JPH0753594A

JPH0753594A - インターロイキン−１２のｐ４０ホモダイマー

Info

Publication number: JPH0753594A
Application number: JP6151081A
Authority: JP
Inventors: Maurice Kent Gately; ケントゲイトリーモーリス; John Hakimi; ハキミジョン; Ping Ling; リングピング
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 1995-02-28
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: DE69431545D1; EP0640689B1; DE69431545T2; ES2184748T3; RU2135584C1; ATE226215T1; JP3546076B2; NZ260843A; RU94022238A; AU6607294A; EP0640689A3; PT640689E; DK0640689T3; ZA944567B; US5650492A; CA2125763A1; CA2125763C; AU675532B2; EP0640689A2

Abstract

(57)【要約】【構成】インターロイキン−１２のｐ４０サブユニッ
トが２つ、好ましくは少なくとも１つのジスルフィド結
合により、連結されている、分子量約８０ｋＤａのｐ４
０ホモダイマータンパク質、該タンパク質を含有する医
薬組成物、および該タンパク質の生産方法。【効果】ｐ４０ホモダイマータンパク質はインターロ
イキン−１２受容体のアンタゴニストとして作用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インターロイキン-12
受容体のアンタゴニストとして作用する、インターロイ
キン-12 のｐ40サブユニットが２つ会合したタンパク質
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン-12 （ＩＬ-12 ）は、
以前は細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）または
ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）として知ら
れていたものであるが、活性化したＴ細胞およびＮＫ細
胞の増殖刺激（１，２）、末梢血単核細胞によるＩＮＦ
-γ産生の誘導、およびＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性の
増進（２−４）を含む、多面的な活性を有するサイトカ
インである。

【０００３】ＩＬ-12 は、およその分子量が約75kDで、
ジスルフィド結合で連結された２つのサブユニット、す
なわち分子量が約35kDのｐ35と分子量が約40kDのｐ40、
からなっているヘテロダイマー分子である（２，４−
６）。ｐ40サブユニットはインターロイキン-6受容体
（ＩＬ−６Ｒ）とアミノ酸配列において相同性を有して
いることから、サイトカイン受容体スーパーファミリー
に属しており、一方ｐ35はＩＬ-6／Ｇ−ＣＳＦサイトカ
インファミリーと遠いが有意な関連性を有している。ｐ
35／ｐ40ヘテロダイマーは、サイトカイン（ｐ35）と可
溶性のサイトカイン受容体（ｐ40）の複合体として示す
ことができ、細胞性ＩＬ−１２受容体はＩＬ-6シグナル
変換タンパク質のｇｐ130 と類似した機能を提供するも
のと推測されてきた（７，８）。

【０００４】ＩＬ-12 の生物学的活性は、活性化された
Ｔ細胞またはＮＫ細胞上の原形質膜受容体への無傷のＩ
Ｌ-12 分子の結合によって仲介される（９，10）。しか
し、受容体結合およびシグナル変換に対するそれぞれの
サブユニットの寄与については未解明のままである。ヒ
トＩＬ-12 に対する中和抗体（11）および部位特異的化
学修飾（12）を使用した研究により、ｐ40サブユニット
は、ＩＬ-12 がその受容体に結合するのに重要なエピト
ープを含むことが示唆された。また、ヒト／マウスキメ
ラ分子を使用した研究により、ｐ35は生物学的活性に関
してそのヘテロダイマーの種特異性を決定づけているこ
とが示された。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イン
ターロイキン-12 受容体に結合することができるが細胞
増殖を仲介することはできない、インターロイキン-12
のｐ40サブユニットのホモダイマータンパク質を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】初めに、本明細書で用い
る用語について説明する。用語「ホモダイマー」は２つ
のｐ40サブユニットの相互会合を意味する。ｐ40サブユ
ニットの会合は共有結合または非共有結合性のもので、
たとえば翻訳後修飾による適当な宿主細胞中でのｐ40サ
ブユニットの組換え発現によってin vivoで、またはた
とえば架橋剤などの化学的手段によってin vitroで、形
成させることができる。

【０００７】用語「ｐ40サブユニット」には天然のおよ
び組換え体のインターロイキン-12ｐ40サブユニットと
ともにそれらの誘導体も含まれる。この用語は、ｐ40サ
ブユニット断片と、融合タンパク質（すなわち、天然の
ｐ40のアミノ酸配列またはその部分配列と別のタンパク
質から誘導されたアミノ酸配列とをともに含んでいる、
ｐ40サブユニット誘導体）をも意味する。本発明のタン
パク質は任意にイニシエーターのメチオニンを含んでい
てもよい。

【０００８】用語「ｐ40サブユニット」は、さらに、ｐ
40またはその断片のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列
を有する、天然には存在しないｐ40様サブユニットをも
含んでいる。このようなｐ40様サブユニットとは、天然
ｐ40またはその断片の中の１またはそれ以上のアミノ酸
が、上述のｐ40ホモダイマーの活性を損なうことなく置
き換わるかまたは欠失しているタンパク質のことであ
る。これらの類似体は、ペプチド化学の公知の方法によ
り、または部位特異的変異誘発などの組換えＤＮＡ技術
の公知の方法により、製造することができる。

【０００９】さらに、用語「ｐ40ホモダイマータンパク
質」および「ｐ40サブユニット」には「機能性誘導体」
も含まれる。この用語は、残基上の側鎖として存在する
官能基またはＮ−もしくはＣ−末端基から公知の方法に
よって生成される、ｐ40ホモダイマータンパク質および
ｐ40サブユニットの誘導体を意味しているが、それらが
依然として薬学上許容される、すなわちこのタンパク質
の活性を損なわず、これを含む組成物に毒性をもたらさ
ない限りにおいて、本発明に含まれる。これらの誘導体
として、たとえば抗原部位を遮蔽し、ｐ40ホモダイマー
タンパク質の体液中の滞留時間を延長させることができ
る、ポリエチレングリコール側鎖が含まれる。その他の
誘導体として、カルボキシル基の脂肪族エステル、アン
モニアまたは１級もしくは２級アミンとの反応によるカ
ルボキシル基のアミド、アシル成分（たとえばアルカノ
イルまたは炭素環式アロイル基）によって形成されたア
ミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、または
アシル成分によって形成された（たとえばセリルまたは
トレオニル残基の）遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が含
まれる。

【００１０】次に、図面について説明する。図１．フローサイトメトリーにより分析した、ヒトＩＬ
-12 およびＣＯＳ発現ｒｐ40のＫＩＴ225 ／Ｋ６細胞へ
の用量依存的結合。「材料および方法」に記載したよう
に、種々の濃度の精製ヒトＩＬ-12 またはｒｐ40含有馴
化培地（標準としてＩＬ-12 を使用したＥＩＡ（酵素免
疫検定法）によって測定）をＫＩＴ225／Ｋ６細胞とと
もにインキュベートし、ビオチニル化８Ｅ３ｍＡｂ続い
てストレプトアビジン−ＰＥによって検出した。パネル
Ａ：曲線ａはビオチニル化８Ｅ３およびストレプトアビ
ジン−ＰＥのみとインキュベートした細胞の非特異的染
色を示す。曲線ｂおよびｃはそれぞれ100 および500ng/
mlのヒトＩＬ-12 とインキュベートした細胞を示す。パ
ネルＢ：曲線ａは非特異的染色を示し、曲線ｂ，ｃ，ｄ
およびｅはそれぞれ2.5 ,12.5 ,125 ,および500 ng/ml
のｒｐ40とインキュベートした細胞を示す。

【００１１】図２．ＦＡＣＳ分析によって検出したｒｐ
40のＫＩＴ225 ／Ｋ６細胞への結合特異性。精製ヒトＩ
Ｌ-12 （Ａ）、ヒトｐ35およびｐ40ｃＤＮＡで同時トラ
ンスフェクションしたＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化
培地（Ｂ）、またはヒトｐ40ｃＤＮＡのみでトランスフ
ェクションしたＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化培地
(Ｃ)を0.5μg/ml（ＥＩＡによって測定）に希釈し、Ｋ
ＩＴ225 ／Ｋ６細胞を添加する前に、最終濃度25μg/ml
の４Ａ１中和モノクローナル抗ヒトＩＬ-12 抗体（ｂ）
または正常ラットＩｇＧ（Ｒ−ＩｇＧ）（ｃ）とともに
室温で１時間インキュベートした。ｐＥＦ−ＢＯＳ野生
型プラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養
物からの馴化培地を対照として使用した（Ｄ）。非特異
的染色を測定するため、細胞をビオチン−８Ｅ３および
ストレプトアビジン−ＰＥのみとインキュベートした
（ａ）。

【００１２】図３．別々に発現させたｒｐ40およびｒｐ
35、または同時に発現させたｒｐ35／ｒｐ40を含有する
馴化培地に応答したＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球の増
殖。ヒトＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）−芽球を、ヒ
トｐ35およびｐ40ｃＤＮＡ（−●−）、ｐ40ｃＤＮＡの
み（−■−）、ｐ35ｃＤＮＡのみ（−▲−）、またはｐ
ＥＦ−ＢＯＳ野生型プラスミド（−○−）でトランスフ
ェクトしたＣＯＳ細胞培養物から得た馴化培地の連続希
釈物とともに培養した。48時間後、「材料および方法」
に記載したように［³Ｈ］チミジンの取り込みを測定し
た。

【００１３】図４．ＣＯＳ発現ヒトｒｐ35、ｒｐ40、お
よびｒｐ35／ｒｐ40ヘテロダイマータンパク質のウェス
タンブロット分析。馴化培地（0.5ml ）をヤギ抗ヒトＩ
Ｌ-12 抗血清から単離したＩｇＧタンパク質５μgによ
って免疫沈降させ、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）条件
下でＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ウサギ抗ヒトＩ
Ｌ-12 抗血清およびペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギ
ＩｇＧを使用したイムノブロットによって分析した。各
レーンに添加した試料は図に記載した通りである。比較
のため、ＣＨＯ細胞からのヒトＩＬ-12 の２つの異なる
量（それぞれ50ngおよび200ng ）を添加した。分子量標
準（ｘ10^-3）の位置を左側に示す。

【００１４】図５．ＣＯＳ発現ヒトｒｐ40タンパク質の
脱グリコシル化。精製ヒトＩＬ-12（0.5μg ）およびヤ
ギ抗ヒトＩＬ- 12抗血清によって免疫沈降させたＣＯＳ
発現ヒトｒｐ40タンパク質を、「材料および方法」に記
載したように、Ｎ−デグリコシダーゼＦによって脱グリ
コシル化した。脱グリコシル化タンパク質の２反復試料
を、非還元（Ａ）または還元（Ｂ）条件下でＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥによって分離し、「材料および方法」に記載した
ように、イムノブロットによって分析した。分子量標準
（ｘ10^-3）の位置を左側に示す。

【００１５】図６．ｒｐ40種のＨＰＬＣ分画化。組換え
ｐ40タンパク質をイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによって部分精製し、ハイロード・スーパーデック
ス（HiLoad Superdex ）75ゲル濾過カラムに通した。画
分をｐ40ＥＩＡおよびＫＩＴ225 ／Ｋ６ＦＡＣＳ結合検
定で評価した。ＥＩＡのデータ（−○−）はμg/ml（標
準としてヒトＩＬ-12 を使用）でプロットし、結合デー
タ（−●−）は蛍光強度の平均ピークでプロットした
（上部パネル）。ＥＩＡ陽性画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびウェスタンブロット分析で評価した（下部パ
ネル）。レーン１から12はそれぞれ画分40, 44, 46, 4
8, 50, 52, 54, 58, 60, 62, 64, および70から得たタ
ンパク質（約50ng）を表している。

【００１６】図７．ＣＯＳ発現ｒｐ40タンパク質によ
る、［¹²⁵Ｉ］ヒトＩＬ-12 のヒトＰＨＡ−芽球への結
合に対する阻害。種々の濃度の精製ヒトＩＬ-12 ヘテロ
ダイマー（−●−）、ＣＯＳ発現ｒｐ40ホモダイマー
（−○−）またはｒｐ40モノマー（−■−）（標準とし
てＩＬ-12 を使用したＥＩＡによって測定）を100pM の
［¹²⁵Ｉ］ヒトＩＬ-12 の存在下、室温で1.5 時間、１
ｘ10⁶個のＰＨＡ−芽球とともにインキュベートした。
データは［¹²⁵Ｉ］ＩＬ-12 の特異的結合を示し、非標
識ＩＬ-12不在下での総特異的結合に対する、表示濃度
の非標識ＩＬ-12またはｒｐ40タンパク質存在下で細胞
に結合した［¹²⁵Ｉ］ＩＬ-12 量のパーセンテージで表
してある。

【００１７】図８．ＣＯＳ発現ヒトｐ40ホモダイマーは
ヒトＰＨＡ−芽球の増殖をほとんど誘発しない。精製天
然ヒトＩＬ-12 （−○−）、部分精製ＣＯＳ発現ヒトｒ
ｐ40ホモダイマー（−●−）、またはＰＢＳ緩衝液（−
□−）の連続希釈物を２ｘ10 ⁴個のＰＨＡ−芽球ととも
にインキュベートした。増殖を「材料および方法」に記
載したように48時間検定で測定した。ｒｐ40の濃度は
「材料および方法」に記載したように、標準として天然
ヒトＩＬ-12 を使用したサンドイッチＥＩＡによって決
定した。

【００１８】図９．ＣＯＳ発現ｐ40ホモダイマーによる
ＩＬ-12 の生物活性の阻害。種々の濃度のＣＯＳ発現ヒ
トｒｐ40ホモダイマーを２ｘ10⁴個のＰＨＡ−芽球とと
もにインキュベートする前に、天然ヒトＩＬ-12 0.1ng
／mlと混合した。ＣＯＳ発現ｐ40ホモダイマーによるＩ
Ｌ-12 の生物活性の中和を、「材料および方法」に記載
したように、48時間増殖検定で測定した。データは、同
希釈のＰＢＳ緩衝液存在下での［³Ｈ］チミジンの取り
込みに比較した、表示濃度のｐ40ホモダイマー存在下で
の［³Ｈ］チミジンの取り込みの阻害％で表してある。
ｐ40の濃度は、「材料および方法」に記載したように、
標準として天然ヒトＩＬ-12 を使用したサンドイッチＥ
ＩＡによって決定した。

【００１９】図10．ＩＬ-12 ｐ35／ｐ40ヘテロダイマー
およびｐ40／ｐ40ホモダイマーのＩＬ- 12受容体への結
合およびシグナル変換の模式図。ＩＬ-12 ｐ40サブユニ
ットは、ＩＬ-12 受容体への結合のために必要とされる
エピトープの適切なコンホメーションをとるためには、
ｐ35サブユニットまたはもう１つのｐ40分子と会合しな
ければならない。しかし、ホモダイマー（Ｂ）ではな
く、ヘテロダイマー（Ａ）のみが、シグナルを誘発する
ための完全アゴニストとして作用する。

【００２０】本発明の好適な実施態様は、好ましくは少
なくとも１つのジスルフィド結合によって結合した、イ
ンターロイキン-12 の２つのｐ40サブユニットからな
る、ｐ40ホモダイマータンパク質である。この化合物の
分子量はおよそ80kDである。好適なｐ40サブユニットは
配列番号：１のものである。本発明のｐ40ホモダイマー
タンパク質は、インターロイキン-12 受容体に結合する
ことはできるが、細胞増殖を仲介することはできない。
すなわち、これらはインターロイキン-12 受容体のアン
タゴニストとして作用する。この生物学的活性は当業界
で知られた標準検定法（ＥＰ 0 443 827）によって、た
とえば下記のようにして、測定することができる。

【００２１】本発明によるｐ40ホモダイマータンパク質
は純粋な形態で得られる。インターロイキン-12 のｐ40
サブユニット（配列番号：１）は当業界で知られた方法
（ＥＰ 0 433 827）によって得ることができるが、この
配列を土台にして、ｐ40サブユニットおよびｐ40ホモダ
イマータンパク質それぞれの生物学的に活性な類似体お
よび断片を製造することができる。これらの生物学的活
性タンパク質は、組換えＤＮＡ技術の標準的方法によっ
て生物学的に生産するか、あるいはアミノ酸合成装置に
よるか、よく知られた液相または固相ペプチド合成法で
の手動合成によって、化学的に合成することができる。
同様にして、ｐ40のアミノ酸配列を他のアミノ酸ととも
に含んでいる類似体、断片、そしてタンパク質を製造す
ることができる。その後これらすべてのタンパク質の対
応する生物学的活性を試験する。

【００２２】このように、本発明はｐ40ホモダイマータ
ンパク質とその使用、そしてこれらの製造方法に関する
ものである。本発明の実施においては、他に示さないか
ぎり、当分野の技術者の技術範囲内の、分子生物学、微
生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の一般的な技術を使
用する。これらの技術は文献に十分に説明されている。
たとえば以下の文献を参照されたい：Sambrook,Fritsch
& Maniatis, MOLECULAR CLONING ; A LABORATORYMANUA
L(1989) ; DNA CLONING,VOLUMES I AND II (D.N.Glover
ed.,1985) ;OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J.Gait e
d.,1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D.Hames & S.
J.Higgins eds.,1984) ;TRANSCRIPTION AND TRANSLATIO
N (B.D.Harnes & S.J.Higgins eds.,1984) ;ANIMAL CEL
L CULTURE(R.I.Freshney ed. ,1986) ; IMMOBILIZED CE
LLS AND ENZYMES (IRL Press,1986) ; B.Perbal,APRACT
ICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984);METHODS IN E
NZYMOLOGYシリーズ(Academic Press,Inc.) ; GENE TRAN
SFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H.Miller and
M.P.Calos eds.,1987, Cold Spring Harbor Laborator
y),Methodsin Enzymology Vol.154 and Vol.155 (それ
ぞれWu and Grossman,and Wu,eds.);IMMUNOCHEMICAL ME
THODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Mayer and Wal
ker,eds.,1987, Academic Press,London), Scopes ,PR
OTEIN PURIFICATION :PRINCIPLES AND PRACTICE,second
Edition (1987,Springer-Verlag,N.Y.),および HANDB
OOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY , VOLUMES I-IV(D.M.
Weir and C.C.Blackwell eds.,1986)

【００２３】本発明のｐ40サブユニットをコードするＤ
ＮＡ配列およびＤＮＡ分子は多種にわたる宿主−ベクタ
ーの組合せを使用して発現させることができる。たとえ
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮ
Ａ配列のセグメントからなっているものでもよい。こう
したベクターの例として、種々の既知のＳＶ40誘導体な
どのウィルスベクター；ｐＣＲ１、ｐＢＲ322 、ｐＭＢ
９およびＲＰ４を含むＥ．coliからのプラスミドなどの
バクテリアベクター；ファージλＭ13および他の繊維状
一本鎖ＤＮＡファージの多くの誘導体などのファージＤ
ＮＡ；２μプラスミドなどの酵母中で有効なベクター、
真核細胞中で有効なベクター；より好ましくはＳＶ40、
アデノウィルスおよび／またはレトロウィルス由来の誘
導ＤＮＡ配列を含んだものなどの、動物細胞中で有効な
ベクターがある。有効なベクターは、ファージＤＮＡを
含むように改変されたプラスミドまたはその他の誘導体
などのような、プラスミドＤＮＡとファージＤＮＡとを
組み合わせたものから誘導することもできる。

【００２４】組換えｐ40ホモダイマータンパク質の生産
に使用することのできる発現ベクターは、ベクター中に
挿入されるｐ40ＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結され
た、クローン化ｐ40ＤＮＡ配列の発現を制御および調節
するための発現制御配列を少なくとも１つ含むものとし
て特徴づけられる。有効な発現制御配列の例として、ｌ
ａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの
主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコート
タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナー
ゼプロモーターなどの酵母解糖プロモーター、Ｐｈｏ５
などの酵母酸性ホスファターゼプロモーター、酵母α交
配因子プロモーター、そしてＳＶ40の初期および後期プ
ロモーターなどの、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、レトロウィルスおよびシミアンウィルスから誘導さ
れるプロモーター、また原核または真核細胞およびそれ
らのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られて
いるその他の配列があり、そして上記プロモーター／オ
ペレーター配列の組合せも有効である。

【００２５】ｐ40サブユニットをコードするＤＮＡは既
知である（２，４−６，13）。このＤＮＡは、一般的な
クローニング技術によって、またはｐ40サブユニットの
ｃＤＮＡコード配列の始めと終わりに相補的なプライマ
ーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
得ることができる（６，13）。本発明は、ｐ40ホモダイ
マーの生産のための宿主細胞および発現ベクターを提供
するものでもある。この方法は、既知の調節配列の制御
下においてｐ40モノマーをコードするＤＮＡ配列で形質
転換された、好適な細胞または細胞系を培養することか
らなっている。好適な細胞または細胞系として、ＣＯＳ
細胞、バキュロウィルス発現系のためのＳＦ９細胞など
の真核細胞またはＥ．coliなどの原核細胞がある。その
他の宿主細胞、発現ベクター、また形質転換、培養、増
幅、スクリーニングおよび目的物の生産の方法の選択に
ついては当業界で知られている（17）。好適な発現ベク
ターは、ＣＯＳ発現にはｐＥＦ−ＢＯＳ（16ａ）であ
り、バキュロウィルス発現系にはｐＡＣＤＺ−１であ
る。

【００２６】本発明はまた、たとえばイムノアフィニテ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動
などによるｐ40ホモダイマータンパク質の回収方法をも
提供する。さらに、本発明のＤＮＡ配列で形質転換され
た原核および真核宿主細胞の培養によって生産されたｐ
40ホモダイマーはその後、たとえば以下に示すような公
知の方法によって、本質的に均質となるまで精製され
る：種々の速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる
沈殿、（常圧または減圧での）透析、等電点電気泳動分
離、ゲル電気泳動分離、あるいはゲル濾過、高性能液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびアフィニテ
ィークロマトグラフィー（たとえば、セファロース（商
標）ブルーＣＬ−６ＢまたはＩＬ-12 ホモダイマーに対
する担体結合モノクローナル抗体を使用）などの種々の
クロマトグラフィーの方法。

【００２７】ＩＬ-12 ホモダイマーを含有する医薬もま
た、その医薬の製造方法とともに本発明の目的の１つで
ある。そしてその方法は、ＩＬ-12 ホモダイマーを、必
要ならば１またはそれ以上の他の治療上有用な物質とと
もに製剤上の投与形態にすることからなるものである。
ｐ40ホモダイマータンパク質またはこれを含む医薬組成
物は、たとえば錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、硬質または軟
質ゼラチンカプセル、溶液剤、乳濁剤、懸濁剤などの形
態で経口投与することができる。投与はまた、たとえば
座薬を使用した直腸投与、たとえば軟膏、クリーム、ゲ
ルまたは溶液を使用した局所または経皮投与、あるいは
注射による非経口投与または時間をかけた緩やかな灌流
で実施することもできる。その投与は静脈内、腹腔内、
筋肉内または皮下で実施することができる。

【００２８】錠剤、被覆錠剤、糖衣錠または硬質ゼラチ
ンカプセルの製造のためには、本発明の化合物を薬学的
に不活性な無機または有機賦形剤と混合すればよい。錠
剤、糖衣錠または硬質ゼラチンカプセル用の好適な賦形
剤の例として、ラクトース、コーンスターチまたはその
誘導体、タルクまたはステアリン酸またはその塩が含ま
れる。

【００２９】軟質ゼラチンカプセルに使用する好適な賦
形剤として、たとえば植物油、ワックス、脂肪、半固形
または液状多価アルコールその他が含まれる。しかし、
活性成分の性質によっては、軟質ゼラチンカプセルには
一切賦形剤が必要でない場合もあり得る。溶液剤および
シロップ剤の製造のためには、使用され得る添加剤とし
て、たとえば水、多価アルコール、ショ糖、転化糖およ
びグルコースがある。

【００３０】非経口投与のための薬学的に許容される製
剤には無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤および
乳濁剤が含まれる。非水性溶媒の例に、プロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植
物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エ
ステルがある。水性担体には、食塩水および緩衝化媒体
を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは
懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウ
ム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよ
び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性
油が含まれる。静脈内ビヒクルには、水分および栄養補
給剤、リンゲルデキストロースを基本としたものなどの
電解質補給剤やこれらに類するものが含まれる。保存剤
や、たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活
性ガスなどのその他の添加剤も存在させてもよい。一般
的には、Remington's Pharmaceutical Science. 18th E
d.,Mack Eds.,1990 を参照されたい。

【００３１】坐薬および局所または経皮適用について
は、使用することのできる賦形剤として、たとえば天然
または硬化油、ワックス、脂肪および半固形または液状
多価アルコールが含まれる。医薬組成物は保存剤、可溶
化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味付与剤、着色剤、
付香剤、浸透圧変化のための塩類、緩衝剤、被覆剤また
は抗酸化剤を含有してもよい。それらはまた、治療上有
用な他の薬剤を含有してもよい。

【００３２】生物学的応答を得るためにヒトに投与する
ｐ40ホモダイマーは、好ましくは週に２から３回筋肉ま
たは静脈内に投与すべきである。ｐ40ホモダイマーの投
与量は、当業者が過度の実験をすることなく決定するこ
とができるが、その予想投与量は0.1 から２mg／kg体重
である。本発明は、本発明のｐ40ホモダイマーを含有す
る医薬組成物を製造する方法にも関わるものである。

【００３３】ＩＬ-12 ｐ40ホモダイマーは、病理学的免
疫応答において、ＩＬ-12 の生物学的活性をブロックす
るためのＩＬ-12 アンタゴニストとして、有用である。
Invitro およびin vivo での両方の研究による現在ま
での知見によれば、細胞性免疫応答を促進するＴｈ１型
ヘルパーＴ細胞の発生（22，24）、成熟Ｔおよび／また
はＮＫ細胞によるガンマインターフェロン生産の誘導
（25）、および特異的細胞溶解性Ｔリンパ球の応答の促
進（26）において、ＩＬ-12 が重要な役割を果たしてい
るとが示唆されている。Ｔｈ１細胞の過剰活性（27，2
8）および／またはガンマインターフェロンの過剰生産
（27−31）がある種の自己免疫疾患および敗血症性ショ
ックの病因に関連していると考えられることから、ＩＬ
-12 ｐ40ホモダイマーは、リューマチ性および他の炎症
性関節炎、Ｉ型糖尿病、多発硬化症、全身性エリテマト
ーデス、敗血症性ショックその他などの疾患の治療に有
用であることがわかる。さらに、ＩＬ-12 ｐ40ホモダイ
マーは同種移植の拒絶反応および移植片対宿主病を予防
または遅延させるのにも有用である。ＩＬ-12 ｐ40ホモ
ダイマーを病的免疫応答の予防または拮抗に使用するに
あたっては、ＩＬ-2受容体や可溶性ＴＮＦ受容体に対す
る抗体またはＩＬ-1受容体アンタゴニストやそれに類す
る、別のサイトカインアンタゴニストと併用することが
できる。

【００３４】

【実施例】材料および方法細胞系ヒトＴ細胞系ＫＩＴ225 （14）から誘導された、ＩＬ-2
依存性サブクローンの１つである、ＫＩＴ225 ／Ｋ６が
ＩＬ-12 受容体を発現することは、すでにわかっている
（15）。ＫＩＴ225 ／Ｋ６細胞を、２mMＬ−グルタミン
（ Sigma社、ミズーリ州、セントルイス）、100 Ｕ／ml
ペニシリン、100 μg／mlストレプトマイシン（Gibco
社、ニューヨーク州グランドアイランド）、15％ＦＣＳ
（JRH Biosciences 社、カンザス州レネクサ）および10
0 Ｕ／mlヒトｒＩＬ-2（Hoffmann- La Roche社、ニュー
ジャージー州ナットレー）を補充したＲＰＭＩ1640培地
(BioWhittaker社、メリーランド州ウォーカーズビル）
中で培養した。ＣＯＳ（ATCC CRL 1650 または1651）細
胞を、4500mg／ｌグルコース、２mMＬ−グルタミン、50
Ｕ／mlペニシリン、50μg／mlストレプトマイシンおよ
び10％ＦＣＳ（JRH Biosciences 社）を加えたＤＭＥＭ
（Gibco 社）中で培養した。

【００３５】ＩＬ-12 サブユニットの発現ＣＯＳ発現のためのＩＬ-12 発現構築物を、ヒトポリペ
プチド鎖延長因子１α（ＥＦ-1α）染色体遺伝子のプロ
モーターを含んでいるｐＥＦ−ＢＯＳベクター中で構築
した（16ａ）。文献（６，13）にしたがって、サブユニ
ットのｃＤＮＡコード配列の始めと終わりに相補的なプ
ライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
よって生成させた、ヒトまたはマウスのｐ40またはｐ35
ｃＤＮＡの全コード領域を含むｃＤＮＡ断片を、平滑末
端連結により、ｐＥＦ−ＢＯＳベクター中のＸｂａ１ク
ローニング部位に、それぞれサブクローン化した（1
7）。連結生成物をＥ．coli株ＤＨ-5アルファ（BRL-Gib
co 社）中に形質転換し、形成されたコロニーについ
て、ｐＥＦ−ＢＯＳプロモーター中の正プライマーおよ
びサブユニットのコード配列中の逆プライマーを使用し
て、正しい挿入方向のものを、ＰＣＲによりスクリーニ
ングした。陽性クローンを選択し、適当なＥ．coli株、
たとえばＭＣ1161中で増幅させた。プラスミドＤＮＡを
ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット（Qiagen社、カリフォル
ニア州チャッツワース）を使用して、あらかじめ調製
し、ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン法（17）を使用
して、ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトした。濃度２μ
g／mlのこのＤＮＡを、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変
必須培地）中の10％ニュートリドーマ (Ｎｕｔｒｉｄｏ
ｍａ) −ＳＰ（Boehringer Mannheim 社、インジアナ州
インジアナポリス）、0.5mg／mlＤＥＡＥデキストラン
および0.05mg／mlクロロキンと混合し、16時間前に接種
したＣＯＳ細胞に加えた。2.5 〜３時間インキュベート
した後、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地中の10％ＤＭＳＯで
３分間処理し、ＤＭＥＭ培地で洗浄し、つづいてＤＭＥ
Ｍ／10％ＦＣＳ培地中で培養した。72時間後、トランス
フェクトＣＯＳ細胞の培養物から上清を採取した。ｐ40
およびｐ35サブユニットの同時発現を、この２つのプラ
スミドＤＮＡを比１：１（Ｗ／Ｗ）でトランスフェクシ
ョン用試薬中に混合することにより、実施した。ｐＥＦ
−ＢＯＳ野生型プラスミドＤＮＡでトランスフェクトし
たＣＯＳ培養物から取り出した上清を対照として使用し
た。

【００３６】上記と同じ手順にしたがって、バキュロウ
ィルス系での発現のためのヒトＩＬ-12 ｐ40構築物をｐ
ＡＣＤＺ−１ベクター（16ｂ，16ｃ）中のＢａｍＨ１部
位に構築した。ＳＦ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ1711）に
野生型バキュロウィルスＤＮＡとｐ40発現プラスミドｐ
ＡＣＤＺ−１を同時トランスフェクションすることによ
って、ｐ40鎖を発現する組換えバキュロウィルスを生成
させた。ヒトＩＬ-12ｐ40サブユニットを発現する組換
えバキュロウィルス１個を単離するのに、マイロタイタ
ープレートでの限界希釈クローニング法を使用した。

【００３７】ＩＬ-12 受容体の結合と増殖の検定ＣＯＳ発現ＩＬ-12 分子のＩＬ-12 受容体担持細胞への
結合を、Desai らの記載（10）に基本的に基づいたＦＡ
ＣＳ（蛍光活性化細胞選別）検定法によって測定した。
簡単に述べると、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（リン酸緩衝
液）／２％ＦＣＳ／0.05％アジ化ナトリウム）25μl中
に懸濁した１ｘ10⁶個のＫＩＴ225/Ｋ６細胞をＩＬ-12
調製物（25μl）とともに室温で40分間インキュベート
し、次にビオチニル化ｍＡｂ８Ｅ３、非阻害性抗ヒトＩ
Ｌ-12 ｐ40特異的モノクローナル抗体（５μg／ml，50
μl）（11）と30分間、さらにストレプトアビジン−Ｐ
Ｅ（1.5μg／ml,50μl；FisherBiotech 社、ペンシルバ
ニア州ピッツバーグ）と20分間インキュベートした。染
色した細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Be
cton Dickinson社）で検定した。細胞添加前に、ＩＬ-1
2 調製物（0.5μg／ml）をラット阻害性抗ヒトＩＬ-12
モノクローナル抗体の４Ａ１（25μg／ml）とプレイン
キュベートすることによって、結合特異性を測定した。
対照試料を正常ラットＩｇＧ（25μg／ml）とインキュ
ベートした。ＣＯＳ発現ＩＬ-12 分子の受容体結合特性
も、基本的に記載された（11）ように実施した
［¹²⁵Ｉ］ＩＬ-12競合受容体結合検定法によって測定し
た。培養上清または精製ＩＬ-12 の連続希釈物の0.1ml
アリコートを、［¹²⁵Ｉ］ＩＬ-12(２ｘ10⁶cpm）を含有
する結合用緩衝液（ＲＰＭＩ-1640 ，５％ＦＣＳ，25mM
ＨＥＰＥＳ, ｐＨ7.4 ）の0.05mlアリコートと混合し
た。混合物を活性化芽球(１ｘ10⁷細胞／ml）0.1ml に加
え、25℃の撹拌水浴中で1.5 時間インキュベートした。
この検定では20μg／mlの非標識ＩＬ-12 を入れること
によって、非特異的結合を測定した。インキュベーショ
ンを２回反復実施した。２回反復の検定試料の0.1ml ア
リコートをシリコーン油0.1ml を通して、10,000ｘｇで
90秒間遠心分離することによって、遊離［¹² ⁵Ｉ］ＩＬ-
12 から細胞結合放射能を分離した。細胞ペレットを含
有する先端部を切り取り、ガンマ計数管で細胞結合放射
能を測定した。

【００３８】ＣＯＳ発現ＩＬ-12 分子の生物学的活性
は、記載された（４，13）とおりに、４日ＰＨＡ活性化
ヒトリンパ芽球を使用した増殖検定によって評価した。

【００３９】抗ＩＬ−１２抗体およびサンドイッチ酵素
免疫検定法（ＥＩＡ）ＣＨＯ細胞において発現させ、精製したヒトｒＩＬ−１
２で免疫した動物から、ヤギおよびウサギ抗ヒトＩＬ−
１２抗血清を得た（３５）。プロテインＧ−セファロー
ス（Pharmacia 社、ニュージャージー州ピスカタウェ
ー）アフィニティークロマトグラフィーによりメーカー
の手順に従って１００ｍｌの抗血清からＩｇＧ画分を単
離した。該ＩｇＧ画分から抗ヒトＩＬ−１２抗体をヒト
ＩＬ−１２結合ヒドラジド AvidGel F（BioProbe Inter
national社）イムノアフィニティーカラム（１．５×
２．０ｃｍ、０．５５ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂）で精
製した。Biotin X-NHS（Calbiochem社、カリフォルニア
州サンディエゴ）による該抗体のビオチニル化を記載の
とおりに行った（１８）。モノクローナル抗体４Ａ１お
よび８Ｅ３はヒトＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに特
異的なラット抗体である（EP 0 433 827,11 ）。

【００４０】ＩＬ−１２サンドイッチＥＩＡは、捕捉抗
体としてｍＡｂ４Ａ１を、検出抗体としてペルオキシダ
ーゼ結合８Ｅ３を用いて、以前に記載されたとおりに行
った（１１）。このアッセイではＩＬ−１２ヘテロダイ
マーとｐ４０サブユニットを検出できるが、ｐ３５サブ
ユニットは検出できない。それ故、ｐ４０とｐ３５の両
方を検出するために、ポリクローナル抗体を用いる第２
のＩＬ−１２サンドイッチＥＩＡを開発した。このアッ
セイでは、９６ウェルＥＩＡプレート（Nunc MaxiSorp
社、カリフォルニア州サザンオークス）にアフィニティ
ー精製したヤギ抗ヒトＩＬ−１２抗体（２μｇ／ｍｌ、
５０μｌ／ウェル）を４℃で一夜被覆し、ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）中の１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロック
した。ＩＬ−１２および培養上清の連続希釈液を該プレ
ートに加え、室温にて２．５時間インキュベートした。
その後、該プレートをビオチニル化したアフィニティー
精製ウサギ抗ヒトＩＬ−１２抗体（５００ｎｇ／ｍｌ、
５０μｌ／ウェル）と、続いてペルオキシダーゼ結合ス
トレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル、
Sigma 社、ミズーリ州セントルイス）と共にインキュベ
ートした。１００μｌの１ｍＭＡＢＴＳ（２，２’−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）
／０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂を用いて発色させ、４０５
ｎｍでの吸光度を Vmax Kinetic Microplate読み取り機
（Molecular Devices 社、カリフォルニア州パロアル
ト）により測定した。すべての値はＩＬ−１２標準曲線
に基づくものであり、モノマーまたはダイマーの分子量
の差についての補正は行わなかった。

【００４１】免疫沈降ＣＯＳ発現させたＩＬ−１２サブユニットおよびヘテロ
ダイマーの免疫沈降は記載のとおりに行った（１７）。
簡単に述べると、トランスフェクションを行ったＣＯＳ
培養物からの０．５ｍｌの上清を、ヤギ抗ＩＬ−１２抗
血清から単離した５μｇのＩｇＧタンパク質と共に回転
ミキサー上で４℃、一夜インキュベートした。免疫複合
体をプロテインＧ−セファロース（５０％懸濁液、１０
μｌ、Pharmacia 社）に４℃で２時間吸着させ、ビーズ
を１ｍｌのNET-Gel バッファー〔50mM Tris-HCl, pH7.
5, 150mM NaCl, 0.1%(v/v) ノニデットP-40, 1mM EDTA,
0.25%(w/v)ゼラチンおよび0.02%(w/v)アジ化ナトリウ
ム〕で２回、１ｍｌの0.1%(v/v) ノニデットP-40含有10
mM Tris-HCl(pH7.5)で１回洗浄した。ビーズを還元（１
０％２−ＭＥ）または非還元ＳＤＳサンプルバッファー
中９５℃で３分間加熱することにより、結合したタンパ
ク質をビーズから解離させた。

【００４２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッ
ト法ＳＤＳ−ＰＡＧＥは Laemmliの方法（１９）に従って行
った。ウエスタンブロット法はタンパク質をニトロセル
ロース膜（０．２μ）（ＭＳＩ社、マサチューセッツ州
ウエストボーロ）に電気泳動移行させることにより実施
した。移行させた膜は５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＰ
ＢＳＴバッファー（0.05%v/v Tween-20含有ＰＢＳ）中
でのインキュベーションによりブロックし、次いで抗Ｉ
Ｌ−１２ウサギ抗血清（１：５００希釈）で釣り上げ
た。ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、該膜をペル
オキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１００
０希釈）（Jackson Immuno Research 社、ペンシルバニ
ア州ウエストグローブ）と共に室温でインキュベートし
た。０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂を含有する２０ｍＭ Tri
s-HCl バッファー（ｐＨ７．５）中の４−クロロ−１−
ナフトール（BioRad社、カリフォルニア州リッチモン
ド）を用いて発色させた。

【００４３】ＣＯＳ発現させたｐ４０の精製約３μｇ／ｍｌのヒト組換えｐ４０（ｒｐ４０）を含有
する馴化培地１リットルを、モノクローナル抗体４Ａ１
結合ＮｕＧｅｌ（ＮＨＳ）イムノアフィニティーカラム
（２．５×１０ｃｍ、ゲル１ｍｌあたり１．６ｍｇの抗
体を含む）（３５）に２ｍｌ／分の流速で加え、２８０
ｎｍでモニターした吸光度が０．０１より低くなるまで
０．５ＭＮａＣｌおよび０．２％ Tween 20 を含有す
るＰＢＳで該カラムを十分に洗浄した。その後、結合し
たタンパク質を１００ｍＭグリシン／１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ２．８）により２ｍｌ／分の流速で溶出し、
２０ｍｌ画分を集め、すぐに１／１０容量の１Ｍ Tris-
HCl（ｐＨ８．０）で中和した。ＥＩＡ陽性画分をプー
ルし、ＰＢＳに対して４℃で一夜透析し、ＹＭ１０メン
ブラン（Amicon社、マサチューセッツ州ベバリー）を用
いた限外濾過により５ｍｌに濃縮し、そしてダルベッコ
ＰＢＳバッファーで平衡化したHiLoad Superdex 75（Ph
armacia 社）カラム（１．６×６０ｃｍ）にかけた。該
カラムは同一のバッファーを用いて１ｍｌ／分の流速で
溶出し、１ｍｌ画分を集めた。それぞれの画分からのタ
ンパク質をＥＩＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン
ブロット法で検定した。

【００４４】脱グリコシル化５００ｎｇの純粋なヒトＩＬ−１２または免疫沈降させ
たｒｐ４０タンパク質を、１％２−ＭＥ含有または不含
の０．２５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）、０．５％
ＳＤＳ中９５℃で５分間加熱することにより変性した。
サンプルを室温へ冷却し、１％ノニデット P-40 、２０
ｍＭＥＤＴＡに調整し、次いで０．１ＵのＮ−デグリ
コシダーゼＦ（Boehringer Mannheim 社、インジアナ州
インジアナポリス）を用いて３７℃で２４時間処理し
た。脱グリコシル化されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびウエスタンブロット法で調べた。

【００４５】ＣＯＳ発現させたｐ４０のアミノ末端配列イムノアフィニティー精製したｒｐ４０タンパク質を１
０％非還元ＳＤＳゲル上で分離し、Immobilon^TM PVDF
メンブラン（Millipore 社、マサチューセッツ州ベッド
フォード）に電気泳動移行させた。クーマシーブルー染
色により同定された約８０および約４０ｋＤａのバンド
は、以前に記載された（２０）とおりにフェニルチオヒ
ダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体のオンライン解析
を備えたApplied Biosystems 470A 型気相シークエンサ
ーで自動エドマン分解にかけた。

【００４６】

【表１】表ＩＣＯＳ発現させたヒトｐ４０モノマー、ｐ８０ホモダイマーおよび天然ヒトＩＬ−１２ｐ４０サブユニットのアミノ末端配列 ─────────────────────────────────── タンパク質配列 ─────────────────────────────────── 天然ヒトｐ４０ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶ^a（配列番号：２）ｒｐ４０ダイマーＩｗ^bＥＬＫＫＤＶＹＶ（配列番号：２）ｒｐ４０モノマー（バンド１）ＩｗＥＬＫＫＤＶＹＶ（配列番号：２）ｒｐ４０モノマー（バンド２）ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶ（配列番号：２） ─────────────────────────────────── a. Podlaski et al., 1991 から b. 小文字は２ｐｍｏｌ未満の回収を示したシグナルを
表す。

【００４７】ヒトＩＬ−１２サブユニットの発現および
特性決定ヒトＩＬ−１２サブユニットｐ３５およびｐ４０、また
はヒトＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーは、そ
れぞれのサブユニットｃＤＮＡを別個にＣＯＳ細胞に導
入するか、または両方のｃＤＮＡを１：１（ｗ：ｗ）の
比でＣＯＳ細胞に同時に導入することにより発現させ
た。組換えタンパク質の分泌は２つの異なるＥＩＡによ
り評価した。ｐ４０特異的モノクローナル抗体に基づい
たＥＩＡはｐ４０サブユニットとｐ３５／ｐ４０ヘテロ
ダイマーを検出することができた。ＩＬ−１２特異的ポ
リクローナルＥＩＡはｐ３５サブユニットも検出可能で
あった。標品としてヒトＩＬ−１２を使うと、馴化培地
中のｒｐ４０およびｒｐ３５／ｒｐ４０タンパク質の濃
度範囲は０．５〜３．０μｇ／ｍｌであったが、ｒｐ３
５のみの発現はおよそ０．２μｇ／ｍｌであった。ｐ３
５の発現が低いのか、ｐ３５を検出するポリクローナル
ＥＩＡの感度が低いのかは不明のままである。

【００４８】ＣＯＳ発現させたヒトＩＬ−１２組換えタ
ンパク質は、初めに、ＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球への
〔¹²⁵I〕ヒトＩＬ−１２の結合を阻止するその能力につ
いて調べた。１：２希釈のｒｐ４０上清は３回の独立し
た実験において〔¹²⁵I〕ヒトＩＬ−１２の結合を３０〜
４０％阻止したが、ｒｐ３５上清は不活性であった。さ
らに、ＩＬ−１２受容体へのｒｐ４０の結合は、ＩＬ−
１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）を構成的に発現するＫＩＴ
２２５／Ｋ６細胞を用いたフローサイトメトリーにより
特徴づけられた（１５）。ＫＩＴ２２５／Ｋ６へのヒト
ＩＬ−１２およびｒｐ４０の用量依存的結合が２．５〜
５００ｎｇ／ｍｌの範囲で見られた（図１）。この結合
の特異性は、ＩＬ−１２またはｒｐ４０と抑制性ラット
抗ヒトｐ４０モノクローナル抗体４Ａ１とのプレインキ
ュベーションにより結合が８０％以上阻止されることに
よって実証された（図２）。正常なラットＩｇＧはＩＬ
−１２またはｒｐ４０の結合にまったく影響を及ぼさな
かった。

【００４９】ＣＯＳ発現させたＩＬ−１２サブユニット
タンパク質を含有する馴化培地はヒトＰＨＡ−芽球増殖
検定で評価した（図３）。ｒｐ３５／ｒｐ４０含有培地
は８ｎｇ／ｍｌの見かけＥＣ₅₀でもって用量依存的にＴ
細胞増殖を支持した。ｒｐ４０上清はｒｐ３５／ｒｐ４
０上清と同じ濃度で増殖を誘導しなかった。

【００５０】ｒｐ４０の４０ｋＤおよび８０ｋＤ種の特
性決定組換えヒトＩＬ−１２サブユニットを抗ヒトＩＬ−１２
ヤギ抗血清により免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びウエスタンブロット分析により特性決定を行った。ｐ
４０ｃＤＮＡのみを導入したＣＯＳ細胞により発現され
たｒｐ４０の分析から、非還元条件下において７０〜８
５ｋＤおよび３５〜４５ｋＤの均一でない分子量を有す
る２組の多重バンドが明らかになった（図４のＡ）。還
元条件下では、およそ３８〜４９ｋＤａのところに近接
したバンドが３本だけ確認され、８０ｋＤタンパク質は
ジスルフィド結合したｒｐ４０ホモダイマーであること
が示唆された（図４のＢ）。Ｎ−デグリコシダーゼＦで
ｒｐ４０免疫沈降物を処理すると、非還元条件下では両
方の分子量がより小さい産物へとシフトし（図５の
Ａ）、還元した３本のバンドは脱グリコシル化されたヒ
トＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに類似した単一の３
６ｋＤａ産物に変換された（１２）。このことから、Ｃ
ＯＳ細胞により発現されたｒｐ４０の多重バンドはグリ
コシル化の不均質性によるものであることが検証され
た。

【００５１】これに対して、ｒｐ３５タンパク質の免疫
沈降は、還元条件下で３５ｋＤの分子量を有するただ１
本のバンドを示した（図４のＢ）。非還元条件下では、
１組の弱く染色されたバンドが６０〜７０ｋＤのところ
に存在し、これによりｒｐ３５も部分的にダイマーを形
成しうることが示唆される。しかし、ポリクローナルヤ
ギ抗ＩＬ−１２抗体はｒｐ３５タンパク質を十分には認
識しなかった（図４のＡ）。ｐ３５とｐ４０の同時発現
は、各サブユニットを別個に発現させたときに見られた
バンドが入り混じったパターンをもたらした（図４）。

【００５２】２つのｒｐ４０種の同一性を確かめるため
に、ｒｐ４０タンパク質を４Ａ１イムノアフィニティー
クロマトグラフィーで部分的に精製した。１５０ｍＭの
ＮａＣｌを含有する１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．８）
で溶出することによりＥＩＡ陽性物質の６０％だけを回
収した。その後、４Ａ１アフィニティー精製したタンパ
ク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブラン
に電気泳動移行させ、そしてアミノ酸微量配列決定法に
付した。８０ｋＤ付近の１本の幅広バンドと３５〜４０
ｋＤの２本のバンドは、ＮＣ−３７細胞（４，１２）か
ら精製した天然ヒトＩＬ−１２ｐ４０のアミノ末端配列
と同じアミノ末端配列を与えた（表１）。ｒｐ４０種と
同一であるとするｐ３５配列の形跡は全くなかった。こ
の結果から、８０ｋＤタンパク質はｐ４０ホモダイマー
であることが確かめられた。

【００５３】イムノアフィニティー精製したｐ４０タン
パク質はスーパーデックス (Superdex)-７５ゲル濾過ク
ロマトグラフィーによりさらに分画化した。２つのＥＩ
Ａ陽性タンパク質のピークが８０ｋＤと４０ｋＤに対応
する分子量のところに認められた（図６のＡ）。それぞ
れの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
分析によりモノマーｒｐ４０からのダイマーの分離を確
認した（図６のＢ）。モノマーとダイマーの比は実験ご
とに変化したが、平均して、ＣＯＳ発現させたｒｐ４０
のおよそ３０％がｐ４０ホモダイマーであった。

【００５４】スーパーデックス７５カラム画分はＦＡＣ
Ｓ分析によりＫＩＴ２２５細胞への結合について試験し
た。結合活性は８０ｋＤａｐ４０−ＥＩＡ陽性タンパク
質とのみ関連していた（図６）。８０ｋＤと４０ｋＤの
ピーク画分を別々にプールし、濃縮し、そして競合的放
射性リガンド受容体結合検定法で調べた（図７）。８０
ｋＤタンパク質のプールはヒトＩＬ−１２ヘテロダイマ
ーのＩＣ₅₀（２０ｎｇ／ｍｌ）と同様の８０ｎｇ／ｍｌ
のＩＣ₅₀でＰＨＡ−芽球への〔¹²⁵I〕ヒトＩＬ−１２結
合を阻止した。しかしながら、８０ｋＤホモダイマーに
よる競合曲線の勾配はＩＬ−１２ヘテロダイマーのそれ
と相違しており、受容体との異なる結合相互作用を示唆
している。４０ｋＤタンパク質のプールは、おそらく少
量のｐ４０ホモダイマーの混入によると思われるが、約
１００倍高いＩＣ₅₀でもって〔¹² ⁵I〕ヒトＩＬ−１２結
合を阻止した（図６のＢ）。

【００５５】ＰＨＡ−芽球の増殖を支持するｒｐ４０モ
ノマーおよびダイマーの能力も調べた（図８）。いずれ
のｒｐ４０種においても、５０％最大応答を引き出すの
に要するヒトＩＬ−１２の濃度よりも10,000倍高い濃度
でさえ増殖応答が観察されなかった。ｒｐ４０ダイマー
については、ＰＨＡ−芽球のＩＬ−１２依存性増殖を中
和する能力を検討した。様々な濃度の８０ｋＤタンパク
質を０．１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２と混合し、ＰＨ
Ａ−芽球に加えた。ＰＨＡ−芽球のＩＬ−１２誘導増殖
が用量に依存して阻害され、そのＩＣ₅₀は１μｇ／ｍｌ
であった（図９）。

【００５６】個々のサブユニットの機能的役割を解明
し、かつ生物学的活性および結合活性を仲介するエピト
ープの位置を決定するために、それぞれのサブユニット
を単独でまたは互いと組み合わせてＣＯＳ細胞に発現さ
せ、発現タンパク質を結合検定およびバイオアッセイ
で、あるいはウエスタンブロット分析で調べた。ｒｐ３
５タンパク質は結合検定とバイオアッセイにおいて１０
０ｎｇ／ｍｌほどの高濃度でも不活性であった。ところ
が、ｒｐ４０タンパク質は生物学的活性を示すことなく
結合活性を示し、これは再現性があった。ｐ４０ｃＤＮ
Ａのみを導入したＣＯＳ細胞の培養物から得た馴化培地
の分析から、かかる培地は抗ｐ４０抗体と反応するモノ
マーｐ４０と８０ｋＤ分子の両方を含むことが確認され
た。イムノアフィニティークロマトグラフィーとＨＰＬ
Ｃゲル透過クロマトグラフィーによるｒｐ４０の部分精
製は、４０ｋＤタンパク質ではなく、８０ｋＤタンパク
質がＩＬ−１２Ｒと結合することを示した。

【００５７】この８０ｋＤタンパク質がｐ４０のホモダ
イマーではなく、１つのＩＬ−１２ｐ４０サブユニット
と第２の３５〜４０ｋＤの外因性ＣＯＳ由来タンパク質
とからなるヘテロダイマーであるかもしれないという可
能性を検討した。特に、多くの細胞系が構成的にＩＬ−
１２ｐ３５のｍＲＮＡを発現するという報告（２１）
は、この８０ｋＤタンパク質がＣＯＳ由来のＩＬ−１２
ｐ３５と会合したヒトＩＬ−１２ｐ４０であり得る可能
性を提起した。ｐ３５特異的抗体を用いるウエスタンブ
ロット分析および脱グリコシル化実験（図５）は、８０
ｋＤタンパク質がｐ４０モノマーに還元されるだろうと
いう見解を支持した。良好な結合活性にもかかわらず生
物学的活性が消失していることから、（ヒト細胞へのサ
ルＩＬ−１２の活性に種制限がないと仮定して）第２の
タンパク質はＣＯＳ由来のｐ３５ＩＬ−１２サブユニッ
トではないと予想された。また、バキュロウイルス系で
のｐ４０の発現は受容体結合能を有するｐ４０の生物学
的に不活性な８０ｋＤ形態をもたらした。昆虫細胞がＩ
Ｌ−１２様ｐ３５タンパク質を産生する可能性はないよ
うだ。最も重要なことは、ｐ４０ホモダイマーと８０ｋ
Ｄタンパク質との同一性が該タンパク質のアミノ酸微量
配列決定（ＩＬ−１２ｐ４０サブユニットに一致する単
一のＮ末端配列を明らかにした）により確認されたこと
である。

【００５８】競合的結合検定において、ｐ４０ホモダイ
マーはヘテロダイマーのＩＬ−１２とほとんど同じくら
い強くＩＬ−１２Ｒに結合することがわかり、ＩＬ−１
２の重要な結合エピトープはｐ４０サブユニットに存在
することが示唆された。ヘテロダイマーとホモダイマー
のＩＣ₅₀値はそれぞれ２０および８０ｎｇ／ｍｌで類似
していたが、競合曲線の勾配は異なっていた。このこと
は２つのリガンドと受容体との相互作用に差があること
を示唆している。ｐ４０の結合エピトープはコンホメー
ションが関係し、これはｐ３５または第２のｐ４０サブ
ユニットとの会合により誘導される可能性が最も強い。

【００５９】ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットは、活性
化されたＢリンパ芽球様細胞系とＩＬ−１２を産生する
ように刺激されたヒトＰＢＭＣの両方によってヘテロダ
イマーのＩＬ−１２より多量に産生されることがこれま
でに報告されている（１２，２３）。ｐ４０／ｐ３５ヘ
テロダイマーを発現する細胞ではｐ４０ホモダイマーが
形成される可能性がある。

【００６０】結合およびシグナル発生におけるＩＬ−１
２サブユニットの役割を検証したことに基づいて、ＩＬ
−１２がその受容体に結合する模式図を図１０に示す。
ｐ４０サブユニットは受容体結合エピトープを含むが、
これはｐ４０が第２タンパク質（すなわち、ｐ３５また
はもう１つのｐ４０分子）と会合しているときだけ機能
する。両方のダイマー分子はＩＬ−１２Ｒと特異的に結
合するが、ｐ３５を含むダイマーだけが細胞のシグナル
変換を仲介するアゴニストとして作用する（図１０の
Ａ）。これに対して、ｐ４０／ｐ４０ダイマーはＩＬ−
１２仲介応答を抑制するアンタゴニストとして作動する
（図１０のＢ）。

【００６１】文献 (1) Gately, M.K., B.B. Desai, A.G. Wolitzky, P.M.
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学的作用を示すヘテロダイマーサイトカインであるナチ
ュラルキラー細胞刺激因子のｃＤＮＡクローニング。

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るためには２つの異なる遺伝子の同時発現が必要であ
る。

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クローナル抗体は活性化リンパ芽球上の受容体結合およ
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【００７２】(12) Podlaski, F.I., V.B. Nanduri, J.
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（インターロイキン１２）の産生。

【００８６】(24) Manetti, R., P. Parronchi, M.G. G
iudizi, M.P. Piccinni, E. Maggi, G. Trinchieri, an
d S. Romagnani, J. Exp. Med. 177:1199 (1993). ナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２
〔ＩＬ−１２〕）はＴヘルパー１型（Ｔｈ１）特異的免
疫反応を誘発し、ＩＬ−４産生Ｔｈ細胞の発生を抑制す
る。

【００８７】(25) D'Andrea, A., M. Rengaraju, N.M.
Valiante, J. Chehimi, M. Kubin, M.Aste, S.H. Chan,
M. Kobayashi, D. Young, E. Nickbarg, R. Chizzonit
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uinn, and R. Chizzonite, Cell Immunol. 143:127 (19
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答の調節。

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【００９０】(28) Schlaak, J., E. Hermann, M. Ringh
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lde, and B. Fleischer, Eur. J. Immunol. 22:2771 (1
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滑液中で主要部を占めるＴｈ１型Ｔ細胞。

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のインターフェロンγおよびインターロイキン６の重要
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【００９３】(31) Doherty, G.M., J.R. Lange, H.N. L
angstein, H.R. Alexander, C.M. Buresh, and J.A. No
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【００９４】(32) Harlow, E. and D. Lane, 1988, Ant
ibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor La
boratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

【００９５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３０６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【００９６】

【化１】

【００９７】

【００９８】配列番号：２配列の長さ：１０アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【００９９】

【化２】

【図面の簡単な説明】

【図１】フローサイトメトリーにより分析したヒトＩＬ
−１２およびＣＯＳ発現ｒｐ４０のＫＩＴ２２５／Ｋ６
細胞への用量依存的結合を示す図である。

【図２】ＦＡＣＳ分析によって検出したｒｐ４０のＫＩ
Ｔ２２５／Ｋ６細胞への結合特異性を示す図である。

【図３】別々に発現させたｒｐ４０とｒｐ３５、または
同時に発現させたｒｐ３５／ｒｐ４０を含有する馴化培
地に応答したＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球の増殖を示す
図である。

【図４】ＣＯＳ発現させたヒトｒｐ３５、ｒｐ４０およ
びｒｐ３５／ｒｐ４０ヘテロダイマータンパク質のウエ
スタンブロット分析を示す図である。

【図５】脱グリコシル化したＣＯＳ発現ヒトｒｐ４０タ
ンパク質のイムノブロット分析を示す図である。

【図６】ｒｐ４０種のＨＰＬＣ分画化を示す図である。

【図７】ＣＯＳ発現ｒｐ４０タンパク質による〔¹²⁵I〕
ヒトＩＬ−１２のヒトＰＨＡ−芽球結合に対する阻害を
示す図である。

【図８】ＣＯＳ発現ヒトｐ４０ホモダイマーがヒトＰＨ
Ａ−芽球の増殖を誘導しないことを示す図である。

【図９】ＣＯＳ発現ヒトｐ４０ホモダイマーによるＩＬ
−１２の生物学的活性の阻害を示す図である。

【図10】ＩＬ−１２ｐ３５／ｐ４０ヘテロダイマーおよ
びｐ４０／ｐ４０ホモダイマーのＩＬ−１２受容体への
結合およびシグナル変換を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＪＡＢＮＡＤＰＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｋ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ 8314−4ＣＡＢＮＡＤＰ 9050−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 8412−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者ジョンハキミアメリカ合衆国 10583 ニューヨーク州スカースデイル，カントリーリッジロード 210 (72)発明者ピングリングアメリカ合衆国 07110 ニュージャージー州ナットレイ，チェスナットストリート 293

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン−１２のｐ４０ホモダ
イマー。
【請求項２】細胞の増殖を媒介することなくインター
ロイキン−１２受容体に結合することができる、請求項
１記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項３】分子量が約８０ｋＤである、請求項１ま
たは２記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項４】２つのｐ４０サブユニットが少なくとも
１つのジスルフィド結合で一緒に結合されている、請求
項３記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項５】ｐ４０サブユニットが配列番号：１であ
る、請求項４記載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項６】医薬として有効な量の、請求項１〜５の
いずれか１つに記載したインターロイキン−１２のｐ４
０ホモダイマー、および製剤上許容される担体を含有す
る医薬組成物。
【請求項７】１種またはそれ以上の他のサイトカイン
拮抗薬を含有する、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】インターロイキン−１２の生物学的活性
を阻止する医薬組成物を調製するための請求項１〜５の
いずれか１つに記載したｐ４０ホモダイマーの使用法。
【請求項９】病的免疫反応および敗血症性ショックの
予防および治療用の医薬組成物を調製するための請求項
１〜５のいずれか１つに記載したｐ４０ホモダイマーの
使用法。
【請求項10】炎症性関節炎、Ｉ型真性糖尿病、多発性
硬化症および全身性エリテマトーデスの治療用医薬組成
物を調製するための請求項１〜５のいずれか１つに記載
したｐ４０ホモダイマーの使用法。
【請求項11】同種移植反応および移植片対宿主病を予
防するおよび／または遅らせる医薬組成物を調製するた
めの請求項１〜５のいずれか１つに記載したｐ４０ホモ
ダイマーの使用法。
【請求項12】請求項１〜５のいずれか１つに記載した
ｐ４０ホモダイマーの生産方法であって、ａ．インターロイキン−１２のｐ４０サブユニットをコ
ードするクローン化遺伝子を含む発現ベクターで細胞を
形質転換し；ｂ．該形質転換細胞内でｐ４０ホモダイマータンパク質
を発現させ；そしてｃ．該ｐ４０ホモダイマーを回収し、所望により、これ
をその機能的誘導体に変換する；ことを特徴とする方
法。
【請求項13】前記の細胞が真核細胞または原核細胞、
好ましくはＳＦ９またはＣＯＳ細胞である、請求項12記
載の方法。
【請求項14】前記の発現ベクターがｐＥＦ−ＢＯＳま
たはｐＡＣＤ７−１から誘導される、請求項12または13
記載の方法。
【請求項15】インターロイキン−１２のｐ４０ホモダ
イマーをイムノアフィニティーおよびゲル濾過クロマト
グラフィーにより回収する、請求項12〜14のいずれか１
つに記載の方法。
【請求項16】請求項12〜15のいずれか１つに記載した
方法により調製された請求項１〜５のいずれか１つに記
載のｐ４０ホモダイマー。
【請求項17】インターロイキン−１２受容体のアンタ
ゴニストとしての請求項１〜５のいずれか１つに記載の
ｐ４０ホモダイマー。