JP3529173B2 - 新規な寒天分解酵素及びそれを用いるネオアガロビオースの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な寒天分解酵素お
よび当該酵素を利用したネオアガロビオースの製造法並
びに当該寒天分解酵素を保有する微生物に関する。 よ
り詳細には、アルテロモナス属に属する新規微生物、そ
の微生物の産生する寒天分解酵素およびこれをアルカリ
性条件で寒天溶液に作用させるネオアガロビオースの製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】天然に存在するヘテロ多糖類（複数の単
糖から構成される多糖）は多く知られている。 このう
ち、海藻由来のものとしては寒天、カラゲナン、アルギ
ン酸などが知られており、増粘剤やゲル化剤として特に
化粧品や食品の素材として広く利用されている。

【０００３】一方、最近ではヘテロオリゴ糖の研究開発
も進められている。 例えば、フラクトオリゴ糖やガラ
クトオリゴ糖にはビフィズス菌の選択的増殖因子として
の機能や、カップリングシュガーやパラチノースのよう
な難う蝕性機能（虫歯の原因になりにくい）が認められ
ている。

【０００４】これらのオリゴ糖は２〜５糖が中心であ
り、これらは、ヘテロ２糖であるスクロース（ショ糖）
やラクトース（乳糖）に酵素を作用させ、その転移反応
により製造されていた。

【０００５】また、ヘテロオリゴ糖を製造する別の方法
としては、天然に多く存在するヘテロ多糖を加水分解す
る方法も知られている。 この方法の例としては、寒天
に寒天分解酵素を作用させて、寒天オリゴ糖を生産する
方法が挙げられ、６糖、４糖、２糖を主成分とするオリ
ゴ糖混合物が調製されている。 そして、このようにし
て得られた寒天オリゴ糖（混合物）には、デンプン老化
防止作用、非消化、静菌作用などの機能が認められてい
る。

【０００６】しかし、従来の技術では、ヘテロ２糖であ
るネオアガロビオースを含めて単一の寒天オリゴ糖のみ
を選択的に調製することは困難であった。 すなわち、
寒天に酸やアルカリを作用させて化学的に加水分解を行
った場合には、単糖を含めて複数の糖の混合物が調製さ
れ、単一のオリゴ糖を取得することは不可能であった。

【０００７】また、従来発見されている酵素を使用した
場合にも、上述したような６糖、４糖、２糖を主成分と
するオリゴ糖混合物が調製されてしまい、選択的に単一
のオリゴ糖を生産させることは不可能であった。

【０００８】従って、単一の寒天オリゴ糖を調製するた
めには、更に単離・精製の工程が必要とされており、煩
雑なものとならざるを得なかった。 換言すれば、単一
の寒天オリゴ糖を大量生産するための技術は、確立され
ていなかった。

【０００９】寒天からのヘテロ２糖であるネオアガロビ
オースは、現在は研究用試薬としてのみ販売されてお
り、他の糖類と比較した場合、かなり高価である。 し
かし、このネオアガロビオースについて、安全性が高
く、コストが低く、しかも選択的にネオアガロビオース
を生産する技術が実現すれば、当該物質の新規な用途開
発も期待される状況にある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上記のような理由か
ら、簡便かつ選択的に寒天オリゴ糖、特にネオアガロビ
オースを生産するための技術の開発が望まれており、当
該目的に利用できる寒天分解酵素およびこれを利用した
選択的なネオアガロビオースの製造法の確立が求められ
ていた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題解
決のためにまず、寒天を分解する能力を有する微生物を
検索し、これを分離した。 そして更に、それら微生物
の保有する酵素を分離し、それらの作用を検索した結
果、特定の微生物が産生する寒天分解酵素は、寒天を分
解し、選択的にヘテロ２糖であるネオアガロビオースと
することを見出し、本発明を完成した。

【００１２】すなわち、本発明はアガロースを分解し、
選択的にネオアガロビオースを産生する寒天分解酵素お
よび当該酵素を利用するネオアガロビオースの製造法並
びに当該寒天分解酵素を保有する微生物を提供するもの
である。

【００１３】本発明の寒天分解酵素を産生する微生物
は、例えば次のようにして得ることができる。 まず、
微生物群中から寒天を分解する能力を有する微生物を選
択し、次いでこの微生物を寒天を含むアルカリ性培地中
で培養することにより寒天分解酵素を生産させ、分離す
る。 更に、得られた寒天分解酵素を寒天を含む溶液と
接触させることにより、ネオアガロビオースを選択的に
生産する寒天分解酵素を保有する微生物を選抜すること
ができる。

【００１４】このような微生物の一例として、本発明者
は神奈川県の土壌からアルテロモナス・エスピー（Alte
romonas sp.） Ｅ−１を分離、取得しているが、この微
生物は、次のような菌学的性質を有している。

【００１５】 （１） 形 態 グラム染色性： 陰 性 細胞の形および大きさ： 桿 菌 （０.８〜０.９）×（２.０〜２.２）μｍ 寒天培地上での集落の色調： 淡黄色 運 動 性： あ り べ ん 毛： あ り（極べん毛） 胞子形成： な し （２）各培地における生育： 肉汁寒天平板培地： 生育は微弱 マリンアガー平板培地： 生育は微弱。但し寒天を穿孔し、孔の周囲に付着し （ディフコ社） た生育が認められる。

【００１６】（３）生理学的性質 好気下生育： あ り 嫌気下生育： な し 蛍光色素の生育： な し ＰＨＢ（ポリヒドロキシ酪酸）蓄積： な し オキシダーゼ： 陽 性 カタラーゼ： 陽 性 Ｏ−Ｆテスト： Ｏ（微弱） ＮａＣｌ非存在下での生育： あ り ３.０％ ＮａＣｌ 存在下での生育： な し ６.０％ ＮａＣｌ 存在下での生育： な し

【００１７】 ＯＮＰＧ： 陽 性 Ｖ−Ｐテスト： 陽 性 硝酸塩の還元性： あ り ウレアーゼ： 陰 性 リパーゼ： 陰 性 ゼラチンの液化： 陰 性 デンプン分解： 陽 性 ＤＮＡの分解： 陽 性 システインからの硫化水素発生： 陰 性 ４１℃における生育： な し

【００１８】 糖類からの酸の生成： （ 糖 類 ） （酸生成） （ 糖 類 ） （酸生成） グルコース ＋ マンニトール ＋ フルクトース ＋ ソルビトール ＋ アラビノース ＋ イノシトール − キシロース − サリシン ＋ スクロース − デンプン ＋ マルトース ＋ アガロース ＋ ラクトース ＋ 寒天 ＋

【００１９】（４）その他の性質 インドールの生成 ＋ クエン酸の炭素源としての資化性 −

【００２０】この微生物について、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology）に基づき
検索した結果、まず、アルテロモナス（Alteromonas）
属またはデライア（Deleya）属に属する微生物と判断さ
れた。 更に、いずれかの属に属するものかについて検
討したが、アルテロモナス属に属する微生物であるとさ
れる可能性が強いが、デライア属に属するものである可
能性も捨てきれない。

【００２１】そこで、上記菌株を、一応アルテロモナス
属に属するものとした上で、平成６年１１月２５日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ. Ｐ−１
４６６４号として寄託した。

【００２２】この菌株、アルテロモナス・エスピー Ｅ
−１から本発明の寒天分解酵素を得るには、例えばこれ
を常法にしたがって培養し、次いで培養液中から当該酵
素を回収すれば良い。 また、本発明の寒天分解酵素の
調製には、上記菌株に限られず、上記菌株の変種、変異
株の他、アガロースを選択的にアガロビオースに分解で
きる菌株であれば何れも使用することができる。

【００２３】寒天分解酵素を得るための微生物の培養方
法としては、当該寒天分解酵素が誘導酵素であるため、
寒天、アガロース、アガロヘキサオース、アガロトリオ
ースなどを炭素源として単独あるいは併用して使用する
ことが可能である。 尚、グルコースなどの他の炭素源
を併用することも可能である。

【００２４】また、窒素源としては、各種無機アンモニ
ア塩、硝酸塩、尿素などの無機窒素源や、カザミノ酸、
酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、大豆粉、コーンス
ティープリカー、各種アミノ酸などの有機窒素化合物
を、使用微生物の資化性と生育を考慮して、１種又は２
種以上を適宜選択して使用することができる。

【００２５】無機塩としては、ナトリウム、マグネシウ
ム、カルシウム、鉄、カリウムのリン酸塩、塩酸塩、硫
酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの１種又は２種以上を適宜添
加することができる。 更に、必要に応じて、植物油、
界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。

【００２６】培養は、前記培地成分を含む液体培地中で
振盪培養、通気撹拌培養、連続培養など通常の培養法を
用いて実施可能である。 培養条件は培地の種類、培養
法により適宜選択すればよく、寒天分解菌が増殖して寒
天分解酵素を生産可能な条件であればよい。 通常、培
養初発ｐＨ６.０〜８.０、温度２５〜３７℃で通気撹拌
して培養を行えば良く、培養日数は１〜２日間程度とす
ることが多い。

【００２７】以上のようにして生産された寒天分解酵素
は、次のような方法で分離、回収される。 まず、本発
明の寒天分解酵素は菌体に付着しているため、培養終了
後、遠心分離により菌体を回収し、緩衝溶液にて洗浄を
行う。 次いで、界面活性剤を添加して菌体より寒天分
解酵素を遊離させ、更に遠心分離により菌体を除去すれ
ば酵素の抽出液が得られる。 一方、菌体外酵素であれ
ば、培養終了後、濾過や遠心分離により菌体を除去し、
寒天分解酵素を含む培養濾液を調製できる。

【００２８】得られた酵素を含む液は、ゲル濾過などの
操作により脱塩処理したのち、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動法などの精製方法を１種又は２種以上組合せて高純度
に精製することが可能である。 また、硫安塩析、溶媒
沈澱法、凍結乾燥、限界濾過、クロマトフォーカシング
などの方法も利用される。

【００２９】上記のようにして得られる本発明の寒天分
解酵素の活性測定法は、以下のような方法により行うこ
とができる。 まず、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液
（ｐＨ７.５） に希釈溶解した酵素溶液５０μｌを４０
℃にて保温しておき、これに０.１％寒天溶液（高温で
溶解した後に４０℃で保温したもの）０.４５ｍｌを添
加して反応を開始する。 反応は４０℃で１０分間行な
い、沸騰水中で５分間放置することにより反応を停止す
る。 還元糖はソモギー・ネルソン法で測定する。活性
は、１μｍｏｌｅのガラクトースに相当する還元力を生
成する酵素量を１単位（Ｕ）として表示する。

【００３０】かくして得られた寒天分解酵素は、次のよ
うな物理的、化学的性質を有する。 （１） 作用：アガロースのβ−１,４結合を加水分解し
てアガロース溶液の粘度を低下させ、ネオアガロビオー
スを生成する。 （２） 基質特異性：アガロース、ネオアガロヘキサオ
ース、ネオアガロテトラオースに作用し、速やかにネオ
アガロビオースに分解する。 しかし、ネオアガロビオ
ースやラクトース（乳糖）には作用しない。

【００３１】（３） ｐＨ安定性および最適ｐＨ：基質
が存在しない条件下においては、ｐＨ６.０〜９.０の範
囲で安定である。寒天を基質としたとき最適ｐＨは７.
５であり、ｐＨ８.０においても高い活性（最高活性の
９５％）を示す。 （４） 熱安定性および最適温度：基質が存在しない条
件下においては、４０℃以下では安定、５０℃では約３
％の活性が残存する。 寒天を基質としたとき最適温度
は４０℃である。

【００３２】（５） 分子量： 約 ８４,０００（電気泳動法） 約１８０,０００（ゲル濾過法） （６） 金属塩等の影響：Ｃｕ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｈ
ｇ²⁺およびＺｎ²⁺により阻害される。 また、Ｃａ²⁺、
Ｍｇ²⁺、Ａｇ⁺、パラクロロマーキュリー安息香酸（Ｐ
ＣＭＢ）によりやや阻害される。 Ｋ⁺、Ｎａ⁺、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）によっては阻害され
ない。

【００３３】以上の本発明酵素の性質を公知の寒天分解
酵素（特開平１−２２８４６５号）と比較すると、公知
酵素は、アガロースを加水分解しネオアガロテトラオー
スとネオアガロヘキサオースを産生するのに対し、本発
明酵素はネオアガロビオースのみを産生する点において
明らかに相違し、新規酵素と判断される。

【００３４】かくして得られた本発明の寒天分解酵素を
用いて選択的にネオアガロースを調製するためには、当
該酵素をアルカリ性条件とした寒天溶液に加え、反応さ
せればよい。

【００３５】具体的には、例えば１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝溶液（ｐＨ７.５）に０.５％濃度になるように寒天
またはアガロースを加え、これに当該寒天分解酵素５０
ｍＵ/ｍｌ以上の濃度になるように添加して、４０℃に
て４時間以上作用させる。 この溶液を沸騰水中で５分
間放置することにより反応を停止させ、４℃に冷却す
る。 ここで、特に寒天を基質とした場合には不溶物の
沈澱などが存在するため遠心分離により残渣を除去す
る。 得られた上澄液にネオアガロビオースが含まれる
ので、これからネオアガロビオースを得ることができ
る。

【００３６】上記方法によれば、寒天から選択的にネオ
アガロビオースを得ることができ、他のオリゴ糖、例え
ばネオアガロテトラオースやネオアガロヘキサオースは
それぞれネオアガロビオースの量の５％以下しか含まれ
ない。 また、ネオアガロビオースを固体として回収す
るためには、この上澄液をロータリエバポレーターなど
で濃縮したのち、常法によりシリカゲルやセファデック
スＧ−１０（ファルマシア製）などのカラムを通して脱
塩、精製すればよい。

【００３７】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。

【００３８】実 施 例 １ 寒天分解酵素を生産する微生物のスクリーニング： （１） 寒天 １５ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ １.０ｇ、ＫＣｌ ０.
７５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １２.４ｇ、ＣａＣｌ₂・
２Ｈ₂Ｏ １.４５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.０７５ｇ、ＦｅＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０１２ｇ、カザミノ酸 １.２５ｇおよ
び酵母エキス １.２５ｇを１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
溶液（ｐＨ８.０）に溶解し、全量を１リットルとして
寒天培地を得た。 これをオートクレープで１２０℃、
１５分間蒸気滅菌した後に、無菌条件下において２０ｍ
ｌずつシャーレに分注して常温で平板状に固化させて寒
天平板培地を得た。

【００３９】（２） 上記した寒天平板培地を用い、日
本各地から収集した土壌試料中の微生物の培養を行って
寒天分解酵素を生産する微生物をスクリーニングした。
まず、土壌試料を滅菌蒸留水に適宜懸濁し、その０.５
ｍｌを寒天平板培地上に接種し、３０℃にて３日間静置
培養した。 集落の形成が認められ、さらに寒天に穿孔
が認められたものについて、寒天分解酵素生産微生物の
候補として選択した。 この候補微生物を、常法に従
い、種々の培地を利用して純粋分離した。純粋分離した
候補微生物を、上記の寒天培地上で５日間を周期として
５回以上継代培養し、安定に生育を示すものを寒天培地
上のスラントとして冷蔵庫中（４℃）で保存した。

【００４０】（３） さらに、前記の寒天培地組成にお
いて、寒天濃度のみを１ｇ／ｌに代えた寒天液体培地を
作成し、この５０ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに
分注した。 それぞれの微生物をスラントから１白金耳
を同培地に接種して、３０℃で１日間、１２０ｒｐｍに
て振盪培養して前培養液を調製した。 この前培養液１
ｍｌを本培養用寒天液体培地に接種して同一の条件下で
５日間培養した。 １〜５日間の各培養日ごとに寒天分
解酵素活性を調べ、強力な寒天分解活性が検出された微
生物６株を選択した。 この中で、最高の活性を示した
寒天分解酵素生産菌としてアルテロモナス・エスピーＥ
−１株を取得した。

【００４１】（４） なお、前記６株の微生物生産する
寒天分解酵素については、菌体を除去した培養濾液また
は無細胞抽出液を粗酵素溶液として、寒天に対する作用
を調べた。 この時、アルテロモナス・エスピーＥ−１
株の粗酵素溶液のみが寒天からネオアガロビオースのみ
を選択的に生成したため、当該寒天分解酵素が新規なも
のであると判断した。

【００４２】実 施 例 ２ 本発明微生物からの本発明寒天分解酵素の生産方法： （１）５００ｍｌ容の坂口フラスコに、上記の組成の寒
天液体培地５０ｍｌを分注して、アルテロモナス・エス
ピーＥ−１株を１白金耳接種し、３０℃で２４時間、１
２０ｒｐｍにて液内振盪培養した。 培養終了後、菌体
を遠心分離により回収し、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
溶液（ｐＨ７.５）で菌体を洗浄し、遠心分離して洗浄
菌体を再回収した。 この菌体を同緩衝溶液に懸濁し、
これを適宜希釈してそのまま活性測定に使用した。 こ
のとき、寒天分解酵素は培養液当り０.８０Ｕ／ｍｌ生
産されていた。

【００４３】なお、界面活性剤として０.５％ＣＨＡＰ
Ｓ（3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-prop
anesulfonate）を使用し、菌体から寒天分解酵素を遊離
させた後、これをセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア製）により脱塩した無細胞抽出液（粗酵素溶液）を使
用した場合にもほぼ同等の活性が得られた。

【００４４】実 施 例 ３ 本発明の寒天分解酵素の精製および物性の確認試験： （１）寒天分解酵素の精製：５００ｍｌ容の坂口フラス
コに、前記の組成の寒天液体培地５０ｍｌを分注し、ア
ルテロモナス・エスピーＥ−１株を１白金耳接種して、
３０℃で２４時間、１２０ｒｐｍにて液内振盪培養し
た。 培養終了後、菌体を遠心分離により回収し、０.５
Ｍ ＫＣｌを含む１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ
７.８）で菌体を洗浄し、遠心分離して洗浄菌体を再回
収した。 この菌体を同緩衝溶液５ｍｌに再懸濁し、終
濃度０.５％となるようにＣＨＡＰＳを添加して菌体か
ら寒天分解酵素を遊離させた。 遠心分離して上澄液を
取得し、これをセファデックスＧ−２５（ファルマシア
製）を充填したカラムを通過させて脱塩処理した。

【００４５】得られた溶液をＤＥＡＥ−トヨパール６５
０Ｍ（東ソー製）に吸着させ、２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝溶液（ｐＨ７.８）にＫＣｌを０〜０.５Ｍの濃度勾配
的に添加したものを流下させ、イオン交換クロマトグラ
フィーにより寒天分解活性のある分画を得た。 これを
２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７.８）で平衡化
したセファクリルＳ−３００（ファルマシア製）を充填
したカラムを通過させて、ゲル濾過により活性のある分
画を得た。 さらに、この分画をブチル−トヨパール６
５０Ｍ（東ソー製）に吸着させ、２０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝溶液（ｐＨ７.８）に３０％、２０％、０％の濃
度で硫安を添加した溶液を順次流下させて、疎水クロマ
トグラフィーにより寒天分解酵素活性のある分画を得
た。 得られた精製標品の活性は、１５Ｕ／ｍｇタンパ
ク質であった。 また、活性回収率は９.６％であった。

【００４６】（２）酵素活性の測定：市販の寒天（和光
純薬製）およびアガロース（ニッポンジーン製）は、
０.５％濃度となるように１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶
液（ｐＨ７.５）に加熱溶解した後に４０℃に保温し、
また、ネオアガロヘキサオース（シグマ製）およびネオ
アガロオテトラオース（シグマ製）は０.５％の濃度と
なるように１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７.
５）に常温で溶解して試験液を調製した。 各試験液に
上記（１）で得られた精製酵素を５０ｍＵ／ｍｌ以上に
なるように添加して、４０℃で４時間攪拌しながら反応
させたところ、いずれの試験液においてもネオアガロビ
オースのみが得られ、他のオリゴ糖や単糖は検出されな
かった。

【００４７】（３）ｐＨ安定性：２０ｍＭ クエン酸−
リン酸緩衝溶液および２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝溶液
を用い、ｐＨ５.０〜９.５の範囲における精製酵素の安
定性を調べた。 この結果を図１および図２に示す。
このうち、図１は基質としての寒天が存在する場合、図
２は基質が存在しない場合を示す。 この結果より、基
質が存在しない条件下においては、ｐＨ６.０〜９.０の
範囲で安定であることが示された。 また寒天を基質と
したとき最適ｐＨは７.５であり、ｐＨ８.０においても
高い活性（最高活性の９５％）を有することが示され
た。

【００４８】（４）熱安定性：ｐＨ７.５の条件で、２
０℃〜７０℃の範囲での精製酵素の安定性を調べた。こ
の結果を図３および図４に示す。 このうち、図３は寒
天を基質として用いたものであり、最適温度は４０℃で
ある。 また、図４は基質が存在しない条件下における
もので、４０℃以下では安定、５０℃では約３％の活性
が残存する。

【００４９】（５）分子量の測定：上記（１）で得られ
た精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法に供したところ、単一なバンドが１本のみ検出され、
分子量は約８４,０００であった。 さらに、この精製酵
素について、ゲル濾過法による分子量を測定したとこ
ろ、約１８０,０００であった。

【００５０】（６）金属塩の影響：ｐＨ ７.５、４０
℃、２ｍＭの濃度での各種金属塩の存在下、３時間の処
理での酵素活性を調べた。 この結果、Ｃｕ²⁺、Ｍ
ｎ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｈｇ²⁺の存在下では酵素活性が０％、ま
た、Ｚｎ²⁺の存在下では３％であり、これら金属により
阻害されることが示された。 一方、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、
Ａｇ⁺、パラクロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）
の存在下での酵素活性は７４〜８９％であり、これらに
よりやや阻害されることが示された。 更に、Ｋ⁺、Ｎａ
⁺、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）では１０
６％の酵素活性が認められ、これらによる酵素阻害は認
められなかった。

【００５１】実 施 例 ４ 本発明寒天分解酵素を利用したネオアガロビオースの製
造方法（１）：０.５％アガロース（ニッポンジーン
製）を加熱溶解させた１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液
（ｐＨ７.８）５０ｍｌに対して、５０ｍＵ／ｍｌ以上
になるように酵素を添加した。 ４０℃にて４時間以上
撹拌しながら反応させた。 この溶液を沸騰水中で３分
間放置することにより反応を停止させ、４℃に冷却す
る。 ここで、寒天分解酵素自体はタンパク質であるた
め変性して沈澱となり、とくに寒天を基質とした場合に
は不溶物の沈澱などが存在するため遠心分離により残渣
を除去する。得られた上澄液にネオアガロビオースが回
収される。

【００５２】なお、経時的に同様の操作によって上澄液
の０.２ｍｌを分取してシリカゲルの薄層クロマトグラ
フィーに供することにより酵素反応の進行を確認した。
薄層クロマトグラフィーの展開液組成は、ｎ−ブタノー
ル／酢酸／水（２：１：１）とし、検出はナフトレゾル
シンのエタノール溶液の噴霧により行った。

【００５３】３０分間の酵素反応では、ネオアガロビオ
ースの生成が顕著に確認されたがこの時点ではネオアガ
ロヘキサオースやネオアガロテトラオースの存在も認め
られた。 しかし、２時間の酵素反応では、ほとんどネ
オアガロヘキサオースやネオアガロテトラオースは認め
られず、ネオアガロビオースの量が選択的に増大してい
た。 ４時間以上の反応ではネオアガロビオースのみが
生成しており、他のオリゴ糖は検出されなかった。ま
た、以上のどの反応時間においても単糖は検出されなか
った。

【００５４】また、本実施例により、寒天やアガロース
から生成したネオアガロビオースと市販の標品（シグマ
製）と比較した。 この結果、両者は、薄層クロマトグ
ラフィー上では同一の展開位置に同一の発色を示し、高
速液体クロマトグラフィーＬＣ−６Ａ（島津製）による
分析においても同一の保持時間の位置に検出されたた
め、同一構造を有することが確認された。

【００５５】実 施 例 ５ 本発明寒天分解酵素を利用したネオアガロビオースの製
造方法（２）：０.５％アガロースに代えて寒天を使用
する以外は実施例４と同様にしてネオアガロビオースを
製造した。この製法によってもネオアガロビオースが選
択的に得られた。

【００５６】

【発明の効果】本発明の寒天分解酵素は、寒天を選択的
にネオアガロビオースに分解する。従って、糖の単離・
精製工程なしに、デンプン老化防止作用、非消化、静菌
作用などの機能が認められる寒天オリゴ糖であるネオア
ガロビオースを得ることができ、単一の寒天オリゴ糖を
有利に大量生産することができるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 基質として寒天が存在する場合のｐＨ依存の
酵素活性を示す図面。 図中、白丸は２０ｍＭ クエン酸
−リン酸緩衝液を示し、黒丸は２０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝溶液を示す。図２〜図４も同じ。

【図２】 基質が存在しない場合のｐＨ依存の酵素活性
を示す図面。

【図３】 基質として寒天が存在する場合の温度依存の
酵素活性を示す図面。

【図４】 基質が存在しない場合の温度依存の酵素活性
を示す図面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01 (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献 Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ．， 1992， Ｖｏｌ. 58， Ｎｏ．12， ｐａｇｅｓ 4060− ３ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．, 1993， Ｖｏｌ．214， Ｎｏ．２, ｐａｇｅｓ 599−607 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/14 - 9/46 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルテロモナス属に属する微生物が産
   生し、アガロースを分解して選択的にネオアガロビオー
   スを産生する寒天分解酵素であって、次の性質を有する
   寒天分解酵素。 （１） 作用： アガロースのβ−１ , ４結合を加水分解してアガロース
   溶液の粘度を低下させ、ネオアガロビオースを生成す
   る。 （２） 基質特異性： アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテト
   ラオースに作用し、速やかにネオアガロビオースに分解
   する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース（乳
   糖）には作用しない。 （３） ｐＨ安定性および最適ｐＨ： 基質が存在しない条件下においては、ｐＨ６ . ０〜９ . ０
   の範囲で安定である。寒天を基質としたとき最適ｐＨは
   ７ . ５であり、ｐＨ８ . ０においても高い活性（最高活性
   の９５％）を示す。 （４） 熱安定性および最適温度： 基質が存在しない条件下においては、４０℃以下では安
   定、５０℃では約３％の活性が残存する。 寒天を基質
   としたとき最適温度は４０℃である。 （５） 分子量： 約 ８４ , ０００（電気泳動法） 約１８０ , ０００（ゲル濾過法） （６） 金属塩等の影響： Ｃｕ ²⁺ 、Ｍｎ ²⁺ 、Ｆｅ ²⁺ 、Ｈｇ ²⁺ およびＺｎ ²⁺ により阻
   害される。 また、Ｃａ ²⁺ 、Ｍｇ ²⁺ 、Ａｇ ⁺ 、パラクロロ
   マーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によりやや阻害され
   る。Ｋ ⁺ 、Ｎａ ⁺ 、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
   Ａ）によっては阻害されない。
2. 【請求項２】 工業技術院生命工学工業技術研究所に
   ＦＥＲＭ.Ｐ−１４６６４号として寄託された微生物よ
   り得たものである請求項第１項記載の新規な寒天分解酵
   素。
3. 【請求項３】 請求項第１項または第２項記載の寒天
   分解酵素と寒天とを接触させ、ネオアガロビオースを得
   ることを特徴とするネオアガロビオースの製造法。
4. 【請求項４】 寒天のβ−１,４結合を加水分解し、選
   択的にネオアガロビオースを得るものである請求項第３
   項記載のネオアガロビオースの製造法。
5. 【請求項５】 アガロースを分解し、選択的にネオア
   ガロビオースを産生する寒天分解酵素を保有するアルテ
   ロモナス・エスピー Ｅ−１（ＦＥＲＭ . Ｐ−１４６６
   ４号）。