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Diese Erfindung betrifft ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren, insbesondere eine Elektrophoresemediummembrane und ein
Elektrophoreseverfahren, die für die elektrophoretische
Trennung von hochmolekularen Proteinen und großen DNA-Molekülen
durch die Anwendung eines gepulsten elektrischen Felds
geeignet sind. Diese Erfindung betrifft insbesondere ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren, das für die elektrophoretische
Trennung von Bestandteilen von lebenden Organismen mittels
eines verbesserten Verfahrens der Anwendung eines gepulsten
elektrischen Felds geeignet ist.
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Die Gelelektrophorese ist ein wichtiges Mittel für die
Trennung von hochmolekularen Materialien, wie Proteinen und
Nukleinsäuren auf dem Gebiet der Gentechnologie. Mit der
konventionellen Art der Elektrophorese, d.h. der kontinuierlichen
Elektrophorese, konnten bei Trennung und Analyse großer DNAs,
wie Chrornosomenkartographierung, DNAs, die eine Molekulargröße
(Molekulargewicht) haben, welche kleiner als mehrere 10
Kilobasenpaare (kbp; wobei bp ein einziges Basenpaar repräsentiert
und kbp 1.000 Basenpaare repräsentiert) ist, getrennt werden,
und DNAs, die eine Molekulargroße haben, welche größer als
mehrere 10 Kilobasenpaare ist, konnten nicht getrennt werden.
wegen der übermäßigen Menge an Forschung, die in den
vergangenen Jahren in der genetischen Technologie unternommen worden
ist, ist es zu einem dringenden Bedürfnis für eine schnelle
Identifizierung der Basenfolgen der DNA gekommen. Es ist
bisher eine lange Zeit zum Trennen eines gewünschten DNA-Bereichs
von Chromosomen und großen DNAs erforderlich gewesen, und die
Leistungsfähigkeit der Basenaufeinanderfolgebestimmung einer
DNA ist bisher niedrig gewesen.
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Die Impulsgradientenelektrophorese, worin sich miteinander
schneidende elektrische Felder abwechselnd angewandt werden,
wurde durch Cantor et al. 1982 entwickelt und wurde in der
PCT-Patentveröffentlichung WO 84/02001 offenbart. Außerdem
wurden die Orthogonal-Feld-Alternierungs-Gel-Elektrophorese
(OFAGE) und die Feld-Inversions-Gel-Elektrophorese (FIGE)
durch Olson et al. in "Nucleic Acids Res."; 12, 5647 (1984)
offenbart.
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In jedem offenbarten Elektrophoreseverfahren werden DNAs, die
unterschiedliche Anzahlen von Basen haben, durch periodisches
Ändern der Richtung eines elektrischen Felds, welches
seinerseits die Formen der DNAs ändert, voneinander getrennt.
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Bei dem OFAGE-Verfahren sind Elektroden vorgesehen und unter
45º-Winkeln mit Bezug aufeinander angeordnet, wobei ein 1%-
Agarosegel in dem von den Elektroden umgebenen Raum vorgesehen
ist, wobei die Stärke jedes angewandten elektrischen Felds auf
angenähert 10V/cm eingestellt wird, wobei die elektrischen
Felder abwechselnd mit einer Periode von mehreren 10 Sekunden
angewandt werden, und wobei die Elektrophorese während
angenähert 15 Stunden ausgeführt wird. Auf diese Art und Weise
können DNAs bis zu angenähert 400 kbp getrennt werden. Das OFAGE-
Verfahren hat den Nachteil, daß, da die elektrischen Felder
weder die gleiche Richtung noch Richtungen von 180º
voneinander weg haben, das erhaltene elektrophoretische Bild verzerrt
ist, und daher ein großer Fehler entsteht, wenn man das
Molekulargewicht des DNA-Moleküls bestimmt.
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In dem FIGE-Verfahren wird die Richtung des elektrischen Felds
um 180º umgekehrt (d.h. genau umgekehrt). Bei dem
FIGE-Verfahren, worin das elektrische Feld genau in einer Dimension
angewandt wird, wird das Trennungsbild nicht verzerrt. Jedoch
wird, obwohl die Impulsbedingungen gemäß dem Molekulargewicht
der DNA, welche getrennt werden soll, gewählt werden, ein
vorbestimmtes elektrisches Feld in der Vorwärts- und
Rückwärtsrichtung über die gesamte Gelmembrane angewandt. Daher kann
die Form des DNA-Moleküls, das ein Molekulargewicht hat,
welches in einen gewünschten Bereich fällt, nicht mit einem hohen
Nutzeffekt verändert werden. Infolgedessen ist der
Molekulargewichtsbereich,
über den eine DNA-Fraktionierung möglich ist,
schmal. Dieses Problem sollte gelöst werden, um die
Geschwindigkeit dieser Art von genetischer Analyse und
DNA-Sequenzanalyse zu erhöhen.
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Weiterhin offenbart WO-A-87/00 635 ein Verfahren für die
Impulsfeldelektrophorese zum Trennen von geladenen
Makromolekülen, worin die zu trennenden Makromoleküle dazu veranlaßt
werden, daß sie sich unter dem Einfluß eines elektrischen
Potentials, dessen Polarität intermittierend umgekehrt wird, durch
ein Gel in einer vorbestimmten Richtung weg von einem Ursprung
bewegen. Die Polarität des intermittierend umgekehrten Stroms
ist derart, daß die Moleküle abwechselnd einen Einfluß in
einer Vorwärtsrichtung weg von dem Ursprung und der
entgegengesetzten nach dem Ursprung hin erfahren. Der Nettoeinfluß nach
dem Ursprung hin, welcher über eine Zeitdauer hinweg gemittelt
ist, ist nicht größer als 50 % des Vorwärtseinflusses. Die
angewandte Spannung kann typischerweise jene sein, welche in der
Elektrophorese im Bereich von 100 bis 500 V verwendet wird,
und das Zeitintervall zwischen dem umkehrenden Strom ist von
1/5000 einer Sekunde bis zu 90 Sekunden. Obwohl WO-A-87/00 635
beschreibt, daß die Polarität des elektrischen Potentials
intermittierend umgekehrt wird, ist jedoch das Potential weg von
dem Ursprung vom gleichen Wert wie das Potential, das nach dem
Ursprung hin gerichtet ist. Nur die Dauer der Potentiale wird
verändert.
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Schließlich offenbart WO-A-87/01955 ein Verfahren für die
Gelelektrophorese, welches eine periodische Umkehrung des
elektrischen Felds im wesentlichen in einer Dimension anwendet,
das als Feldumkehrgelelektrophoreseverfahren (FIGE) bezeichnet
wird. Dieses Verfahren führt zu einer Nettowanderung durch
Verwendung einer längeren Zeit oder höheren Spannung in der
einen Richtung als in der entgegengesetzten Richtung. Es
ermöglicht eine Trennung von DNA- oder Proteinmischungen in
Größenbereichen, die für die übliche konventionelle
Elektrophorese nicht zugänglich sind.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren unter Verwendung einer
Elektrophoresemediummembrane, die aus einem wäßrigen
Agarosegel zusammengesetzt ist bzw. besteht, zur Verfügung zu
stellen.
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Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren zur Verfügung zu stellen,
worin der Molekulargewichtsbereich, über welchen eine
Fraktionierung möglich ist, verbreitert ist und eine Trennung von
großen DNA-Molekülen erreicht werden kann.
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Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren zur Verfügung zu stellen,
worin die elektrophoretischen Bedingungen leicht für das
Molekulargewicht eines großen DNA-Moleküls eingestellt werden
können und hohe Fraktionierungswirkungen durch kurze
Wanderungsvorgänge erhalten werden.
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Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein
verbessertes Impulsfeldelektrophorese-Verfahren für die
Impulsfeldumkehrelektrophorese zur Verfügung zu stellen.
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Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren zur Verfügung zu stellen,
worin der Bereich der Molekulargewichte der DNA, über welchen
eine Fraktionierung möglich ist, verbreitert ist und die
Trennung von großen DNA-Molekülen erreicht werden kann.
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Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren zur Verfügung zu stellen,
welches eine Trennung und Fraktionierung von Bestandteilen von
lebenden Organismen der Art, wie Nukleinsäuren und Proteinen,
in einer kurzen Wanderungszeit ermöglicht.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Impulsfeldelektrophorese-
Verfahren zur Verfügung, umfassend die Schritte des Anwendens
eines gepulsten Potentials in einer solchen Art und Weise, daß
das an die Anodenseite eines Elektrophoresemediums angelegte
Vorwärtspotential und das an die Kathodenseite des
Elektrophoresemediums angelegte Rückwärtspotential unterschiedlich
voneinander sind, und des Machens einer Zeitdauer von jeder
Periode des Anwendens des Potentials auf die Anode unterschiedlich
von einer Zeitdauer von jeder Periode des Anwendens des
Potentials auf die Kathode, und weiter umfassend die Verwendung
einer Elektrophoresemediummenbrane, die ein wäßriges Agarosegel
umfaßt, worin das Gel eine vorbestimmte allmähliche Änderung
in der Schichtdicke und/oder Konzentration längs der Richtung
der Elektrophorese hat.
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Weitere Weiterbildungen des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen
Ansprüchen definiert.
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Das Impulsfeldelektrophorese-Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht die Trennung von chromosomalen DNAs,
Chromosomkartographierung, Erzeugung von Genbüchereien, DNA-
Sequenzanalyse, RNA-Sequenzanalyse, sowie Trennung und Analyse
von Proteinen, welche mit der konventionellen Technologie
unmöglich oder schwierig waren. Die vorliegende Erfindung kann
zum Beispiel auf die Trennung von chromosomalen DNAs,
Chromosomenkartographierung, Erzeugung von Genbüchereien,
DNA-Sequenzanalyse, RNA-Sequenzanalyse, sowie Trennung und Analyse
von Proteinen angewandt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 ist ein Blockschaltbild, das ein Beispiel des
Potentialanwendungsmechanismus in der
Elektrophoreseeinrichtung zeigt, die zum Ausführen des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, und
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Fig. 2 gibt die Werte und Perioden von angewandten
Potentialimpulsen des Vergleichsbeispiels 3 graphisch
wieder.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Verwendung einer ersten Elektrophoresemediummembrane in
einer ersten Ausführungsform des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachstehend in
weiterem Detail beschrieben.
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Agarose, welche üblicherweise für die Trennung von DNAs, die
große Molekulargewichte haben, oder für die Basenanalyse
verwendet wird, kann in der ersten Elektrophoresemediummembrane
verwendet werden, die das Wäßrigagarosegel umfaßt, das eine
Dicke hat, welche eine vorbestimmte allmähliche Änderung längs
der Richtung der Elektrophorese hat. Die Agarose kann
ausgewählt sein aus niedrigelektroendosmotischer Agarose,
mittelelektroendosmotischer Agarose und hochelektroendosmotischer
Agarose. Beispiele der Agarose sind in der ungeprüften
japanischen Patentveröffentlichung Nr. 55(1980)-5730, dem
US-Patent 4 290 911 und der PCT-Patentveröffentlichung WO 82/02599
offenbart. Ein wasserlosliches Polymer, zum Beispiel ein
nichtionisches wasserlösliches Polymer, wie Polyacrylamid oder
Polyethylenglycol, kann zu dem Wäßrigagarosegel hinzugefügt
sein. Das Gewicht des hinzugefügten wasserlöslichen Polymers
ist nicht größer als angenähert 20 % des Agarosegewichts, und
fällt vorzugsweise in den Bereich von angenähert 0,1 % bis
angenähert 10 %. Außerdem können Zusätze, zum Beispiel ein
oberflächenaktives Mittel, wie ein nichtionisches
oberflächenaktives Mittel oder ein anionisches oberflächenaktives Mittel,
eine pH-Puffer-Zusammensetzung, ein Denaturierungsmittel (oder
ein Modifizierungsmittel) und eine Polyolverbindung, wie
Glycerol, zu dem wäßrigen Gel in Mengen innerhalb der
üblicherweise verwendeten Bereiche hinzugefügt sein. Die Konzentration
des wäßrigen Gels wird auf einen im wesentlichen konstanten
Wert eingestellt, der in den Bereich von angenähert 0,4 %
(Agarose g/Wasser ml) bis angenähert 4,0 % (Agarose g/Wasser
ml) gemäß dem Zweck der Verwendung, dem
Molekulargewichtsbereich der DNA-Probe o.dgl. fällt. Der Bereich, in den die
Dicke der Wäßriggelmembrane fällt, ist nicht auf einen
speziellen Bereich beschränkt. Die Dicke der Membrane aus dem
wäßrigen Gel variiert generell innerhalb des Bereichs von
angenähert 100 µm bis angenähert 10 mm, und vorzugsweise
innerhalb des Bereichs von angenähert 100 µm bis angenähert 5 mm.
Eine Kurve der Dickenfunktion der Membrane aus dem wäßrigen
Gel bzw. der Wäßriggelmembrane kann wie eine gerade Linie,
eine Exponentialfunktion, eine logarithmische Funktion oder
eine stufenartige Funktion aussehen. Alternativ kann eine
Kurve der Dickenfunktion der Wäßriggelmembrane aussehen wie
eine gerade Linie, eine gebogene Linie oder eine Kurve, die
durch eine willkürliche Kombination der oben aufgezählten
Funktionen ausgedrückt ist. Die Änderung in der Dicke der
Wäßriggelmembrane wird generell so eingestellt, daß die Dicke der
Gelmembrane größer auf der Probentüpfelungsseite
(Kathodenseite) als auf der entgegengesetzten Seite (Anodenseite) ist,
aber sie kann auch so eingestellt sein, daß die Dicke der
Gelmembrane auf der Probentüpfelungsseite (Kathodenseite) kleiner
als auf der entgegengesetzten Seite (Anodenseite) ist, und
zwar entsprechend dem Verwendungszweck, dem
Molekulargewichtsbereich der DNA-Probe o.dgl.
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Im allgemeinen wird eine Platte oder eine dünne Folie bzw. ein
dünnes Blatt bzw. eine Dünnplatte, die bzw. das glatte
Oberflächen hat und aus Glas, einem Keramikmaterial oder einem
elektrisch isolierenden organischen Polymer zusammengesetzt
ist bzw. besteht, generell als ein Träger für die
Elektrophoresemediummembrane verwendet. Die Platte oder die Folie bzw.
Dünnplatte, die aus dem organischen Polymer zusammengesetzt
ist bzw. besteht, kann zum Beispiel eine
Polyacrylesterpolymerplatte bzw. -dünnplatte, wie eine Polymethylacrylatplatte
bzw. -dünnplatte; eine Polyvinylchloridplatte bzw.
-dünnplatte; eine Platte bzw. Dünnplatte aus einem Polyester, wie
Polycarbonat
von Bisphenol A oder Polyethylenterephthalat, unter
welchen die Polymethylacrylatplatte bzw. -dünnplatte oder die
Polyethylenterephthalatplatte bzw. -dünnplatte bevorzugt
werden, sein. Die Oberfläche des organischen Polymerträgers
sollte vorzugsweise einer bekannten physikochemischen
Oberflächenbehandlung unterworfen sein, wie
Ultraviolettstrahlen-Bestrahl ungsbehandlung oder Glimmentladungsbehandlung, und/oder
mit einer Auffangschicht bzw. Subbing-Schicht, wie einer
Celluloseacetat-Auffangschicht bzw. Celluloseacetat-Subbing-
Schicht oder einer Gelatine-Auffangschicht bzw.
Gelatine-Subbing-Schicht versehen sein. Der Träger kann nur auf einer
Seite der Gelmediummembrane oder auf beiden Seiten derselben
vorgesehen sein. Die Dicke der Gelmembrane kann mittels einer
Formungsverfahrens eingestellt sein, worin zwei Glasplatten
oder zwei Polymerplatten einander zugewandt mit
Abstandsteilen, die an beiden Rändern dazwischenliegen, positioniert
sind. Auf diese Weise wird ein dünner Zwischenraum, der eine
gewünschte Änderung in der Dicke hat, zwischen den beiden
Glasplatten oder den beiden Polymerplatten erzeugt, und eine
wäßrige Agaroselösung wird in den Zwischenraum eingefügt, um
dadurch das Gel herzustellen. Die wäßrige Agaroselösung kann
auch auf einen Träger aufgebracht und geliert werden. In dem
Formungsverfahren kann eine gewünschte
Gelmembrandickenfunktion durch Ändern der Dicke von einem oder den beiden Trägern
oder durch Ändern des Abstands zwischen den beiden Trägern
unter Verwendung von Abstandsteilen, welche eine gewünschte
Änderung in der Dicke haben, erhalten werden.
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Die Anwendung eines elektrischen Felds in der ersten
Ausführungsform des Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der
vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben. Jedes
bekannte Verfahren, zum Beispiel das Verfahren, welches von
Cantor et al. vorgeschlagen worden ist, oder das OFAGE-Verfahren,
kann dazu verwendet werden, das Feld anzuwenden. In der ersten
Ausführungsform des Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß
der vorliegenden Erfindung wird die Elektrophorese ausgeführt
durch periodisches Umkehren der Richtung des Felds um 180º
(d.h. exakt umgekehrt), anstatt des Anwendens eines
Gleichstroms in einer einzigen vorbestimmten Richtung wie in dem
konventionellen Elektrophoreseverfahren. Das Feld wird
impulsweise angelegt. Für eine Gelmembrane, die eine Länge innerhalb
des Bereichs von angenähert 50 mm bis angenähert 50 cm längs
der Wanderungsrichtung hat, wird die Spannung (Differenz im
Potential), die über beiden Rändern der Gelmembrane (über der
Anode und der Kathode) angewandt wird, so gewählt, daß sie in
den Bereich von angenähert +10 V bis angenähert +5.000 V fällt
oder aus dem Bereich von angenähert -10 V bis angenähert
-5.000 V, und vorzugsweise in den Bereich von angenähert +30 V
bis angenähert +2.000 V oder aus dem Bereich von angenähert
-30 V bis angenähert -2.000 V. Das Potential wird periodisch
in Zeitintervallen gewechselt, die aus dem Bereich von
angenähert 1 Millisekunde bis angenähert 1.000 Sekunden,
vorzugsweise aus dem Bereich von angenähert 100 Millisekunden bis
angenähert 1.000 Sekunden, gewählt werden. Für die Trennung von
großen DNAs (die eine Größe innerhalb des Bereichs von
mehreren zehn Kilobasenpaaren bis mehreren tausend Kilobasenpaaren
haben) wird eine Spannung innerhalb des Bereichs von
angenähert +50 V bis angenähert +1.000 V oder innerhalb des Bereichs
von angenähert -50 V bis angenähert -1.000 V verwendet. Das
Feld kann in jeder Art und Weise angewandt werden, zum
Beispiel so, daß die Spannung in der Vorwärtsrichtung höher und
die Spannung in der Rückwärtsrichtung niedriger ist. Umgekehrt
kann die Spannung in der Vorwärtsrichtung niedriger als die
Spannung in der Rückwärtsrichtung sein. Grundsätzlich sollten
die Zeiten, während deren die Spannungen angewandt werden, so
gewählt werden, daß die Vorwärtswanderungsgeschwindigkeit
wesentlich höher als die Rückwärtswanderungsgeschwindigkeit ist.
Die Zeiten, während deren die Impulse angewandt werden, sind
nicht auf spezielle Zeiten beschränkt, und sie werden gemäß
der Größe des Moleküls, welches fraktioniert werden soll,
gewählt. Die Impulsanwendungszeiten sollten vorzugsweise in den
Bereich von angenähert 1 Millisekunde bis angenähert 1.000
Sekunden, und mehr bevorzugt in den Bereich von angenähert 100
Millisekunden bis angenähert 1.000 Sekunden fallen. Für die
Trennung von großen DNAs sollte die Impulsanwendungszeit
vorzugsweise in den Bereich von angenähert 1 Sekunde bis
angenähert 1.000 Sekunden fallen. Die Wellenform des angewandten
Impulsfelds ist nicht auf eine spezielle beschränkt und kann zum
Beispiel eine Rechteckwelle, eine Sägezahnwelle, eine
Dreieckwelle oder eine Sinuswelle sein.
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In der vorliegenden Erfindung kann vertikale Elektrophorese,
horizontale Elektrophorese und jede andere bekannte Art von
Elektrophorese angewandt werden.
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Für die Detektion von großen DNAs, wie Doppelketten-DNAs, wird
nach der Elektrophorese das elektrophoretische Bild unter
Verwendung eines Fluoreszenzmittels, wie Ethidiumbromid, in ein
sichtbares Bild umgewandelt, das sichtbare Bild wird
fotografiert, und der Zustand der Trennung wird analysiert.
Alternativ wird die DNA zu einer Membrane, wie einer porösen
Nitrocellulosemembrane, übertragen (Südliches Beklecksungsverfahren
bzw. Southern-blot-Verfahren), es wird eine Hybridisierung
unter Verwendung einer radioaktiv markierten DNA-Sonde
ausgeführt, und dann wird das Trennungsmuster in ein sichtbares
Bild umgewandelt, und zwar durch Ausführen einer
Autoradiographie oder Verarbeitung unter Verwendung einer berechneten
Radiographieeinrichtung, die mit einer Abbildungsplatte
versehen ist. In dem Fall, in welchem die elektrophoretische
Trennung unter Verwendung einer Probe ausgeführt wird, die
farbstoff- oder fluorchrommarkierte Nukleinsäurefragmente
enthält, kann das Trennungsmuster unter Verwendung einer
Einrichtung, die mit einem fotoelektrischen Umwandlungsmittel
versehen ist, in ein sichtbares Bild umgewandelt werden.
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Die Verwendung einer zweiten Elektrophoresemediummembrane in
einer zweiten Ausführungsform des Impulsfeldelektrophorese-
Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachstehend
beschrieben.
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Agarose von der gleichen Art wie jene der ersten Elektrophore
semediummembrane kann in der zweiten
Elektrophoresemediummembrane verwendet werden, umfassend ein Wäßrigagarosegel, dessen
Konzentration eine vorbestimmte allmähliche Änderung längs der
Richtung der Elektrophorese hat.
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Die Konzentration des wäßrigen Geis wird eingestellt, um eine
angemessene Konzentrationsfunktion vorzusehen, und sie wird
aus dem Bereich von angenähert 0,4 % (Agarose g/Wasser ml) bis
angenähert 4,0 % (Agarose g/Wasser ml) entsprechend dem
Verwendungszweck, dem Molekulargewichtsbereich der DNA-Probe
o.dgl. gewählt. Die Dicke der Wäßriggelmembrane ist nicht auf
einen speziellen Wert beschränkt. Die Dicke der
Wäßriggelmembrane wird generell aus dem Bereich von angenähert 100 µm bis
angenähert 10 mm, und vorzugsweise aus dem Bereich von
angenähert 100 µm bis angenähert 7 mm, gewählt.
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Wie sich die Konzentration der Wäßriggelmembrane ändert, wird
generell so eingestellt, daß die Gelkonzentration höher auf
der Probentüpfelungsseite (Kathodenseite) als auf der
entgegengesetzten Seite (Anodenseite) ist, und es kann eine
allmähliche oder schrittweise Änderung in der Konzentration von
einer höheren Konzentration zu einer niedrigeren Konzentration
längs der Richtung der elektrophoretischen Wanderung von dem
Rand des Probentüpfelungsteils aus auftreten. Jedoch kann auch
das Gegenteil der Änderung in der Konzentration, wie sie oben
beschrieben worden ist, entsprechend dem Verwendungszweck, dem
Molekulargewichtsbereich der DNA-Probe o.dgl. angewandt
werden.
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Grundsätzlich sollte die Konzentrationsfunktion des Gelmediums
derart sein, daß die Gelkonzentration allmählich abnimmt, wie
dargestellt durch eine leicht gebogene gerade Linie, eine
gerade Linie; einen Teil einer Kurve, ausgedrückt durch eine
Stufenfunktion, eine Exponentialfunktion, eine logarithmische
Funktion, eine Kettenlinienfunktion, eine
Fortführkurvenfunktion, eine Parabolfunktion, eine Hyperbolfunktion, eine
Ellipsenfunktion
oder eine Funktion einer Kurve dritten Grades,
durch irgendeine andere Kurve, welche sich allmählich ändert,
oder durch Kombination einer Kurve mit einer geraden Linie.
Die Konzentration variiert mit Bezug auf die Entfernung längs
der Richtung der Wanderung von dem Rand des
Bogentüpfelungsteils, und wenn notwendig, wird die Gelkonzentration auf einen
vorbestimmten Wert über eine vorbestimmte Länge im
wesentlichen gehalten. Außerdem kann die Änderung in der
Agarosekonzentration mit einer Änderung in der Gelmembrandicke
kombiniert sein. Auch kann die Form des Probentüpfelungsteils aus
bekannten Formen gewählt werden, wie einem Rechteck, einem
Quadrat, einem Dreieck (Haifischzahnform) und einem Kreis.
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Im allgemeinen kann eine Platte oder dünne Folie bzw.
Dünnplatte bzw. ein dünnes Blatt, die bzw. das glatte Oberflächen
hat und aus Glas, einem Keramikmaterial oder einem elektrisch
isolierenden organischen Polymer, wie oben erwähnt,
zusammengesetzt ist bzw. besteht, als ein Träger für die
Elektrophoresemediummembrane verwendet werden. Die Oberfläche des
Trägers aus organischem Polymer sollte vorzugsweise einer
bekannten physikochemischen Oberflächenbehandlung unterworfen sein,
wie Ultraviolettstrahlen-Bestrahlungsbehandlung oder
Glimmentladungsbehandlung, und/oder mit einer Auffangschicht bzw.
Subbing-Schicht, wie einer Celluloseacetat-Auffangschicht bzw.
Celluloseacetat-Subbing-Schicht oder einer
Gelatineauffangschicht bzw. Gelatine-Subbing-Schicht versehen sein. Der
Träger kann nur auf einer Seite der Gelmediummembrane oder auf
beiden Seiten derselben vorgesehen sein. Die gewünschte
Konzentration in der Gelmembrane kann durch ein Formungsverfahren
erhalten werden, worin zwei Glasplatten oder zwei
Polymerplatten einander zugewandt mit Abstandsteilen, die an beiden
Rändem dazwischenliegen, positioniert sind. Auf diese Weise wird
ein dünner Zwischenraum, der eine gewünschte Dicke hat,
zwischen den beiden Glasplatten oder den beiden Polymerplatten
erzeugt, und eine wäßrige Agaroselösung wird in den
Zwischenraum eingeführt, während die Agarosekonzentration verändert
wird, so daß dadurch das Gel hergestellt wird. Die wäßrige
Agaroselösung kann auch auf einen Träger aufgebracht werden,
während die Agarosekonzentration verändert wird, und geliert
werden.
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Um die Agarosegelkonzentration des Gelmediums zu verändern,
ist es möglich, ein Verfahren anzuwenden, umfassend die
Schritte des Einführens einer wäßrigen Agaroselösung (Lösung
für die Gelbildung), die eine verhältnismäßig hohe
Konzentration hat, in einer Menge, die zum Erstrecken über eine
vorbestimmte Länge entlang der Richtung der Wanderung geeignet ist,
in eine Glasform, die aus zwei planaren Glasplatten (einer
Träger- und einer Abdeckungsplatte) und einer Abstandsplatte,
die dazwischen befestigt ist, zusammengesetzt ist bzw.
besteht, gelieren der auf diese Weise eingeführten wäßrigen
Agaroselösung, danach Einführen einer wäßrigen Agaroselösung, die
eine verhältnismäßig niedrige Konzentration hat, in einer
Menge, die für das Erstrecken über eine vorbestimmte Länge
entlang der Richtung der Wanderung geeignet ist, und
aufeinanderfolgendes Wiederholen des Gelierens der wäßrigen
Agaroselösungen, die in einer Art und Weise eingeführt werden, die ähnlich
bzw. gleichartig jener ist, welche oben beschrieben ist. Es
ist auch möglich, ein Verfahren anzuwenden, wie es in
"Tanpakushitsu.Koso No Kisojikkenho" (Grundsätzliches
experimentelles Verfahren für Proteine und Enzyme), Horio und Yamashita,
Nankodo, 1981, Seiten 304-308 und der ungeprüften japanischen
Patentveröffentlichung Nr. 54(1979)-43881 beschrieben ist,
worin ein Behälter, der eine wäßrige Agaroselösung enthält,
welche eine Agarose in einer relativ hohen Konzentration enthält,
und ein Behälter, der eine wäßrige Agaroselösung enthält,
welche die Agarose in einer relativ niedrigen Konzentration
enthält, durch eine Leitung in Positionen leicht oberhalb der
Bodenoberflächen der Behälter miteinander verbunden sind,
wobei eine Lösungsmischungsausspeisungsleitung mit einem der
Behälter in einer Position leicht oberhalb der Bodenoberfläche
des Behälters verbunden ist, wobei die Lösung in dem Behälter,
mit welchem die Lösungsmischungsausspeisungsleitung verbunden
ist (dem Behälter, der die wäßrige Agaroselösung hoher
Konzentration
enthält, oder dem Behälter, der die wäßrige
Agaroselösung niedriger Konzentration enthält) gerührt wird, und die
Lösungsmischung durch eine Pumpe ausgespeist wird, welche an
einer Zwischenstelle der Lösungsmischungsausspeisungsleitung
vorgesehen ist. Weiterhin ist es möglich, ein Verfahren
anzuwenden, wie es in der ungeprüften japanischen
Patentveröffentlichung Nr. 62(1987)-167459 offenbart ist, in welchem eine
Einrichtung verwendet wird, die mit zwei wäßrige Lösung
aufnehmenden Behältern versehen ist, welche eine wäßrige
Agaroselösung hoher Konzentration bzw. eine wäßrige Agaroselösung
niedriger Konzentration enthalten, sowie mit einem einzigen
Misch- und Rührbehälter zum Aufnehmen, Mischen und Verrühren
der beiden Arten der wäßrigen Agaroselösungen, mit
Lösungszuführungsleitungen zum Zuführen der wäßrigen Agaroselösungen
aus den beiden wäßrige Lösung aufnehmenden Behältern zu dem
Misch- und Rührbehälter, mit
Lösungszuführungsströmungsrateneinsteilmitteln, die an Zwischenstellen der jeweiligen
Lösungszuführungsleitungen vorgesehen sind, mit einem
Steuerbzw. Regelmittel zum Steuern bzw. Regeln des jeweiligen
Lösungszuführungsströmungsrateneinstellmittel, zum Einstellen
der Lösungszuführungsströmungsraten in Übereinstimmung mit
Information (Signalen), welche allmählichen Änderungen in einer
vorbestimmten Strömungsratenfunktion entsprechen, und mit
einem Gieß- oder Aufbringungsmittel, das mit einem vorderen Rand
einer einzigen Lösungszuführungsleitung verbunden ist, die aus
dem Misch- und Rührbehälter kommt. Es ist auch möglich, ein
Verfahren anzuwenden, wie es in der japanischen
Patentanmeldung Nr. 62(1987)-129924 vorgeschlagen ist, worin eine wäßrige
Agaroselösung hoher Konzentration und eine wäßrige
Agaroselösung niedriger Konzentration durch Lösungsausspeisungsmittel
(Pumpen) in einem Strömungsratenverhältnis in Übereinstimmung
mit einer Funktion ausgespeist werden, welche zu einer
vorbestimmten allmählichen Änderung führt, und miteinander in einem
statischen Mischer vermischt werden.
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In der zweiten Ausführungsform des Impulsfeldelektrophorese-
Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung werden die
Feldanwendungs-
und Elektrophoresevorgänge in der gleichen Art und
Weise, wie oben mit Bezug auf die erste Ausführungsform des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung erwähnt, ausgeführt.
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Eine Grundausführungsform des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens, die gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit einer
Elektrophoresemembrane verwendbar ist, welche ein
Wäßrigagarosegel umfaßt, worin das Gel eine vorbestimmte allmähliche
Änderung in der Schichtdicke und/oder Konzentration längs der
Richtung der Elektrophorese hat, wird nachstehend beschrieben.
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Die Grundausführungsform des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens, die gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit einer
Elektrophoresemembran zu verwenden ist, welche ein wäßriges
Agarosegel umfaßt, worin das Gel eine vorbestimmte allmähliche
Änderung in der Schichtdicke und/oder der Konzentration längs
der Richtung der Elektrophorese hat, ist charakterisiert durch
das Ausführen der Elektrophorese einer Probe mittels Anwenden
eines elektrischen Felds so, daß die Richtung des Felds
während einer spezifischen Periode und Zeitdauer um 180º
umgekehrt wird (d.h. exakt umgekehrt). Das Feld wird impulsweise
angewandt. Die angewandte Spannung wird aus dem Bereich von
angenähert -5.000 V bis angenähert +5.000 V ausgewählt. Die
angewandte Spannung wird periodisch in Zeitintervallen
geändert, die aus dem Bereich von angenähert 1 Millisekunde (0,001
Sekunde) bis angenähert 1.000 Sekunden ausgewählt werden. Für
die Trennung von großen DNAs (die eine Größe innerhalb des
Bereichs von mehreren zehn Kilobasenpaaren bis mehreren tausend
Kilobasenpaaren haben) wird eine Spannung innerhalb des
Bereichs von angenähert -1.000 V bis angenähert +1.000 V
verwendet. Das Feld kann in irgendeiner Art und Weise angewandt
werden, zum Beispiel so, daß die Spannung in der Vorwärtsrichtung
höher als die Spannung in der Rückwärtsrichtung ist. Umgekehrt
kann die Spannung in der Vorwärtsrichtung niedriger als die
Spannung in der Rückwärtsrichtung sein. Die Länge der Zeit,
während welcher die Spannung angewandt wird, wird so gewählt,
daß die Vorwärtswanderungsgeschwindigkeit wesentlich höher als
die Rückwärtswanderungsgeschwindigkeit ist. Die Dauer der
Zeit, d.h. die Zeitdauer, während welcher jeder Impuls
angewandt wird, ist nicht auf einen speziellen Wert beschränkt und
wird entsprechend der Größe des Moleküls, das fraktioniert
werden soll, gewählt. Die Zeitdauer von jedem Impuls sollte
vorzugsweise innerhalb des Bereichs von angenähert 1
Millisekunde bis angenähert 1.000 Sekunden sein. Für die Trennung von
großen DNAs sollte die Impulszeitdauer vorzugsweise innerhalb
des Bereichs von angenähert 1 Sekunde bis angenähert 1.000
Sekunden sein.
-
Vertikale Elektrophorese, horizontale Elektrophorese,
Scheibenelektrophorese und jede andere bekannte Art der
Elektrophorese kann in der Grundausführungsform des
Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt
werden.
-
Im allgemeinen wird Wäßrigagarosegel als das
Elektrophoresemedium für die Trennung und Analyse von großen DNAs verwendet.
Die Gelkonzentration wird aus dem Bereich von angenähert 0,4
Gew.-/Vol.-% (Agarose g/Wasser ml) bis angenähert 4,0 Gew.-
/Vol.-% (Agarose g/Wasser ml) gewählt. Die Agarose kann aus
den oben aufgezählten Agarosen ausgewählt sein.
-
Ein membranförmiges (schichtförmiges) Medium wird generell als
das Geleleketrophoresemedium angewandt. Die Dicke des
membranformigen Gelmediums (d.h. der Gelmembrane) ist nicht auf einen
speziellen Wert beschränkt und kann aus dem Bereich von
angenähert 100 µm bis angenähert 10 mm, und vorzugsweise aus dem
Bereich von angenähert 100 µm bis angenähert 5 mm ausgewählt
werden.
-
Die Elektrophoreseeinrichtung für das Ausführen der
Grundausführungsform des Impulsfeldelektrophorese-Verfahrens, die
gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit einer
Elektrophoresemembran zu verwenden ist, welche ein Wäßrigagarosegel
umfaßt,
worin das Gel eine vorbestimmte allmähliche Änderung in
der Schichtdicke und/oder Konzentration längs der Richtung der
Elektrophorese hat, ist charakterisiert durch die Verwendung
eines Potentialanwendungsmechanismus. Es sei auf Fig. 1 Bezug
genommen, die ein Beispiel des Potentialanwendungsmechanismus
der Elektrophoreseeinrichtung zeigt, wobei die
Elektrophoreseeinrichtung hauptsächlich von einem Stromquellenmechanismus
10, der mit Gleichstromquellen 11 und 12 versehen ist, die
fähig sind, auf unterschiedliche willkürliche Spannungsniveaus
eingestellt zu werden, sowie einem
Impulspotentialumschaltund -verbindungsmechanismus 20, der mit einem
Schaltmechanismus 21 und einem Zeitsteuermechanismus 22, welcher fähig ist,
die Verbindungszeitdauer auf einen von zwei willkürlichen
werten einzustellen, versehen ist, und einem
Elektrophoresebehälter 30, der mit einer Behälteroberseitenelektrode
(elektrischer Verbindungsanschluß) 31, einer
Behälterunterseitenelektrode (elektrischer Verbindungsanschluß) 32 und einem
Temperatursteuer- bzw. -regelmechanismus 40 versehen ist, gebildet
ist. Der Stromquellenmechanismus 10 und der
Impulspotentialumschalt- und -verbindungsmechanismus 20 können zu einem
einzigen Mechanismus kombiniert sein.
-
Der Hauptkörper des Elektrophoresebehälters 30
(Elektrophoreseeinrichtung) ist der gleiche wie bei der bekannten
Elektrophoreseeinrichtung vom Gleichstromanwendungstyp oder
Impulsfeldtyp. Der Umschaltmechanismus 21 befindet sich zwischen
dem Elektrophoresebehälter 30 und den Gleichstromquellen 11,
12 und ist mit den Gleichstromquellen 11, 12 verbunden, die
fähig sind, auf unterschiedliche willkürliche Potentialwerte
eingestellt zu werden, und mit einer der Elektroden
(elektrische Verbindungsanschlüsse) der Elektrophoreseeinrichtung, so
daß Potentialimpulse während gewünschter Zeitdauern an die
Anodenseite und die Kathodenseite des Elektrophoresemediums
angelegt werden, indem das an die Anodenseite angelegte
Potential unterschiedlich gegenüber dem an die Kathodenseite
angelegten Potential und die Zeitdauern der Impulse
unterschiedlich voneinander gemacht werden. Das Potential über der
Anode und der Kathode des Elektrophoresebehälters 30 wird
durch den Umschaltmechanismus 21 geändert, welcher die obere
Behälterelektrode mit der Gleichstromquelle 11 oder der
Gleichstromquelle 12 während der gewünschten Impulszeitdauer
verbindet. Der Umschaltmechanismus 21 kann von einem bekannten
elektromagnetischen Relais oder einem bekannten
Halbleiterrelais gebildet sein. Außerdem sollte, um auf eine
willkürliche Impulszeitdauer innerhalb des Bereichs von angenähert 1
Millisekunde bis angenähert 1.000 Sekunden einzustellen&sub1; ein
Blockmechanismus, der aus einer im großen Maßstab integrierten
Haibleiterschaltung (LSI) besteht, vorzugsweise als ein
Verbindungszeitsteuer- bzw. -regelmechanismus angewandt werden.
Die Wellenform der angewandten Impulse wird aus einer
Rechteckwelle, einer Sinuswelle, einer Sägezahnwelle und anderen
Wellen ausgewählt. Im allgemeinen wird die Rechteckwelle
angewandt. Die Elektrophoreseeinrichtung kann auch mit
zusätzlichen Mechanismen versehen sein, wie einem bekannten
Temperatursteuer- bzw. -regelmechanismus (hauptsächlich einem
Kühlmechanismus), einem Pufferzuführungs-, -halte- und
-entladungsmechanismus, und einem
Elektrophoresemediumanbringungsund -haltemechanismus. Die Fig. 2 zeigt ein Beispiel der
Potentialwerte und Zeitdauern der angewandten Impulse.
-
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden
nichtbeschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
[Herstellung der Agarosegelmembrane, worin die Dicke der
Membrane eine vorbestimmte allmähliche Änderung längs der
Richtung der Elektrophorese hat]
-
Wäßrigarosegelmembranen, die eine Gelkonzentration von 1,5 %
haben, wurden hergestellt durch Aufbringen einer Lösung für
die Gelbildung (Wäßrigagaroselösung), welche einen TBE-Puffer
enthielt, der die unten gezeigte Zusammensetzung hat, und
darin aufgelöste Agarose, auf eine 20m-Quadrat-Glasplatte,
die glatte Oberflächen hatte, und Halten der aufgebrachten
Lösung auf einer niedrigen Temperatur, um sie zu gelieren. Auf
diese Art und Weise wurden zwei Arten von
Wäßrigarosegelmembranen hergestellt, die unterschiedliche
Membrandickenfunktionen haben, worin sich die Gelmembrandicke von 2,0 mm auf 5,0
mm (Gelmembrane 1) änderte und worin sich die Gelmembrandicke
von 0,5 mm auf 5,0 mm (Gelmembrane 2) änderte.
1) Zusammensetzung des TBE-Puffers
-
Tris(hydroxymethyl)aminomethan [Tris] 103 g
-
Borsäure 55 g
-
EDTA-2Na-Salz 9,3 g
-
Auf 10,0 Liter mit Wasser aufgefüllt.
2) Zusammensetzung der wäßrigen Agaroselösung
-
Agarose 150 g
-
Oben angegebener TBE-Puffer 10 Liter.
-
Danach wurden vertiefungen für Proben in der Nähe des Rands
von jeder Wäßrigagarosegelmembrane auf der Seite größerer
Dicke durch das konventionelle Verfahren unter Verwendung
eines Kamms vom Vertiefungstyp, der eine Größe von 10 mm x 15 mm
hatte, gemacht.
[Leistungsfähigkeitsabschätzung der Agarosegelmembrane gemäß
einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung]
-
Als DNA-Proben wurden TdC-DNA (166 kbp), λ-DNA (48 kbp) und
ein Hind-III-Spaltprodukt von λ-DNA verwendet. Jede DNA-Probe
in einer Menge von 0,02 µg wurde in 5 µl des TBE-Puffers, der
die gleichen Bestandteilskonzentrationen wie oben erwähnt
hatte und 10 % an Glycerol und 0,0015 % an Bromphenolblau
enthielt, aufgelöst und für die Analyse verwendet. Die Proben
wurden unter Verwendung einer Gilson-Pipetman-Pipette, die
einen abgeschnittenen Pipettenrand hatte, in die Vertiefungen
aufgebracht. Vor der Impulsanwendung wurde ein Gleichstromfeld
während 15 Minuten in einer Richtung angewandt, bis die Probe
in die Agarosegelmembrane eingeführt wurde.
-
Die Elektrophorese wurde gemäß dem Impulsumkehrverfahren durch
Verbinden des Rands der Agarosegelmembrane auf der Seite
größerer Dicke mit der Kathodenseite und Halten der Temperatur
auf 14,0ºC ausgeführt. Die Elektrophoresebedingungen sind in
Tabelle 1 gezeigt.
-
Nachdem die Elektrophorese beendet war, wurde die Gelmembrane
in eine Färbungsflüssigkeit eingetaucht, die 0,5 µg an
Ethidiumbrornid pro 1 ml des TBE-Puffers enthielt, und das
elektrophoretische DNA-Bild wurde in ein sichtbares Bild umgewandelt.
Danach wurde das sichtbare elektrophoretische Bild unter
Verwendung eines Fuji-Instant-Schwarz-und-Weiß-Films
(Handeisbezeichnung FP-3000B) unter Bestrahlung mit kurzwelligem
Ultraviolettlicht fotografiert. Die Wanderungsstrecke von jeder DNA
wurde auf der Fotografie des elektrophoretischen Bilds
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1
-
Eine Wäßrigagarosegelmembrane (Gelmembrane 3) wurde in der
gleichen Art und Weise wie im Beispiel hergestellt,
ausgenommen, daß die Dicke der Gelmembrane so eingestellt wurde, daß
sie konstant bei 2,0 mm war. Eine
Leistungsfähigkeitsabschätzung wurde dann in der gleichen Art und Weise wie im Beispiel
1 ausgeführt, und es wurden die in Tabelle 1 gezeigten
Ergebnisse erhalten.
-
Wie aus Tabelle 1 klar ist, waren mit dem
Impulselektrophorese-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unter
Verwendung der Agarosegelmembrane, die eine sich ändernde Dicke
hatte, die Wanderungsstrecken der DNA-Proben deutlich länger
als bei dem Verfahren des Vergleichsbeispiels 1, in dem die
Gelmembrane konstanter Dicke verwendet wurde. Demgemäß hat die
Elektrophoresemediummembrane in dem Impulsfeldelektrophorese-
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verbesserte
Wirkungen gegenüber dem konventionellen Verfahren.
Beispiel 2
-
Eine Lösung für die Agarosegelbildung wurde in der gleichen
Art und Weise wie im Beispiel 1 hergestellt, und
Wäßrigarosegelmembranen von den gleichen Arten, wie in Tabelle 1 gezeigt,
wurden auf 250 µm dicken farblosen
Polyethylenterephthalatfilmen hergestellt. Die Elektrophorese wurde in der gleichen Art
und Weise wie im Beispiel 1 unter Verwendung der auf diese
Weise hergestellten Agarosegelmembranen ausgeführt, und die
gleichen Ergebnisse wie im Beispiel 1 wurden erhalten. Die
Experimente, mit denen die Membranleistungsfähigkeit getestet
wurde, zeigten, daß die gleiche
DNA-Fraktionierungsleistungsfähigkeit erhalten wurde, wenn der Träger aus
Polyethylenterephthalatfilm hergestellt war, wie wenn der Träger aus einer
Glasplatte hergestellt war.
Beispiel 3
-
Eine wäßrige Agaroselösung wurde auf einen farblosen
transparenten Polyethylenterephthalatfilm aufgebracht, der eine Dicke
von 250 µm hatte, und sie wurde auf einer niedrigen Temperatur
gehalten, um die wäßrige Agaroselösung zu gelieren. Auf diese
Art und Weise wurden zwei Arten von Wäßrigarosegelmembranen
mit unterschiedlichen Membrandickenfunktionen so hergestellt,
daß sich in einem Fall die Dicke der Gelmembrane exponentiell
von 2,0 mm auf 5,0 mm änderte (Gelmembrane 4), und sich in dem
andern Fall die Dicke der Gelmembrane exponentiell von 0,5 mm
auf 5,0 mm änderte (Gelmembrane 5). (In jeder der Gelmembranen
4 und 5 war eine der Membranoberflächen gerade, und die
Membrandicke war konvex nach der geraden Oberfläche zu gekrümmt.)
Teile in der Nähe des dickeren Rands von jeder Gelmembrane
wurden mit einem scharfen Schneidmesser abgeschnitten, um
Vertiefungen für die Probentüpfelung herzustellen.
-
Die Elektrophorese wurde in der gleichen Art und Weise wie im
Beispiel 1 unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten
Agarosegelmembranen ausgeführt. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist,
wiesen die Gelmembranen einen weiten Bereich von
DNA-Molekulargewichten auf, über welchen eine Fraktionierung möglich
war, und eine hohe Auflösung.
Tabelle 1
Gelmembranvariablen
Dickenänderung
Elektrophoresebedingungen (Impulse)
Trennungsstrecke
Kathodenseite: mm
Anodenseite: mm
Die Dicke variiert als eine gerade Linie
Vorwärts: Sekunden
Rückwärts: Sekunde
Angewandte Spannung: V
Konstant bei mm
Tabelle 2
Gelmembranvariablen
Dickenänderung
Elektrophoresebedingungen (Impulse)
Trennungsstrecke
Kathodenseite: mm
Anodenseite: mm
Dicke ändert sich als eine Exponentialfunktionskurve
Vorwärts: Sekunden
Rückwärts: Sekunde
Angewandte Spannung: V
Konstant bei mm
-
Beachte: In den Tabellen 1 und 2 bedeutet die
Trennungsstrecke die Strecke zwischen den Trennungsbanden von
T4 (166 kbp) und λ (48,5 kbp).
-
Die Markierung " " bedeutet, daß der Wert der
gleiche wie der linke ist.
Beispiel 4
[Herstellung einer Agarosegelmembrane mit einer variierenden
Konzentration der Agarose]
-
Es wurden zwei Arten von wäßrigen Agarosegellösungen (Lösungen
für die Gelbildung), welche Agarosekonzentrationen von 2,0 %
und 0,5 % hatten, durch Auflösen von Agarose in einem
TBE-Puffer, der die unten gezeigte Zusammensetzung hatte,
hergestellt. Die beiden Arten von wäßrigen Agaroselösungen, die
hohe und niedrige Konzentration hatten, wurden unter
Verwendung eines statischen Mischers gemäß dem Verfahren, das in der
japanischen Patentanmeldung Nr. 62(1987)-129924 vorgeschlagen
ist, durch allmähliche Änderung des
Strömungsratenverhältnisses gemischt (d.h. durch anfängliches Einstellen dahingehend,
daß der Anteil der wäßrigen Agaroselösung niedriger
Konzentration hoch ist und dann der Anteil der wäßrigen Agaroselösung
hoher Konzentration allmählich erhöht wird). Eine lineare
Konzentrationsfunktion von einer Gelkonzentration von 0,5 % zu
einer Gelkonzentration von 2,0 % wurde über eine Länge von 20
cm in der Richtung des Gießens oder des Aufbringens
(Gelmembrane 6) erhalten, und eine lineare Konzentrationsfunktion von
einer Gelkonzentration von 0,5 % zu einer Gelkonzentration von
2,5 % wurde über eine Länge von 20 cm in der Richtung des
Gießens oder Aufbringens (Gelmembrane 7) erhalten. Die auf diese
Weise erhaltene Wäßriglösungsmischung wurde mit einer
konstanten Strömungsrate zu einem Gieß- oder Aufbringungskopf
zugeführt. Die Wäßriglösungsmischung wurde mit einer konstanten
Strömungsrate auf eine 20cm-Quadrat-Glasplatte, die glatte
Oberflächen hatte, so gegossen oder aufgebracht, daß die
Gelmembrandicke gleichförmig bei 2,0 mm war, und sie wurde zum
Gelieren der Mischung auf einer niedrigen Temperatur gehalten.
Auf diese Art und Weise wurden zwei Arten von
Wäßrigagarosegelmembranen mit unterschiedlichen Konzentrationsfunktionen
hergestellt.
1) Zusammensetzung des TBE-Puffers
-
Tris(hydroxymethyl)aminomethan [Tris] 206 g
-
Borsäure 110 g
-
EDTA 2Na-Salz 18,6 g
-
Aufgefüllt auf 20,0 Liter mit Wasser.
2) Zusammensetzung der wäßrigen Agaroselösung hoher
Konzentration
-
Agarose 200 g
-
Oben angegebener TBE-Puffer 10 Liter
3) zusammensetzung der wäßrigen Agaroselösung niedriger
Konzentration
-
Agarose 50 g
-
Oben angegebener TBE-Puffer 10 Liter
-
Danach wurden Vertiefungen für Proben in der Nähe des Rands
von jeder Wäßrigagarosegelmembrane auf der Seite höherer
Konzentration durch das konventionelle Verfahren unter Verwendung
eines Kamms vom Vertiefungstyp, der eine Größe von 10 mm x
15 mm hatte, hergestellt.
[Leistungsfähigkeitsabschätzung der Agarosegelmembrane mit
einer variierenden Konzentration der Agarose]
-
Als DNA-Proben wurden TdC DNA (166 kbp), λ-(DNA 848 kbp) und
ein Hind-III-Spaltprodukt von λ-DNA verwendet. Jede DNA-Probe
in einer Menge von 0,02 µg wurde in 5 µl des TBE-Puffers, der
die gleichen Bestandteilskonzentrationen wie oben erwähnt
hatte und 10 % an Glycerol und 0,0015 % an Bromphenol blau
enthielt, aufgelöst und für die Analyse verwendet. Die Proben
wurden in die Vertiefungen unter Verwendung einer
Gilson-Pipetman-Pipette, die einen abgeschnittenen Pipettenrand hatte,
aufgebracht. Vor der Impulsanwendung wurde ein Gleichstromfeld
während 15 Minuten in einer Richtung angewandt, bis die Probe
in die Agarosegelmembrane eingeführt wurde.
-
Die Elektrophorese wurde gemäß dem Impulsumkehrverfahren durch
Verbinden des Rands der Agarosegelmembrane auf der Seite
höherer Gelkonzentration mit der Kathodenseite und Halten der
Temperatur
auf 14,0ºC ausgeführt. Die Elektrophoresebedingungen
sind in Tabelle 3 gezeigt.
-
Nachdem die Elektrophorese beendet war, wurde die Gelmembrane
in eine Färbungsflüssigkeit eingetaucht, die 0,5 µg an
Ethidiumbromid pro 1 ml des TBE-Puffers enthielt, und das
elektrophoretische DNA-Bild wurde in ein sichtbares Bild umgewandelt.
Danach wurde das sichtbare elektrophoretische Bild unter
Verwendung eines Fuji-Instant-Schwarz-und-Weiß-Films
(Handelsbezeichnung: FP-3000B) unter Bestrahlung mit kurzwelligem
Ultraviolettlicht fotografiert. Die Strecke der Wanderung von jeder
DNA wurde auf der Fotografie des elektrophoretischen Bilds
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 2
-
Eine Wäßrigagarosegelmembrane (Gelmembrane 8) wurde in der
gleichen Art und Weise wie im Beispiel 4 hergestellt,
ausgenommen, daß die Dicke der Gelmembrane so eingestellt wurde,
daß sie konstant bei 2,0 mm war, und die Gelkonzentration
wurde so eingestellt, daß sie konstant bei 1,5 % war. Eine
Leistungsfähigkeitsabschätzung wurde dann in der gleichen Art
und Weise wie im Beispiel 4 ausgeführt, und es wurden die in
Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse erhalten.
-
Wie es aus Tabelle 3 klar ist, waren bei dem
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, in dem
die Agarosegelmembrane, die eine gewünschte
Konzentrationsfunktion hatte, verwendet wurde, die Strecken der Wanderung
der DNA-Proben deutlich länger als bei dem Verfahren des
Vergleichsbeispiels 1, in dem die Gelmembrane konstanter Dicke
und konstanter Konzentration verwendet wurde. Demgemäß hat die
Elektrophoresemediummembrane in dem Impulsfeldelektrophorese-
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verbesserte
Wirkungen gegenüber dem konventionellen Verfahren.
Beispiel 5
-
Zwei Arten von wäßrigen Agaroselösungen, die hohe und niedrige
Konzentration hatten, wurden in der gleichen Art und Weise wie
im Beispiel 4 hergestellt, und Wäßriggelmembranen der gleichen
Arten, wie es jene sind, die in Tabelle 3 gezeigt sind, wurden
auf 250 µm dickem farblosem Polyethylenterephthalatfilmen her
gestellt. Die Elektrophorese wurde in der gleichen Art und
Weise wie im Beispiel 4 unter Verwendung der auf diese Weise
hergestellten Agarosegelmembranen ausgeführt, und die gleichen
Ergebnisse wie im Beispiel 4 wurden erhalten. Die Experimente,
mit denen die Leistungsfähigkeit der Membrane getestet wurde,
zeigten, daß die gleiche DNA-Fraktionierungsleistungsfähigkeit
erhalten wurde, wenn der Träger aus Polyethylenterephthalat
hergestellt war, wie wenn der Träger aus einer Glasplatte
hergestellt war.
Beispiel 6
-
Farblose, transparente Polyethylenterephthalatfilme, die eine
Dicke von 250 µm hatten, wurden als die Träger verwendet, und
zwei Arten von Wäßrigarosegelmembranen, die eine konstante
Mernbrandicke (2,0 mm) hatten, aber mit unterschiedlichen
Konzentrationsfunktionen, wurden auf den Trägern in der gleichen
Art und Weise wie im Beispiel 4 hergestellt, wobei sich die
Gelkonzentration exponentiell von 0,5 % auf 2,0 % (Gelmembrane
9) in einer Membrane änderte, und wobei sich die
Gelkonzentration exponentiell von 0,5 % auf 2,5 % (Gelmembrane 10) in der
anderen Membrane änderte. Teile in der Nähe des Rands von
jeder Gelmembrane auf der Seite höherer Gelkonzentrationen
wurden mittels eines scharfen Schneidmessers abgeschnitten, um
Vertiefungen für die Probentüpfelung herzustellen.
-
Die Elektrophorese wurde in der gleichen Art und Weise wie im
Beispiel 4 unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten
Agarosegelrnembranen ausgeführt. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist,
wiesen die Gelmembranen einen weiten Bereich von
DNA-Molekulargewichten
auf, über welchen eine Fraktionierung möglich
war, und eine hohe Auflösung.
Tabelle 3
Gelmembranvariable
Konzentrationsänderung (Dicke: mm)
Elektrophoresebedingungen (Impulse)
Trennungsstrecke
Kathodenseite: %
Anodenseite: %
Konzentration ändert sich als eine gerade Linie
Vorwärts: Sekunden
Rückwärts: Sekunde
Angewandte Spannung: V
Konstant bei %
Tabelle 4
Gelmembranvariable
Konzentrationsänderung (Dicke: mm)
Elektrophoresebedingungen (Impulse)
Trennungsstrecke
Kathodenseite: %
Anodenseite: %
Konzentration ändert sich als eine Exponentialfunktionskurve
Vorwärts: Sekunden
Rückwärts: Sekunde
Angewandte Spannung: V
Konstant bei %
-
Beachte: In den Tabellen 3 und 4 bedeutet die
Trennungsstrecke die Entfernung zwischen den Trennungsbändern
von T4 (166 kbp) und λ (48,5 kbp).
-
Die Markierung " " bedeutet, daß der Wert der
gleiche wie der linke ist.
Vergleichsbeispiel 3
-
Eine Agaroselösung für die Gelbildung wurde durch Hinzufügen
eines TBE-Puffers, welcher 10,3 g an
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 5,5 g an Borsäure und 930 mg des EDTA-2NA-Salzes pro
1 Liter der Pufferlösung enthielt, in eine wäßrige
Agaroselösung
bei angenähert 70ºC nach Kochen und Auflösen, so daß die
Agarosekonzentration 1 Gew.-/Vol.-% war, hergestellt.
-
Es wurde eine Glasform, die mit einem 2mm dicken Zwischenraum
zwischen parallelen Ebenen versehen war, durch Befestigen von
2 mm dicken Abstandsteilen an zwei gegenüberliegenden Seiten
von 2 quadratischen, farblosen, transparenten Glasplatten, die
eine Dicke von 5 mm und eine Abmessung von 20 cm x 20 cm
hatten, hergestellt. Ein Kamm vorn Vertiefungstyp, der eine Größe
von 10 mm x 1,5 mm hatte, wurde auf einer Seite, die frei von
Abstandsteilen war, vorgesehen, und die vorerwähnte Lösung für
die Gelbildung wurde sorgfältig in die Form eingeführt und bei
Raumtemperatur (innerhalb des Bereichs von angenähert 23ºC bis
angenähert 25ºC) stehengelassen. Auf diese Art und Weise wurde
eine Agarosegelmembrane hergestellt, die eine Konzentration
von 1 Gew.-/Vol.-% hatte.
-
Die auf diese Weise hergestellte Agarosegelmembrane wurde
vertikal an einer Elektrophoreseeinrichtung angebracht, welche
von der Hoefer Company geliefert worden war. Ein TBE-Puffer,
der die gleiche Konzentration wie oben erwähnt hatte, wurde in
einen oberen Behälter und einen unteren Behälter der
Elektrophoreseeinrichtung eingeführt. Die unten beschriebenen
Vorgänge wurden bei einer Temperatur von 14ºC ausgeführt.
-
Der Potentialanwendungsmechanismus, wie er in Fig. 1 gezeigt
ist, wurde verwendet.
-
Als DNA-Proben wurden T4DC DNA (166 kbp), λ-DNA (48 kbp) und
Hind-III-Spaltprodukte von λ-DNA (23,14 kb, 9,42 kb, 6,56 kb,
4,36 kb, 2,32 kb, 2,02 kb, 0,56 kb, 0,13 kb) verwendet.
-
Jede DNA-Probe in einer Menge von 20 ng (2 x 10 g) wurde in
5 µl des TBE-Puffers, der die gleiche Konzentration wie oben
erwähnt hatte und 10 % an Glycerol und 0,0015 % an
Bromphenolblau enthielt, aufgelöst und für die Analyse verwendet. Die
DNA-Probenlösungen wurden in die Vertiefungen der
Agarosegelmembran
unter Verwendung einer Gilson-Pipetman-Pipette, die
einen abgeschnittenen Pipettenrand hatte, aufgebracht.
-
Vor der Elektrophorese wurden, folgend auf die
Probenaufbringung in die Vertiefungen, 300 V Gleichstrom während 5 Minuten
angewandt, um die Proben in das Gel zu bewegen. Ein gepulster
Potentialzyklus (wie in Fig. 2 gezeigt) war zusammengesetzt
aus 3-Sekunden-Perioden, während welcher der obere Behälter
auf 0 V und der untere Behälter auf +300 V gehalten wurde,
gefolgt von 0,5-Sekunden-Perioden, während welcher der untere
Behälter auf 500 V und der obere Behälter auf 0 V gehalten
wurde. Die Anwendung des gepulsten Potentials wurde beendet,
und die Elektrophorese wurde zu der Zeit, in welcher
Bromphenolblau, wobei der Farbstoff mit den Proben koexistierte, den
Gelrand erreichte, beendet. Die Elektrophoresezeit war 140
Minuten.
Vergleichsbeispiel 4
-
Das gleiche Verfahren wie im Vergleichsbeispiel 3 wurde
ausgeführt, ausgenommen, daß ein gepulster Potentialzyklus
angewandt wurde, zusammengesetzt aus 3-Sekunden-Perioden, während
welcher der obere Behälter auf 0 V und der untere Behälter auf
300 V gehalten wurde, gefolgt von 1-Sekunde-Perioden, während
welcher der untere Behälter auf -300 V und der obere Behälter
auf 0 V gehalten wurde (der Absolutwert der Potentiale war
derselbe, aber die Zeitdauern, während deren sie angewandt
wurden, waren unterschiedlich). Die Elektrophoresezeit war
170 Minuten.
Vergleichsbeispiel 5
-
Das gleiche Verfahren wie im Vergleichsbeispiel 3 wurde
ausgeführt, ausgenommen, daß der obere Behälter konstant auf 0 V
und der untere Behälter auf +300 V gehalten wurde. Die
Elektrophoresezeit war 110 Minuten.
[Leistungsfähigkeitsabschätzung]
-
Die Gelmembrane wurde nach der Elektrophorese aus der Glasform
herausgenommen, und es wurde ein Fluoreszenzmittel in die DNA
eingebaut, indem das Gel in eine wäßrige Lösung getaucht
wurde, die 0,5 µg an Ethidiumbromid pro 1 ml des TBE-Puffers
enthielt. Danach wurden Ultraviolettstrahlen auf die
Gelmembrane aufgestrahlt, und die auf diese Weise erzeugte
Fluoreszenz wurde unter Verwendung des Instant-Schwarz-und-Weiß-Films
FP-3008, geliefert von der Fuji Photo Film Co., Ltd.,
fotografiert. Auf diese Art und Weise wurde das DNA-Trennungsbild in
ein sichtbares Bild umgewandelt.
-
Die Entfernung zwischen dem T4DC-DNA-Band und dem -DNA-Band
in dem erhaltenen Trennungsbild wurde gemessen. Die unten
gezeigten Ergebnisse wurden erhalten.
Entfernung zwischen Bändern
Elektrophoresezeit
Vergl.-Beispiel
Minuten
-
Bei dem Impulsfeldelektrophorese-Verfahren, in dem die
Zeitdauer des Potentials auf der Anodenseite (Vorwärtspotential)
und die Zeitdauer des Potentials auf der Kathodenseite
(Rückwärtspotential) auf unterschiedliche Werte eingestellt waren,
kann der Band-zu-Band-Abstand zwischen den DNA-Proben, die ein
großes Molekulargewicht haben, so lang wie angenähert 6mal dem
Band-zu-Band-Abstand sein, der durch das
Elektrophoreseverfahren erhalten worden war, worin ein Gleichstrompotential
angewandt wurde. Außerdem ist bei dem vorerwähnten
Impulsfeldelektrophorese-Verfahren der Band-zu-Band-Abstand um angenähert
20 % länger und die Elektrophoresezeit um angenähert 20 %
kürzer
als bei dem FIGE-Impulsfeldelektrophorese-Verfahren, worin
die Richtung des angewandten Potentials einfach umgekehrt wird
und die Zeitdauern der Anwendung verändert werden.