JPH0824630A - 微小粒子捕捉方法及び分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 微小粒子をレーザー光の照射により捕捉、分
離する。 【構成】 半導体レーザー光源１１からのレーザー光
は、レーザー光を偏向するガルバノによるミラー１６、
１７の位置と同期してパルス駆動を開始する。同時に、
ガルバノミラー１６、１７もガルバノ駆動回路１４、１
５による駆動電流で周期的に揺動を繰り返すと、それぞ
れ紙面とを含む軸１６Ａ、紙面と垂直な軸１７Ａを中心
に所定の角度に揺動することになり、顕微鏡視野内でレ
ーザー光は例えば１０ｍＳおきの断続的な照射パターン
が形成される。このときの照射パターンの幅ｇは、レー
ザーパルス幅ｅとガルバノミラー１６、１７の角速度か
ら定まるが、これらを適当に設定して幅ｇを所望の粒子
の直径と同程度かそれ以下の長さになるようにして、溶
液Ｓに対して断続的に走査を繰り返すと、溶液Ｓ中でブ
ラウン運動により動いている粒子Ｐがトラップサイトに
入って捕捉される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、溶液中の微小粒子を補
足したり分離する微小粒子捕捉方法及び分離方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】溶液中の微小粒子を顕微鏡視野下で粒子
を捕捉し移動する手段として、例えば特開平３−１１０
５１０号公報に示すような、レーザー光を用いた光トラ
ップ技術などが知られている。これらの技術の応用例と
して、培養液中に浮遊する細胞の分離、或いは細胞融合
が挙げられる。これは浮遊細胞の顕微鏡画像から得られ
る情報を用いて粒子を選択し、光トラップにより所望の
粒子のみを捕捉し移動することにより行われる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、細胞の分離な
どの作業を効率的に行うためには、複数の粒子を同時に
捕捉することが望まれるが、従来の方法ではそのために
複数のレーザー光の光源を用いて、それぞれを顕微鏡の
視野下に集光しなければならず、装置が複雑化したり、
捕捉できる粒子の数が限られるといった問題点がある。
或いは、それぞれの粒子を独立に移動しようとすると、
それぞれのビームについて偏向手段を用いて照射位置を
変える必要があり、そのための光学系は複雑になるとい
う問題点がある。

【０００４】また、トラップの際の散乱光などを検知
し、その信号を基に各サイトの粒子の要否を判断し、所
望の粒子の存在する捕捉サイトのみ捕捉されるように走
査することにより、複数の種類の粒子から所望の粒子を
分離することができる。

【０００５】本発明の目的は、簡単な構成の装置によ
り、容易に細胞融合などの微小粒子の顕微操作の効率を
高めることができる微小粒子捕捉方法及び分離方法を提
供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
の第１発明に係る微小粒子捕捉方法は、レーザー光を断
続的に発生するレーザー光源と、偏向手段とにより粒子
の存在面上に離散的な照射パターンを生成させるレーザ
ー光トラッピングを用いた微小粒子捕捉方法において、
複数の粒子を個々に所定の位置に固定させるように、前
記偏向手段と前記レーザー光源の繰り返しパルスを制御
することにより、粒子存在面上のレーザー光照射パター
ンを制御することを特徴とする。

【０００７】また、第２発明に係る微小粒子分離方法
は、捕捉されている複数の粒子から得られる信号を検知
して、該信号を用いたレーザー光照射によって各粒子の
捕捉と解放の切換えを行うことにより、複数種類の粒子
から所望の種類の粒子を分離することを特徴とする。

【０００８】

【作用】上述の構成を有する微小粒子捕捉方法は、レー
ザーパルスの照射長さとレーザー光の走査を制御するこ
とにより、レーザー光の照射位置を1 回の走査ごとに少
しずつ変え、捕捉された粒子を移動する。

【０００９】また微小粒子分離方法は、捕捉されている
粒子から得られる信号によりレーザー光を粒子に照射し
て捕捉と解放を切換えて所望の粒子の分離を行う。

【００１０】

【実施例】本発明を図示の実施例に基づいて詳細に説明
する。図１は第１の実施例の構成図であり、１１は半導
体レーザー光源であり、例えば波長６８０ｎｍのレーザ
ー光を発する。この半導体レーザー光源１１は駆動回路
１２により制御され、１ＭHzまでのパルスのレーザー光
を発することができる。半導体レーザー光源１１から出
射したレーザー光の光路には、コリメータレンズ１３、
ガルバノ駆動回路１４、１５によりそれぞれ駆動される
ガルバノミラー１６、１７、６００ｎｍ以上の波長光を
反射し他の波長光を透過する特性を有するダイクロイッ
クミラー１８、顕微鏡の対物レンズ１９、捕捉すべき多
数の微粒子Ｐを含む溶液Ｓが配置されている。この溶液
Ｓはスライドガラス２０上に滴下され、カバーガラス２
１により覆われている。そして、溶液Ｓ内の粒子Ｐは数
μｍから数１００μｍの大きさを持つ細胞或いはポリス
チレンなどから成り、溶液Ｓ内に混濁、浮遊して存在し
ている。

【００１１】スライドガラス２０の下方には、６００ｎ
ｍ以上の波長光を透過し他の波長光を反射するダイクロ
イックミラー２２、コンデンサレンズ２３、白色光源２
４が配置されている。また、ダイクロイックミラー２２
の反射方向には、レンズ２５、例えばフォトマルチプラ
イヤから成る光電変換素子２６が配置され、光電変換素
子２６の出力はオシロスコープなどの観察手段２７に接
続されている。

【００１２】一方、ダイクロイックミラー１８の溶液Ｓ
からの光束の透過方向には、レンズ３０、６５０ｎｍ以
下の波長光を透過させるバリヤフィルタ３１、ＣＣＤカ
メラカメラ３２が接続されており、ＣＣＤカメラ３２の
出力は画像処理装置３３、ＶＴＲ３４、テレビモニタ３
５に順次に接続されている。

【００１３】半導体レーザー光源１１からレーザー光が
出射されると、先ずガルバノミラー１６、１７に入射し
て偏向されるが、これらのレーザー光はガルバノによる
ミラー１６、１７の位置と同期して、図２(a) 示すよう
なパルス駆動を開始する。同時に、ガルバノミラー１
６、１７も図２(b) 、(c) に示すようなガルバノ駆動回
路１４、１５による駆動電流で周期的に揺動を繰り返す
と、それぞれ紙面とを含む軸１６Ａ、紙面と垂直な軸１
７Ａを中心に所定の角度に揺動することになり、顕微鏡
視野内でレーザー光は図３に示すような例えば１０ｍＳ
おきの断続的な照射パターンが形成される。

【００１４】このときの照射パターンの幅ｇは、レーザ
ーパルス幅ｅとガルバノミラー１６、１７の角速度から
定まるが、これらを適当に設定して幅ｇを所望の粒子の
直径と同程度かそれ以下の長さになるようにして、溶液
Ｓに対して断続的に走査を繰り返す。すると、溶液Ｓ中
でブラウン運動により動いている粒子Ｐがトラップサイ
トに入って捕捉される。照射パターンの幅ｇは粒子Ｐの
径と同程度かそれ以下なので、それぞれの捕捉サイトに
捕捉される粒子Ｐは１個に限定され、数１０秒後には図
４に示すように粒子Ｐが個々に分離された状態で捕捉さ
れることになる。

【００１５】この様子は白色光源２４で下方が照明さ
れ、粒子Ｐの像は対物レンズ１９、ダイクロイックミラ
ー１８、バリアフィルタ３１を経てＣＣＤカメラ３２に
よって撮影され、画像処理装置３３で画像処理された上
で、テレビモニタ３５上で操作者により観察されると同
時にＶＴＲ３４に録画される。その際に、ＣＣＤカメラ
３２に粒子Ｐからのレーザー光の反射光が入らないよう
に、バリヤフィルタ３１が６５０ｎｍ以下の波長光のみ
を透過している。

【００１６】このとき、レーザーパルス幅ｅは捕捉する
粒子Ｐの大きさにより設定し、周期ｆは隣の粒子Ｐとの
間隔により適当に設定することにより、所望のサイズの
粒子Ｐを１個ずつ、所望の間隔で顕微鏡視野下に捕捉す
ることができる。また、効率良く粒子Ｐを捕捉するため
に、図３に示すように粒子Ｐの径に応じて走査方向に垂
直なレーザー光の径ｈを変えてもよい。

【００１７】このようにして粒子捕捉を行うことで、簡
単な構成の装置で複数の粒子Ｐを１個ずつ所望の位置に
捕捉することができる。また、捕捉する位置の変更もレ
ーザー光の照射タイミング、又はガルバノ駆動回路１
４、１５からの出力を変えることで容易に行うことが可
能となる。

【００１８】レーザー光が微粒子Ｐをトラップする際の
粒子Ｐからのレーザー光の散乱光は、ダイクロイックミ
ラー２２により反射し、レンズ２５を介して光電変換素
子２６により散乱光強度に応じた電気信号に変換され、
オシロスコープなどの観察手段２７により観察される。

【００１９】この場合に光電変換素子４１からは、例え
ば図２(d) に示すような電気信号が得られる。散乱光の
強度は主に粒子Ｐの表面反射や粒子Ｐの内部の散乱の大
きさにより決まり、また散乱光の強度分布は粒子Ｐの大
きさのサイズによることが知られているので、異種の或
いは異なるサイズの粒子Ｐが、混在して溶液Ｓ中に存在
する場合に、これらの情報を用いてどこにある粒子Ｐが
どのような種類の粒子Ｐかを判断することができる。

【００２０】そのためには、各サイトに粒子Ｐが捕捉さ
れた図４のような状態で、図５(d)に示すように予め設
定した閾値V1、V2と比較する。図５(a) 、図６に示すよ
うに光学変換素子２６からの信号強度が閾値V1よりも大
きく、閾値V2よりも小さいと判断されたサイトのみオン
になるようにレーザー光を駆動する。すると、数秒後に
はレーザー光の照射のないサイトの粒子Ｐがブラウン運
動により捕捉サイトから離れてゆき、結果的には図７に
示すように所望の粒子Ｐのみが捕捉されることとなる。

【００２１】この際に、より確実な分類を行うために、
光学変換素子２６の出力を走査の周期ごとに重ね合わせ
て平均することにより、信号に含まれるノイズを低減す
ることができる。また、得られた波形を解析すること
で、各サイトの粒子Ｐの分類の判断に使用することもで
きる。

【００２２】このような手法により、簡単な構成の装置
で効率良く粒子Ｐの分離を行うことができる。また、ト
ラップビームが粒子Ｐに作用して得られる信号を用いる
ことで、画像処理など複雑な信号処理をすることなく、
粒子Ｐの大きさ、表面や内部の散乱など粒子Ｐの様々な
光学特性の信号を得て分離を行うことができる。

【００２３】また、１回の走査ごとにレーザー光照射位
置を少しずつ変えることにより、捕捉した粒子Ｐを顕微
鏡の視野下で移動することができる。レーザー光照射位
置の変更は、レーザー光の照射タイミングを変えること
により行われる。或いは、レーザー光を偏向するガルバ
ノミラー１６、１７の制御により行うこともできる。

【００２４】例えば、細胞融合を行う場合に、所望の特
徴を持つ細胞を上述のように捕捉、分離した後に、レー
ザー光の照射パターンを徐々に変え、図８に示すように
２個の細胞が適度に接する状態にする。ここで、３６０
ｎｍのレーザー光を細胞の接触面付近に照射することで
細胞融合ができる。

【００２５】このような方法を用いることで、簡単な構
成の装置で複数の粒子Ｐを１個ずつ独立して移動するこ
とができ、粒子Ｐの顕微鏡操作を効率良く行うことがで
きる。

【００２６】第１の実施例では、レーザー光照射中にも
走査が行われていたが、図９(b) に示すようなガルバノ
駆動電流を与え、走査をステップ状にし、レーザー光の
照射中に走査をしない状態にしても、同様に粒子Ｐを１
個ずつ所望の位置に固定できる。このとき、レーザー光
照射のパターンは図１０に示すようになるが、レーザー
光の径ｉを調節することにより、捕捉される粒子Ｐの大
きさを選択することができる。

【００２７】また第１の実施例では、粒子Ｐの分別の信
号を光学変換素子２６の信号を使用していたが、ＣＣＤ
カメラ３２により画像を撮影し、画像処理により各サイ
トの散乱光強度などの信号を測定し、分類の判断の基準
とすることもできる。

【００２８】また、粒子Ｐの分別の信号は散乱光だけで
なく他の信号でもよい。例えば、培養液中にある浮遊細
胞の分類においては、抗原抗体を利用して細胞を蛍光標
識し、トラッピングビームにより励起される蛍光を検知
することにより、その細胞を分類、分離することが可能
である。また、ここで蛍光標識の色素の励起波長とトラ
ッピングのレーザー光の波長が大きく異なる場合には、
細胞を捕捉した状態のまま、他の光源を用いて適当な波
長の光で細胞を照射し、蛍光を励起、測定することによ
り同様な分離を行うこともできる。

【００２９】以上の実施例ではブラウン運動を利用して
いるが、溶液Ｓが流れを形成するような構造にして、粒
子Ｐの運動を高めることにより粒子Ｐの分離を早めるこ
ともできる。

【００３０】また、粒子Ｐの捕捉の方法としてはレーザ
ー光を走査するものでなく、粒子Ｐを個々に固定できる
他の方法で粒子Ｐを分離することもできる。例えば、複
数のＣＷレーザー光を溶液Ｓの平面上の異なる位置に集
光して行い、各粒子Ｐからの信号に基づいて、それぞれ
のビームをオン・オフすることにより、粒子Ｐの分離を
行うこともできる。このビームのオン・オフはレーザー
駆動電流によって制御してもよいし、各ビームを独立し
て遮光できるような液晶シャッタのようなもので制御す
ることも可能である。

【００３１】また、光源は半導体レーザー光源ではなく
ともよく、例えば音響光学素子（ＡＯＭ）を使用すれ
ば、ＣＷレーザーを使って繰り返しパルスのレーザー光
を得て、同様に粒子Ｐを捕捉、分離することが可能であ
る。

【００３２】

【発明の効果】以上説明したように第１発明に係る微小
粒子捕捉方法は、レーザー光を照射する複数の位置が、
捕捉される微小粒子の大きさと同程度、或いはそれ以下
になるようにレーザーパルスの照射長さとレーザー光の
走査を制御することにより、希望の位置に微小粒子を１
個ずつ捕捉することが可能になる。

【００３３】また、第２発明に係る微小粒子分離方法
は、捕捉されている粒子から得られる信号によりレーザ
ー光を粒子に照射して、粒子の捕捉と解放を切換えて所
望の粒子の分離を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施例の概略図である。

【図２】レーザー駆動、走査系駆動、各粒子からの信号
の波形図である。

【図３】顕微鏡視野下の走査の様子とレーザー光の照射
位置の説明図である。

【図４】粒子がそれぞれの捕捉サイトに捕捉された状態
の説明図である。

【図５】レーザー駆動、走査系駆動、各粒子からの信号
の波形図である。

【図６】レーザー光照射位置の説明図である。

【図７】所望の粒子のみ捕捉した状態の説明図である。

【図８】粒子を移動した状態の説明図である。

【図９】第２の実施例におけるレーザー駆動、走査系駆
動の波形図である。

【図１０】レーザー光照射位置の説明図である。

【符号の説明】

１１ 半導体レーザー光源 １２ レーザー駆動回路 １６、１７ ガルバノミラー １８ ダイクロイックミラー １９ 対物レンズ ２６ 光電変換素子 ３２ ＣＣＤ ３３ 画像処理装置

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザー光を断続的に発生するレーザー
   光源と、偏向手段とにより粒子の存在面上に離散的な照
   射パターンを生成させるレーザー光トラッピングを用い
   た微小粒子捕捉方法において、複数の粒子を個々に所定
   の位置に固定させるように、前記偏向手段と前記レーザ
   ー光源の繰り返しパルスを制御することにより、粒子存
   在面上のレーザー光照射パターンを制御することを特徴
   とする微小粒子捕捉方法。
2. 【請求項２】 前記レーザー光照射パターンの大きさ
   が、それぞれの粒子捕捉サイトについて捕捉する粒子の
   大きさと略等しいか又はそれ以下とした請求項１に記載
   の微小粒子捕捉方法。
3. 【請求項３】 レーザー光照射のタイミング又は偏向手
   段を制御することにより、粒子の存在面上のレーザー光
   照射の位置を１回の走査ごとに変えることによって粒子
   を移動するようにした請求項１に記載の微小粒子捕捉方
   法。
4. 【請求項４】 捕捉されている複数の粒子から得られる
   信号を検知して、該信号を用いたレーザー光照射によっ
   て各粒子の捕捉と解放の切換えを行うことにより、複数
   種類の粒子から所望の種類の粒子を分離することを特徴
   とする微小粒子分離方法。
5. 【請求項５】 粒子から得られる前記信号を、粒子を捕
   捉するレーザー光が粒子に作用して得られる信号とした
   請求項４に記載の微小粒子分離方法。