JPH08275776A - 新規キチナーゼ及びその製造方法 - Google Patents
新規キチナーゼ及びその製造方法Info
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- JPH08275776A JPH08275776A JP8107895A JP8107895A JPH08275776A JP H08275776 A JPH08275776 A JP H08275776A JP 8107895 A JP8107895 A JP 8107895A JP 8107895 A JP8107895 A JP 8107895A JP H08275776 A JPH08275776 A JP H08275776A
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- chitin
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 新規酵素キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ
−３。 【効果】 高活性で、かつ、熱安定性に優れる新規なキ
チナーゼを提供する。
−３。 【効果】 高活性で、かつ、熱安定性に優れる新規なキ
チナーゼを提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビブリオ属に属する微
生物によって生産される新規キチナーゼＣ−１およびキ
チナーゼＣ−３に関するものである。本発明の酵素は、
種々の用途に利用されるキチンを効率的に分解するの
で、キチンの有効利用を図る上で、極めて重要である。
生物によって生産される新規キチナーゼＣ−１およびキ
チナーゼＣ−３に関するものである。本発明の酵素は、
種々の用途に利用されるキチンを効率的に分解するの
で、キチンの有効利用を図る上で、極めて重要である。
【０００２】
【従来の技術】キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンが多数β−（1,４）−結合した多糖であり、自然界
に幅広く分布している。キチナーゼは、キチンを加水分
解し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を経て、Ｎ−アセチル
キトビオースにまで分解する。キチナーゼ（ＥＣ３・２
・１・14）は、微生物界に幅広く分布し、ストレプトマ
イセス属微生物を中心に研究が行われている。一方、ビ
ブリオ属微生物が生成するキチナーゼに関する研究は、
内田ら（発酵工学 第57巻 第３号 131-140 1979)によ
って最初に報告されている。さらに、最近、高橋ら（J.
Ferment. Bioeng. Vol-75 457-459 1993)によっても報
告されている。
ミンが多数β−（1,４）−結合した多糖であり、自然界
に幅広く分布している。キチナーゼは、キチンを加水分
解し、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を経て、Ｎ−アセチル
キトビオースにまで分解する。キチナーゼ（ＥＣ３・２
・１・14）は、微生物界に幅広く分布し、ストレプトマ
イセス属微生物を中心に研究が行われている。一方、ビ
ブリオ属微生物が生成するキチナーゼに関する研究は、
内田ら（発酵工学 第57巻 第３号 131-140 1979)によ
って最初に報告されている。さらに、最近、高橋ら（J.
Ferment. Bioeng. Vol-75 457-459 1993)によっても報
告されている。
【０００３】しかしながら、上記キチナーゼは、キチナ
ーゼ活性及び熱安定性の点で満足できるものではなかっ
た。すなわち、これらの酵素の活性は、いずれもタンパ
ク質１mg当たり10ユニット未満であり、熱安定性におい
ても、50℃で１時間以上安定性を保持することはできな
かった。
ーゼ活性及び熱安定性の点で満足できるものではなかっ
た。すなわち、これらの酵素の活性は、いずれもタンパ
ク質１mg当たり10ユニット未満であり、熱安定性におい
ても、50℃で１時間以上安定性を保持することはできな
かった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高い
キチナーゼ活性を有し、かつ高い熱安定を有する新規な
キチナーゼを提供することにある。
キチナーゼ活性を有し、かつ高い熱安定を有する新規な
キチナーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく、海洋性細菌由来のキチナーゼの探索を行
った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いキチナ
ーゼ活性を有し、かつ熱安定性にも優れる新規なキチナ
ーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
を解決すべく、海洋性細菌由来のキチナーゼの探索を行
った結果、ビブリオ属に属するＨ−８株が、高いキチナ
ーゼ活性を有し、かつ熱安定性にも優れる新規なキチナ
ーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明は、下記の酵素化学的性質を
有するキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３である。 Ａ．キチナーゼＣ−１ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.６ Ｂ．キチナーゼＣ−３ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.９ また、本発明は、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１
またはキチナーゼＣ−３産生能を有する微生物を培養
し、その培養物からキチナーゼＣ−１またはキチナーゼ
Ｃ−３を採取することを特徴とするキチナーゼＣ−１ま
たはキチナーゼＣ−３の製造方法である。
有するキチナーゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３である。 Ａ．キチナーゼＣ−１ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.６ Ｂ．キチナーゼＣ−３ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.９ また、本発明は、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１
またはキチナーゼＣ−３産生能を有する微生物を培養
し、その培養物からキチナーゼＣ−１またはキチナーゼ
Ｃ−３を採取することを特徴とするキチナーゼＣ−１ま
たはキチナーゼＣ−３の製造方法である。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。Ｈ−８株
は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。Ｈ
−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンア
ガー（Bacto MarineAgar 2216)(Difco 社製）あるいは
マリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）
を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から
48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用い
て形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウム
を要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海
水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩
化ナトリウムを添加することによって行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ：曲がりのない桿菌、0.７〜1.１×
1.３〜1.８μｍ 細胞の多形成の有無：無し 運 動 性 ：あり 鞭毛の着生状態 ：極毛性、固体培地で培養した場合
菌体周辺に周鞭毛が観察される。
は、静岡県浜名湖にて採取した底泥より分離された。Ｈ
−８株の菌学的性質は下記に示すが、培地は、マリンア
ガー（Bacto MarineAgar 2216)(Difco 社製）あるいは
マリンブロス（Bacto Marine Broth 2216)(Difco社製）
を用いた。これらの培地に本菌株を植菌し30℃で24から
48時間培養し、光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用い
て形態観察を行った。また、本菌株は、塩化ナトリウム
を要求することから、生化学的性状の試験は75％人工海
水を用いて培地を作成するか、あるいは培地中に３％塩
化ナトリウムを添加することによって行った。 （１）形態（好気的条件下） 細胞の形及び大きさ：曲がりのない桿菌、0.７〜1.１×
1.３〜1.８μｍ 細胞の多形成の有無：無し 運 動 性 ：あり 鞭毛の着生状態 ：極毛性、固体培地で培養した場合
菌体周辺に周鞭毛が観察される。
【０００８】スウォーミング ：あり 胞子の有無 ：無し グラム染色性 ：陰性 （２）各培地における生育状態 マリンアガー平板培養：良好に生育、コロニーは、凸円
状に生育し、全縁湿光、不透明乳白色であり、表面は平
滑である。
状に生育し、全縁湿光、不透明乳白色であり、表面は平
滑である。
【０００９】 マリンアガー斜面培養：良好に生育、糸状、乳白色 マリンブロス培養 ：良好に生育、培養液は均一に濁
る。 マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する（１週間
後）。 リトマスミルク ：消化する （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：還元する インドールの生成：生成する。
る。 マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する（１週間
後）。 リトマスミルク ：消化する （３）生理学的性質 硝酸塩の還元 ：還元する インドールの生成：生成する。
【００１０】 硫化水素の生成 ：ＴＳＩ培地では、生成しない。 でんぷんの分解 ：加水分解する。 クエン酸の利用 ：Simons培地 利用する。 ：Cristensen培地 利用する。 無機窒素源の利用：利用する。
【００１１】色素の生成 ：生成しない。 ウレアーゼ活性 ：陰性 オキシダーゼ活性：陽性 カタラーゼ活性 ：陽性 生育の範囲（温度、pH）：温度12〜45℃ 30℃で最も
良好に成育 ：pH３〜10 ６〜８で最も良好に成育 酸素に対する態度：通性嫌気 Ｏ−Ｆテスト ：ブドウ糖を発酵する。
良好に成育 ：pH３〜10 ６〜８で最も良好に成育 酸素に対する態度：通性嫌気 Ｏ−Ｆテスト ：ブドウ糖を発酵する。
【００１２】 メチルレッド試験：陽性 ＶＰ反応 ：陽性 糖類から酸及びガスの生成の有無 30℃、１週間培養後 酸の生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース ＋ − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース ＋ − Ｄ−ガラクトース ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 − − 乳 糖 − − トレハロース ＋ − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット ＋ − イノシット − − グリセリン ＋ − デンプン ＋ − −：生成せず、 ＋：生成する エスクリンの分解：陰性 アルギニンの分解：陰性 ＤＮＡの分解 ：陽性 ＰＨＢの蓄積 ：蓄積しない 好 塩 性 ：１％〜10％の範囲で生育 ＯＮＰＧテスト ：陽性 Tween80 分解性 ：陽性 ＧＣ含量 ：45.8％ イソプレノイドキノン： 主たるキノン ユビキノン Ｑ-8 マイナーなキノン ユビキノン Ｑ-7, Ｑ-6, Ｑ-9 メナキノン ＭＫ-7 デメチルメナキノン ＤＭＫ-8 以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌
で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテスト
で発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダー
ゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌
株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本
菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命
工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託され
ている（寄託日：平成７年１月19日）。
デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版の分類基
準に従って公知の菌株と比較した結果、グラム陰性桿菌
で、極毛性の鞭毛を有し、通性嫌気性、またＯＦテスト
で発酵性であり、好塩性で発光性をもたず、オキシダー
ゼ陽性、ＧＣ含量が４５．８％である等の理由から本菌
株は、ビブリオ属に所属すると考えられた。そして、本
菌株は、ビブリオｓｐ．Ｈ−８株として工業技術院生命
工学技術研究所に寄託番号FERM P-14737として寄託され
ている（寄託日：平成７年１月19日）。
【００１３】キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３
は、ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を培地で培養
し、培養物から得ることができる。キチナーゼ生産菌と
しては、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１及びキチ
ナーゼＣ−３を産生するものであれば、いずれの菌株で
も用いることができる。また、これら微生物の人工的変
異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理
など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操
作、細胞融合による変異株でもキチナーゼＣ−１又はキ
チナーゼＣ−３を生産するものであればいずれも本発明
に用いることができる。このようなキチナーゼ生産能を
有する菌株を選定するには、菌株の培養物を取り出し、
そのキチナーゼ活性を測定することにより行うことがで
きる。キチナーゼ生産株のうち、代表的な株としては、
ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げること
ができる。
は、ビブリオ属に属するキチナーゼ生産菌を培地で培養
し、培養物から得ることができる。キチナーゼ生産菌と
しては、ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１及びキチ
ナーゼＣ−３を産生するものであれば、いずれの菌株で
も用いることができる。また、これら微生物の人工的変
異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理
など、あるいは自然発生による変異株、また遺伝子操
作、細胞融合による変異株でもキチナーゼＣ−１又はキ
チナーゼＣ−３を生産するものであればいずれも本発明
に用いることができる。このようなキチナーゼ生産能を
有する菌株を選定するには、菌株の培養物を取り出し、
そのキチナーゼ活性を測定することにより行うことがで
きる。キチナーゼ生産株のうち、代表的な株としては、
ビブリオｓｐ．Ｈ−８株（FERM P-14737) を挙げること
ができる。
【００１４】本発明の微生物の培養には微生物の培養に
一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培
地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必
要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば
合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素
は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオ
リゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭
素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、
マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノ
ース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせ
て用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、
アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源として
は塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸な
どが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食
塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、
硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更
に使用菌の生育やキチナーゼの生産を促進する微量成分
を適当に添加することができる。
一般的に用いられる培養方法を用いることができる。培
地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必
要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば
合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。本酵素
は、誘導酵素のため炭素源として、キチン又はキチンオ
リゴ糖を用いることが必須である。また、そのほかに炭
素源としてグルコース、澱粉、デキストリン、麦芽糖、
マンノース、フラクトース、シュークロース、アラビノ
ース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせ
て用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、
アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源として
は塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵
母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸な
どが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食
塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫
酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、
硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更
に使用菌の生育やキチナーゼの生産を促進する微量成分
を適当に添加することができる。
【００１５】培養法としては、一般の培養方法が用いら
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当
であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモ
ニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７
〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96
時間培養をおこなうと、目的物質のキチナーゼＣ−１及
びキチナーゼＣ−３が菌体外に生成される。培養物中の
生成量が最大に達したときに培養を停止する。
れるが、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも
適している。培養温度は16〜60℃、特に30〜42℃が適当
であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモ
ニウム溶液、塩酸溶液などを添加して、６〜11、特に７
〜９に維持することが望ましい。液体培養で通常６〜96
時間培養をおこなうと、目的物質のキチナーゼＣ−１及
びキチナーゼＣ−３が菌体外に生成される。培養物中の
生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１６】培養物からキチナーゼＣ−１及びキチナー
ゼＣ−３の分離、精製は、酵素をその培養物から単離精
製するために常用される方法に従っておこなわれる。例
えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ
液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によって沈澱物を
得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手順で精製
することができる。
ゼＣ−３の分離、精製は、酵素をその培養物から単離精
製するために常用される方法に従っておこなわれる。例
えば培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、培養ろ
液を硫酸アンモニウム等を用い、塩析によって沈澱物を
得る。この沈澱物を溶解、透析、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手順で精製
することができる。
【００１７】以上の手順で生成されたキチナーゼＣ−１
は、以下の酵素化学的性質を有している。 （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.６ キチナーゼＣ−３は、以下の酵素化学的性質を有してい
る。 （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.９ 以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本
発明のキチナーゼと公知のキチナーゼとを比較したとこ
ろ、50℃で１時間以上安定である点、及び、酵素活性が
タンパク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公
知のキチナーゼと明らかに相違する。そこで、キチナー
ゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３を新規酵素と認定した。
は、以下の酵素化学的性質を有している。 （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.６ キチナーゼＣ−３は、以下の酵素化学的性質を有してい
る。 （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.９ 以上の酵素化学的性質及び後述の酵素活性について、本
発明のキチナーゼと公知のキチナーゼとを比較したとこ
ろ、50℃で１時間以上安定である点、及び、酵素活性が
タンパク質１mg当たり、10ユニット以上である点で、公
知のキチナーゼと明らかに相違する。そこで、キチナー
ゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３を新規酵素と認定した。
【００１８】本発明の酵素の用途としては、例えばカビ
のプロトプラスト化のための試薬または、Ｎアセチルキ
トビオースの製造のために用いることができる。
のプロトプラスト化のための試薬または、Ｎアセチルキ
トビオースの製造のために用いることができる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母
エキス１g/L 、グルコース５g/L 、りん酸第二鉄0.01g/
L 、天然海水1000mlの組成を有する前培養培地（殺菌前
pH7.５) 30mlを300ml フラスコに加え、ビブリオｓ
ｐ．Ｈ−８株を種菌として植菌し、37℃、24時間培養し
た。このようにして得られた前培養液を 100Ｌ容量の発
酵槽中の上記組成と同一組成の培地30Ｌに５％v/v の割
合で植菌し、40℃で通気攪拌方式（回転数100rpm, 通気
量0.7vvm) により18時間培養を行った。この際、pHは7.
８になるように調整しながら培養した。 ［実施例２］実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm
で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウ
ムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、20mM 酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.０）２Ｌに懸濁し、再び濾過
後、そのろ液を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110
透析チューブ（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、20mM
酢酸ナトリウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行っ
た。透析した酵素懸濁液をＤＥＡＥトヨパール ＨＷ-55
(東ソー社製) を用いて、キチナーゼ活性画分の分画を
行った。このＤＥＡＥトヨパールＨＷ-55 による分画を
２回行うことで、精製キチナーゼＣ−１を140mg 及び精
製キチナーゼＣ−３を120mg 得ることができた。 ［実施例３］キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３の
活性の測定には、シャーレの変法（Agr. Biol. Chem. V
ol 35, No.7, 1154-1156, 1971) を用いた。なお、キチ
ナーゼ１ユニットは、１分間に１μmol のＮ−アセチル
グルコサミンを遊離する活性を有する量とする。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］キチン粉末５g/L 、ペプトン５g/L 、酵母
エキス１g/L 、グルコース５g/L 、りん酸第二鉄0.01g/
L 、天然海水1000mlの組成を有する前培養培地（殺菌前
pH7.５) 30mlを300ml フラスコに加え、ビブリオｓ
ｐ．Ｈ−８株を種菌として植菌し、37℃、24時間培養し
た。このようにして得られた前培養液を 100Ｌ容量の発
酵槽中の上記組成と同一組成の培地30Ｌに５％v/v の割
合で植菌し、40℃で通気攪拌方式（回転数100rpm, 通気
量0.7vvm) により18時間培養を行った。この際、pHは7.
８になるように調整しながら培養した。 ［実施例２］実施例１で得られた培養液30Ｌを1000rpm
で遠心分離し、培養上清を得た。上清を硫酸アンモニウ
ムで塩析し（80％飽和）、沈澱物をろ過後、20mM 酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.０）２Ｌに懸濁し、再び濾過
後、そのろ液を粗酵素液とした。次に、50ＦＴ-Ｃ-110
透析チューブ（三光純薬製) に上記粗酵素を入れ、20mM
酢酸ナトリウム緩衝液40Ｌを透析液として透析を行っ
た。透析した酵素懸濁液をＤＥＡＥトヨパール ＨＷ-55
(東ソー社製) を用いて、キチナーゼ活性画分の分画を
行った。このＤＥＡＥトヨパールＨＷ-55 による分画を
２回行うことで、精製キチナーゼＣ−１を140mg 及び精
製キチナーゼＣ−３を120mg 得ることができた。 ［実施例３］キチナーゼＣ−１及びキチナーゼＣ−３の
活性の測定には、シャーレの変法（Agr. Biol. Chem. V
ol 35, No.7, 1154-1156, 1971) を用いた。なお、キチ
ナーゼ１ユニットは、１分間に１μmol のＮ−アセチル
グルコサミンを遊離する活性を有する量とする。
【００２０】上記方法に従って、キチナーゼＣ−１及び
キチナーゼＣ３の活性を測定した。その結果、タンパク
質１mgあたり、キチナーゼＣ−１の活性は、11.5ユニッ
トまた、キチナーゼＣ−３の活性は、10.8ユニットであ
った。
キチナーゼＣ３の活性を測定した。その結果、タンパク
質１mgあたり、キチナーゼＣ−１の活性は、11.5ユニッ
トまた、キチナーゼＣ−３の活性は、10.8ユニットであ
った。
【００２１】
【発明の効果】本発明は、高活性で、かつ、熱安定性に
優れる新規なキチナーゼを提供する。
優れる新規なキチナーゼを提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 浩 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者 西島 美由紀 静岡県清水市袖師町1900番地 株式会社海 洋バイオテクノロジー研究所清水研究所内 (72)発明者 大石 一男 静岡県沼津市三園町７−１職住303 (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市小川256−２ (72)発明者 鈴木 光彰 静岡県沼津市泉町16−６大岡寮202号室 (72)発明者 勝山 敦弘 静岡県清水市殿岡２−12−17 (72)発明者 三輪 端 静岡県磐田郡福田町塩新田浜野328
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の酵素化学的性質を有するキチナー
ゼＣ−１又はキチナーゼＣ−３。 Ａ．キチナーゼＣ−１ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約69000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.６ Ｂ．キチナーゼＣ−３ （１）キチンに作用し、キチンを可溶性のＮ−アセチル
キトオリゴ糖にまで加水分解する。 （２）至適 pH ：40℃で7.８−8.２ （３）至適温度：pH8.０で50℃ （４）pH安定性：40℃で5.５−9.０で安定 （５）熱安定性：pH8.０で50℃で一時間の処理に安定 （６）分子量：約81000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） （７）等電点：3.９ - 【請求項２】 ビブリオ属に属し、キチナーゼＣ−１ま
たはキチナーゼＣ−３産生能を有する微生物を培養し、
その培養物からキチナーゼＣ−１またはキチナーゼＣ−
３を採取することを特徴とするキチナーゼＣ−１または
キチナーゼＣ−３の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP8107895A JP3820418B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8107895A JP3820418B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ及びその製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08275776A true JPH08275776A (ja) | 1996-10-22 |
| JP3820418B2 JP3820418B2 (ja) | 2006-09-13 |
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ID=13736365
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8107895A Expired - Fee Related JP3820418B2 (ja) | 1995-04-06 | 1995-04-06 | 新規キチナーゼ及びその製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3820418B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108342374A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-31 | 中国海洋大学 | 一种甲壳素酶及其应用 |
| US20220071200A1 (en) * | 2017-05-04 | 2022-03-10 | TLC Products | Methods of pest control |
-
1995
- 1995-04-06 JP JP8107895A patent/JP3820418B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220071200A1 (en) * | 2017-05-04 | 2022-03-10 | TLC Products | Methods of pest control |
| US11832611B2 (en) * | 2017-05-04 | 2023-12-05 | TLC Products | Methods of pest control |
| CN108342374A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-07-31 | 中国海洋大学 | 一种甲壳素酶及其应用 |
| CN108342374B (zh) * | 2018-04-17 | 2021-05-25 | 中国海洋大学 | 一种甲壳素酶及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3820418B2 (ja) | 2006-09-13 |
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