JPH07500735A

JPH07500735A - メッセンジャーｒｎａの同定、単離およびクローニング

Info

Publication number: JPH07500735A
Application number: JP5516011A
Authority: JP
Inventors: リャン，ペン; パーディー，アーサー・ビー
Original assignee: ダナ−ファーバー・キャンサー・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-03-11
Filing date: 1993-03-11
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2014-01-06
Also published as: DE69332665D1; EP0592626A4; US5599672A; EP0592626B1; DE69332665T2; US5965409A; CA2102784A1; WO1993018176A1; EP0592626A1; US5665547A; JP2843675B2; ATE231920T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】メツセンシャーＲＮＡの同定、単離およびクローニング発明の背景本出願は１９９２年３月１１日に出願された係属中の米国出願第０７／８５０゜３４３号の一部係属出願である。

本発明は、個々のｍＲＮＡの検出法およびクローニング法に関する。

細胞中の遺伝子の活性はそれらのｍＲＮＡおよび蛋白質種の種類および量に反映される。遺伝子発現は、加齢、発育、分化、代謝生産、セルサイクルの進行、および感染疾患または遺伝疾患および他の疾患の状態のような過程において極めて重大である。発現されたｍＲＮＡの同定はそれらの分子機構の解明、および上記過程の応用に価値があるであろう。

鴫乳動物細胞は約１５．０００の異なるｍＲＮＡ配列を含むが、しかしながら、各ｍＲＮＡ配列は細胞内で異なった頻度で存在する。通常、３つのレベルのうちの一つで発現する。一部の［豊富なＪｍＲＮＡは細胞あたり約１０．０００コピー存在し、約３，０００−約４．０００の［中間体ＪｍＲＮＡは細胞あたり約３００〜５００コピー存在し、そして約１１．０００の「あまり豊富でない」あるいは［稀なＪ　ｍＲＮＡは細胞あたり約１５コピー存在する。中間体および低頻度のｍＲＮＡにより象徴される多数の遺伝子が既に確立されたさまざまな技術によりクローン化されうる（例えば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、８．　６−８．　３５を参照せよ）。

遺伝子の配列または蛋白質についていくらかの知見があれば、いくつかの直接的クローニング法が利用可能である。しかしながら、所望の遺伝子の所在が未知であれば、所望の遺伝子産物を選択または豊富にすることにより、多大な時間および資源を浪費することなく該「未知の」遺伝子を同定することができるにちがいない。

未知の遺伝子の同定は、サブトラクティブ／１イブリダイゼーシヨン技術または別々のハイブリダイゼーション技術の使用をしばしば含みうる。サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は、極めて密接に関連した細胞集団の使用に頼り、例えば、異なる遺伝子発現が主として所望の遺伝子に関与する場合である。サブトラクティブハイブリダイゼーション技術の鍵を握る要素は包括的な相補的ＤＮＡ　（ｒｃＤＮＡＪ　）ライブラリーの構築である。

相補的ＤＮＡライブラリーの構築は現在かなり日常的な工程である。ポリＡｍＲＮＡを所望の細胞から調製し、そしてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」）および１２〜１８のチミジンからなるオリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いてｃＤＮＡの第−鎖を合成する。ｃＤＮＡの第二鎖は幾つかの方法の一つにより合成するが、最も効果的な方法は、「置換合成」および「プライムド合成」として広く知られている。

置換合成は、ＲＮＡ：　ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡのホスホジエステルバックボーンを分断して３°　ヒドロキシルおよび５゛　リン酸を残すリボヌクレアーゼＨ（ｒＲＮＡ　ａ　ｓ　ｃ　ＨＪ　）の使用を含み、ｍＲＮＡ鎖にニックおよびギャップを生じさせ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼまたはそのフレノウ断片により用いられる一連のＲＮＡプライマーを作ることによりｃＤＮＡの第二鎖を合成する。この反応は極めて効果的であるか、生成されるｃＤＮＡがｍＲＮＡ配列の５′末端を欠いていることがしばしばある。

第二ｃＤＮＡ鎖を生成するためのプライムド合成は、置換合成よりも難しい幾つかの方法の一般名であるが、高い効率で５゛末端の配列をクローン化する。通常、ｃＤＮＡ第−鎖の合成後、ｃＤＮＡ鎖の３゛末端はターミナルトランスフエラーセにより伸長合成され、該酵素＋ｊデオキシヌクレオチド、最も共通にはデオキシシチジンのホモポリマーチイルを付加する。該テイルは次に、デオキシグアニンルプライマーまたはデオキシグアニジル化されたテイルを有する合１ｉ１５ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、そしてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ第二鎖が合成される。

プライム）・合成法は効果的であるか、該法は労力を要し、生成されるｃ　ＤＮＡクローノの全てが、ｍＲＮＡ配列のすぐ上流のデオキシグアニジルトラクト（ｔｒａｃｔ）を有する。該デオキシグアニジルトラクトはインビトロまたはインビボにおいてＤＮＡの転写を阻害し得、そしてサンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法によるクローンの配列決定を阻害し得る。

ｃＤＮＡの両鏡が合成されたならば、適切なプラスミドまたはウィルスベクター中に該ｃＤＮＡをクローン化することによりｃＤＮＡライブラリーを構築する。

特に、この工程は、平滑末端を生じるように制限酵素により消化されたベクターに、該ｃＤＮＡの平滑末端を直接連結することにより実施することができる。平滑末端の連結は極めて効率が低いが、これは一般的選択法ではない。通常使用される方法は、制限酵素認識配列を含む合成リンカ−またはアダプターを該ｃＤＮＡの末端に付加することを含む。次に、該ｃＤＮＡを高い頻度で所望のベクターにクローン化することができる。

相補的ｃＤＮＡライブラリーがセルラインから構築されたなら、サブトラクティブハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子が同定される（例えば、３ａｒｇｅｎｔ　Ｔ　Ｄ、、１９８７．Ｍｅｔｈ、、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、Ｖｏｌ、１５２゜ｐｐ、４２３−４３２：Ｔ、ｃｅら、１９９１．、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、Ｍｏ１．８８．１）ｌ）、２８２５−２８３０を参照せよ）。サブトラクティブハイブリダイゼーションの一般的方法は、以下のとおりである。

ｃＤＮＡの相補鎖を合成して標識する。この一本領ｃＤＮＡは、ポリＡ　ｍＲＮＡまたは存在するｃＤＮＡライブラリーから作ることかできる。該標識ｃＤＮＡを近縁細胞集団からの過剰量のｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、ヒドロキシアパタイトカラムのクロマトグラフィーによりｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドを単離する。次に、残りの「引かれた」標ｆｉｃＤＮへを用いて、同一細胞集団のｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡをスクリーニングする。

サブトラクティブハイブリダイゼーションは両細胞集団において発現される遺伝子の大多数を除き、そして即ち所望の細胞集団にのみ存在する遺伝子を豊富にする。しかしながら、特定のｍ　ＲＮ　Ａ配列の発現がわずかな時間のみ、引かれた集団より所望の細胞集団でより豊富になるのならば、引かれた／％イブリダイゼ−ジョンによる遺伝子の単離は不可能がもしれない。

発明の概要我々は、少なくとも２種のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ増幅法により、ｍＲＮＡをｃＤＮＡとして同定、単離およびクローニングする方法を開発してきた。ひとつのアプローチとして、第一のプライマーはｍＲＮＡのポリＡテイルの最初のＡリボヌクレオチドのすぐ上流の配列を含む部位にハイブリダイズすることができる配列を含み、そして第二のプライマーは任意の（ａｒｂｉｔａｒｙ）配列を含む。他のアプローチにおいて、第一のプライマーはｍＲＮＡのポリＡシグナル配列を含む部位にハイブリダイズすることができる配列を含み、そして第二のプライマーは任意の配列を含む。他のアプローチにおいて、第一のプライマーは任意の配列を含み、そして第二のプライマーはｍＲＮＡのコザック（Ｋｏｚａｌ＜）配列を含む部位にハイブリダイズすることができる配列を含む。他のアプローチにおいて、第一のプライマーは既知の配列を有するｍＲＮＡの特定の配列に実質的に相補的な配列を含み、そして第二のプライマーは任意の配列を含む。他のアプローチにおいて、第一のプライマーは任意の配列を含み、そして第二のプライマーは既知の配列を有するｍＲＮＡの特定の配列と実質的に同一の配列を含む。第一のプライマーはｍＲＮＡの逆転写のためのプライマーとして用いられ、そしてその結果性じるｃＤＮＡは第一のプライマーおよび第二のプライマーをプライマーセットとして用いてポリメラーゼにより増幅される。

変更可能な異なるペアのプライマーを用いるこの方法により、極めて微量でしか存在しないｍ　ＲＮ　Ａを含む事実上あらゆるまたはすべてのｍＲＮＡを、あらゆる細胞種またはあらゆるセルサイクルのステージから同定および’１ｌｉｌＩすることができる。さらに、例えば発生の異なるステージまたはセルサイクルの異なるステージにあるかもしれない密接に関連した細胞からのｍ　ＲＮ　Ａ種の比較から、とのｍＲＮＡか構成的に発現され、そして分化により発現されるが、および各々の発現頻度が示され得る。

本明細書にて使用されるＵ第一のプライマー」または「第一のオリゴデオキシヌクレオチド」は、ｍＲＮＡの逆転写に用いられることによりｃＤＮＡの第−鎖を作成し、そして次にｃＤＮＡの増幅にも使用されるオリゴデオキシヌクレオチドブライマーであると定義される。第一のプライマーは、このプライマーがｍＲＮＡにハイブリダイズし、がっｃＤＮＡの第−鎖の３°末端を規定する限りは、３ ′プライマーとも呼ばれる。本明細書にて使用される「第二のプライマー」は、ｃＤＮＡの第二鎖を作成し、そして次にｃＤＮＡの増幅にも使用されるオリゴデオキシヌクレオチドプライマーであると定義される。第二のプライマーは、このプライマーがｃＤＮＡの第−鎖にハイブリダイズし、がっｃＤＮＡの第−鎖の５ °末端を規定する限りは、５゛プライマーとも呼ばれる。

本明細書にて使用されるオリゴデオキシヌクレオチドプライマー「任意の」配列は、個々の判断または裁量に基づくかまたは支配されるものとして定義される。

ある例として、任意の配列は完全にランダムかまたはひとつ以上の塩基に関して部分的にランダムでありうる。他の例として、任意の配列は特定の比率のデオキシヌクレオチドを含むように、例えば、はぼ等しい比率の各デオキシヌクレオチドまたは一つのデオキシヌクレオチドを優勢に含むように選択されるが、または特定の制限酵素認識部位を含まないように選択されうる。任意の配列は、既知のｍＲＮＡ配列に実質的に等しい（少なくとも５０が相同の）配列を含むが、または既知のｍＲＮＡ配列を含まないように選択されうる。

オリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、配列に対して相補的でも、実質的に同一でもありうる。本明細書において定義されるように、相補的オリゴデオキシヌクレオチドブライマーは、ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を含み、塩基は互いに相補的であり、かつ逆転写酵素がプライマーを伸長合成してｍＲＮＡのｃＤＮＡ鎖を形成するプライマーである。本明細書において定義されるように、実質的に同一のプライマーはｍＲＮＡの配列と同一の配列を含み、５０％以上同一なプライマーであり、そして該プライマーはｍＲＮＡと同一の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有し、即ちｍＲＮＡとはハイブリダイズしないがまたは相補的でないが、そのようなプライマーを用いてｃＤＮＡの第−鎖にハイブリダイズさせることができ、かつ、ポリメラーゼにより伸長合成してｃＤＮＡの第二鎖を生成できる。本明細書において定義される、単語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ鎖との間のオリゴデオキシヌクレオチドの塩基対として定義される。本明細書において使用される、オリゴデオキシヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズする「条件」は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとの間のオリゴデオキシヌクレオチドの塩基対が生じ、かつ、はんのわずかなミスマツチ（ひとつまたはふたつ）の塩基対が許容される温度および緩衝液の条件（以下に記載される）であると定義される。

オリゴヌクレオチドブライマーは既知のｍＲＮＡの「コンセンサス配列」であることが知られている配列を含みつる。本明細書において定義されるように、「コンセンサス配列」は、同様の機能および同様の特徴を有する蛋白質の遺伝子ファミリーにおいて見いだされる配列である。コンセンサス配列を含むプライマーの使用は、所望の遺伝子ファミリーの追加のメンバーのクローニングをもたらしうる。

本明細書において使用される、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーの「好ましい長さ」は、アニーリングの所望の特異性および細胞中の全てのｍＲＮＡにハイブリダイズするために必要な所望の特異性を有するオリゴデオキシヌクレオチドの数から決定される。２０ヌクレオチドのオリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、１０ヌクレオチドのオリゴデオキシヌクレオチドプライマーよりも特異的であるか、しかしなから、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーへのそれぞれランダムなヌクレオチドの４つほどの付加は、細胞中の各ｍＲＮＡがハイブリダイズするのに必要なオリゴデオキシヌクレオチドプライマーの数を増加させる。

一つの局面において、一般的に、本発明は、ｍ　ＲＮ　ＡのポリＡテイルの第一のＡリボヌクレオチドのすく上流の配列を含む部位にハイブリダイズすることができる配列を含む第一のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて逆転写するためにｍＲＮＡを：Ａ製し、そして、上記第一のプライマーと第二オリゴデオキシヌクレオチドプライマー、例えば、任意の配列を有するプライマー、をプライマーセットとして用いるポリメラーゼ増幅法によりｃＤＮＡを増幅することにより、ｍＲＮＡを同定および単離する方法に関する。

好ましい態様において、第一のプライマーはポリＡティルのすぐ上流のｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができるオリゴデオキシヌクレオチドの３°末端の少なくとも１ヌクレオチドを含み、かつ、ポリＡティルにハイブリダイズする５°末端の少なくとも１１ヌクレオチドを含む。完全な３′オリゴデオキシヌクレオチドは少なくとも１３ヌクレオチドの長さが好ましく、２ｏヌクレオチドまでの長さでありうる。

もっとも好ましくは、第一のプライマーはポリＡティルのすぐ上流のｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができるオリゴデオキシヌクレオチドの３″の２ヌクレオチドを含む。好ましくは、２つのポリＡ非相補的ヌクレオチドがＶＮであるが、その際、■はデオキシアデニレート（ｄＡ）、デオキシアデレート（ｄＧ）、またはデオキシアデニレート（ｄ　Ｃ）であり、そしてＮは、３゛末端ヌクレオチドがｄＡＳｄＧ、ｄＣまたはデオキシアデニレート（ｄＴ）である。即ち、好ましい第一のプライマーの配列は５’　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ　（配列番号１）である。２ヌクレオチドの使用は、ｍＲＮＡとそのポリＡティルの間の連結部分（ｊｕｎｃ　ｔ　１ｏｎ）における第一のプライマーの位置どりを正確に提供し、正確なオリゴデオキシヌクレオチドの並びが提供される：ｍＲＮＡハイブリダイズは不正確に並んだものよりもより安定になり、即ち、正確に並んだ雑種分子（ハイブリ７ド）が形成され、高い温度においてもハイブリダイズされたままのこる。好ましい態様においては、ｍＲＮＡサンプルは１２のアリコートに分割され、そして第一のプライマーの１２の考えうるＶＮ配列のひとつを各反応において使用してｍＲＮＡを逆転写を開始する。単一配列のオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、ｍＲＮＡサブセットへの結合、統計的には１／１２、即ち、各サンプル中のｍＲＮＡの同定をｆ１純化することによ各サンプル中の分析されるｍＲＮＡの数を減らす。

幾つかの態様においては、第一のプライマーの３゛末瑞はポリＡティルのすぐ上流のｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる１ヌクレオチドを含むことができ、そして５゛末嬬の１２ヌクレオチドはポリΔティルにハイブリダイズすることができる、即ち、該プライマーは５’　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ　（配列番号２）を有するであろう。単一の非ポリＡ相補デオキシヌクレオチドの使用は、各ｍＲＮＡの同定に必要なオリゴデオキシヌクレオチドの数を３に減らすが、しかしながら、ｍＲＮＡ配列とポリＡテイルの連結部分にプライマーをアニーリングさせるための単一ヌクレオチドの使用は、アニーリングの特異性の顕著な損失をもたらし、そして２つの非ポリＡ相補ヌクレオチドが好ましい。

幾つかの態様においては、第一のプライマーの３′末端はポリＡテイルのすぐ上流のｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができる３以上のヌクレオチドを含みうる。３°末端への各ヌクレオチドの付加は正確に並んだ雑種分子の安定性を増加させ、そして、ポリＡテイルにハイブリダイズさせるための配列は、添加された各付加的非ポリＡ相補的ヌクレオチドに関する１ヌクレオチドにより低下させることができる。このような第一のプライマーの使用は、与えられたセルラインに含まれるｍＲＮＡの迅速なスクリーニングには実用的でなく、ポリＡテイルのすぐ上流のｍＲＮＡのハイブリダイズする２以上のヌクレオチドと共に第一のプライマーを使用すると各ｍＲＮＡを同定するのに必要なオリゴデオキシヌクレオチドの数が増加する。例えば、プライマー５’　−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＮＮ ■（配列番号３）は各ｍＲＮＡに結合するために４８の別々の第一プライマーの使用を必要とするはずであり、そして、与えられたセルラインからｍＲＮＡをスクリーニングするために必要な反応の数を顕著に増加させる。４つの群として− か所に単一のランダムなヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、各ｍＲＮＡを同定するために４８の別々の反応を設定する必要的問題が解決しつる。しかしながら、非ポリＡ相補的配列がより長くなると、各ｍＲＮＡを同定するのに必要な反応の数を増加させる必要性かすぐに生しる。

好ましい態様において、第二のプライマーは任意の配列を有し、そして９ヌクレオチドの長さである。好ましくは、第二のプライマーは多くて１３ヌクレオチドの長さであり、そして２０ヌクレオチドの長さでありうる。

他の局面において、一般的には、本発明は、ポリアデニレーンヨンシグナル配列にハイブリダイズすることができる配列および５゛　または３′に位置する少なくとも４ヌクレオチド、またはポリアゾニレ−ジョンシグナル配列の両方を含む第一プライマーを用いた逆転写のためにｍＲＮＡ調製物をブライミングすることによりｍＲＮＡを調製および単離するための方法に関し：この完全第一プライマーは少なくとも１０ヌクレオチドの長さが好ましく、そして２０ヌクレオチドまでの長さでありうる。一つの好ましい態様においては、配列５°　−ＮＮＴＴＴＡＴＴＮＮ　（配列番号４）は、該配列がＧＣＴＴＴＡＴＴＮＣ（配列番号５）であるように選択でき、その結果生じる４つのプライマーはｍＲＮＡの逆転写をブライミングするための単一反応において一緒に用いられる。第一のｃＤＮＡ鎖が逆転写により作成されたならば、次に、第一のプライマーを、例えば任意の配列を含む第二のプライマーと共に用いてｃＤＮＡを増幅することができる。

一つの局面においては、一般的には、本発明は、ｃＤＮＡ第−鎖を生成するために第一オリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いて逆転写のためにｍＲＮＡ調製物をブライミングし、そしてｍＲＮＡのコザック配列と実質的に同一の配列を含む第ニプライマーを用いてｃＤＮＡ第二鎖調製物をブライミングすることからなるｍＲＮＡの同定および単離法、およびプライマーセットとして第一および第ニプライマーを用いてポリメラーゼ増幅法によりｃＤＮＡを増幅する方法に関する。

奸ましい態様においては、第一および第二のプライマーは少なくとも９ヌクレオチドの長さであり、そしてせいぜい１３ヌクレオチドの長さであり、そして２０ヌクレオチドまでの長さである。最も好ましいのは、第一および第二のプライマーが１０ヌクレオチドの長さである。

好ましい態様においては、第一のプライマーの配列は、ランダムに選択されるか、または、第一のプライマーは選択された任意の配列を含むか、または第一のプライマーは制限酵素認識配列を含む。

好ましい態様においては、ｍＲＮＡのコザック配列吉実質的に同一の配列を含む第二のプライマーの配列は、配列ＮＮＮＡＮＮＡＴＧＮ　（配列番号６）を有するか、または配列ＮＮＮＡＮＮＡＴＧＧ　（配列番号７）を有する。Ｎは４つのデオキシヌクレオチドの任意のひとつである。いくつかの態様においては、第一のプライマーはさらに、プライマーの長さを少なくとも５ヌクレオチド増加させるために、プライマーの５°　または３′末端のいずれかに付加された制限酵素認識配列を含む。

他の局面においては、一般的には、本発明は、公知の配列を有する配列を含むｍＲＮＡの配列に実質的に相補的な配列を含む第一オリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いた逆転写のためにｍＲＮＡ調製物をブライミングし、そして、第ニプライマーを用いてｃＤＮＡＤＮＡ第二型物をブライミングすることからなる、ｍＲＮＡの同定法および単離法、およびプライマーセットとして第一および第ニプライマーを用いてポリメラーゼ増幅法によりｃＤＮＡを増幅する方法に関する。

好ましい態様においては、第一および第ニプライマーは少なくとも９ヌクレオチドの長さであり、せいぜい１３ヌクレオチドの長さであり、そして２０ヌクレオチドまでの長さである。最も好ましくは、第一および第ニプライマーは１０ヌクレオチドの長さである。

好ましい態様においては、第一プライマーはさらに制限酵素認識配列を含むが、該配列は、該オリゴデオキシヌクレオチドの長さを少なくとも５ヌクレオチド増加させるために、プライマーの好ましい１０ヌクレオチドの範囲に含まれるかまたは３゛　または５゛のいずれかに付加される。

好ましい態様においては、第二のプライマーの配列はランダムに選択されるか、または第二のプライマーは選択された任意の配列を含むか、または第二のプライマーは制限酵素認識配列を含む。

他の局面においては、一般的には、本発明は、第一オリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いた逆転写のために１ηＲ，ＮＡＡ製物をブライミングし、そして公知の配列を有するｍ　ＲＮ　Ａの配列と実質的に同一の配列を含む第二のプライマーを用いてｃＤＮＡＤＮＡ第二型物をブライミングすることからなる、ｍＲＮＡの同定法およびｒＪＩＪｌ法、およびプライマーセットとして第一および第ニプライマーを用いてポリメラーゼ増幅法によりｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａを増幅する方法に関する。

好ましい態様においては、第一のプライマーの配列はランダムに選択されるか、または第一のプライマーは選択された任意の配列を含むか、または第一のプライマーは制限酵素認識配列を含む。

好ましい態様において、公知の配列を有するｍＲＮＡの配列に実質的に相補的な配列を有する第二のプライマーの配列はさらに制限酵素配列を含み、該制限酵素配列はプライマーの好ましい１．０ヌクレオチド中に存在していてよく、またはオリゴデオキシヌクレオチドブライマーの長さを少なくとも５ヌクレオチドまで増加させるべくプライマーの３′または５゛末端のいずれかに付加されていてよい。

他の局面において、一般的に、本発明は、公知配列を有するｍＲＮＡの配列に実質的に相補的な配列を含む第一オリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いた逆転写のためにｍＲＮＡ調製物をブライミングし、そしてｍＲＮＡのコザ・ンク配列と実質的に同一の配列を含む第二のプライマーを用いてｃＤＮＡＤＮＡ第二型物をブライミングすることからなる、ｍ　ＲＮ　Ａの同定法および単離法、およびプライマーセント表して第一および第ニプライマーを用いてポリメラーゼ増幅法によりｃＤＮＡを増幅する方法に関する。

本発明のそれぞれ一般的な局面の幾つかの好ましい態様においては、増幅されたｃＤＮＡは単離され、次に所望のＣＩ）　Ｎ　Ａは、ポリメラーゼ増幅反応および第一および第ニプライマーを用いて再び増幅される。

本発明のそれぞれ一般的な局面の幾つかの好ましい態様においては、それぞれひとつ以」二のプライマーからなる第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドプライマーのセットを使用することができる。幾つかの態様において、ひとつ以上の第一プライマーが逆転写反応に含まれ、そして、それぞれひとつ以上の第一および第ニプライマーが増幅反応に含まれる。それぞれひとつ以上のプライマーの使用は各反応において同定されるｍＲＮＡの数を増加させ、そして使用されるプライマーの総数から、それぞれ個々のｃＤＮＡを完全に単離する可能性を残すように、ｃＤＮＡを単離するための所望の方法に基づいて決定される。好ましい態様において、数百のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて単離および同定されうる。

本発明の方法は、サブトラクディブハイブリダイゼーションを利用する現在のクローニング技術を越えた顕著な進歩である。一つの局面においては、本発明の方法は、発現頻度を変えられた遺伝子、並びに構成的発現および分化による発現によるｍＲＮＡが、簡単な可視的調査による同定および単離を可能にする。他の局面において、本発明の方法は、所望のｍＲＮＡをｃＤＮＡとして増幅するだめの特異的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、そして第二ｃＤＮＡ鎖のブライミングのためにｃＤＮＡ第−鎖にホモポリマーチイルを付加する中間工程が不要になり、それにより、単１Ｉｉｉ遺伝子およびその産物の続く分析においてホモポリマーチイルの干渉が避けられる。他の局面において、本発明の方法は、選択されたｍＲＮＡのクローニングおよび配列決定を可能にし、その結果、研究者は、完全鎖長の遺伝子産物に関する相捕的ｃＤＮＡのスクリーニングの前に、遺伝子の相対的必要性を決定するかもしれない。

好ましい態様の説明図面図１は、本発明の方法を模式的に表す。

図２は、正常マウス線維芽細胞（Ａ３１）のＮＬＪ伝子の３°末端の配列である（配列番号９）。

図３は、正常細胞または腫瘍形成性マウス線維芽細胞の全細胞ＲＮＡ上のＮ１配列のノーザンプロットである。

図４は、コザｌクプライマーのみ、Ａ　Ｐ　−１プライマーのみ、コザックプライマーおよびＡＰ−１プライマー、コザックプライマーおよびＡＰ−２プライマー、コザックプライマーおよびＡＰ−３プライマー、コザックプライマーおよびＡＰ−４プライマー、およびコザックプライマーおよびＡＰ−５プライマーを用いた、４つの源（レーン１−４）から調製されたｍＲＮＡに関する増幅結果を示す、シーフェンシングゲルである。このゲルは以下において完全に記載される。

図５は、ｍＲＮＡの調製に先立って、非許容温度において培養され、次に許容温度（３２，５℃）に２４時間シフトしたＡ１−５セルラインからクローン化されたクローンに１の５°末端の部分的配列である。該Ａｌ−５セルラインはｒａＳおよび温度感受性変異体ｐ５！　（”　ｐ６！“”）で二重形質転換された初期ラット胚線維芽細胞由来である。

一般的な説明、本発明の方法の開発例示の方法により、本発明の方法の実施例が以下に記載されるが、如何にして特定の例示的実施例が開発されたかを導くことにより記載される。

オリゴデオキシヌクレオチドの長さがｍＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションに適切であることは、本発明の操作に重要である。特異的ハイブリダイゼーションを得るために、慣用的クローニング法またはＰＣＲのいずれかにより、通常は、オリゴデオキシヌクレオチドは２０またはそれ以上の長さに選択される。この例における長いオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、各試験において同定されるｍ　ＲＮ　Ａの数を低下させ、そして各ｍ　ＲＮ　Ａを同定するために必要なオリゴデオキシヌクレオチドの数を増加させるはずである。最近、ＰＣＲによるＤＮＡポリモルフォリズム分析に９−２０のヌクレオチドを使用できることが証明された［ウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ）ら、１，９９１．Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、。

Ｖｏｌ、１８．１）ｐ、６５３１−６５３５］。

クローン化されたネズミのチミシンキナーゼを含むプラスミド（”ＴＫ　ｃＤＮＡプラスミド“）をモデルの鋳型として使用して、ｍＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーション、および特異的ＰＣＲ産物の生産のために必要とされるオリゴデオキシヌクレオチドの長さを決定した。ｍＲＮＡ中の内部でハイブリダイズするように選択されたオリゴデオ」−ンヌクレオチドプライマーの長さを６から１３ヌクレオチドの間で変化させ、そしてポリＡテイルの上流の末端においてハイブリダイズするように選択されたオリゴデオキシヌクレオチドの長さを７から１４の間で変化させた。異なるセットおよび異なる長さのプライマーを用いた草大な試験の後、生成物の特異性に関しては４２°Ｃのアニーリング温度が最適であり、そして内部でハイブリダイズするオリゴデオキシヌクレオチドは少なくとも９ヌクレオチドの長さであり、そして少なくとも１３ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシヌクレオチドがポＩＪＡテイルの上流末端への結合に必要であることが決定された。

今、図１を参照すると、本発明の方法は模式的に表現される。ｍＲＮＡは第一フライマー、例え１ｆＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ　［配列番号２］　（ＴＩＩＶＮ）（１）と混合され、そしてｃＤＮＡ第−鎖を作成するために逆転写（２）される。以下のとおりにｃＤＮＡを増幅する。ｃＤＮＡ第−鎖を第二のプライマーに添カル、そして適切な濃度のヌクレオチドおよび化合物を含む標準緩衝液中の第一プライマーおよびポリメラーゼを９４°Ｃに加熱してｍＲＮＡ：　ｃＤＮＡ雑種分子を変成しく３）　、ｆｆｉ度を４２℃に低下させて第二のプライマーをアニールさせ（４）、そして次に温度を７２°Ｃに上げてポリメラーゼによる第二のプライマーの伸長合成を許す（５）。次に、この温度操作を繰り返して（６，７，８）　、第一および第二のプライマーにより／Ｓイブリダイズされる配列の増幅を開始する。各配列の所望のコピー数か得られるまで、温度操作か繰り返される。

当業界においては明らかなとおり、この増幅法は、温度安定性ポリメラーゼまたは温度不安定性ポリメラーゼを用いて実施することができる。温度不安定性ポリメラーゼを用いる場合、プライマーのアニーリング後に、伸長合成工程の始めに、新鮮なポリメラーゼを鋳型に加えなければならず、そして伸長合成工程番ま選択されたポリメラーゼの許容温度で実施されなければなら纏）。

本発明の方法に関する以下の実施例は、例示の目的のみに示される。認識されるとおり、本発明の方法はあらゆる源からポリＡｍＲＮへのｉｌ離ｉこ使用することができ、そしてあらゆるレベルで、即ちまれなものから豊富なものまで、分化によるかまたは構成的に発現される遺伝子の単離に使用することができる。

実施例ＩＰＣＨによる正確な結果および生産性のある結果に必要な条件を用いた実験が、ＴＫ　ｃＤＮＡプラスミドおよび単一セットのオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて実施されたが、配列ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡ　（”Ｔ＋　ｌＣＡ”）［配列番号１０］を選択してポＩＪＡテイルの上流末端にハイブリダイズさせ、そして配列ＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣ（”Ｌｔｋ３”）［配列番号１１］を選択してポ１）Ａテイルの２８８塩基対（”ｂｐ”）上流にハイブリダイズさせた。これら２つのプライマーを用いて期待される断片サイズは２９９ｂｐである。

ＰＣＲは、当業界において公知の標準緩衝液の条件で、１０ｎｇのＴＫ　ｃＤＮＡプラスミドを用いて実施された（緩衝液およびポリメラーゼはパーキンエルマー−シータス社から市販されている）。標準条件は、１μＭの各プライマーの代わりに、２．５μＭのＴ１１ＣＡ［配列番号１０］、および０．５μＭのＬｔｋ３　［配列番号１１］の濃度でプライマーを用いるように変更された。ヌクレオチド（”ｄＮＴＰｓ”）の濃度も、１００倍、即ち標準の２００μＭから２μＭに変更された。ＰＣＲパラメーターは、変成工程が３０秒で９４℃、アニーリング工程が１分で４２℃、そして伸長合成工程が３０秒で７２℃であった。ｄＮＴＰの濃度が２００μＭのとき、顕著な量の非特異的ＰＣＲ産物が歓察され、ｄＮＴＰｓの濃度か２０μＭまたはそれ以下のときＰＣＲ産物か特異的に増幅された。

ＰＣＲ産物の特異性は、増幅ＤＮＡの制限酵素消化物により変更され、期待されたサイズの制限断片か生成された。幾つかの例において、第二のプライマーに対して５倍以上の第一プライマーの使用が産物の特異性を増加させたことが見いだされた。２μＭへのｄＮＴＰ濃度の低下により、ＰＣＲ産物が高い特異活性で［ α−３５５］　ｄＡＴＰ、０．５μＭ　［（Ｚ−３５Ｓ］　ｄＡＴＰ　（Ｓｐ、Ａｃ　ｔ、１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）により！！Ａ識されたが、このことは、高度分析変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、による分析において、ＰＣＲ産物を区別するのに必要である。

実施例２次に、短いオリゴデオキシヌクレオチドブライマーを用いたＰＣＲ増幅法を使用して、哺乳動物細胞中のｍＲＮＡサブセットを検出した。全ＲＮＡおよびｍＲＮＡは、正常に生育させる「サイクリング（ｃｙｃ　１　ｉｎｇ）Ｊ、または血清飢餓状態である［静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）Ｊのいずれかのマウス線維芽細胞から調製した。ＲＮＡおよびｍＲＮＡは、ＴＩＩＣＡ　［配列番号１０］をプライマーとして逆転写された。Ｔ、、ＣＡ　［配列番号１０］は、ｍＲＮＡとプライマーを共に６５℃に加熱し、そして該混合物を徐々に３５℃に冷やすことによりｍＲＮＡにアニールした。逆転写反応は、モロニーマウスの白血病ウィルスの逆転写酵素を用いて３５℃において実施された。その結果生成されたｃＤＮＡは、実施例１に記載されたように、２μＭのｄＮＴＰｓを用いてＴＩＩＣＡ　［配列番号１０］およびＬｔｋ３　［配列番号１１］の存在下でＰＣＨにより増幅された。Ｔ、ＩｃＡ　［配列番号１０］プライマーおよびＬｔｋ３　［配列番号１１］プライマーの使用は、使用されるＴＫ　ｍＲＮＡを、まれなｍＲＮＡ転写物の分化による発現に関する内部コントロールにする；ＴＫ　ｍＲＮＡは細胞あたり約３０コピーで存在する。

ＤＮＡシークエンシングゲルにより、さらなる分析におし）て最適な１００ｈＳら５００ヌクレオチドの大きさの範囲のｍＲＮＡが５０から１００増幅されたこと力（明らかとなった。サイクリング細胞または静止細胞におｔ）て観察されるｍＲＮＡ種のパターンは、いくつか違うものもあったが、期待されたよりも力・なり７４％さ力・つた。注意すべきことは、６１期および８期において発現されるＴＫ遺伝子ｍＲＮＡは、期待されたとおり、サイクリング細胞のＲＮＡ調製物中でのみ見０だされ、即ち、この方法がＴＫのようなまれなｍＲＮＡ種を分離または単離する可能性を証明している。

実施例３正常または腫瘍形成性マウス線維芽細胞中のｍＲＮＡの発現眼ＰＣＲ増中畠により、ｒｕｃＡ［配列番号１０］プライマーおよびＬｔｋ３　［配列番号１１］プライマーを用いても比較された。ｍＲＮＡは、Ｔ　Ｉ　Ｉ　ＣＡ［配列番号１０］をプライマーとして逆転写され、そしてその結果生成されたｃＤＮＡは２μＭのｄＮＴＰｓおよび上記ＰＣＲパラメーターを用いてＰＣＨにより増幅された。

ＰＣＲ産物はＤＮＡシークエンシングゲルにより分離された。ＴＫ　ｍＲＮＡ４ま、期待されたとおり、正常および腫瘍形成性ｍＲＮＡ調製物の両方において同じレベルで存在し、まれなｍＲＮＡ種の代表を例示する目的で良好な内部コントロールを提供した。ひとつの調製物の中には幾つかの他のバンドが存在したが、他の調製物には存在しなく、正常細胞からのｍＲＮＡのみにわずかなバンドが存在し、そして腫瘍形成性細胞からのｍＲＮＡのみにわずかなバンドが存在し：そして幾つかのバンドは正常細胞および腫瘍形成性細胞中で異なるレベルで発現された。即ち、本発明の方法は、正常に絶え間無く発現される（構成的発現）遺伝子、および分化により発現される遺伝子、抑制される遺伝子、または発現１ノベルを変える遺伝子を同定するために使用できる。

実施例３において同定されたｍＲＮＡのクローニング３つのｃＤＮＡ、即ち、ＴＫ　ｃＤＮＡ、正常細胞中でのみ発現される一つのｃＤＮＡ　ＣＮｌ”）、および腫瘍形成性細胞中でのみ発現される一つのｃＤＮＡ（”Ｔ１”）は、電気的溶出、エタノール沈殿により尿素および他の汚染物を除去することによりＤＮＡシークエンシングゲルから回収され、そして２つの連続するＰＣＲ増幅をそれぞれ４０サイクル、２０μＭのｄＮＴＰｓの存在下で、Ｔ、、ＣＡ、［配列番号１０］プライマーおよびＬｔｋ３　［配列番号１１］プライマーを用いて、特異性を解決することなく最適の収量を達成するために、ＰＣＨにより再び増幅された。

再び増幅されたＰＣＲ産物は、適切なサイズおよびさらなるコントロールとしてのプライマー依存性を有することが確認され、そして再び増幅されたＴＫ　ｃＤＮＡは２つの異なる制限酵素により消化され、そして消化産物か正確なサイズであることも確認された。

再び増幅されたＮ１［配列番号９］を、ＴＡクローニングシステム（インビトロジエン社）を用いてプラスミドｐｃＲ１０００中にクローン化し、そして配列を決定した。今、図２を参照すると、ヌクレオチド配列から、Ｎ１断片［配列番号９］は、期待されたとおり、下線部ＬＬｋ３プライマー１５を５゛末端に、そして下線部Ｔ１１ＣＡプライマー１６を３°末端に連結していることが明らかである。

ｆｉｌ性ｍｍＮ１プローブを用いた全細胞Ｒ，ＮＡのノーザン分析により、Ｎ１のｍＲＮＡは正常マウス線維芽細胞にのみ存在し、そして腫瘍形成性マウス線維芽細胞には存在しないことが再び確認された。今、図３を参照すると、ｍＲＮＡを検出するために用いられたプローブを該図の右側に記載された部分で標識し、そしてＮ１のｍＲＮＡの大きさは、該図面の左側に記載された２８Ｓおよび１８Ｓマーカーから見積もることができる。Ｎ１のｍＲＮＡは対数増殖期の正常細胞および静止正常細胞のいずれにおいても低い量で存在しくレーン１および３）、そして対数増殖期の腫瘍形成性細胞および静止腫瘍形成性細胞のいずれにおいても存在しない（レーン２および４）。対照として、放射性標識されたプローブとして３６Ｂ４を用いた同じノーザンプロットを再びプローブし、正常および腫瘍形成性のいずれの細胞においても、等しい量のｍＲＮＡを証明するように（レーンＬ−４）　、発現される遺伝子かノーザンブロソト上に存在した。

実施例４３つのセルラインにおけるｍＲＮＡの発現の比較を実施したが、そのうちのひとつは、２つの異なる条件で培養した後に試験された。そのセルラインとは、初期胚線維芽セルライン（”ＲＥＦ”）、ｒａｓおよびｐ５３の変異株（”Ｔ１０１ −４”）を用いて二重形質転換されたＲＥＦセルライン、およびｒａｓおよびＰ５３の温度感受性変異株（”Ａ１−５”）を用いて二重形質転換されたＲＥＦセルラインであった。Ａ１−５セルラインは非許容温度である３７°Ｃにおいて培養され、そして３７°Ｃにおいて培養後、ｍＲＮＡの調製前に許容温度である３２．５°Ｃにおいて２４時間シフトした。本発明の方法は、プライマー”コザック”および５つの特定されない配列のプライマー、”ＡＰ−１，ＡＰ−２，ＡＰ −３，ＡＰ−４，またはＡＰ−５”のうちの一つをそれぞれ第二または第一プライマーとして用いて実施された。

“コザノク”プライマーの配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始部位のコンセンサス配列に関する公表コンセンサス配列に基づいて選択された（コザ・ｌり（Ｋｏｚａｋ）、１９９１．Ｊｏｕｒ、Ｃａｌ　ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１１５．ｐｐ、８８７−９０３　）。翻訳開始部位のコンセンサス配列と実質的に同一の配列を有する縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）コザソクプライマーを同時に用い、これらの配列は５’　−ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ　［配列番号１２］であり、ＲがｄＡまたはｄＧであり、即ち、オリゴデオキシヌクレオチドは、プライマーの混合物をもたらす与えられたヌクレオチドの一つのみを有する。

５つの特定されないプライマーの配列は以下のとおりである：ＡＰ−１は配列５ ’　−ＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡ　［配列番号１３］を有し、ＡＰ−２は配列５°− ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ　［配列番号１４］を有し；ＡＰ−３は配列５°−ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ　［配列番号１５］を有し；ＡＰ−４は配列５′　−ＧＧＴＡＣＴＣＣＡＣ［配列番号１６］を有し、そしてＡＰ−５は配列５’　−ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＣ［配列番号１７］を有する。これらの任意の配列のプライマーは任意に選択された。

ｍＲＮＡは第一プライマーとしてＡＰプライマーを用いて逆転写され、そしてその結果のＣＤＮＡ第−鎖は両プライマー、ＡＰプライマーおよび変更コザックプライマーの存在下で、２μＭのＮＴＰｓおよび上記のＰＣＲパラメーターを用いてＰＣＨにより増幅された。ＰＣＲ産物はＤＮＡシークエンシングゲルにより分離された。少なくとも５０−１００の増幅ｃＤＮＡバントが試験された各セルラインに存在し、そしていくつかのバンドはそれぞれのセルラインにおいて異なったレベルで発現された。対照として、コザックプライマーの不在下で各特定されないプライマーを用いた反応が実施された。特定されないプライマーのみではＣＤＮＡは生成されず、即ち、このことは両方のプライマーが、ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの増幅に必要であることが証明される。

ライマーを用いた反応、およびコザノクプライマーの不在下でｍＲＮＡと共にＡＰ−１を用いた反応を実施した。ｍＲＮＡの不在下では該プライマーによるｃＤＮＡの生成はなく、あるいは特定されないプライマーのみでも生成はなかったことから、ｍＲＮＡが増幅に必要であること、および両方のプライマーはｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡへの増幅に必要であることが証明される。該増幅によるｃＤＮＡ産物は同じオーダーでゲルに泳動され、即ち、ＲＩζＦセルラインは各レーン１に示され、セルラインＴｌ０Ｉ−４は各レーン２に示され、３７℃において培養されたセルラインＡｌ−５は各レーン３に示され、そして３２．５℃において培養されたセルラインＡｌ−５は各レーン４に示される。プライマーの６対は上記セルラインからの異なったセットのｍＲＮＡの増幅をもたらした。コザックプライマーおよびＡＰ−Ｌ、ＡＰ−２，ＡＰｌ、ＡＰ−４，またはＡＰ−５をプライマーセットとして用いて実施した反応は、３７°Ｃにおいて培養されたセルラインＲＥＦ、Ｔ１０１−４、Ａｌ−５および３２．５℃において培養されたＡｌ −５のそれぞれにおいて同じｃＤＮＡパターンの増幅をもたらした。各セルラインからのｍＲＮＡの増幅、およびコザック変更プライマーおよびＡＰ−３プライマーを用いた温度は、Ａｌ−５セルラインを３２．５℃において２４時間培養した場合に調製された特定の一つのバンドの発見をもたらしたが、該バンドはあらゆる他のｍＲＮＡ調製物からは発見されず、該バンドは図４でに、として示される。即ち、本発明の方法は、変異株のセルラインにおいて別々に発現される遺伝子を同定するために使用可能である。

実施例４て同定されたｍＲＮＡのクローニング３２．５°ＣにおいてＡＪ−５セルラインを培養した場合にのみ発現したｃＤＮＡ（”Ｋ１”）をＤＮＡシークエンシングゲルから回収し、上記のとおりプライマー、コザックおよびＡ　Ｉ）　 −３を用いて再び増幅した。再び増幅されたに、のＣＤＮＡは約４５０ｂｐの適切な大きさを有することが確認され、そしてインビトロジエン社のＴＡクローニングシステムを用いて使用説明書にしたがってベクターｐｃＲＩＩ中にクローン化され、そして配列を決定された。今、図５を参照すると、Ｋ１クローンはその５′末端に下線部コザソクブライマ−２０、および３゛末瑞に下線部Ａ　Ｉ）　 −３プライマー２１−を連結していることが、ヌクレオチド配列から明らかに示される。この部分的ｃＤＮＡの５°末瑞は配列番号１８であると同定され、そしてこのｃＩ）ＮΔの３′末端は配列番号１９であると同定される。

この部分的配列はオーブンリーディングフレームであり、そして遺伝子データベースＥ　Ｍ　＋３０およびＧｅｎｂａｎｋの検索によると、Ｋ１の３°部分からの翻訳アミノ酸配列がユビキチン連結酵素ファミリー（ＵＢＣ酵素）と相同であることが明らかとなった。Ｋ、の３°部分からの該翻訳アミノ酸配列は、Ｄ、ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　（メラノガスター）のＵＢＣ酵素と１００％同一であり、モしてＵＢＣ−４酵素と７５％同一であり、そして酵母Ｓ、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サツ力ロフイセス）のＵＢＣ−５酵素と７９％同一であり；そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス　サリアナ）のＵＢＣ酵素と７５％同一である。ＫＩクローンはこの遺伝子の実際の５°末端を含んでよいが、そうでなければ、コザックプライマーは５“末端の直後でハイブリダイズする。この結果から、本発明の方法を用いて遺伝子の５゛コーディング配列をクローン化することかできることが証明される。

使用法本発明の方法を用いることより、任意の数の源からｍＲＮＡを同定、単離およびクローン化することができる。該方法は、単離後の単一の可視調査により所望のｍＲＮＡの同定を提供し、そして研究調査、工業的応用および医療的応用に用いることができる。

例えば、再び増幅されたｃＤＮＡは、塩基配列決定することができ、または完全長の遺伝子を得るためにＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用できる。ｃＤＮＡの配列が決定されたならば、アミノ酸ペプチドを翻訳蛋白質配列から作ることができ、そして抗体の作成に使用できる。これらの抗体は該遺伝子産物のさらなる調査およびその機能の調査に使用でき、または医療用診断および予後に応用できる。再び増幅されたｃＤＮＡはさらなる増殖のために適切なベクター中にクローン化することができ、またはイノビトロまたはインビボにおいて発現されるために適切なベクター中にクローン化できる。発現ベクター中にクローン化されたｃＤＮＡは蛋白質産物の大量生産のための工業的状況において使用することかできる。他の応用としては、再び増幅されたＣＤＮＡまたはそれらの対応するクローンは、インサイチュハイブリダイゼーションのプローブとして使用されるであろう。そのようなプローブは疾患の診断および予後にも用いることができる。

他の態様他の態様は請求の範囲の節回内である。

オリゴデオキシヌクレオチドの長さは、選択されるアニーリング温度に依存して変更可能である。好ましい態様においては、温度は４２℃に選択され、そしてオリゴヌクレオチドの長さは少なくとも９ヌクレオチドに選択される。アニーリング温度を３５℃に低下したのならば、オリゴヌクレオチドの永さは少なくとも６ヌクレオチドに減らすことができる。

ｃＤＮＡは３５５以外、例えば３２ｐおよび３！Ｐで標識されたヌクレオチドにより放射性標識することができる。必要であれば、非放射性イメージング法も、本発明の方法に適用することができる。

ｃＤＮＡの増幅は、上記されたとおり、連続ラウンドの変成、アニーリングおよび伸長合成のための温度循環の間、温間循環ポリメラーゼチェインリアクションにより、反復コピーのｃＤＮＡのための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて達成することができる。あるいは、該増幅は、一定温度（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）ＤＮＡ増幅法（Ｗａｉｋｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、８９．　ｐｐ、３９２−３９６）により達成することができる。

該一定温度増幅法は適切な制限酵素認識配列を含むことによりｃＤＮＡを増幅するための使用に適合させられるはずてあり、該配列の一つは一方の鎖がホスホロチオエート化された認識部位でニックが入れられ、その認識部位はα”Ｓ標識ｄＮＴＰを用いて再生することができる。

同様の機能または同様の機能ドメインを有する蛋白質は、しばしば遺伝子ファミリーのひ占つと吋ばれる。多くのこのような蛋白質はクローン化され、そしてファミリーのメンバー間で高度に保存されているコンセンサス配列を含むことか同定されている。配列のこの保存は、ファミリーの新しいメンバー、または関連したメンバーのクローニングのためのオリゴデオキシヌクレオチドブライマーのデザインに使用することができる。本発明の方法を用いれば、細胞由来のｍＲＮＡは逆転写することかでき、モしてｃＤＮＡは、公知のｍ　ＲＮ　Ａの配列と実質的に同一の配列を有する少なくともひとつのプライマーを用いて増幅されうる。

少なくとも以下のファミリーおよび機能ドメインに関するコンセンサス配列は文献に記載されている。蛋白質チロシンキナーゼ（Ｈａ　ｎ　ｋ　ｓら、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｍｏ１．２００．ｐｐ、５３３−５４６）、ホメオボックス遺伝子、ジンクフィンガーＤＮＡ結合蛋白質（Ｍ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅｒら、１９８５、ＥＭＢＯＪｏｕｒ、、Ｖａｔ、４．Ｉ）Ｉ）、１６０９−１６１４）：リセブター蛋白質１分泌蛋白質のシグナル配列、核に存在する蛋白質（Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅ　ｌら、１９８９．Ｖｏｌ、５７．　ｐｐ、１１４７−１１５４）；セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼの阻害剤：サイトカイン、チロシンキナーゼおよび他の蛋白質において記載されているＳＨ２およびＳＨ３ドメイン（ｐａｗｓｏｎら、１９９２．Ｃｅ１ｌ、Ｍｏｌ　７１．Ｉ）ｌ）、３５９−３６２）；セリン／チロシンおよびチロシンホスファターゼ（Ｃｏ　ｈ　ｅ　ｎ。

１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｍｏ１．２０１．　ｐｐ、３９８−４０８）；サイクリンおよびサイクリン依存性プロティンキナーゼ（ＣＤＫｓ）　（例えば、Ｋｅｙｏｍａｒｓｉら、１９９３．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、Ｙｏｌ、９０．　ｐｐ、１１１２−１１１６）。

任意のコンセンサス配列に関するプライマーは、アミノ酸のコドン使用頻度に基づいて容易にデザインすることができる。ひきつまたは複数の部位における縮ｆｔ　（ｄｅｇｅｎｅ　ｒａｃｙ）の利用は所望のコンセンサス配列を含む高いパーセンテージ、即ち５０％以上、のｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマーのデザインを可能にする。

本発明の方法において使用するためのプライマーは、シンクフィンガーＤＮＡ結合蛋白質のコンセンサス配列に基づいて、例えば、蛋白質ｐｙｖｃのコンセンサス配列に基づいてデザインすることができる。このファミリーのさらなるメンバーのクローニングのために有用なプライマーは、以下の配列　５°　−ＧＴＡＹＧＣＮＴＧＴ　［配列番号２０］または５’　−ＧＴＡＹＧＣＮＴＧＣ［配列番号２１］を有することかできるが、その際、Ｙは、プライマーがその位置で縮重した場合のデオキシヌクレオチドｄＴまたはｄＣであり、モしてＮは、イノシン（“ビ）である。塩基イノシンは他のすへての塩基と対を形成することができ、そ。

してバリダ■”がこの位置で高い頻度で縮重した場合のオリゴデオキシヌクレオチドの位置に関して選択された。使用される、記載されたオリゴデオキシヌクレオチドブライマーは、５°　−ＧＴＡＴＧＣＩＴＧＴと５°　−ＧＴＡＣＧＣＩＴＧＴの混合物、または５°　−ＧＴＡＴＧＣＩＴＧＣと５’　−ＧＴＡＣＧＣＩＴＧＣの混合物である。

配列表配列番号　１配列の長さ：１３配列の型：核酸鎖の数・一本型トポロジー、直鎖状配列の種類：他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列＝Ｎ。

アンチセンス、Ｎ。

配列Ｔｒ　ＴＶＮ　１３配列番号：２配列の長さ、１３配列の型・核酸鎖の数　一本型トポロジー、直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポをティカル配列・ＮＯアンチセンス二Ｎ。

配列ＴＴＴｍＴＴＴＴ　ＴｒＮ　１３配列番号：３配列の長さ１３配列の型　核酸鎖の数ニ一本型トポロジー　直鎖状配列の種類、他の核酸　合ｌ１１３２ＤＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　ＮＯ配列ＴＴｒＴＴＴＴＴＴＴ　ＶＮＮ　１．３配列番号　４配列の長さ　１０配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成ＤＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＮＮＴＴＴＡＴＴＩＪＮ　１０配列番号　５配列の長さ　１０配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列　ＮＯアンチセンス　ＮＯ配列ＧＣＴＴＴＡＴＴＮＣ１０配列番号　６配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数°−一本鎖ポロシー：直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列、Ｎ。

アンチセンス−Ｎ。

配列ＮＮＮＡＮＮＡＴＧＮ　１０配列番号　７配列の長さ　１０配列の型、核酸鎖の数−一本鎖トポロジー　直鎖状配列の種類他の核酸　合１１ｉ３ＥＤＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＮＮＮＡＮに＾ＴＧＧ　１０配列番号・８配列の長さ　１−０配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロジー　直鎖状配列の種類、他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列：Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ　１０配列番号　９配列の長さ　２６０配列の型　核酸鎖のｅ１＝一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列二Ｎ。

アンチセンス、Ｎ。

配列ＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴ　ＴＧＡＧＧＴＡＡＣＴ　ＧＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡ　ＧＡＴＡＣＴＡＡＡＡ　ＣＣＴＡＡＣＴｒＣf　１８０配列番号　１０配列の長さ、１３配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列［ＴＣＡ　１３配列番号：１１配列の長さ・１０配列の型・核酸鎖の数ニ一本型トポロジー・直鎖状配列の種類：他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＧＴｒＧＡＴｒＧＣＣ１０配列番号：１２配列の長さ・１０配列の型°核酸鎖の数ニ一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列、Ｎ。

アンチセンス＝Ｎ。

配列ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ　１０配列番号　１３配列の長さ　１０配列の型・核酸鎖の数・一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイボセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列＾ＧＣＣＡＧＣＧ＾＾　１０配列番号、１４配列の長さ　１０配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＴ　］　０配列番号　１−５配列の長さ　１０配列の型　核酸鎖の数　一本型トポロノー　直鎖状配タリの種類　他の核酸　合戎ＤＮＡハイボセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ　１０配列番号　１６配列の長さ°１０配列の型：核酸鎖の数　一本型トポロジー・直鎖状配列の種類　他の核酸　合５５．ＤＮＡハイポセティカル配列二ＮＯアンチセンス、ＮＯ配列ＧＧＴＡＣＴＣＣＡＣ１０配列番号＝１７配列の長さ　１−０配列の型・核酸鎖の数、一本型トポロジー　直鎖状配列の種類　他の核酸　合５５．ＤＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス　Ｎ。

配列ＧＴｒＧＣＧＡＴＣＣ１０配列番号　１８配列の長さ　４２配列の型　核酸鎖の数、一本鎖トポロジー・直鎖状配列の種類：ＣＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎ。

アンチセンス、Ｎ。

配列ＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧ　ＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧ　ＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＣＡＴＧ　ＡＡ　４２配列番号、１９配列の長さ・７８配列の型・核酸鎖の数、一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類　ｃＤＮＡハイポセティカル配列・ＮＯアンチセンス　Ｎ。

配列配列番号　２０配列の長さ、１０配列の型　核酸鎖の数　一本鎖トポロシー−直鎖状配列の種類　他の核酸　合成りＮＡハイポセティカル配列、ＮＯアンチセンス、Ｎ。

配列ＧＴＡＹＧＣＮＴＧＴ　１０配列番号、２１配列の長さ　１０配列の型：核酸鎖の数・一本鎖トポロジー、直鎖状配列の種類：他の核酸　合１１ｉ１ＪＤＮＡハイポセティカル配列　Ｎ。

アンチセンス、ＮＯ配列ＧＴＡＹＧＣＮＴＧＣ１０ＦＩＧ、２ＦＩＧ、４Ｓ’　−ｑ；；へΩ；Δ工ΩＱＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣ入ＴＧＡＡ、、、、、、、、、、、、、、、、。

ＦＩＧ、５フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、　ＳＥ）、　ＣＡ、ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｍＲＮＡと第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記オリゴデオキシヌクレオチドがｍＲＮＡのポリＡテイルの第一Ａリボヌクレオチドのすぐ上流の配列を含む部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリブターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上記ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、第二オリゴデオキシヌクレオチドがＤＮＡとハイブリダイズする条件下で、該第二オリゴデオキシヌクレオチドと接触させ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための非特異的クローニング法。
２．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが、ポリＡテイルの第一Ａリボヌクレオチドの少なくとも１塩基上流および隣接塩基を含む部位で上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする、請求項１記載の方法。
３．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが、ポリＡテイルの第一Ａリボヌクレオチドの少なくとも２塩基上流および隣接塩基を含む部位で上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする、請求項２記載の方法。
４．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが、少なくとも１１塩基からなるポリＡ相補的領域、上記ポリＡ相補的領域の上流、および少なくとも１塩基からなる非ポリＡ相補的領域を含む、請求項１記載の方法。
５．上記非ポリＡ相補的領域が少なくとも２つの隣接する塩基を含む、請求項４記載の方法。
６．上記非ポリＡ相補的領域が３′−ＮＶを含むが、その際、ＶはｄＡ、ｄＣまたはｄＧのうちのひとつであり、そして、ＮはｄＡ、ｄＴ、ｄＣまたはｄＧのうちのひとつで請求項５記載の方法。
７．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１３塩基からなる、請求項４記載の方法。
８．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも６デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
９．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
１０．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがランダムに選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
１１．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドが選択された任意の配列を含む、請求項１記載の方法。
１２．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドがｄＣ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＡを含む、請求項１記載の方法。
１３．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位を含む、請求項１記載の方法。
１４．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが、公知配列のｍＲＮＡ内に含まれる配列と同一の配列を含む、請求項１記載の方法。
１５．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドの少なくともひとつが多数のオリゴデオキシヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
１６．ｍＲＮＡと第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記オリゴデオキシヌクレオチドがｍＲＮＡのポリＡテイルを含む部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリブターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上記ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、第二オリゴデオキシヌクレオチドがＤＮＡとハイブリダイズする条件下で、該第二オリゴデオキシヌクレオチドと接触させ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための非特異的クローニング法。
１７．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも６ヌクレオチドからなる、請求項１６記載の方法。
１８．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９ヌクレオチドからなる、請求項１６記載の方法。
１９．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも６デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１６記載の方法。
２０．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１６記載の方法。
２１．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがランダムに選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項１６記載の方法。
２２．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドが選択された任意の配列を含む、請求項１６記載の方法。
２３．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドがｄＣ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＡを含む、請求項１６記載の方法。
２４．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位を含む、請求項１６記載の方法。
２５．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが、公知配列のｍＲＮＡ内に含まれる配列と同一の配列を含む、請求項１６記載の方法。
２６．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドの少なくともひとつが多数のオリゴデオキシヌクレオチドからなる、請求項１６記載の方法。
２７．ｍＲＮＡと第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記オリゴデオキシヌクレオチドがある部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリブターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上流ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、下記第二オリゴデオキシヌクレオチドがコザック配列を含む部位においてＤＮＡとハイブリダイズする条件下で、該第二オリゴデオキシヌクレオチドと接触させ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための方法。
２８．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９ヌクレオチドからなる、請求項２７記載の方法。
２９．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチドからなる、請求項２７記載の方法。
３０．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項２７記載の方法。
３１．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項２７記載の方法。
３２．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがランダムに選択されたデオキシリボヌクレオチド配列を含む、請求項２７記載の方法。
３３．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの選択された任意の配列を含む、請求項２７記載の方法。
３４．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位を含む、請求項２７記載の方法。
３５．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが、公知配列のｍＲＮＡ内に含まれる配列と実質的に同一の配列を含む、請求項２７記載の方法。
３６．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがさらに制限酵素認識部位を含む、請求項２７記載の方法。
３７．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドの少なくともひとつが多数のオリゴデオキシヌクレオチドからなる、請求項２７記載の方法。
３８．ｍＲＮＡと公知配列のｍＲＮＡ中の配列に実質的に相補的な塩基配列を有する第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記オリゴデオキシヌクレオチドが上記実質的に同一な配列を含む部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリブターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上流ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、第二オリゴデオキシヌクレオチドが上記ＤＮＡ鎖とある部位でハイブリダイズする条件下で、該第二オリゴデオキシヌクレオチドと接触させ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための非特異的クローニング法。
３９．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項３８記載の方法。
４０．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項３８記載の方法。
４１．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項３８記載の方法。
４２．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項３８記載の方法。
４３．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位をさらに含む、請求項３８記載の方法。
４４．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがランダムに選択されたデオキシリボヌクレオチド配列を含む、請求項３８記載の方法。
４５．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの選択された任意の配列を含む、請求項３８記載の方法。
４６．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの上記塩基配列が制限酵素認識部位を含む、請求項３８記載の方法。
４７．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドの少なくともひとつが多数のオリゴデオキシヌクレオチドからなる、請求項３８記載の方法。
４８．ｍＲＮＡと第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記オリゴデオキシヌクレオチドがある部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリブターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上流ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、公知配列のｍＲＮＡ中の配列と実質的に同一な配列を有する第二オリゴデオキシヌクレオチドに接触させるが、その際、上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが上記実質的に同一な配列を含む部位において上記第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする条件下で行い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための非特異的クローニング法。
４９．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項４８記載の方法。
５０．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項４８記載の方法。
５１．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項４８記載の方法。
５２．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項４８記載の方法。
５３．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドがランダムに選択されたデオキシリボヌクレオチド配列を含む、請求項４８記載の方法。
５４．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの選択された任意の配列を含む、請求項４８記載の方法。
５５．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位を含む、請求項４８記載の方法。
５６．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが制限酵素認識部位をさらに含む、請求項４８記載の方法。
５７．上記第一または第二オリゴデオキシヌクレオチドの少なくともひとつが多数のオリゴデオキシヌクレオチドからなる、請求項４８記載の方法。
５８．ｍＲＮＡと公知配列のｍＲＮＡ中の配列と実質的に同一な配列を有する第一オリゴデオキシヌクレオチドとを、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記実質的に同一な配列を含むある部位においてｍＲＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触させ、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、およびリバーストランスクリプターゼを用いてｍＲＮＡを逆転写することにより、上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが上記ｍＲＮＡとハイブリダイズする部位から上流の上流ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＤＮＡ第一鎖を生成し、該ＤＮＡ第一鎖を、第二オリゴデオキシヌクレオチドに接触させるが、その際、上記第二オリゴデオキシヌクレオチドがコザック配列を含む部位において上記ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする条件下で行い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて該第二オリゴデオキシヌクレオチドを伸長合成して、上記ＤＮＡの第一鎖にハイブリダイズする上記第二オリゴデオキシヌクレオチドの部位の下流の上記ＤＮＡ第一鎖に相補的なＤＮＡ第二鎖を生成し、そして上記第一および第二オリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして、そしてＤＮＡポリメラーゼを用いて上記ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を増幅する工程からなる、核酸サンプル中の、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを単離するための非特異的クローニング法。
５９．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項５８記載の方法。
６０．上記第一オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項５８記載の方法。
６１．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも９デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項５８記載の方法。
６２．上記第二オリゴデオキシヌクレオチドが少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項５８記載の方法。