JPH076945B2 - 電気泳動分離方法 - Google Patents
電気泳動分離方法Info
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- JPH076945B2 JPH076945B2 JP61504077A JP50407786A JPH076945B2 JP H076945 B2 JPH076945 B2 JP H076945B2 JP 61504077 A JP61504077 A JP 61504077A JP 50407786 A JP50407786 A JP 50407786A JP H076945 B2 JPH076945 B2 JP H076945B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は電気泳動により帯電高分子（帯電分子複合体を
含む）の混合物を分離する方法に関する。
含む）の混合物を分離する方法に関する。
ゲル電気泳動、例えば、ポリアクリルアミドゲルにおい
ては、主目的は高分解能であり、このために泳動帯域を
できるだけ鋭く保つ方法がある。帯域の拡大は一部拡散
によるが、特に濃縮ゲル内の大きな分子では、他の拡大
作用が起こり得ることが分かっている。その理由は、泳
動する分子がゲルの細孔に入り、入った通路による以外
に逃げることができないからである。その作用は「えび
捕りかご」取込みの作用である。遥かに大きな核酸分子
では、同様な相互作用が異なるサイズの分子を識別しそ
こなうことにつながる。平滑な直流の作用は、分子をト
ラップ内により深く追い込むことである。
ては、主目的は高分解能であり、このために泳動帯域を
できるだけ鋭く保つ方法がある。帯域の拡大は一部拡散
によるが、特に濃縮ゲル内の大きな分子では、他の拡大
作用が起こり得ることが分かっている。その理由は、泳
動する分子がゲルの細孔に入り、入った通路による以外
に逃げることができないからである。その作用は「えび
捕りかご」取込みの作用である。遥かに大きな核酸分子
では、同様な相互作用が異なるサイズの分子を識別しそ
こなうことにつながる。平滑な直流の作用は、分子をト
ラップ内により深く追い込むことである。
実際の作用は、原点に置かれた試料が完全には順方向に
運ばれず、ゲルを通して試料が泳動するにつれて取込ま
れた物質の「引きずった跡」が後に残され、物質の泳動
帯域の減少につながる。初めの試料が小さければ、取込
まれた物質は結局当初原点に置かれた全物質の大きな割
合を占め得るので、泳動帯域内の物質の量が小さくなり
過ぎて観測又は測定が不可能になる。ずっと感度のよい
検出法を用いる現在では、遥かに小さい試料をゲルに加
えることが実際的で望ましく、従って、上記の問題は遥
かに重要な意味を持つ。
運ばれず、ゲルを通して試料が泳動するにつれて取込ま
れた物質の「引きずった跡」が後に残され、物質の泳動
帯域の減少につながる。初めの試料が小さければ、取込
まれた物質は結局当初原点に置かれた全物質の大きな割
合を占め得るので、泳動帯域内の物質の量が小さくなり
過ぎて観測又は測定が不可能になる。ずっと感度のよい
検出法を用いる現在では、遥かに小さい試料をゲルに加
えることが実際的で望ましく、従って、上記の問題は遥
かに重要な意味を持つ。
最近染色体サイズのDNAのような極めて大きな分子を分
離できることが重要になった。断続的に可変な横（直
交）方向の電界をゲルに加える、多重電極の複合装置を
用いることによりある程度成功しているが、実際的にこ
れは、特に同一ゲルで多数の試料を同時に分析する場合
には実施が困難である。このような装置はカンターほか
の米国特許第4,473,452号及びCell,37（1984）,67−75
頁に記載されている。同装置は、多重配列のダイオード
制御電極を用いて異なった電極列間の短絡による問題に
遭遇することなく所望の複合電界効果を達成している。
離できることが重要になった。断続的に可変な横（直
交）方向の電界をゲルに加える、多重電極の複合装置を
用いることによりある程度成功しているが、実際的にこ
れは、特に同一ゲルで多数の試料を同時に分析する場合
には実施が困難である。このような装置はカンターほか
の米国特許第4,473,452号及びCell,37（1984）,67−75
頁に記載されている。同装置は、多重配列のダイオード
制御電極を用いて異なった電極列間の短絡による問題に
遭遇することなく所望の複合電界効果を達成している。
本発明は帯電高分子を分離する電気泳動方を提供する。
同方法では極性が断続的に逆転する電位の影響下におい
て、高分子が原点から所定の方向にゲル又は同様な物理
的な妨害媒体を通して移動するように誘導される。
同方法では極性が断続的に逆転する電位の影響下におい
て、高分子が原点から所定の方向にゲル又は同様な物理
的な妨害媒体を通して移動するように誘導される。
本発明の一実施態様では、電流反転は高分子が移動する
ように誘導される所定の方向に対して平行に行われる。
ように誘導される所定の方向に対して平行に行われる。
この驚くほど簡単な技術、すなわち、最も簡単な例では
標準電気泳動装置に１対の電極及び適切なスイッチ開閉
装置により補足される従来の電源を用いて行える技術に
より、少なくともこれまでに提案された（例えばカンタ
ーほかによる）より複雑な電極装置によるものと同程度
に有効な分子分離を行うことができる。実際により優れ
た分離が行える場合もある。従って、必要な不平衡電流
反転を行えるスイッチ開閉装置により補足した従来の電
気泳動装置を用いることにより、最も簡単な形で本発明
の利点を享受できる。
標準電気泳動装置に１対の電極及び適切なスイッチ開閉
装置により補足される従来の電源を用いて行える技術に
より、少なくともこれまでに提案された（例えばカンタ
ーほかによる）より複雑な電極装置によるものと同程度
に有効な分子分離を行うことができる。実際により優れ
た分離が行える場合もある。従って、必要な不平衡電流
反転を行えるスイッチ開閉装置により補足した従来の電
気泳動装置を用いることにより、最も簡単な形で本発明
の利点を享受できる。
DNAの分離では、最近電流反転の重要かつ実際的な利点
がオルソンほかにより独自に立証され、1985年11月にオ
ルソンがハイデルベルクで行った講演の主題となった。
さらに、カンターほかによりNature,319（1986）,701−
702頁に開示されたものは、多重電界法において100−15
0度に亘る交互電界間の角度につながる電界形状が分解
能を高めることを示唆し、内在的にこれが、方向逆転が
重要であることの認識につながっている。
がオルソンほかにより独自に立証され、1985年11月にオ
ルソンがハイデルベルクで行った講演の主題となった。
さらに、カンターほかによりNature,319（1986）,701−
702頁に開示されたものは、多重電界法において100−15
0度に亘る交互電界間の角度につながる電界形状が分解
能を高めることを示唆し、内在的にこれが、方向逆転が
重要であることの認識につながっている。
本発明の他の実施態様では、所定の方向に加えられる主
電流は同方向に直角な成分を持つ第２印加電位により補
足され、また第２印加電位の極性が断続的に逆転され
る。主電流を一定して断続的に加え、また所望ならば逆
転することもできる。
電流は同方向に直角な成分を持つ第２印加電位により補
足され、また第２印加電位の極性が断続的に逆転され
る。主電流を一定して断続的に加え、また所望ならば逆
転することもできる。
本発明のもう１つの実施態様では、複数個の電位がゲル
に印加され、各電位は所定の方向に直角な成分と所定の
方向に平行な成分とを有し、電位の相対的な大きさ及び
相対的な恒常性又は周波数が、所定の方向において分子
が正味の影響を受けるように設けられる。
に印加され、各電位は所定の方向に直角な成分と所定の
方向に平行な成分とを有し、電位の相対的な大きさ及び
相対的な恒常性又は周波数が、所定の方向において分子
が正味の影響を受けるように設けられる。
断続的な電流逆転にも拘らず、高分子は依然として一定
時間に亘り平均化された特定方向の正味電位の影響を必
ず受ける。従って、順方向の影響は逆方向の影響を越え
なければならない。実際に、逆転された電流の影響は、
順方向の影響の約50％を越えないことが望ましい。
時間に亘り平均化された特定方向の正味電位の影響を必
ず受ける。従って、順方向の影響は逆方向の影響を越え
なければならない。実際に、逆転された電流の影響は、
順方向の影響の約50％を越えないことが望ましい。
電流逆転を用いるには、同一の移動率に対し大きな電流
を必要とする。代表的な例では、電源から400vで40mAが
必要とされることがあり、この場合は全時間の1/6の間
電流が逆転される。比較し得る一定の所要直流は27mAで
ある。電流がより大きくなるにもかかわらず、クーロン
発熱による問題は起こりそうにない。今日の電気泳動装
置には、既に適切な温度制御装置が含まれている。
を必要とする。代表的な例では、電源から400vで40mAが
必要とされることがあり、この場合は全時間の1/6の間
電流が逆転される。比較し得る一定の所要直流は27mAで
ある。電流がより大きくなるにもかかわらず、クーロン
発熱による問題は起こりそうにない。今日の電気泳動装
置には、既に適切な温度制御装置が含まれている。
逆転の周波数は、分子のブラウン運動拡散によりトラッ
プを回避するのに十分な時間を与えるようにすべきであ
る。これは関連分子の大きさ及び自然拡散速度に左右さ
れるであろう。例として、蛋白質の場合には25/秒の周
波数が極めて適切であるが、毎秒１−5000の逆転も有効
である。DNA断片のようなより大きい分子の場合には、
より小さい周波数の逆転のほうが適切かもしれず、１分
以上の間隔が例外的に大きな分子に適している。
プを回避するのに十分な時間を与えるようにすべきであ
る。これは関連分子の大きさ及び自然拡散速度に左右さ
れるであろう。例として、蛋白質の場合には25/秒の周
波数が極めて適切であるが、毎秒１−5000の逆転も有効
である。DNA断片のようなより大きい分子の場合には、
より小さい周波数の逆転のほうが適切かもしれず、１分
以上の間隔が例外的に大きな分子に適している。
用いられる電圧及び電流は、電源からの出力で測定され
た、概して5mA−50mA及び100v−500vの範囲のゲル電気
泳動に用いられるもので代表される。電気泳動分離の所
要時間も典型的でありかつ分析すべき緻密な条件及び物
質次第では２−18時間に亘る。より普通には２−８時間
である。例外的に大きな分子の場合には、より大きな電
流と電圧及びより長い分離時間が適しているかもしれな
い。
た、概して5mA−50mA及び100v−500vの範囲のゲル電気
泳動に用いられるもので代表される。電気泳動分離の所
要時間も典型的でありかつ分析すべき緻密な条件及び物
質次第では２−18時間に亘る。より普通には２−８時間
である。例外的に大きな分子の場合には、より大きな電
流と電圧及びより長い分離時間が適しているかもしれな
い。
従って、本発明の方法は、正規の直流電源の全部又は一
部が可変可逆電源により置き換えられ又は補足される、
いかなる電気泳動装置を用いても実行することができ
る。一実施態様では、可逆電流の時間比を変えることが
可能で、より長い順方向パルスと比較的短い逆方向パル
スが一定の電圧で与えられる。
部が可変可逆電源により置き換えられ又は補足される、
いかなる電気泳動装置を用いても実行することができ
る。一実施態様では、可逆電流の時間比を変えることが
可能で、より長い順方向パルスと比較的短い逆方向パル
スが一定の電圧で与えられる。
本発明の実施には、電源及びそれと組合わされる（望ま
しくは一体形の）スイッチ開閉装置を含む電力装置が必
要である。スイッチ開閉装置は出力電流の極性を逆転
し、逆転の周波数を変え、また「マークタイム」（すな
わち、順逆両電流の持続時間の比を変えることができ
る）を変える能力を有する。電源は現在の電気泳動処理
の必要性を満たすように、最低1000vの平滑の直流出力
を提供し得ることが望ましい。多重出力を備えることも
有利で、それにより一連の電流形式を１組以上の電極に
連続的に印加し又は数個の電気泳動装置を同一電力装置
で作動させることができる。
しくは一体形の）スイッチ開閉装置を含む電力装置が必
要である。スイッチ開閉装置は出力電流の極性を逆転
し、逆転の周波数を変え、また「マークタイム」（すな
わち、順逆両電流の持続時間の比を変えることができ
る）を変える能力を有する。電源は現在の電気泳動処理
の必要性を満たすように、最低1000vの平滑の直流出力
を提供し得ることが望ましい。多重出力を備えることも
有利で、それにより一連の電流形式を１組以上の電極に
連続的に印加し又は数個の電気泳動装置を同一電力装置
で作動させることができる。
上記の能力を有する電力装置を構成するのに肝要な技術
は、電子技術では標準的なものであり、電力装置の詳細
な構造は、本発明の一部を成さない。電力装置により提
供しなければならない技術的機能を備えた適切な装置を
製造することは、当業者にとり容易である。例としての
み述べれば、適切なスイッチング波形は手動（電流逆転
間隔の長いものに対して）又はアナログ・デジタルタイ
マ、若しくはマイクロプロセッサを用いて発生させるこ
とができる。当該波形は高圧スイッチ用、金属酸化物
（MOS）スイッチ用又は高圧バイポーラトランジス用の
リレーを駆動するのに用いられる。高インピーダンス抵
抗器によりバイパスされた直流接続の多重MOSを用いる
ことは既に一般化しており、それにより高電圧・電流を
反復して高速度で切替えることが可能である。適切なス
イッチ開閉装置の例は添付の第１図乃至第３図に示す通
りで、以下簡単に説明する。
は、電子技術では標準的なものであり、電力装置の詳細
な構造は、本発明の一部を成さない。電力装置により提
供しなければならない技術的機能を備えた適切な装置を
製造することは、当業者にとり容易である。例としての
み述べれば、適切なスイッチング波形は手動（電流逆転
間隔の長いものに対して）又はアナログ・デジタルタイ
マ、若しくはマイクロプロセッサを用いて発生させるこ
とができる。当該波形は高圧スイッチ用、金属酸化物
（MOS）スイッチ用又は高圧バイポーラトランジス用の
リレーを駆動するのに用いられる。高インピーダンス抵
抗器によりバイパスされた直流接続の多重MOSを用いる
ことは既に一般化しており、それにより高電圧・電流を
反復して高速度で切替えることが可能である。適切なス
イッチ開閉装置の例は添付の第１図乃至第３図に示す通
りで、以下簡単に説明する。
第１図は、パワードライバ12に連結された演算増幅器11
を用いるスイッチ開閉装置を示す。低圧波形（第1a図）
は、R1値の第１抵抗器13を介して演算増幅器11に供給さ
れる。パワードライバ12及び演算増幅器11は、時事上よ
り高いR2値の第２抵抗器14を介して帰還ループにより接
続される。電気泳動セル15はパワードライバ12の出力及
び演算増幅器の「ゼロ」、すなわち、「アース」電位端
子に接続される。最初の波形（第1a図）は、例えば、マ
イクロプロセッサを用いて発生される。パワードライバ
からの出力電圧Ｖは下記の関係式により求められる。
を用いるスイッチ開閉装置を示す。低圧波形（第1a図）
は、R1値の第１抵抗器13を介して演算増幅器11に供給さ
れる。パワードライバ12及び演算増幅器11は、時事上よ
り高いR2値の第２抵抗器14を介して帰還ループにより接
続される。電気泳動セル15はパワードライバ12の出力及
び演算増幅器の「ゼロ」、すなわち、「アース」電位端
子に接続される。最初の波形（第1a図）は、例えば、マ
イクロプロセッサを用いて発生される。パワードライバ
からの出力電圧Ｖは下記の関係式により求められる。
Ｖ＝−R2/R1 従って、出力波形は遥かに高い電圧の波形となり、入力
電圧の逆となる。これは第1b図により表される。第１
図、第1a図及び第1b図の低圧（±15V）及び高圧（±300
V）源のような各種電圧は、原理説明の単なる例として
示す。
電圧の逆となる。これは第1b図により表される。第１
図、第1a図及び第1b図の低圧（±15V）及び高圧（±300
V）源のような各種電圧は、原理説明の単なる例として
示す。
第２図はスイッチ開閉装置23及び24を介してそれぞれ電
気泳動セル25に切替えられる、２個の別個の電源21及び
22（正及び負）を用いるスイッチ開閉方式を示す。この
実施態様では、スイッチ開閉装置はリレー、バイポーラ
トランジスタ又はMOSスイッチでもよい。
気泳動セル25に切替えられる、２個の別個の電源21及び
22（正及び負）を用いるスイッチ開閉方式を示す。この
実施態様では、スイッチ開閉装置はリレー、バイポーラ
トランジスタ又はMOSスイッチでもよい。
第３図は単一電源しか必要としない利点を持つブリッジ
回路を示す。ブリッジは従来設計のもので、４個のスイ
ッチ開閉装置31乃至34及びブリッジ中央の電気泳動セル
35を含む。あらゆるブリッジ回路において、スイッチ対
31、33及び32、34を交互にオン及びオフすることにより
その電流逆転が可能である。また場合によっては、スイ
ッチ開閉装置はリレー、バイポーラトランジスタ又はMO
Sでもよい。
回路を示す。ブリッジは従来設計のもので、４個のスイ
ッチ開閉装置31乃至34及びブリッジ中央の電気泳動セル
35を含む。あらゆるブリッジ回路において、スイッチ対
31、33及び32、34を交互にオン及びオフすることにより
その電流逆転が可能である。また場合によっては、スイ
ッチ開閉装置はリレー、バイポーラトランジスタ又はMO
Sでもよい。
本発明により用いられる電気泳動装置は基本的に、ゲル
支持体（カセット）、カセットを入れる溶媒タンク、適
切な電極及び電極用コネクタ並びに上記の適切に切替え
られる電力装置を含む。最も簡単な実施態様において
は、これらの構成部品はすべて変形電源を除き電気泳動
装置の標準品目であるこが認められるであろう。従っ
て、本発明の利点は、精巧な電極及び特殊なゲル支持体
を必要とせずに達成できる。
支持体（カセット）、カセットを入れる溶媒タンク、適
切な電極及び電極用コネクタ並びに上記の適切に切替え
られる電力装置を含む。最も簡単な実施態様において
は、これらの構成部品はすべて変形電源を除き電気泳動
装置の標準品目であるこが認められるであろう。従っ
て、本発明の利点は、精巧な電極及び特殊なゲル支持体
を必要とせずに達成できる。
本発明の実施態様では、例えば、DNAの大きな断片を分
離するのに可逆及び定電流の組合わせを用いることがで
きる。多くの可能な組合わせがあるが、実施例３、４及
び５では、それらの内有効な３例を示す。２種類の電流
逆転が実施例４及び５で共に用いられ、一方実施例３で
は、左右逆転が対角的移動を回避する利点を示した。こ
れらの実施例では、電気泳動装置の正規部品ではないス
イッチ開閉装置がゲル側の補足電極と共に用いられた。
従って、本発明による電流逆転は、もし所望なら、カン
ターほかにより示されたような静電界電気泳動技術と適
切に組合わせて用いることができる。
離するのに可逆及び定電流の組合わせを用いることがで
きる。多くの可能な組合わせがあるが、実施例３、４及
び５では、それらの内有効な３例を示す。２種類の電流
逆転が実施例４及び５で共に用いられ、一方実施例３で
は、左右逆転が対角的移動を回避する利点を示した。こ
れらの実施例では、電気泳動装置の正規部品ではないス
イッチ開閉装置がゲル側の補足電極と共に用いられた。
従って、本発明による電流逆転は、もし所望なら、カン
ターほかにより示されたような静電界電気泳動技術と適
切に組合わせて用いることができる。
本発明は、蛋白質及び核酸のような生態物質の複合混合
物を分離するのにとくに有用である。
物を分離するのにとくに有用である。
下記実施例により本発明を例証する。
実施例 １ 本実施例は、電流逆転を用いて帯域の拡大を減少させる
方法を示す。アクリルアミド15g、メチレンビスアクリ
ルアミド0.75g、テトラメチルジアミノメタン0.2mlをト
リグリシン緩衝剤（トリスヒドロキシアミノメタン1.2g
及びグリシン5.76g/l）100mlに溶解した。ゲル化は過硫
酸アンモニウム溶液（10％w/v）0.5ml及び従来の垂直ス
ラブ電気泳動装置内で形成された140×160×0.75mmの２
つの同一ゲルを加えることにより誘導した。
方法を示す。アクリルアミド15g、メチレンビスアクリ
ルアミド0.75g、テトラメチルジアミノメタン0.2mlをト
リグリシン緩衝剤（トリスヒドロキシアミノメタン1.2g
及びグリシン5.76g/l）100mlに溶解した。ゲル化は過硫
酸アンモニウム溶液（10％w/v）0.5ml及び従来の垂直ス
ラブ電気泳動装置内で形成された140×160×0.75mmの２
つの同一ゲルを加えることにより誘導した。
各々には蛋白質0.05μｇ乃至５μｇ又は10μｇの範囲の
負荷を与えるために、0.01μｌ乃至８μｌの牛血清アル
ブミン溶液が負荷された。その後一方のゲルは平滑直流
電源により10mAで７時間作動され、他方のゲルは25/秒
に設定された電流逆転周波数により15mAで７時間、及び
逆転電流で当該時間の1/6の間作動された。この逆転電
流は、すでに述べた第３図のスイッチ開閉回路を用いて
生成された。単極電源はブリッジ形に配列された４つの
バイポーラトランジスタに供給され、マークタイムは従
来の可変トランジスタにより制御された。両ゲル内を移
動した距離は殆ど同様であった。
負荷を与えるために、0.01μｌ乃至８μｌの牛血清アル
ブミン溶液が負荷された。その後一方のゲルは平滑直流
電源により10mAで７時間作動され、他方のゲルは25/秒
に設定された電流逆転周波数により15mAで７時間、及び
逆転電流で当該時間の1/6の間作動された。この逆転電
流は、すでに述べた第３図のスイッチ開閉回路を用いて
生成された。単極電源はブリッジ形に配列された４つの
バイポーラトランジスタに供給され、マークタイムは従
来の可変トランジスタにより制御された。両ゲル内を移
動した距離は殆ど同様であった。
蛋白質は銀着色により検出され、また帯域面積はクオン
ティメット（Quan-timet）像アナライザを用いて測定さ
れた。第４図は平均結果を示すもので、電流逆転を用い
た場合帯域面積が減少したことを示す。
ティメット（Quan-timet）像アナライザを用いて測定さ
れた。第４図は平均結果を示すもので、電流逆転を用い
た場合帯域面積が減少したことを示す。
第４図において、Ｘは着色移動帯域をmm2で表し、Ｙは
原点に置かれた初期加重をμｇで表す。線Ａは電流逆転
を用いる場合の代表的関係を示し、線Ｂは一定の直流電
力を用いた場合の代表的結果を示す。若し拡散のみが拡
大に影響するならば、帯域の横方向への広がり方、すな
わち、移動方向に対して直角に広がる仕方、を帯域面積
の概算に用いることができる。これらの面積を概算した
結果電流逆転を用いることにより、拡散のみに起因する
と予想される面積まで減少したことを示した。電流逆転
が拡散による帯域拡大に影響を与えることは期待できな
いであろう。
原点に置かれた初期加重をμｇで表す。線Ａは電流逆転
を用いる場合の代表的関係を示し、線Ｂは一定の直流電
力を用いた場合の代表的結果を示す。若し拡散のみが拡
大に影響するならば、帯域の横方向への広がり方、すな
わち、移動方向に対して直角に広がる仕方、を帯域面積
の概算に用いることができる。これらの面積を概算した
結果電流逆転を用いることにより、拡散のみに起因する
と予想される面積まで減少したことを示した。電流逆転
が拡散による帯域拡大に影響を与えることは期待できな
いであろう。
第5a及び第5b図は、制御手段として電流逆転及び平滑電
流を用いて得られた代表的着色ゲルを示す。第5a図は電
流逆転を用いた結果を示す。痕跡Ａ−Ｆは、当初原点
（各痕跡の頂部）においてそれぞれ10、５、１、0.5、
0.1及び0.05μｇを含んだサンプルの移動パターンを示
す。第5b図は定電流を用いた制御を表し、痕跡Ａ−Ｆは
同様な意味を持つ。第5a図の各場合には、最終移動帯域
は対応する直流制御移動帯域（第5b図）より著しく暗
く、より鋭く定められ、実際に制御痕跡の原点において
最低濃度の出発物質を含んだ移動パターンＦでは、移動
帯域が全く観測されず、資料物質すべてが原点まで後方
に伸びる「尾」に分布されたことを示す。第5a図に対応
する痕跡Ｆは、薄いけれどはっきり見分けられる移動帯
域を示し、これは本発明の電流逆転技術により極少量の
サンプル物質を扱うとき電気泳動の感度を著しく高めら
れることを示す。
流を用いて得られた代表的着色ゲルを示す。第5a図は電
流逆転を用いた結果を示す。痕跡Ａ−Ｆは、当初原点
（各痕跡の頂部）においてそれぞれ10、５、１、0.5、
0.1及び0.05μｇを含んだサンプルの移動パターンを示
す。第5b図は定電流を用いた制御を表し、痕跡Ａ−Ｆは
同様な意味を持つ。第5a図の各場合には、最終移動帯域
は対応する直流制御移動帯域（第5b図）より著しく暗
く、より鋭く定められ、実際に制御痕跡の原点において
最低濃度の出発物質を含んだ移動パターンＦでは、移動
帯域が全く観測されず、資料物質すべてが原点まで後方
に伸びる「尾」に分布されたことを示す。第5a図に対応
する痕跡Ｆは、薄いけれどはっきり見分けられる移動帯
域を示し、これは本発明の電流逆転技術により極少量の
サンプル物質を扱うとき電気泳動の感度を著しく高めら
れることを示す。
実施例 ２ 上記実施例は、帯域拡大の主因が拡散であることを示し
た。拡散は濃度勾配を減少させること、すなわち、極微
量の蛋白質又は核酸を加えることにより、最も効果的に
減少させることができる。極微量を加える場合取込み及
び引きずった跡を避けることがとくに重要である。
た。拡散は濃度勾配を減少させること、すなわち、極微
量の蛋白質又は核酸を加えることにより、最も効果的に
減少させることができる。極微量を加える場合取込み及
び引きずった跡を避けることがとくに重要である。
この実施例は、電流逆転で複合混合物を分析して得られ
た結果が普通の直流で得たものより優れていることを示
す。
た結果が普通の直流で得たものより優れていることを示
す。
実施例１と同様に２つのゲルを調製したが、今回の緩衝
剤はさらに0.1％（w/v）の硫酸ナトリウムドデシルを追
加した、蛋白質約10mg/mlを含む豚全筋肉抽出物１−10
μｇの試料が提供され、その後一方のゲルが電流逆転に
より45mAで165分間作動され、他方のゲルが26mAで同一
時間作動された。用いた可変電源は実施例１のものと同
一であった。総体的な移動は２ゲル間で殆ど同様であっ
た。蛋白質を検出するための銀着色後において、電流逆
転を用いたときの帯域の質がより密であることがはっき
り認められた。
剤はさらに0.1％（w/v）の硫酸ナトリウムドデシルを追
加した、蛋白質約10mg/mlを含む豚全筋肉抽出物１−10
μｇの試料が提供され、その後一方のゲルが電流逆転に
より45mAで165分間作動され、他方のゲルが26mAで同一
時間作動された。用いた可変電源は実施例１のものと同
一であった。総体的な移動は２ゲル間で殆ど同様であっ
た。蛋白質を検出するための銀着色後において、電流逆
転を用いたときの帯域の質がより密であることがはっき
り認められた。
平滑な直流を用いたときよりも電流逆転を用いたときの
方が、よりはっきりしたより鋭い帯域対が得られること
が一貫して観測された。
方が、よりはっきりしたより鋭い帯域対が得られること
が一貫して観測された。
実施例 ３ 本実施例では、電流逆転が大きなDNA断片の分離に用い
られた。用いた装置には、第６及び７図に示す変形垂直
スラブ電気泳動ゲルカセットが含まれた。これは標準ガ
ラス板カセットとカセットの各側に組込まれたプラチナ
線電極とを含んでいた。
られた。用いた装置には、第６及び７図に示す変形垂直
スラブ電気泳動ゲルカセットが含まれた。これは標準ガ
ラス板カセットとカセットの各側に組込まれたプラチナ
線電極とを含んでいた。
第６図から、電気泳動ゲル61は２個のガラス板62及び63
間の中央に挟まれている。両板は、各側にゲルを越えた
等距離に伸び、従って、垂直間隙64及び65はそれぞれ左
右に隣接する板の間に存在する。薄いプラチナ線電極66
がカセット最上部67から間隙64内に達している。線は内
径0.5mmの標準PTFEチューブからなる上下スリーブ68及
び69に囲まれている。電線の中央部分70は裸のままであ
る。上下PTFEスリーブ72及び73に囲まれた同様な電極71
はゲルの右側の間隙65に入っている。各電極は、ガラス
板が世紀の方法で共に締め付けられているとき、スリー
ブの圧縮により定位置に固定させる。
間の中央に挟まれている。両板は、各側にゲルを越えた
等距離に伸び、従って、垂直間隙64及び65はそれぞれ左
右に隣接する板の間に存在する。薄いプラチナ線電極66
がカセット最上部67から間隙64内に達している。線は内
径0.5mmの標準PTFEチューブからなる上下スリーブ68及
び69に囲まれている。電線の中央部分70は裸のままであ
る。上下PTFEスリーブ72及び73に囲まれた同様な電極71
はゲルの右側の間隙65に入っている。各電極は、ガラス
板が世紀の方法で共に締め付けられているとき、スリー
ブの圧縮により定位置に固定させる。
第６図に示す線AAに沿った部分断面図を示す第７図か
ら、板62及び63を共に保持する従来のねじクランプ74及
び75が見られる。電極66及び71を含む、上下スリーブ68
及び72のゲル61に関する配置が見られ、中間にある間隙
64及び65もはっきり見られる。このカッセトが標準の電
気泳動装置内に置かれると、間隙が緩衝剤で満たされる
ようになる。
ら、板62及び63を共に保持する従来のねじクランプ74及
び75が見られる。電極66及び71を含む、上下スリーブ68
及び72のゲル61に関する配置が見られ、中間にある間隙
64及び65もはっきり見られる。このカッセトが標準の電
気泳動装置内に置かれると、間隙が緩衝剤で満たされる
ようになる。
電極を形成するプラチナ線は、上スリーブから標準の電
気泳動セルのふた（図示せず）にある穴を通って上方に
出て、適切な電力装置と接続される。完全に組み立てら
れると、ガラス板カセット上部と下部とは標準の電気泳
動装置の部分を構成する標準の上下の緩衝剤タンクに浸
される。板間に挿入したゲルにより固定されるように曇
りガラス板が用いられた。ゲルの側縁と側電極との間に
残された間隙により、使用中の電極からいかなるガス発
生があってもゲルが壊れないことが保証された。この間
隙は、注入工程中にゲルの各側に取外し可能なスペーサ
を入れることにより容易に得られる。
気泳動セルのふた（図示せず）にある穴を通って上方に
出て、適切な電力装置と接続される。完全に組み立てら
れると、ガラス板カセット上部と下部とは標準の電気泳
動装置の部分を構成する標準の上下の緩衝剤タンクに浸
される。板間に挿入したゲルにより固定されるように曇
りガラス板が用いられた。ゲルの側縁と側電極との間に
残された間隙により、使用中の電極からいかなるガス発
生があってもゲルが壊れないことが保証された。この間
隙は、注入工程中にゲルの各側に取外し可能なスペーサ
を入れることにより容易に得られる。
電気泳動装置に完全に組込まれるとき、従来の電極はＮ
−Ｓ電位を提供し、プラチナ線側の電極はＥ−Ｗ横方向
電位を提供した。
−Ｓ電位を提供し、プラチナ線側の電極はＥ−Ｗ横方向
電位を提供した。
用いたゲルの厚さは1mmで、塩酸を用いてpH8.5に調製し
たTRIS（0.09M）ホウ酸塩（0.09M）EDTA（1.5mM）緩衝
液中で１％（w/v）アガロース（agarose）から形成され
た。サンプルは北部縁に沿ってゲル内のポケット（図示
せず）に加えられた。
たTRIS（0.09M）ホウ酸塩（0.09M）EDTA（1.5mM）緩衝
液中で１％（w/v）アガロース（agarose）から形成され
た。サンプルは北部縁に沿ってゲル内のポケット（図示
せず）に加えられた。
電気泳動タンクへの電力は、40mA、約200vがＮ→Ｓに90
秒間、Ｗ→Ｅに60秒間、Ｎ→Ｓに90秒間さらにＥ→Ｗに
60秒間加えられた。このスイッチ開閉サイクルは無期限
に繰り返された。これはすでにのべた第２図に示すスイ
ッチ開閉装置で達成された。従来の電気泳動電力パック
から得られる双極電源は、１−100秒の範囲の市販され
ている個々の可変タイマにより制御される、湿式水銀リ
レーを用いて切替えた。側電極に起因する短絡作用は最
小に保たれた。その理由は側電極を構成するプラチナが
緩衝剤に比べて比較的高い抵抗を持のに十分なほど薄い
（0.46mm/SWG26）からである。その効果は第８図に示す
通り、牛すき農具のように分子が左右に移動されること
であった。この配列の利点は、分子は逆電流により間隔
を置いて方向を変えるように強制されるが、正味の結果
は依然としてゲル内のＮ→Ｓ方向への明確な直線的移動
であった。
秒間、Ｗ→Ｅに60秒間、Ｎ→Ｓに90秒間さらにＥ→Ｗに
60秒間加えられた。このスイッチ開閉サイクルは無期限
に繰り返された。これはすでにのべた第２図に示すスイ
ッチ開閉装置で達成された。従来の電気泳動電力パック
から得られる双極電源は、１−100秒の範囲の市販され
ている個々の可変タイマにより制御される、湿式水銀リ
レーを用いて切替えた。側電極に起因する短絡作用は最
小に保たれた。その理由は側電極を構成するプラチナが
緩衝剤に比べて比較的高い抵抗を持のに十分なほど薄い
（0.46mm/SWG26）からである。その効果は第８図に示す
通り、牛すき農具のように分子が左右に移動されること
であった。この配列の利点は、分子は逆電流により間隔
を置いて方向を変えるように強制されるが、正味の結果
は依然としてゲル内のＮ→Ｓ方向への明確な直線的移動
であった。
この方法により、DNA酵母染色体断片T4ファージ（166k
b）及びラムダファージ（40kb）の大きな断片が約６時
間の電気泳動後に得られた。
b）及びラムダファージ（40kb）の大きな断片が約６時
間の電気泳動後に得られた。
実施例 ４ 本実施例では、電流逆転は実施例１及び２で別個に用い
た可変電源を組合わせることにより達成された。基本の
スイッチ開閉順序は、Ｎ→S90秒間のみ、Ｎ→Ｓ及びＥ
→W60秒間、Ｎ→S90秒間のみ、Ｎ→Ｓ及びＷ→E60秒間
であった。Ｎ→Ｓ電源は永久にオンで、切替えられなか
った。Ｅ→Ｗ及びＷ→Ｅ電源は実施例１で用いた高周波
可変電力装置で、逆転は当該時間の1/6の間に毎秒25回
行われた。スイッチ機構がＮ→Ｓ位置にあるときには電
力はこの電源から取らなかった。すべての方向におい
て、印加電圧は200vであり、電流は約40mAであった。分
子の通路に及ぼす一般的影響は第９図に示す。T4ファー
ジよりゆっくり移動するイーストDNA断片の分解が得ら
れた。
た可変電源を組合わせることにより達成された。基本の
スイッチ開閉順序は、Ｎ→S90秒間のみ、Ｎ→Ｓ及びＥ
→W60秒間、Ｎ→S90秒間のみ、Ｎ→Ｓ及びＷ→E60秒間
であった。Ｎ→Ｓ電源は永久にオンで、切替えられなか
った。Ｅ→Ｗ及びＷ→Ｅ電源は実施例１で用いた高周波
可変電力装置で、逆転は当該時間の1/6の間に毎秒25回
行われた。スイッチ機構がＮ→Ｓ位置にあるときには電
力はこの電源から取らなかった。すべての方向におい
て、印加電圧は200vであり、電流は約40mAであった。分
子の通路に及ぼす一般的影響は第９図に示す。T4ファー
ジよりゆっくり移動するイーストDNA断片の分解が得ら
れた。
実施例 ５ 本実施例では、電流逆転が用いられ、スイッチ開閉順序
は実施例３のものと同一であった。しかし、電流は当該
時間の1/6の間毎秒25回逆転され、永久にＮ→Ｓ方向に
加えられたが、直流電源は断続的にＥ→Ｗ及びＷ→Ｅの
方向に加えられた。電流及び伝あるは実施例４の通りで
あった。分子の通路に及ぼす一般的な効果は第10図に示
す。得られた結果は実施例４のものと同様であった。
は実施例３のものと同一であった。しかし、電流は当該
時間の1/6の間毎秒25回逆転され、永久にＮ→Ｓ方向に
加えられたが、直流電源は断続的にＥ→Ｗ及びＷ→Ｅの
方向に加えられた。電流及び伝あるは実施例４の通りで
あった。分子の通路に及ぼす一般的な効果は第10図に示
す。得られた結果は実施例４のものと同様であった。
実施例 ６ 本実施例では横方向の電界を用いず、200v及び40mAで５
時間に亘り電流逆転を用いた。これは従来の電気泳動装
置で行われ、上記の側部電極（実施例３）は省略され
た。電源は電極のＮ→Ｓ対のみと接続されて連続作動さ
れた。当該時間の1/6の間毎秒25回逆転される電界を生
成した。T4ファージよりゆっくり移動するイーストDNA
断片は、着色後のゲルに見られたが、DNAの多くはこれ
らの作動条件下で殆どゲルに入らなかった。
時間に亘り電流逆転を用いた。これは従来の電気泳動装
置で行われ、上記の側部電極（実施例３）は省略され
た。電源は電極のＮ→Ｓ対のみと接続されて連続作動さ
れた。当該時間の1/6の間毎秒25回逆転される電界を生
成した。T4ファージよりゆっくり移動するイーストDNA
断片は、着色後のゲルに見られたが、DNAの多くはこれ
らの作動条件下で殆どゲルに入らなかった。
実施例 ７ 実施例６が反復されたが、実施例３で用いたスイッチ開
閉装置がまた電流を逆転させるのに用いられた。直流電
源は電極Ｎ→Ｓ対と接続され、その後10秒間Ｎ→Ｓで作
動され、さらに４秒間Ｓ→Ｎで作動するように切替えら
れたが、このサイクルは６時間に亘り反復された。結果
は、ゲル内の位置から判断して、イーストDNAの大きな
断片の正味移動及び分解であった。この場合にはT4ファ
ージよりもゆっくりと移動し、原点への通路のすべてを
占めた。
閉装置がまた電流を逆転させるのに用いられた。直流電
源は電極Ｎ→Ｓ対と接続され、その後10秒間Ｎ→Ｓで作
動され、さらに４秒間Ｓ→Ｎで作動するように切替えら
れたが、このサイクルは６時間に亘り反復された。結果
は、ゲル内の位置から判断して、イーストDNAの大きな
断片の正味移動及び分解であった。この場合にはT4ファ
ージよりもゆっくりと移動し、原点への通路のすべてを
占めた。
Claims (7)
- 【請求項１】極性が断続的に逆転する電位の順方向の影
響下において、原点から遠ざかる所定の方向にゲル又は
類似の物理的妨害媒体中を移動するように帯電高分子を
誘導することにより、該高分子を分離する電気泳動法で
あって、該極性が逆転されるとき、該電位の影響によ
り、該所定の方向に対して平行な方向にかつ該原点に向
かうように該高分子を移動させる電気泳動法。 - 【請求項２】前記所定の方向に加えられる前記電位が、
該所定の方向に対して直角な成分を持つ第２印加電位に
より補足され、該第２印加電位の極性が断続的に逆転さ
れる、請求項１の方法。 - 【請求項３】補足的電位がゲルに加えられ、各電位が前
記所定の方向に直角な成分と該所定の方向に平行な成分
とを有し、該電位の相対的大きさ及び相対的恒常性又は
周波数が、前記高分子が所定の方向において正味の影響
を受けるように設定される、請求項１の方法。 - 【請求項４】前記電位が逆転されるとき該電位の影響が
前記順方向の影響の約50％を越えない、請求項１の方
法。 - 【請求項５】前記電位が逆転される時間間隔が1/5000秒
乃至90秒の範囲である、請求項１乃至４のいずれか１つ
の方法。 - 【請求項６】前記電位が逆転する周波数が毎秒25回であ
る、請求項１乃至５のいずれか１つの方法。 - 【請求項７】前記電位が前記時間の1/6の間逆転され
る、請求項６の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858518030A GB8518030D0 (en) | 1985-07-17 | 1985-07-17 | Separation |
| GB8518030 | 1985-07-17 | ||
| GB868602089A GB8602089D0 (en) | 1986-01-28 | 1986-01-28 | Separation |
| GB8602089 | 1986-01-28 | ||
| PCT/GB1986/000416 WO1987000635A1 (en) | 1985-07-17 | 1986-07-17 | Method for electrophoretic separator |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63500673A JPS63500673A (ja) | 1988-03-10 |
| JPH076945B2 true JPH076945B2 (ja) | 1995-01-30 |
Family
ID=26289540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61504077A Expired - Fee Related JPH076945B2 (ja) | 1985-07-17 | 1986-07-17 | 電気泳動分離方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5176805A (ja) |
| EP (1) | EP0231239B1 (ja) |
| JP (1) | JPH076945B2 (ja) |
| WO (1) | WO1987000635A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4737251A (en) * | 1985-09-27 | 1988-04-12 | Washington University | Field-inversion gel electrophoresis |
| DE3850390T2 (de) * | 1987-04-03 | 1994-10-06 | Gradipore Ltd | Trennung von geladenen molekülen. |
| SU1670563A1 (ru) * | 1987-06-19 | 1991-08-15 | Институт молекулярной биологии АН СССР | Аппарат дл разделени высокомолекул рных ДНК с помощью пульс-электрофореза |
| DE3855429T2 (de) * | 1987-12-18 | 1996-11-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | Verfahren zur Elektrophorese |
| JPH02503118A (ja) * | 1988-02-02 | 1990-09-27 | インスティテュト モレクルヤルノイ ビオロギイ アカデミイ ナウク エスエスエスエル | ゲル中の高分子ｄｎａの電気泳動分離のための装置 |
| US4830726A (en) * | 1988-02-03 | 1989-05-16 | The Wistar Institute | Separation of large DNA molecules in alternating asymmetric electric fields |
| US5027018A (en) * | 1988-09-14 | 1991-06-25 | Eastman Kodak Company | High voltage electrophoresis apparatus |
| JPH02176457A (ja) * | 1988-09-15 | 1990-07-09 | Carnegie Inst Of Washington | パルス志向電気泳動 |
| US4959133A (en) * | 1989-01-23 | 1990-09-25 | Eastman Kodak Company | Field inversion electroblotting & electroelution |
| US5135628A (en) * | 1989-05-05 | 1992-08-04 | Isco, Inc. | Pulsed field gel electrophoresis of large DNA |
| US5650055A (en) * | 1993-04-07 | 1997-07-22 | Margolis; Joel | Electrophoresis separation method and apparatus using barrier separation and polarity reversing |
| WO1994029425A2 (de) * | 1993-06-16 | 1994-12-22 | Call Hans Peter | Mehrkomponentenbleichsystem |
| US5453162A (en) * | 1993-09-09 | 1995-09-26 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Method and apparatus for gel electrophoresis using two electric fields |
| ATE517345T1 (de) * | 2006-07-19 | 2011-08-15 | Koninkl Philips Electronics Nv | Verfahren zur analyse von proben mit einem mittel zur gasentwicklung |
| NZ587863A (en) * | 2008-03-03 | 2012-05-25 | Univ Oregon Health & Science | Method for purifcation and seperation of biological molecules (e.g. DNA or proteins or complexes of) by reversing electrophoresis polarity |
| EP2473842A4 (en) | 2009-09-01 | 2014-03-19 | Univ Oregon Health & Science | ELECTROPHORESIS DEVICE WITH REVERSIBLE STROM GEL FOR THE SEPARATION OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3506554A (en) * | 1968-03-15 | 1970-04-14 | Samuel Raymond | Apparatus for separating electrophoretically active substances |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1046370B (de) * | 1953-05-22 | 1958-12-11 | Walter J Mach Dipl Ing | Verfahren zur elektrophoresischen Trennung von Stoffgemischen |
| US4473452A (en) * | 1982-11-18 | 1984-09-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Electrophoresis using alternating transverse electric fields |
-
1986
- 1986-07-17 JP JP61504077A patent/JPH076945B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-17 US US07/655,386 patent/US5176805A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-17 EP EP86904300A patent/EP0231239B1/en not_active Expired
- 1986-07-17 WO PCT/GB1986/000416 patent/WO1987000635A1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3506554A (en) * | 1968-03-15 | 1970-04-14 | Samuel Raymond | Apparatus for separating electrophoretically active substances |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5176805A (en) | 1993-01-05 |
| WO1987000635A1 (en) | 1987-01-29 |
| JPS63500673A (ja) | 1988-03-10 |
| EP0231239A1 (en) | 1987-08-12 |
| EP0231239B1 (en) | 1991-02-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |