Gel)에 전기영동하였다. 이를 트리스-글라이신 용액에 약 30분간 담근 후, PVDF 막에 블럿팅한 다음 웨스턴 블럿을 하여 pI 값을 측정하였다. 등전치 표준 단백질로서는 미국 바이오-래드(BIO-RAD)사에서 제작한 pI 4.45-9.6 값을 가지는 제품을 사용하였다. 한세눌라 폴리모르파에서 발현된 재조합 알부민의 등전치는 혈청 알부민(시그마)과 동일하게 pI 4.8 부근인 것으로 확인되었다 (도 8).
본 발명의 효과는 본 발명에서 조립된 HSA 발현벡터로 형질전환시킨 고효율 생산 변이주에서 선별된 재조합 한세눌라 폴리모르파 변이주를 메탄올이 함유된 배지에서 배양시켜, 발현분비된 재조합 인간 혈청 알부민을 대량생산할 수 있는 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은 알부민의 수요가 급증하고 있는 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (6)
- 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입(integration)된 형질 전환 효모를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈청 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈청 알부민의 제조 방법
- 제 1항에 있어서, 발효 배양시 형질전환 효모를 메탄올이 함유된 배지에서 배양시킴을 특징으로 하는 인간 혈청 알부민의 제조 방법
- 제 1항에 있어서, 알부민 cDNA는 한국인 태아 간세포로부터 만든 cDNA 라이브러리에서 유래된 pBlue-HSA1 으로부터 분리된 유전자임을 특징으로 하는 인간 혈청 알부민의 제조 방법
- 알부민을 코딩하는 cDNA에서 5'UTR(5' 비해독 영역)이 제거되고 알부민 개시코돈이 직접 MOX 프로모터에 연결된 발현 벡터 pYHSA12 (KCTC-0503BP호)
- 숙주세포의 염색체로 발현벡터 pYHSA12가 삽입(integration)된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T7 (KCTC-0502BP호)
- 숙주세포의 염색체로 발현벡터 pYHSA12가 삽입(integration)된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/T8 (KCTC-0501BP호)
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| Journal of Biotechnology, 46 : 43 (1996) * |
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